Tế bào gốc phôi bò hiện nay được phân lập và nuôi cấy ở giai đoạn phôi nang từ 7-9 ngày hoặc giai đoạn phôi từ 12-14 ngày. Bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào gốc phôi bò ở giai đoạn phôi dâu và phôi nang. Kết quả 9 phôi dâu và 3 phôi nang giai đoạn sớm đã được thử nghiệm nuôi cấy phôi nguyên cho thiết lập tế bào gốc phôi. Tuy nhiên, các blastomere trong 9 phôi dâu không thể bám vào lớp tế bào nuôi dưỡng và phát triển, chỉ có 1 trong 3 phôi nang giai đoạn sớm bám được vào lớp tế bào nuôi dưỡng và phát triển thành quần thể tế bào gốc phôi bò. Quần thể tế bào gốc phôi bò sơ cấp được cấy chuyền 2 lần. Ở lần cấy chuyền thứ nhất, 6 quần thể tế bào gốc phôi được quan sát thấy và kích thước các quần thể này dao động từ 50-100 µm. Chỉ có 2 trong 6 quần thể tế bào ở lần cấy chuyển thứ nhất duy trì được hình thái của quần thể tế bào gốc phôi. Ở lần cấy chuyền thứ hai, 5 quần thể tế bào gốc phôi được quan sát và kích thước các quần thể này dao động từ 70-140 µm. Các quần thể tế bào gốc phôi bò trên đều có đường bao quanh rõ tuy nhiên bề mặt của các quần thể này không trơn bóng như quần thể tế bào gốc phôi chuột. Cả 5 quần thể tế bào gốc phôi bò ở lần cấy chuyền thứ 2 bị thoái hoá chỉ sau một tuần nuôi cấy. Tế bào gốc phôi bò được thử nghiệm biệt hoá in vitro và chúng có khả năng biệt hoá thành thể phôi. Đây là một đặc điểm quan trọng cho thấy tế bào gốc phôi bò thu được có tính đa tiềm năng.
Trang 1NGHIÊN CỨU THU NHẬN, NUÔI CẤY VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM
HÌNH THÁI QUẦN THỂ TẾ BÀO GỐC PHÔI BÒ VIỆT NAM
Lê Thành Long * , Đoàn Thị Hồng Hạnh, Nguyễn Thị Hồng Vân, Hoàng Nghĩa Sơn
Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)lelong2510@gmail.com
TÓM TẮT: Tế bào gốc phôi bò hiện nay được phân lập và nuôi cấy ở giai đoạn phôi nang từ 7-9 ngày
hoặc giai đoạn phôi từ 12-14 ngày Bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào gốc phôi bò ở giai đoạn phôi dâu và phôi nang Kết quả 9 phôi dâu và 3 phôi nang giai đoạn sớm đã được thử nghiệm nuôi cấy phôi nguyên cho thiết lập tế bào gốc phôi Tuy nhiên, các blastomere trong 9 phôi dâu không thể bám vào lớp tế bào nuôi dưỡng và phát triển, chỉ có 1 trong 3 phôi nang giai đoạn sớm bám được vào lớp tế bào nuôi dưỡng và phát triển thành quần thể tế bào gốc phôi bò Quần thể tế bào gốc phôi
bò sơ cấp được cấy chuyền 2 lần Ở lần cấy chuyền thứ nhất, 6 quần thể tế bào gốc phôi được quan sát thấy và kích thước các quần thể này dao động từ 50-100 µm Chỉ có 2 trong 6 quần thể tế bào ở lần cấy chuyển thứ nhất duy trì được hình thái của quần thể tế bào gốc phôi Ở lần cấy chuyền thứ hai, 5 quần thể
tế bào gốc phôi được quan sát và kích thước các quần thể này dao động từ 70-140 µm Các quần thể tế bào gốc phôi bò trên đều có đường bao quanh rõ tuy nhiên bề mặt của các quần thể này không trơn bóng như quần thể tế bào gốc phôi chuột Cả 5 quần thể tế bào gốc phôi bò ở lần cấy chuyền thứ 2 bị thoái hoá chỉ sau một tuần nuôi cấy Tế bào gốc phôi bò được thử nghiệm biệt hoá in vitro và chúng có khả năng biệt hoá thành thể phôi Đây là một đặc điểm quan trọng cho thấy tế bào gốc phôi bò thu được có tính đa tiềm năng
Từ khóa: Phôi bò, đa tiềm năng, nuôi cấy phôi nguyên, tế bào gốc phôi
MỞ ĐẦU
Tế bào gốc phôi (embryonic stem cells -
ESCs) là những tế bào đa tiềm năng thường
được thu nhận từ phôi nang (blastocyst) giai
đoạn tiền làm tổ (pre-implantation) Chúng có
