Để góp phần tìm ra môi trường tối ưu cho mục đích nhân giống cây hoa salem tím (Limonium sinuatum L. Mill) in vitro, nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo sát độ tuổi sinh lý thích hợp của mẫu cấy, ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật, GA3 và adenine lên giai đoạn nhân chồi. Môi trường được sử dụng là môi trường MS cơ bản, có bổ sung 100 mg/l myo-inositol, 30 g/l sucrose và 6 g/l agar. Các thí nghiệm được duy trì ở điều kiện chiếu sáng 16 h/ngày, cường độ chiếu sáng 2800 lux và nhiệt độ là 25 ± 2ºC. Nguyên liệu thích hợp nhất được lựa chọn là chồi của cây con in vitro 6 tuần tuổi. Qua khảo sát về vai trò của cytokinin lên sự tạo chồi, chúng tôi nhận thấy kinetin nồng độ 4 mg/l có tác động kích thích tạo chồi cao nhất (5,6 chồi/mẫu cấy) sau 8 tuần nuôi cấy. Sự kết hợp giữa kinetin nồng độ 4 mg/l với các loại auxin khác nhau (IBA, NAA và 2,4-D) không làm tăng hiệu quả tạo chồi so với kinetin riêng lẻ nhưng chồi mới hình thành có kích thước lớn. Sự hiện diện của GA3/adenine giúp tăng hiệu quả tạo chồi. Kết quả khảo sát cho thấy 4 mg/l kinetin kết hợp với 10 mg/l GA3 hoặc 10 mg/l adenine có hiệu quả tạo chồi cao với số lượng chồi trung bình hình thành trên một mẫu cấy lần lượt là 7,8 và 9,73 chồi sau 8 tuần nuôi cấy.
Trang 1TĂNG HỆ SỐ NHÂN NHANH CHỒI CÂY HOA SALEM TÍM
(Limonium sinuatum L Mill) BẰNG CÁCH SỬ DỤNG KẾT HỢP CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ ADENINE TRONG NUÔI CẤY IN VITRO
Nguyễn Thị Huyền Trang*, Lê Thị Thủy Tiên
Trường Đại học bách khoa, ĐHQG tp Hồ Chí Minh, nguyenthihuyentrang171@gmail.com
TÓM TẮT: Để góp phần tìm ra môi trường tối ưu cho mục đích nhân giống cây hoa salem tím
(Limonium sinuatum L Mill) in vitro, nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo sát độ tuổi sinh lý thích
hợp của mẫu cấy, ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật, GA3 và adenine lên giai đoạn nhân chồi Môi trường được sử dụng là môi trường MS cơ bản, có bổ sung 100 mg/l myo-inositol, 30 g/l sucrose và 6 g/l agar Các thí nghiệm được duy trì ở điều kiện chiếu sáng 16 h/ngày, cường độ chiếu sáng
2800 lux và nhiệt độ là 25 ± 2ºC Nguyên liệu thích hợp nhất được lựa chọn là chồi của cây con in vitro 6
tuần tuổi Qua khảo sát về vai trò của cytokinin lên sự tạo chồi, chúng tôi nhận thấy kinetin nồng độ 4 mg/l có tác động kích thích tạo chồi cao nhất (5,6 chồi/mẫu cấy) sau 8 tuần nuôi cấy Sự kết hợp giữa kinetin nồng độ 4 mg/l với các loại auxin khác nhau (IBA, NAA và 2,4-D) không làm tăng hiệu quả tạo chồi so với kinetin riêng lẻ nhưng chồi mới hình thành có kích thước lớn Sự hiện diện của GA3/adenine giúp tăng hiệu quả tạo chồi Kết quả khảo sát cho thấy 4 mg/l kinetin kết hợp với 10 mg/l GA3 hoặc 10 mg/l adenine có hiệu quả tạo chồi cao với số lượng chồi trung bình hình thành trên một mẫu cấy lần lượt
là 7,8 và 9,73 chồi sau 8 tuần nuôi cấy
Từ khóa: Limonium sinuatum, 2,4-D, adenine, BA, GA3, IBA, kinetin, NAA
MỞ ĐẦU
Salem có tên khoa học là Limonium
sinuatum L Mill, thuộc họ Bạch hoa đan
(Plumbaginaceae) Chi Limonium có khoảng
150 loài hoang dã [3] Salem xuất xứ từ Địa
