Bước đầu chuyển gen Bt vào cây mía (Saccharum officinarum L.)

bước đầu chuyển gen bt vào cây mía Nhóm sâu đục thân là một trong những loài sâu hại làm giảm năng suất đáng kể cho mía. Việc phun thuốc bảo vệ mía gặp một số trở ngại do mật độ mía ở ruộng rất dày, lá mía sắc và sâu đục thân lại sống bên trong thân mía. Chuyển gen kháng sâu (Bt- tổng hợp) cry1Ab và cry1B-cry1Ab (gen lai) vào hai giống mía VN 84 4137 và Suphanbury 7 nhằm mong muốn tạo ra các giống mía có khả năng kháng sâu hiệu quả, chủ yếu là sâu đục thân. Hai dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được biến nạp các plasmid mang gen cry1Ab và gen cry1B-cry1Ab dùng để chuyển gen vào thực vật. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy mô mía cho thấy, khi nuôi cấy tạo mô sẹo từ mảnh lá non ở lõi ngọn mía ex vitro, tỉ lệ tạo mô sẹo cao nhất của giống VN84 4137 trên môi trường có 2,4-D ở nồng độ 3 mg/l là 93,33%, trong khi của giống Suphanbury 7 ở nồng độ 2 mg/l là 96,67%. Tỉ lệ mô sẹo tái sinh chồi cao nhất trên môi trường có tổ hợp BAP 2 mg/l và NAA 1 mg/l là 100% ở cả hai giống. Bước đầu chuyển gen cry1Ab và cry1Bcry1Ab gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào mía đã thu được các khối mô sẹo có biểu hiện GUS và kháng chất chọn lọc phosphinothricin ở nồng độ 3 mg/l, là nồng độ gây chết khi khảo sát khả năng chống chịu phosphinothricin ở mô sẹo không chuyển gen

BƯỚC ĐẦU CHUYỂN GEN Bt VÀO CÂY MÍA (Saccharum officinarum L.)

Phan Tường Lộc*, Hoàng Văn Dương, Mai Trường, Lê Tấn Đức, Trần Thị Ngọc Hà,

Văn Đắc Thành, Phạm Đức Trí, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Hữu Hổ

Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)locphan@itb.ac.vn

TÓM TẮT: Nhóm sâu đục thân là một trong những loài sâu hại làm giảm năng suất đáng kể cho mía

Việc phun thuốc bảo vệ mía gặp một số trở ngại do mật độ mía ở ruộng rất dày, lá mía sắc và sâu đục thân

lại sống bên trong thân mía Chuyển gen kháng sâu (Bt- tổng hợp) cry1Ab và cry1B-cry1Ab (gen lai) vào

hai giống mía VN 84 4137 và Suphanbury 7 nhằm mong muốn tạo ra các giống mía có khả năng kháng

sâu hiệu quả, chủ yếu là sâu đục thân Hai dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được biến nạp các plasmid mang gen cry1Ab và gen cry1B-cry1Ab dùng để chuyển gen vào thực vật Khảo sát các điều kiện nuôi cấy mô mía cho thấy, khi nuôi cấy tạo mô sẹo từ mảnh lá non ở lõi ngọn mía ex vitro, tỉ lệ tạo

mô sẹo cao nhất của giống VN84 4137 trên môi trường có 2,4-D ở nồng độ 3 mg/l là 93,33%, trong khi của giống Suphanbury 7 ở nồng độ 2 mg/l là 96,67% Tỉ lệ mô sẹo tái sinh chồi cao nhất trên môi trường

có tổ hợp BAP 2 mg/l và NAA 1 mg/l là 100% ở cả hai giống Bước đầu chuyển gen cry1Ab và

cry1B-cry1Ab gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào mía đã thu được các khối mô sẹo có biểu

hiện GUS và kháng chất chọn lọc phosphinothricin ở nồng độ 3 mg/l, là nồng độ gây chết khi khảo sát khả năng chống chịu phosphinothricin ở mô sẹo không chuyển gen

Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Bt, chuyển gen, sâu đục thân cây mía

MỞ ĐẦU

Hơn một thập niên qua, ngành mía đường

Việt Nam vẫn luôn gặp khó khăn do nguồn

nguyên liệu mía cung cấp không đủ để sản xuất

Với nhu cầu ngày càng tăng, và theo dự kiến

của ngành, đến năm 2020 cả nước sẽ đạt mức

tiêu thụ đường 2 triệu tấn/năm [25], việc bảo

đảm sản lượng mía đáp ứng đủ và ổn định cho

sản xuất là vấn đề cần thiết

Một trong những nguyên nhân làm giảm sản

lượng mía là do sâu hại, trong đó, nhóm sâu đục

thân thuộc bộ Cánh vảy (Lepidoptera) có thể

gây thiệt hại có thể lên đến 30% [14, 24] Ứng

dụng chuyển gen Bt là một giải pháp tiềm năng

để tạo ra được các giống mía có khả năng kháng

các loại sâu đục thân [3, 9, 18, 21], mà tập tính

sống của chúng thường gây khó khăn cho việc

xử lý bằng hóa chất [14]