khả năng tự làm mới (re-newal) để tạo thành
một số lượng lớn tế bào mà không thay đổi đặc
tính đa tiềm năng và có khả năng biệt hóa thành
các loại tế bào khác nhau trong cơ thể [5]
Chúng biểu hiện các makers hay các đặc tính
chuyên biệt bao gồm các kháng nguyên đặc
hiệu cho giai đoạn phôi, sự hoạt động của các
enzyme như alkaline phosphatase và telomerase
cũng như gene đặc trưng cho tính đa tiềm năng
như Oct4 và Nanog [1] Hơn nữa, chúng có khả
năng biệt hoá in vivo thành khối u quái
(teratomas), các khối u này chứa các tế bào có
đặc điểm giống như các tế bào trong ba lớp
mầm phôi: nội bì, trung bì, ngoại bì và chúng có
khả năng biệt hóa in vitro trực tiếp thành 200
loại tế bào khác nhau trong cơ thể trưởng thành
[12] Các dòng tế bào gốc phôi đã được phân
lập thành công từ phôi nang của chuột, khỉ và
người, hơn nữa việc thu nhận còn có thể được
thực hiện từ phôi ở giai đoạn trước khi compact
[4, 3, 18] Hầu hết những cố gắng phân lập và
nuôi cấy tế bào gốc phôi bò được thực hiện ở phôi nang giai đoạn ngày 7-9 [172,11, 9] hoặc
có thể phân lập từ phôi giai đoạn ngày thứ
12-14 [6] Tuy nhiên, thời gian tối ưu cho viêc phát triển phôi giai đoạn tiền làm tổ để thu nhận tế bào gốc phôi vẫn còn chưa biết rõ Những cố gắng thu nhận tế bào gốc phôi bò từ hợp tử và phôi phân chia giai đoạn sớm hầu hết đều thất bại [18, 8], trong đó chỉ có một dòng tế bào tế bào gốc phôi bò duy nhất được tăng sinh từ phôi giai đoạn hai tế bào, được nuôi cấy hơn 3 năm [8] Trong khi đó, phôi bò giai đoạn phôi dâu được sử dụng cho việc phân lập tế bào gốc phôi
có hiệu quả hình thành các quần thể từ 60-70% [17,18] Cho đến nay, các dòng tế bào gốc phôi
bò vẫn chưa được thiết lập một cách bền vững
và một số đặc điểm hình thái của quần thể tế bào gốc phôi bò chưa được đánh giá một cách đầy đủ Do đó, trong công trình này, chúng tôi bước đầu nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào gốc phôi bò Việt Nam ở một số giai đoạn khác nhau, đồng thời đánh giá khả năng tăng sinh cũng như đặc điểm hình thái của một số quần thể tế bào gốc phôi bò
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trang 2Nuôi chín trứng bò
Trứng bò được thu nhận từ lò mổ sau đó
được chuyển về phòng thí nghiệm Phức hợp
trứng-cumulus (Cumulus - Oocyte complex)
được thu nhận bằng phương pháp chọc hút
Phức hợp trứng-cumulus được nuôi trong môi
trường TCM199 (Sigma) bổ sung 20% FBS
(Gibco), 1% Pen/Strep (Gibco), 2 µg/ml
β-estradiol (Sigma), 10IU FSH (Sigma) và 10IU
LH (Sigma) ở 38,5oC, 5% CO2 trong vòng
22-24 giờ
Thụ tinh in vitro trứng bò
Trứng sau khi được nuôi chín sẽ được sử
dụng cho thụ tinh in vitro Tinh trùng được
swim-up trong môi trường TALP-HEPES (chứa
2 mM sodium pyruvate, 1% pen/strep và
3mg/ml BSA) trong 1 giờ ở 38,5oC Trứng được
thụ tinh với tinh trùng trong vi giọt thụ tinh với
mật độ 1 × 106 tinh trùng/ml Quá trình thụ tinh
được diễn ra ở 38,5oC, 5% CO2 trong 8 giờ Sau
đó trứng thụ tinh sẽ được loại bỏ tinh trùng và
được nuôi cấy trong môi trường nuôi phôi sofa
ở 38,5oC, 5% CO2
Chuẩn bị lớp tế bào nuôi dưỡng
Tế bào nuôi dưỡng (nuôi dưỡng cells) được
sử dụng trong nghiên cứu này là nguyên bào sợi
phôi chuột được phân lập và nuôi cấy từ thai
chuột nhắt trắng 12,5-13,5E Nguyên bào sợi
phôi chuột ở lần cấy chuyển thứ 2 sẽ được sử
dụng làm tế bào nuôi dưỡng Nguyên bào sợi
phôi chuột được bất hoạt bằng mitomycin C 10
µg/ml trong vòng 2,5 giờ Sau đó nguyên bào