Trung Hải và đã có mặt ở Đà Lạt từ trước năm
1975 Vùng trồng hoa salem phổ biến tại Đà Lạt
là Đa Thiện, Thái Phiên và nhiều nơi khác Trên
thế giới, đã có nhiều tác giả tiến hành nghiên
cứu đối tượng này như nuôi cấy tế bào để khảo
sát khả năng tái sinh [3], loại bỏ vi khuẩn ký
sinh gây hoại tử ở lá trong vi nhân giống [9] hay
tạo cây lai giữa 2 loại Limonium perezii và
Limonium sinuatum [5] Trong vài năm gần đây,
một bộ phận nông dân tại Đà Lạt sử dụng các
giống hoa đã bị thoái hóa, trong đó có salem,
dẫn đến sản lượng thấp, màu sắc và độ bền kém
Bên cạnh đó, nguồn giống chưa được chủ động,
cho nên, khi thị trường cần số lượng lớn thì sản
xuất không đáp ứng được [8] Phương pháp vi
nhân giống là phương pháp hiệu quả không
những tạo số lượng cây giống lớn, không những
ổn định về mặt di truyền, mà còn nâng cao chất
lượng cây giống Xuất phát từ yêu cầu thực tế
nhằm sản xuất một lượng lớn cây giống salem
có chất lượng cao và ổn định, đề tài được thực
hiện với mục đích khảo sát ảnh hưởng của một
số yếu tố lên sự nhân chồi của cây salem in
vitro, là giai đoạn quan trọng trong công tác vi
nhân giống
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu
Chồi của cây con in vitro được sử dụng để
làm vật liệu thí nghiệm Hạt giống tạo cây con
là hạt giống hoa salem thương mại được cung cấp bởi công ty TNHH Hạt Giống Hoa Việt Nam, mã số: FVN STA011 Golf Dark Blue, Hoa Kỳ
Phương pháp
Môi trường nhân chồi là môi trường Murashige và Skoog (1962) (MS) [6] bổ sung
100 mg/l myo-inositol, 30 g/l sucrose, 6 g/l agar
và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác nhau Các môi trường này được chỉnh về pH 5,8 trước khi hấp tiệt trùng ở 121ºC, 1 atm trong thời gian 15 phút
Các thí nghiệm được duy trì ở điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng
2800 lux và nhiệt độ là 25 ± 2ºC
Khử trùng hạt
Hạt được khử trùng với dung dịch Javel thương mại 50% trong thời gian 7 phút Môi
Trang 2trường gieo hạt là môi trường MS bổ sung 100
mg/l myo-inositol, 20 g/l sucrose và 6 g/l agar
Khảo sát tuổi sinh lý thích hợp của mẫu cấy
cho sự tạo chồi
Chồi của cây con 4; 6 và 8 tuần tuổi được
nuôi cấy trên môi trường nhân chồi là môi
trường MS bổ sung 4 mg/l kinetin, 100 mg/l
myo-inositol, 30 g/l sucrose và 6 g/l agar Kết
quả về độ tuổi sinh lý thích hợp nhất cho sự tạo
chồi sẽ được sử dụng cho tất cả các thí nghiệm
khảo sát nhân chồi trong báo cáo này
Ảnh hưởng của cytokinin lên sự tạo chồi
Mẫu cấy là chồi của cây con có tuổi sinh lý
thích hợp là kết quả ở thí nghiệm trước được
nuôi cấy trên môi trường bổ sung BA (0; 0,2;
0,5; 1; 2; 3; 4 mg/l) hoặc kinetin (0,5; 1; 2; 3; 4;
5 mg/l) nhằm tìm ra loại và nồng độ cytokinin
thích hợp cho việc nhân chồi cây salem Kết quả
cytokinin thích hợp cho sự cảm ứng tạo chồi
cây salem sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm
tiếp theo
Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa cytokinin và
auxin lên sự tạo chồi
Các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng thực
vật được sử dụng trong thí nghiệm này là IBA;
2,4-D và NAA ở các nồng độ 0,05; 0,1 và 0,2
mg/l kết hợp với loại cytokinin có nồng độ cảm
ứng tạo chồi hiệu quả nhất thu được từ thí
nghiệm khảo sát ảnh hưởng của cytokinin So
sánh hiệu quả tạo chồi trên các môi trường khảo
sát với môi trường chỉ bổ sung cytokinin riêng
lẻ Môi trường có kết quả tạo chồi cao nhất sẽ
được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo
Ảnh hưởng của GA 3 , adenine lên sự tạo chồi
GA3 và adenine được bổ sung riêng lẻ vào
môi trường MS có sự hiện diện của chất điều hòa
sinh trưởng thực vật cảm ứng tạo chồi hiệu quả
nhất từ các thí nghiệm trước Nồng độ của các
chất được khảo sát là: GA3 nồng độ 3; 5; 7 và 10 mg/l và Adenine nồng độ 5; 10; 15 và 20 mg/l
Phân tích và xử lý số liệu
Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng mẫu tạo chồi, số lượng chồi hình thành và hình thái chồi sau 4; 6
và 8 tuần nuôi cấy
Mỗi thí nghiệm được thực hiện với 5 bình, mỗi bình chứa 3 mẫu cấy
Số liệu được ghi nhận và xử lý bằng phần mềm SPSS theo phương pháp Duncan ở mức ý nghĩa 0,05
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát độ tuổi sinh lý thích hợp của mẫu cấy cho sự tạo chồi
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến nhân
giống in vitro thường được nhắc đến như thành
phần môi trường, điều kiện nuôi cấy, mẫu cấy Trong đó, yếu tố mẫu cấy có thể chia làm hai nhóm: lựa chọn mẫu cấy và xử lý mẫu cấy Các nhân tố khi chọn mẫu bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu Trong báo cáo này, chúng tôi tiến hành khảo sát trên nguồn mẫu là hạt, do đó độ tuổi sinh lý của mẫu cấy có thể sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả nhân chồi khi nuôi cấy
Ba độ tuổi sinh lý khác nhau được khảo sát
và ghi nhận kết quả sau 4; 6 và 8 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 4 mg/l kinetin được trình bày trong bảng 1 Kết quả cho thấy, có sự khác biệt rõ rệt về khả năng tạo chồi giữa những mẫu cấy có độ tuổi khác nhau Mẫu cấy 6 tuần tuổi có khả năng tạo chồi cao nhất với số lượng chồi trên một mẫu cấy ban đầu là 5,87 chồi sau
8 tuần nuôi cấy (hình 1b) Tỷ lệ tạo chồi của mẫu cấy 6 tuần tuổi cũng cao hơn so với mẫu cấy 4 và 8 tuần tuổi
Bảng 1 Ảnh hưởng của độ tuổi mẫu cấy đến hiệu quả nhân chồi
Tuổi của
mẫu cấy
(tuần)
Tỉ lệ tạo
chồi (%)
Số lượng chồi/mẫu
Tỉ lệ tạo chồi (%)
Số lượng chồi/mẫu
Tỉ lệ tạo chồi (%)
Số lượng chồi/mẫu
Các chữ cái a, b, c thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan
Trang 3Quan sát hình thái mẫu cấy sau 4 tuần nuôi
cấy trên môi trường có bổ sung 4 mg/l kinetin,
chúng tôi nhận thấy mẫu cấy ban đầu không có
sự gia tăng kích thước, các lá mới hình thành có
kích thước đều nhau, chiều dài dưới 1 cm Chồi
mới xuất hiện ở nách lá và gốc của chồi ban đầu
(hình 1a) Điều này chứng minh sự hiện diện
của kinetin trong môi trường nuôi cấy có tác
động ức chế hiện tượng ưu tính ngọn để kích
thích sự hình thành và tăng trưởng của các chồi
mới, tạo cụm chồi
Ở các mẫu cấy 8 tuần tuổi sau 8 tuần nuôi
cấy, chồi ban đầu tiếp tục gia tăng chiều cao và
tạo lá mới (hình 1c) Như vậy, ở nhóm mẫu cấy
này hiện tượng ưu tính ngọn của chồi ban đầu không bị ức chế hoàn toàn, chồi mới hình thành chủ yếu ở nách lá Đây có lẽ là nguyên nhân làm cho số lượng chồi mới hình thành thấp hơn