sợi phôi chuột được rửa lại bằng môi trường
nuôi cấy tế bào gốc phôi 2 lần mỗi lần 10 phút
Loại bỏ màng zona
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thử
nghiệm loại bỏ màng zona của phôi bò bằng hai
yếu tố là enzyme pronase (Sigma) và acid
tyrode pH 2,5 (Gibco) Phôi bò giai đoạn 8-16
tế bào sẽ được dùng cho khảo sát nồng độ
enzyme pronase cũng như acid tyrode trong
việc loại bỏ màng zona
Nuôi cấy phôi nguyên
Phôi bò giai đoạn morula và giai đoạn
blastocyst sớm được xử lý loại bỏ màng zona
Phôi đã loại bỏ màng zona được chuyển lên đĩa
chứa tế bào nuôi dưỡng bị bất hoạt bởi mitomycin C Phôi nguyên sẽ được nuôi cấy trong môi trường tế bào gốc phôi Knock-out DMEM (Gibco) chứa 20% Knock-out Serum Replacement (Gibco), 1% pen/strep (Gibco), 200
µM mercaptoethanol (Sigma), 1% L-glutamine (Gibco), 1000 IU/ml LIF, 1% Non-essencial amino acid (Gibco), 1% nucleoside (0,73 g/L cytidine, 0,85 g/L guanosine, 0,73 g/L Uridine, 0,8 g/L adenosine, 0,24 g/L thymidine)
Cấy chuyền tế bào gốc phôi bò
Quần thể tế bào gốc phôi được thu nhận bằng ống mao quản, sau đó được chuyển vào đĩa 96 giếng chứa Trypsin-EDTA 0,25% (Gibco) Khi tách rời hoàn toàn, các tế bào sẽ được chuyển vào đĩa nuôi mới chửa lớp tế bào nuôi dưỡng bị bất hoạt bởi mitomycin C Tế bào được nuôi trong môi trường nuôi tế bào gốc phôi ở 38,5oC, 5% CO2
Thử nghiệm biệt hoá in vitro
Quần thể tế bào gốc phôi được tách bằng Trypsin-EDTA 0,25% thành tế bào đơn, sau đó các tế bào này được nuôi cấy trong đĩa petri với môi trường nuôi cấy tế bào gốc phôi không chứa LIF Thể phôi có cấu trúc hình cầu sẽ xuất hiện sau 1-2 tuần nuôi cấy
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Đánh giá hiệu quả loại bò màng zona bằng pronase và acid tyrode
Trong việc tạo phôi bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm, chỉ những phôi không có
sự phân mảnh được chọn lọc cho quá trình nuôi phôi Những phôi bị phân mảnh bị loại bỏ Quá trình phân mảnh của phôi là một đặc điểm hình thái của quá trình apoptosis và quá trình này ảnh hưởng lớn tới sự phát triển của phôi cũng như việc thiết lập các dòng tế bào gốc phôi
Để nuôi cấy tế bào gốc phôi, việc loại bỏ màng zona rất quan trọng cho việc thu nhận phôi ở các giai đoạn khác nhau [15] Các cách phổ biết nhất hiện nay để loại bỏ màng zona của phôi là sử dụng acid tyrode, sử dụng enzyme hoặc sử dụng hệ thống hỗ trợ laser Tuy nhiên, ở đối tượng gia súc đặc biệt là ở bò, phương pháp phổ biến nhất để loại bỏ màng zona là sử dụng enzyme pronase
Trang 3Trong bài báo này, enzyme pronase được sử
dụng ở các nồng độ khác nhau để kiểm tra khả
năng loại bỏ màng zona của phôi bò Chúng tôi
sử phôi phôi bò ở giai đoạn 8 tế bào đến 16 tế
bào để kiểm tra khả năng này của enzyme
pronase Kết quả xử lý loại bỏ màng được trình
bày trong bảng 1
Kết quả xử lý cho thấy, ở nồng độ 10
mg/ml, màng zona của phôi bò bị loại bỏ nhanh
chỉ sau 1 phút Tuy nhiên, màng zona chỉ bị loại
bỏ một nửa đủ để phôi thoát ra ngoài Quá trình
loại bỏ màng zona ở nồng độ 10 mg/ml diễn ra
nhanh nhưng nó lại ảnh hưởng lớn tới các tế bào
phôi bên trong Cấu trúc phôi bị thay đổi mạnh,
liên kết giữa các tế bào phôi bị cắt và các tế bào
phôi này rất dễ rời nhau (hình 1A, 1A1) Ở nồng
độ 0,5 mg/ml, màng zona của phôi bị loại bỏ
hoàn toàn sau 7 phút Quá trình loại bỏ này diễn
ra lâu, phôi có hiện tượng bị biến dạng (hình
1C, 1C1) Điều đó cho thấy, ở nồng độ này,