so với mẫu cấy 4 và 6 tuần tuổi
Như vậy, mẫu cấy chồi từ cây con 6 tuần tuổi có tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi cao, số lượng chồi mới hình thành cũng cao hơn mẫu cấy 4 tuần và
8 tuần tuổi (hình 1a, b, c) nên được lựa chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo nhằm tìm ra môi trường hiệu quả cho việc nhân giống cây hoa salem
Ảnh hưởng của cytokinin lên sự tạo chồi
Bảng 2 Ảnh hưởng của kinetin đến sự tạo chồi của mẫu cấy là chồi từ cây con 6 tuần tuổi
BA
(mg/l)
Kinetin
(mg/l)
Tỉ lệ tạo chồi (%)
Số lượng chồi/mẫu
Tỉ lệ tạo chồi (%)
Số lượng chồi/mẫu
Tỉ lệ tạo chồi (%)
Số lượng chồi/mẫu
Các chữ cái a, b, c thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan
Sau 8 tuần khảo sát trên môi trường bổ sung
chất điều hòa sinh trưởng thực vật là BA cảm
ứng tạo chồi không hiệu quả Tỷ lệ mẫu cấy tạo
chồi và số lượng chồi trên một mẫu cấy cao
nhất ở các môi trường có bổ sung 0,2 mg/l BA
nhưng với tỷ lệ tạo chồi và số lượng chồi trung
bình đều thấp (20,00% và 1,27 chồi/mẫu cấy),
không có sự khác biệt về mặt thống kê so với
mẫu đối chứng (hình 1i)
Kết quả thể hiện ở bảng 2 cho thấy, kinetin
có hiệu quả cao trong sự tạo chồi cây hoa salem
Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi và số lượng chồi tăng
dần khi nồng độ kinetin tăng, đặc biệt trong khoảng nồng độ từ 2 đến 5 mg/l Nghiệm thức bổ sung 1 mg/l kinetin cho kết quả tạo chồi thấp và
tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi chỉ đạt 13,33% Các nồng
độ còn lại có hiệu quả tạo chồi cao hơn đặc biệt
là kinetin nồng độ 5 mg/l (5,73 chồi/mẫu cấy) và
tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi 100% sau 8 tuần nuôi cấy Tuy nhiên nồng độ kinetin 5 mg/l là nồng độ cao,
có thể gây ra những biến dị không mong muốn, khi quan sát mẫu cấy cũng phát hiện có những biểu hiện bất thường về hình thái Ở nghiệm thức
sử dụng 4 mg/l kinetin, số lượng chồi tạo thành
Trang 4trên một mẫu cấy ban đầu là 5,60 chồi/mẫu cấy,
khác biệt không có ý nghĩa với kinetin nồng độ 5
mg/l (5,73 chồi/mẫu cấy) và tỉ lệ tạo chồi cũng
đạt 100%
Trong nghiên cứu về nhân giống cây
Limonium cavanillesii Erben của Amo-Marco et
al (1998) [1], kinetin là loại cytokinin có kết
quả nhân chồi tốt nhất với khoảng nồng độ từ 2
đến 5 mg/l Trong báo cáo này, tác giả cũng
khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự nhân chồi
của mẫu cấy và cho kết quả cao nhất trong
khoảng nồng độ BA là 0,1 đến 0,5 mg/l nhưng
kết quả này thấp hơn trên môi trường bổ sung
kinetin nồng độ từ 2 đến 5 mg/l Ở các nồng độ
BA cao hơn mà tác giả khảo sát (1; 2; 5 mg/l)
cho tỷ lệ tạo chồi và số chồi trung bình giảm
Tomoko Igawa et al (2002) [3] cũng sử dụng
BA trong nghiên cứu tái sinh cây từ nuôi cấy tế
bào cây Limonium sinuatum Mill ở nồng độ 0,1
và 1,0 mg/l nhưng chồi chỉ hình thành mới trên
môi trường bổ sung 0,1 mg/l BA với tỷ lệ tạo
chồi chỉ đạt 3,3% và số chồi mới hình thành
trung bình là 0,3 chồi Trong kết quả của Jeong
et al (2001) [4] khi khảo sát ảnh hưởng của một
số cytokinin riêng lẻ và kết hợp với auxin lên sự