enzyme pronase cũng tác động lớn tới các tế
bào phôi bên trong vì thời gian xử lý lâu,
pronase cắt đứt các liên kết giữa các tế bào
phôi, làm tách rời các tế bào phôi và phôi bị
biến dạng Ở nồng độ 5 mg/ml, màng zona của
phôi bò bị loại bỏ sau 3 phút, phôi gần như vẫn
giữ nguyên được cấu trúc và hình dạng giống
như trước khi xử lý (hình 1B, 1B1) Các tế bào
phôi gần như không tách rời nhau Điều đó cho
thấy, nồng độ pronase 5 mg/ml là thích hợp nhất
cho việc loại bỏ màng zona, thời gian xử lý ở
nồng độ này ngắn mà phôi gần như không bị
thay đổi cấu trúc, hình dạng, tế bào phôi không
bị tách rời, đây là những điều kiện rất quan
trong cho việc phân lập và nuôi cấy tế bào gốc
phôi bò
Acid tyrode pH 2,5 (Gibco) được sử dụng
rất phổ biến trong việc loại bỏ màng zona của
trứng, phôi chuột hay heo và trong việc thu
nhận và nuôi cấy tế bào gốc phôi từ hai đối tượng này, acid tyrode là hóa chất được sử dụng phổ biến nhất [13] Trong nghiên cứu này, acid tyrode cũng được sử dụng để thử nghiệm loại
bỏ màng zona của phôi bò Tuy nhiên, sau khi
xử lý với acid tyrode 30 phút, cấu trúc và hình thái màng zona gần như không biến đổi (hình 1D, 1D1) Điều đó cho thấy, acid tyrode không hiệu quả trong việc loại bỏ màng zona của phôi
bò Hơn nữa, thời gian sử lý với acid tyrode rất lâu nên nó có thể ảnh hưởng tới chất lượng và
sự phát triển của phôi bò
Hình 1 Quá trình xử lý loại bỏ màng zona của
phôi [A, A1] phôi bò trước và sau khi xử lý với pronase
10 mg/ml; [B, B1] phôi bò trước và sau khi xử lý với pronase 5 mg/ml; [C, C1] phôi bò trước và sau khi xử lý với pronase 0,5 mg/ml; [D, D1] phôi bò trước và sau khi xử lý với acid tyrode pH 2,5
Bảng 1 Kết quả loại màng zona bằng pronase and acid tyrode
Tác nhân loại màng Số phôi dùng cho
loại màng zona Số phôi được loại màng zona
Trang 4Nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc phôi bò
Quá trình phân lập và nuôi cấy được thực
hiện với phôi dâu và phôi nang giai đoạn sớm
Phôi được xử lý với pronase 5 mg/ml để loại bỏ
màng zona Sau đó, phôi được rửa nhiều lần
bằng môi trường nuôi cấy tế bào gốc phôi và
được chuyển lên đĩa nuôi cấy có chứa tế bào
nuôi dưỡng đã bất hoạt bằng mitomycin C để
nuôi cấy sơ cấp Trong nuôi cấy sơ cấp, nhân tố
ức chế bệnh bạch cầu (LIF-leukemia inhibitory
factor) được sử dụng ở nồng độ 1.000 IU/ml
môi trường nuôi cấy Nồng độ LIF này được sử
dụng để bước đầu đánh giá khả năng phát triển
của quần thể tế bào gốc phôi bò trong quá trình
nuôi cấy sơ cấp cũng như sự tăng sinh của tế
bào gốc phôi bò sau các lần cấy chuyền khác
nhau Kết quả nuôi cấy phôi nguyên cho thấy,
các blastomere của phôi dâu không thể bám và
tăng sinh trên lớp tế bào nuôi dưỡng (bảng 2)
Ba phôi nang giai đoạn sớm được nuôi cấy trên
lớp tế bào nuôi dưỡng Tuy nhiên, các tế bào
trong 2 phôi đầu tiên không thể bám vào lớp
nuôi dưỡng và bị thoái hóa sau 1 tuần nuôi cấy
Chỉ có 1 quần thể tế bào từ phôi thứ ba bám
được vào lớp tế bào nuôi dưỡng và phát triển
thành quần thể tế bào gốc phôi bò sau 3 tuần
nuôi cấy Quần thể tế bào gốc phôi bò này có
đường bao quanh rõ nhưng hình thái quần thể
hơi gồ ghề, không trơn nhẵn như quần thể tế
bào gốc phôi chuột Sau 3 tuần nuôi cấy, quần
thể tế bào gốc phôi bò này được thu nhận và các
tế bào được tách rời thành tế bào đơn cho cấy
chuyền Các tế bào này được chuyển lên lớp tế
bào nuôi dưỡng mới để nuôi cấy Quá trình này
được thực hiện để đánh giá khả năng tăng sinh