tạo chồi của cây Limonium sinuatum cũng cho
thấy BA riêng lẻ cảm ứng tốt hơn ở nồng độ thấp 1,11 µM (tương ứng 0,25 mg/l) và giảm dần khi tăng nồng độ BA lên Ở nồng độ 8,88
µM BA (tương ứng 2 mg/l) thì không có chồi mới được hình thành Báo cáo này cũng cho thấy BA không hiệu quả trong cảm ứng sự nhân chồi trên đối tượng này
Như vậy các báo cáo trên đều cho thấy với
đối tượng là Limonium sinuatum thì BA riêng lẻ
chỉ có thể cảm ứng tạo chồi ở nồng độ thấp nhưng không hiệu quả vì tỷ lệ tạo chồi và số lượng chồi hình thành đều ít và thấp hơn các chất cảm ứng khác cùng khảo sát Điều này phù hợp với số liệu mà chúng tôi đã thu nhận được
là BA không thích hợp để cảm ứng với đối tượng này, kinetin cảm ứng tạo chồi hiệu quả ở nồng độ 4 và 5 mg/l Do đó chúng tôi chọn kinetin nồng độ 4 mg/l để tiếp tục các thí nghiệm tiếp theo
Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa cytokinin và auxin lên sự tạo chồi
Bảng 3 Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa auxin và 4 mg/l kinetin lên sự tạo chồi của mẫu cấy là
chồi từ cây con 6 tuần tuổi
Kinetin
(mg/l)
IBA 2,4-D NAA
Tỉ lệ tạo chồi (%)
Số lượng chồi/
mẫu
Tỉ lệ tạo chồi (%)
Số lượng chồi/
mẫu
Tỉ lệ tạo chồi (%)
Số lượng chồi/ mẫu
4 0,05 - - 66,67b 2,67a 100,00a 4,07c 100,00a 5,27d
4 0,1 - - 66,67b 1,93ab 86,67bc 3,33c 100,00a 5,07d
4 0,2 - - 60,00bc 2,20ab 86,67bc 3,73c 93,33ab 4,93d
4 - 0,05 - 53,33cd 1,80ab 80,00cd 3,47c 93,33ab 5,20d
4 - - 0,05 46,67de 1,67b 86,67bc 3,87c 86,67b 4,20d
4 - - 0,1 53,33cd 1,87ab 93,33ab 3,40c 100,00a 4,73d
4 - - 0,2 60,00bc 2,20ab 80,00cd 3,40c 100,00a 4,47d Các chữ cái a, b, c thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan
Trang 5Auxin khi kết hợp với cytokinin sẽ giúp sự
tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới
mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô Gaspar et
al (2003) [2] cho rằng các thí nghiệm tạo chồi
bất định thường cho kết quả cao khi sử dụng
cytokinin nồng độ cao và auxin nồng độ từ thấp
đến trung bình Do đó, các auxin trong thí
nghiệm này được sử dụng ở nồng độ thấp nhằm
khảo sát tác động của sự phối hợp giữa auxin và
kinetin trên sự tạo chồi cây hoa salem
Sau 8 tuần khảo sát trên các môi trường bổ
sung auxin với loại và nồng độ khác nhau, hiệu
quả tạo chồi cao nhất lần lượt ở các nghiệm
thức có 0,05 mg/l IBA (5,27 chồi/mẫu cấy),
0,05 mg/l 2,4-D (5,20 chồi/mẫu cấy) và 0,1
mg/l NAA (4,73 chồi/mẫu cấy) (bảng 3) Tuy
nhiên, số lượng chồi tạo thành trung bình trên
một mẫu cấy ban đầu ở các môi trường này đều
thấp hơn môi trường chỉ bổ sung kinetin riêng lẻ
và các sự khác biệt này là không có ý nghĩa
Như vậy, khi kết hợp với 4 mg/l kinetin thì sự
hiện diện của auxin không giúp nâng cao hiệu
quả tạo chồi của cây hoa salem
IBA là loại auxin có độ bền không cao, sau
30 ngày ngoài sáng nồng độ IBA có thể giảm đi
60% [7] Trong khi đó, khi quan sát nhận thấy
mẫu cấy chồi cây salem có biểu hiện đáp ứng
tạo chồi dưới tác động của chất điều hòa sinh
trưởng thực vật sau 3 tuần nuôi cấy Như vậy,
mẫu cấy cần thời gian cảm ứng dài và trong
khoảng thời gian này IBA có thể đã bị giảm hoạt tính nên tác động của IBA đến mẫu cấy không rõ rệt