của quần thể tế bào gốc phôi bò
Đánh giá khả năng tăng sinh của tế bào gốc phôi bò bằng cấy chuyền
Các tế bào gốc phôi bò được nuôi cấy trên lớp tế bào nuôi dưỡng và phát triển trong môi trường chứa LIF 1.000 IU/ml Sau 48 giờ nuôi cấy, sáu quần thể tế bào gốc phôi bò hình thành
và phát triển trên lớp tế bào nuôi dưỡng Quần thể tế bào gốc phôi bò trên phát triển mạnh, số lượng tế bào tăng nhanh Tuy nhiên, một số tế bào vùng ngoài của quần thể tế bào gốc phôi bò biệt hoá và mọc lan trên bề mặt đĩa nuôi cấy cũng như mọc chồng lên lớp tế bào nuôi dưỡng Hình thái các quần thể tế bào gốc phôi bò ở lần cấy chuyền thứ nhất cũng không trơn nhẵn như hình thái của quần thể tế bào gốc chuột, tuy nhiên, các quần thể trên đều có đường bao quanh rất rõ Đó là một đặc điểm phân biệt quần thể tế bào gốc phôi với các cụm tế bào do nhiều
tế bào kết cụm lại với nhau [7] Kích thước của các quần thể tế bào gốc phôi bò này dao động từ
30 µm cho tới 60 µm (hình 2) Kích thước các quần thể tế bào gốc phôi ở lần cấy chuyền thứ nhất này không đồng đều Điều đó chứng tỏ số lượng tế bào gốc phôi trong mỗi quần thể khác nhau, do đó, khả năng tăng sinh của các tế bào gốc phôi bò trong quần thể tế bào nuôi cấy sơ cấp khác nhau
Các quần thể này tiếp túc tăng sinh và phát triển sau 96 giờ nuôi cấy Kích thước của các quần thể tế bào gốc phôi bò tiếp tục tăng Kích thước các quần thể dao động từ 50 µm cho tới
100 µm Kết quả này cho thấy, các tế bào gốc phôi trong các quần thể tế bào gốc phôi ở lần cấy chuyền thứ nhất vẫn còn khả năng tăng sinh mạnh
Hình 2 Sự phát triển của các quẩn thể tế bào gốc phôi bò trên lớp tế bào nuôi dưỡng ở lần cấy
chuyển thứ nhất sau 48 giờ nuôi cấy Thang chia độ 100 µm
Trang 5Sau 1 tuần nuôi cấy, các quần thể 1, 2, 3, 5
của lần cấy chuyền thứ nhất bị thoái hoá
Hình thái của các quần thể này chuyển từ dạng
ụ (hill) sang dạng phẳng (flat), điều đó chứng tỏ
các tế bào trong các quần thể này đã biệt hóa
Chỉ còn lại quần thể số 4 và quần thể số 6
duy trì được hình thái giống quần thể tế bào gốc phôi
Quần thể số 4 được sử dụng cho cấy chuyền
và quần thể số 6 được sử dụng cho thử nghiệm khả năng biệt hoá của tế bào gốc phôi bò
Bảng 2 Khả năng tăng sinh của tế bào gốc phôi bò
Giai đoạn phôi Số phôi sử dụng nuôi
cấy tế bào gốc
Số phôi bám
Số quần thể cấy chuyền lần 1
Số quần thể cấy chuyền lần 2
Tế bào gốc phôi bò của quần thể thứ 4 được
thu nhận và cấy chuyền qua đĩa mới chứa lớp tế
bào nuôi dưỡng bị bất hoạt mitomycin C
Tế bào gốc phôi ở lần cấy chuyền thứ hai này
cũng được nuôi cấy và tăng sinh trên lớp tế bào
nuôi dưỡng được bất hoạt bởi mitomycin C và
môi trường chứa 1.000 IU/ml LIF Sau 96 giờ
nuôi cấy, năm quần thể tế bào gốc phôi bò ở lần
cấy chuyền thứ hai này hình thành và phát triển
Kích thước của các quần thể này dao động từ
70 µm cho tới 140 µm (hình 3) Nếu so với các
quần thể tế bào gốc phôi bò ở lần cấy chuyền
thứ nhất, các quần thể tế bào gốc phôi bò ở
lần cấy chuyền thứ hai này có kích thước lớn
hơn Tuy nhiên, về mặt hình thái, các quần thể
tế bào gốc ở lần cấy chuyền thứ hai này không đồng đều như các quần thể ở lần cấy chuyền thứ nhất Tuy vẫn có đường bao quanh
rõ, nhưng hình thái của các quần thể tế bào gốc
ở lần cấy chuyền thứ hai này gồ ghề hơn nhiều
và nhiều quần thể có hình thái biến dạng không còn tròn đều Quần thể tế bào gốc số 2 và
số 5 ở lần cấy chuyền thứ 2 này có bề mặt gồ ghề nhất, điều đó cho thấy các tế bào gốc trên
bề mặt cũng như tế bào xung quanh của quần thể này đã bắt đầu biệt hóa và không còn giữ được đặc tính tăng sinh mạnh của tế bào gốc phôi nữa
Hình 3 Sự phát triển của các quần thể tế bào gốc phôi bò trên lớp tế bào nuôi dưỡng ở lần cấy
chuyền thứ hai sau 96 giờ nuôi cấy Thang chia độ 100 µm
Cả năm quần thể tế bào gốc phôi bò ở lần
cấy chuyền thứ 2 đều bị thoái hóa sau 1 tuần
nuôi cấy Môi trường được sử dụng cho nuôi
cấy các quần thể tế bào gốc nói trên là môi
trường nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột chứa
1.000 IU/ml LIF Ở bò, LIF được dòng hóa và
sử dụng trong nuôi cấy, tuy nhiên, nó chưa được
thương mại hóa Do đó, hầu hết các nhà nghiên cứu sử dụng LIF người (hLIF) để bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho phôi bò và các quần thể tế bào gốc phôi bò vì chúng có trình tự tương đồng cao với trình tự LIF người Mặc dù vậy, việc sử dụng LIF người có thể ảnh hưởng lớn tới quá trình nuôi cấy tế bào gốc phôi bò đặc
Trang 6biệt là việc duy trì khả năng tự làm mới cũng
như tính đa tiềm năng của các quần thể tế bào
gốc phôi bò
Những nghiên cứu trước đây cho thấy rằng,
việc thiết lập tế bào gốc phôi bò có thể được
thực hiện bằng môi trường nuôi cấy không chứa
LIF [8] Hơn nữa, trong quá trình nuôi cấy phôi
bò, hLIF không làm gia tăng [16] hay giảm
cũng như không có tác động lên ICM trong phôi
nang của bò [10] Việc tăng sinh các quần thể tế
bào từ phôi bào không phụ thuộc vào việc bổ
sung LIF [20] Dựa vào các kết quả trên, LIF
dường như không đóng vai trò quan trọng trong
việc duy trì tính đa tiềm năng của tế bào gốc
phôi bò
Tuy nhiều nghiên cứu khác lại cho rằng LIF
cần thiết cho quá trình tăng sinh và duy trì tính
đa tiềm năng của tế bào gốc phôi bò [11], không
những vậy, LIF còn cần cho quá trình nuôi cấy
tế bào gốc phôi bò được phân lập từ phôi thụ
tinh trong ống nghiệm, phôi nhân bản vô tính
hay phôi trinh sản [7] LIF không chỉ
cần thiết cho việc duy trì khả năng tự làm mới,
nó còn cần thiết cho sự biểu hiện của các marker đa tiềm năng ở tế bào gốc phôi bò (Oct4, Nanog, SSEA1) cũng như duy trì đặc điểm hình thái đặc trưng của quần thể tế bào gốc phôi [15]
Các nghiên cứu về ảnh hưởng của LIF lên quá trình nuôi cấy tế bào gốc phôi bò cho thấy, cần phải có những sự khảo sát kĩ hơn về tác động của LIF lên sự tăng sinh của các tế bào gốc phôi bò Đặc biệt là nồng độ LIF cần cho nuôi cấy tế bào gốc phôi bò vì LIF ảnh hưởng trực tiếp đến sự tăng sinh và khả năng tự làm mới của tế bào gốc phôi bò, mà hình thái của các quần thể tế bào gốc phôi bò là đặc điểm đầu tiên để đánh giá
Thử nghiệm khả năng biệt hóa in vitro
Tế bào gốc phôi có khả năng biệt hoá thành nhiều loại tế bào khác nhau trong ba lớp mầm phôi, bao gồm nội phôi bì, trung phôi bì và ngoại phôi bì Khả năng biệt hóa này đều diễn
ra trong điều kiện in vitro và in vivo [19, 5, 14]
Hình 4 Sự hình thành thể phôi Các tế bào gốc phôi được tách rời và nuôi cấy
trên đĩa petri chứa môi trường không chứa LIF Hai thể phôi xuất hiện sau 2 tuần nuôi cấy
Các thể phôi có cấu trúc hình cầu (mũi tên trắng)
Quần thể tế bào gốc thứ 6 ở lần cấy chuyền
thứ nhất được thu nhận và tách thành tế bào đơn
trong đĩa 96 giếng chứa Trypsin-EDTA 0,25%
Sau đó, tế bào được chuyển qua các đĩa petri
chứa môi trường nuôi tế bào gốc phôi bò nhưng
không chứa nhân tố ức bạch cầu (LIF) Sau hai
tuần nuôi cấy, các thể phôi hình thành Các thể