Trên môi trường có sự hiện diện của 2,4-D,
có sự hình thành các mô sẹo nhỏ ở cuống lá, nơi tiếp xúc với môi trường nuôi cấy (hình 1e) Mô sẹo khi mới xuất hiện có màu trắng, sau đó bị nâu hóa 2,4-D là một loại auxin mạnh, có vai trò quan trọng trong sự kích thích sự phân chia của tế bào tạo mô sẹo Tuy vậy, số lượng mô sẹo hình thành trong thí nghiệm này ít do 2,4-D chỉ được sử dụng với nồng độ thấp
Về hình thái mẫu cấy, các chồi mới tạo thành
ở tất cả các môi trường bổ sung auxin đều có kích thước lớn hơn các chồi được tạo thành trên môi trường chỉ bổ sung 4 mg/l kinetin Trong đó, chiều cao của chồi mới hình thành trên môi trường bổ sung NAA lớn hơn chồi trên môi trường có bổ sung IBA hay 2,4-D (Hình 1d, e, f)
Ở nhiều loài thực vật, việc kết hợp auxin ở nồng
độ thấp với cytokinin giúp nâng cao hiệu quả tạo chồi Nhưng trong nghiên cứu này, với cả 3 loại auxin đã được tiến hành khảo sát là 2,4-D, NAA
và IBA thì kết quả đều không có sự khác biệt hoặc thấp hơn so với khi sử dụng kinetin riêng lẻ Tuy nhiên, việc sử dụng auxin kết hợp với kinetin giúp các chồi mới hình thành có kích thước lớn, dễ tách ra thành từng chồi riêng biệt
để chuyển sang môi trường tạo rễ
Ảnh hưởng của GA 3 lên sự tạo chồi
Bảng 4 Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa GA3 và 4 mg/l kinetin lên sự tạo chồi của mẫu cấy là chồi
từ cây con 6 tuần tuổi
Kinetin
(mg/l)
GA3
(mg/l)
Tỉ lệ tạo chồi (%)
Số lượng chồi/ mẫu
Tỉ lệ tạo chồi (%)
Số lượng chồi/ mẫu
Tỉ lệ tạo chồi (%)
Số lượng chồi/ mẫu
Các chữ cái a,b,c… thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 05 theo phương pháp Duncan
Có nhiều kết quả khác nhau về tác động của
GA3 trên các đối tượng mẫu cấy khác nhau
Mẫu cấy thực vật nói chung tăng trưởng và phát
triển không cần đến sự hiện diện của gibberellin
trong môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, sự tăng trưởng của chồi từ đỉnh sinh trưởng và chồi bên cũng có thể gia tăng khi bổ sung thêm gibberellin Ở một số loài thực vật, acid
Trang 6gibberellic riêng lẻ cũng có thể cảm ứng sự tạo
chồi bất định như ở mô sẹo Ranunculus
scleratus hay thay thế cho vai trò của auxin
trong quá trình cảm ứng tạo chồi [7] Trong thí
nghiệm này, GA3 được bổ sung vào môi trường
nuôi cấy cùng với 4 mg/l kinetin nhằm khảo sát
tác động hỗ trợ của gibberellin với kinetin trong
sự cảm ứng tạo chồi ở cây hoa salem
Kết quả ghi nhận cho thấy môi trường cảm
ứng tạo chồi với sự hiện diện của 4 mg/l kinetin
và GA3 ở các nồng độ 3; 5; 7 và 10 mg/l đều
cho hiệu quả tạo chồi cao hơn trên môi trường
chỉ bổ sung kinetin riêng lẻ (Bảng 4) Kết quả
cao nhất trong thí nghiệm này là môi trường bổ
sung 10 mg/l GA3 (7,80 chồi/mẫu cấy) Các
chồi mới được tạo thành (Hình 1g) có kích
thước lớn hơn so với chồi trên môi trường chỉ
có kinetin (số liệu cụ thể không được đưa ra)
Từ những kết quả thu được trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy sự kết hợp giữa 4 mg/l kinetin và GA3 giúp tăng hệ số nhân chồi của cây hoa salem Số lượng chồi mới hình thành tăng theo sự gia tăng nồng độ của GA3 Không chỉ thu được số lượng chồi lớn hơn trên mỗi mẫu cấy mà kích thước chồi mới hình thành cũng gia tăng, chồi khỏe, dễ tách thành chồi đơn