phôi này có cấu trúc hình cầu, và được hình
thành do sự tăng sinh và biệt hoá từ các tế bào
gốc phôi bò Tuy nhiên, các thể phôi này có
kích thước khác nhau điều đó chứng tỏ sự tăng sinh cũng như khả năng biệt hoá của tế bào gốc phôi bò từ quần thể thu nhận là không đồng nhất Điều đó chứng tỏ, các tế bào trong quần thể được thu nhận có tính đa tiềm năng thông qua việc biệt hóa thành các thể phôi trong điều
kiện nuôi cấy in vitro
KẾT LUẬN
Bước đầu chúng tôi đã phân lập và nuôi cấy
Trang 7thành công quần thể tế bào gốc phôi bò Các
quần thể này biểu hiện một số đặc điểm của
quần thể tế bào gốc phôi và khả năng tăng sinh
qua các lần cấy chuyền
Lời cảm ơn: Chúng tôi chân thành cảm ơn Sở
Khoa học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh
đã hỗ trợ kinh phí cho chúng tôi thực hiện đề tài
này
TÀI LIỆU THAM KHÀO
1 Byrne J A., S M Mitalipov and D P
Wofl, 2006 Current progress with primate
Embryonic stem cell Curr Stem Cell Res
Ther., 1: 127-138
2 Cibelli J B., S.L Stice, P.J Golueke, J J
Kane and J Jerry, 1998 Transgenic bovine
chimeric offspring produced from somatic
cell-derived stemlike cells Nat Biotechnol.,
16: 642-646
3 Delhaise F., V Bralion, N Schuurbiers and
F Dessy, 1996 Establishment of an
embryonic stem cell line from 8-cell stage
mouse embryos Eur J Morphol., 34:
237-243
4 Eistetter H R., 1988 A mouse pluripotent
embryonal stem cell line stage-specifically
regulates expression of homeo-box
containing DNA sequences during
differentiation in vitro Eur J Cell Biol.,
45: 315-321
5 Evans M., Kaufman M H., 1981
Establishment in culture of pluripotential
cells from mouse embryos Nature, 292:
154-156
6 Gjorret J O and P Maddox-Hyttel, 2005
Attemps towards derivation and
establishment of bovine embryonic stem
cell-like cultures Reprod Fertil Dev., 17:
113-124
7 Wang Li, Duan Enkui, Sung Li-ying, Jeong
Byeong-Seon, Yang Xiangzhong, X Cindy
Tian, 2005 Generation and Characterization
of Pluripotent Stem Cells from Cloned
Bovine Embryos Biology of Reproduction,
73: 149-155
8 Mitalipova M., Beyhan Z., First N L.,
2001 Pluripotency of Bovine Embryonic
Cell Line Derived from Precompacting Embryos Cloning, 3: 59-67
9 Munoz M., A Rodriguez, C De Frutos, J
N Caamano, C Diez, N Facal, E Gomez,
2008 Convetional pluripotence markers are unspecific for bovine embryonic derived cell-lines Theriogenology, 69: 1159-1164
10 Rodrigues J L., Oliveira A T., Lopes R F., 2006 Gene expression and developmental competence of bovineembryos produced in vitro with different serum concentrations Reprod Domest Anim., 41(2): 129-136
11 Saito S., Sawai K., Ugai H, Moriyasu S., Minamihashi A., Yamamoto Y., Hirayama H., Kageyama S., Pan J., Murata T., Kobayashi Y., Obata Y., Yokoyama K K.,
2003 Generation of cloned calves and transgenic chimeric embryos from bovine embryonic stem-like cells Biochemical and Biophysical Research Communications, 309: 104-113
12 Savatier P., S Huang, L Szekely, K G Wiman, J Samarut, 1994 Constracting patterns of retinoblastoma protein expression in mouse embryonic stem cells and embryonic fibroblasts Oncogene, 9: 809-818
13 Sayaka W., Takafusa H., Rinako S., Yuko S., Hong-Thuy Bui, Eiji M and Teruhiko W., 2007 Efficient Establishment of Mouse Embryonic Stem Cell Lines from Single Blastomeres and Polar Bodies Stem Cells, 25: 986-993
14 Shamblott M J., Axelman J., Wang S., Bugg E M., Littlefield J W., Donovan P J., Blumenthal P D., Huggins G R., Gearhart