Ảnh hưởng của adenine lên sự tạo chồi
Trong một số trường hợp, người ta thường phối hợp cytokinin với adenine để cảm ứng sự tạo chồi Trong các thí nghiệm nuôi cấy
Begonia, thuốc lá, cây du, Plumbago indica thì
chỉ cần một mình adenine cũng đủ cảm ứng tạo chồi (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên, 2006) [7]
Bảng 5 Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa adenine và 4 mg/l kinetin lên sự tạo chồi của mẫu cấy là
chồi từ cây con 6 tuần tuổi
Kinetin
(mg/l)
Adenine
(mg/l)
Tỉ lệ tạo chồi (%)
Số lượng chồi/ mẫu
Tỉ lệ tạo chồi (%)
Số lượng chồi/ mẫu
Tỉ lệ tạo chồi (%)
Số lượng chồi/ mẫu
Các chữ cái a, b, c thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan Kết quả thí nghiệm cho thấy sự kết hợp
giữa 4 mg/l kinetin với adenine giúp làm tăng
hiệu quả tạo chồi so với chỉ sử dụng kinetin
riêng lẻ (Bảng 5) Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi đạt
100% ở tuần nuôi cấy thứ 6 với tất cả các nồng
độ adenine khảo sát Số lượng chồi được tạo
mới cao hơn so với đối chứng khi kết hợp 4
mg/l kinetin với adenine nồng độ 5; 10 và 15
mg/l Trong đó, nồng độ adenine thích hợp nhất
là 10 mg/l với số lượng chồi trung bình hình
thành từ một mẫu cấy ban đầu là 9,73 chồi
Nồng độ adenine cao hơn 10 mg/l làm giảm khả
năng tạo chồi của mẫu cấy Chồi mới hình thành
có hình thái bình thường và kích thước lớn hơn
so với đối chứng ở tất cả các nồng độ (hình 1h)
Việc sử dụng kết hợp adenine với kinetin
cho kết quả tạo chồi tăng cao có thể được giải thích qua vai trò là tiền chất trong con đường sinh tổng hợp cytokinin của adenine Như vậy, việc bổ sung adenine vào môi trường kết hợp với kinetin làm tăng hiệu quả tạo chồi
KẾT LUẬN
Như vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi
đã xác định được mẫu cấy thích hợp cho mục
đích nhân chồi là chồi từ cây con in vitro 6 tuần
tuổi Ở các nồng độ kinetin khảo sát, kinetin nồng độ 4 mg/l thích hợp nhất cho sự tạo chồi
Sự hiện diện của các loại auxin IBA, 2,4-D và NAA ở các nồng độ 0,05; 0,1 và 0,2 mg/l đều không làm tăng hiệu quả tạo chồi nhưng giúp gia tăng kích thước chồi mới tạo thành so với
Trang 7môi trường chỉ bổ sung 4 mg/l kinetin Adenine
và gibberellin đều có tác động kích thích sự tạo
chồi khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy
kết hợp với 4 mg/l kinetin Không chỉ giúp nâng
cao số lượng chồi mới, cả 2 chất này đều thúc
đẩy sự tăng trưởng của chồi mới
Lời cảm ơn: Nhóm tác giả xin chân thành cảm
ơn Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa và Phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Sinh học nhiệt đới
đã hỗ trợ trang thiết bị để hoàn thành đề tài này
Hình 1 Sự tạo chồi từ mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy (thang đo 1cm)
a Mẫu cấy 4 tuần tuổi trên môi trường MS + 4 mg/l kinetin; b Mẫu cấy 6 tuần tuổi trên môi trường MS + 4 mg/l kinetin; c Mẫu cấy 8 tuần tuổi trên môi trường MS + 4 mg/l kinetin; d 4 mg/l kinetin + 0,05 mg/l IBA;
e 4 mg/l kinetin + 0,05 mg/l 2,4-D; f 4 mg/l kinetin + 0,1 mg/l NAA; g 4 mg/l kinetin + 10 mg/l gibberellin;
h 4 mg/l kinetin + 10 mg/l adenine; i 0,2 mg/l BA
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Amo-Marco J B and Ibanez M R., 1998
Micropropagation of Limonium cavanillesii
Erben, a threatened statice,from
inflorescence stems Plant Growth Regul.,
24: 49-54
2 Gaspar T., Kevers C., Faivre-Rampant O.,
Crèvecoeur M., Penel C., Gerppin H and
Dommes J., 2003 Changing concept in
plant hormone action In Vitro Cell Dev Pl.,
39(2):85-106
3 Igawa T., Hoshina Y and Mii M., 2002
Effcient plant regeneration from cell
cultures of ornamental Statice, Limonium
sinuatum Mill In Vitro Cell Dev Pl., 38:
157-162
4 Jeong J H., Murthy H N and Paek K Y.,
2001 High frequency adventitious shoot induction and plant regeneration from leaves of statice Plant Cell Tiss Org., 65: 123-128
5 Morgan E R., Burge G K., Seelye J F., Hopping M E and Grant J E., 1998 Production of interspecific hybrids between
Limonium perezii (Stapf) Hubb and Limonium sinuatum (L.) Mill Euphytica.,
102: 109-115
Trang 86 Murashige T and Skoog F., 1962 A revised
medium for rapid growth and Bio-assays
with tobacco tissue cultures Phys Plant, 15:
473-497
7 Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên,
2006 Công nghệ tế bào Nxb Đại học quốc
gia tp Hồ Chí Minh
8 Phạm S., 2007 Những giải pháp mở rộng
thị trường tiêu thụ sản phẩm hoa cắt cành ở
Đà Lạt - Lâm Đồng: 333-339 Hội nghị khoa học Công nghệ sinh học thực vật trong công tác nhân giống và chọn tạo giống hoa Nxb Nông nghiệp, Hà Nội
9 Tsu-Hwie A L., Nai-Wen H and Rey-Yuh W., 2005 Control of leaf-tip necrosis of micropropagated ornamental Satice by
elimination of endophytic bacteria In Vitro
Cell Dev Pl., 41: 546-549
HIGH FREQUENCY SHOOT REGENERATION OF DARK BLUE STATICE
(Limonium sinuatum L Mill) BY COMBINING PHYTOHORMONES
WITH ADENINE IN IN VITRO CULTURE
Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien
Ho Chi Minh city University of Technology SUMMARY
In the purpose of optimizing the micropropagation of dark blue Statice (Limonium sinuatum L Mill), the
appropriate age of explants, the effects of phytohormones, GA3 and adenine on Statice shooting were studied
MS medium (Murashige and Skoog, 1962) with 100 mg/l myo-inositol, 30 g/l saccharose, 6 g/l agar was used
in all experiments The cultures were in 16h photoperiod, light intensity of 2800 lux and at a temperature of
25 ± 2ºC The best suitable explants were shoots from six-week seedlings in vitro In the influence of
cytokinin, 4 mg/l kinetin was the best result for statice shooting (5.6 shoots per explant) after 8 weeks of culture The number of shoots per explant on MS medium supplemented with 4 mg/l kinetin and auxin (IBA, NAA or 2,4-D) was lower than MS medium with 4 mg/l kinetin but the size of shoots was raised The presence of GA3/adenine increased shoot sprouting The combination of 4 mg/l kinetin with 10 mg/l GA3 or
10 mg/l adenine raised the number of shoots per explant (7.8 and 9.73 shoots per explant, respectively) after 8 weeks of culture
Keywords: Limonium sinuatum, 2,4-D, adenine, BA, GA3, IBA, kinetin, NAA
Ngày nhận bài: 21-6-2012