J D., 1998 Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells Proc Natl Acad Sci USA,
95:13726-13731
15 Shanbo Cao, Fang Wang, Zhisheng Chen, Zhong Liu, Cheng Mei, Haojia Wu, Junjiu Huang, Chao Li, Lingjun Zhou, Lin Liu,
2009 Isolation and Culture of Primary Bovine Embryonic Stem Cell Colonies by a Novel Method Journal of Experimental Zoology, 311A: 368-376
Trang 816 Sirisathien S., Brackett B G., 2003
Influence of postmortem delay in aspiration
of oocytes on production of bovine
blastocysts in vitro Vet Rec., 153(11):
334-335
17 Stice S L., N Strelchenko, C L Keefer, L
Matthews, 1996 Pluripotent bovine
embryonic stem cell lines direct embryonic
developmet following nuclear transfer Biol
Reprod., 54: 100-110
18 Strelchenko N., 1996 Bovine pluripotent
stem cells Theriogenology, 45: 131-140
19 Thomson J A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro
S S., Waknitz M A., Swiergiel J J., Marshall V S., Jones J M., 1998 Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts Science, 282:
1145-1147
20 Vejlsted M., Du Y., Vajta G., Maddox-Hyttel P., 2006 Post-hatching development
of the porcine andbovineembryo defining criteria for expected development in vivo and in vitro Theriogenology, 65(1): 153-165
ISOLATION AND CULTURE OF BOVINE EMBRYONIC STEM-LIKE CELLS
USING WHOLE ZONA-FREE EMBRYO CULTRUE
Le Thanh Long, Doan Thi Hong Hanh, Nguyen Thi Hong Van, Hoang Nghia Son
Institute of Tropical Biology, VAST
SUMMARY
Zona membranes of bovine embryos were dissolved using 5 mg/ml pronase to collect zona-free embryos Whole embryo culture was applied for bovine embryonic stem cell establishment Bovine embryonic stem cells were isolated and cultured from bovine morula stage embryos and blastocyst stage embryos Nine morula stage embryos were cultured on mouse embryonic fibroblast inactivated by 10 µg/ml mitomycin C However, there was no attachment or proliferation of morula blastomere on the feeder cell layer Whole blastocyst stage embryo culture were also used to establish embryonic stem cells One blastocyst stage embryo attached to feeder cell layer and proliferated to embryonic stem-like cell colony in three weeks The primary bovine embryonic-like colony were collected and passaged to passage one Six embryonic-like colonies were formed on feeder layer in passage one The colonies’ diameter of passage one is from 50µm to
100 µm Four colonies were degenerated Colony 4 and 6 proliferated continuously in one week Colony 4 was picked up and passaged to passage 2 Five embryonic-like colonies were formed on the feeder layer in passage two The colonies’ diameter of passage two was from 70 µm to 140 µm However, all embryonic-like colonies of passage two degenerated in one week These colonies of passage one and two had embryonic-like morphology, and were surrounded by clear boundaries This characteristic is very important to distinguish embryonic-like colonies from feeder cell cluster Colony 6 of passage one was treated to Trysin-EDTA and culture in petri dish with embryonic stem cell medium without leukemia inhibitory factor Some embryoid bodies were formed in two weeks This result supported the pluripotent property of these embryonic stem-like cells
Keywords: bovine embryo, embryonic-like colony, embryonic stem cells, pluripotency, whole emrbyo
culture
Ngày nhận bài: 21-6-2012