Độc tố kháng côn trùng từ Bacillus

thuringiensis (Bt) là các độc tố crystal viết tắt là

Cry do các gen cry mã hóa [20] Độc tố Cry

được phân loại dựa trên cơ sở đồng dạng của

trình tự amino acid của tiền độc tố Các protein

tiền độc tố với ít hơn 45% sự đồng nhất trình tự

sẽ có hệ số khác nhau trong dãy phân hạng đầu

tiên (ví dụ Cry1, Cry2) và ở mức dưới 78% và

95% đồng dạng sẽ thiết lập ranh giới cho các

dãy phân hạng thứ hai và thứ ba (ví dụ Cry1Ab)

[12] Tính đặc hiệu và hoạt tính của độc tố Cry

là kết quả của sự tương tác và ly giải của tiền độc tố bên trong hệ thống tiêu hóa của từng loài côn trùng cụ thể [12] Do biến nạp vào thực vật

dùng các gen cry đơn, nguyên bản cho biểu hiện

độc tố không cao trong giai đoạn ban đầu,

nghiên cứu chuyển gen Bt đã có những cải tiến trong giai đoạn sau này Các gen cry được tổng

hợp có nhiều thay đổi trình tự so với nguyên bản, như giảm các thành phần A, T, tăng tỷ lệ C + G, để thích hợp biểu hiện cao ở thực vật [5, 9]; hoặc áp dụng mô hình hiệu quả quy tụ (pyramiding) để tạo hiệu quả kháng sâu cao khi

lai các gen cry có tác động khác nhau lại và

đồng chuyển vào thực vật [9]

Theo các công bố, gen cry1Ab có tính kháng

chủ yếu với côn trùng thuộc bộ Lepidoptera [1,

2, 6, 12] và cry1B có tính kháng kép trên

Lepidoptera và Coleoptera [5, 12] Protein lai Cry1B-Cry1Ab có thể tạo hiệu ứng kháng hiệu quả hơn đối với Lepidoptera và cả Coleoptera [4]

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu

Giống mía: Hai giống mía được dùng để

chuyển gen là Suphanbury 7 (Thái Lan) và VN84 4137 (Việt Nam), được cung cấp bởi

Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Mía

Đường, xã Phú An, huyện Bến Cát, tỉnh Bình

Dương

Chủng vi khuẩn: Chủng vi khuẩn E coli

mang plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab và

chủng E coli DH5α Chủng vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens EHA 105 có mang

sẵn helper plasmid chứa các gen vir và gen

kháng kháng sinh rifampicin

Plasmid: Plasmid pCRY1B-1Ab, kích thước

khoảng 17 kb, mang tổ hợp gen

Pubi/cry1B-cry1Ab/Tnos (cry1B-cry1Ab: gen lai - tổng hợp)

và gen chọn lọc P70S/bar/T35S trong T-DNA

biểu hiện ở thực vật, và gen nptII kháng kanamycin biểu hiện ở vi khuẩn Gen bar quy

định tính kháng phosphinothricin (PPT) dùng để

chọn lọc đối tượng chuyển gen (hình 1A)

Plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab, có kích

thước 15,6 kb, từ plasmid pCAMBIA3301 được chèn thêm tổ hợp gene Pubi-1/cry1Ab/Tnos trong TDNA (Pubi : maize ubiquitin-1 (Ubi-1) promoter, Tnos: nopaline synthase (NOS) terminator, cry1Ab: gen tổng hợp) (hình 1B) Các gen cry1Ab, cry1B-cry1Ab có nguồn gốc

từ Altosaar I (Canada), chương trình trao đổi khoa học

A

B

Hình 1 Sơ đồ plasmid

A Plasmid pCRY1B-1Ab; B Plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab

Môi trường

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn gồm môi

trường LB (Luria-Bertani) dùng nuôi cấy và giữ

giống E coli và Agrobacterium tumefaciens;

môi trường AB (Chilton) dùng để chuyển gen

Môi trường nuôi cấy thực vật gồm môi

trường khoáng cơ bản MS, vitamin MS, vitamin

B5, đường 30 g/l, pH 5,8; chất điều hòa sinh

trưởng BAP, NAA

Phương pháp

Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E coli bằng

xung điện

Biến nạp được thực hiện bằng xung điện

trên máy BTX ECM 830 ở 2500 V, 40 uF, 5 ms,

cuvette 2 mm Vi khuẩn sau khi biến nạp được

chọn lọc trên môi trường LB có bổ sung

kanamycin 100 mg/l và được ly trích plasmid

để kiểm tra đặc điểm, kích thước bằng enzyme

cắt giới hạn HindIII [8, 15]

Biến nạp plasmid vào vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens

Biến nạp được thực hiện bằng phương pháp

CaCl2 nhiệt Vi khuẩn sau khi biến nạp được

cấy chọn lọc trên môi trường có bổ sung

rifampicin 100 mg/l và kanamycin 100 mg/l

Theo dõi kết quả sau 24-48 giờ [10, 11, 16]

Kiểm tra sự hiện diện của các gen cry1Ab và gen cry1B-cry1Ab bằng phương pháp PCR Đối với gen cry1Ab, trình tự mồi xuôi là

(F): 5’-TTC CT T GGA CGA AAT CCC ACC-3’ và mồi ngược là (R): 5’-GCC AGA ATT GAA CAC ATG AGC GC-3’ kích thước đoạn khuếch đại tương ứng 559 bp Đối với gen

cry1B-cry1Ab, trình tự mồi xuôi là (F): 5’-GAT

AGC AGG ACC TAT CCA AT-3’ và mồi ngược là (R): 5’-GCC GAA GAG GGA GGC GTC AA-3’, kích thước đoạn khuếch đại tương ứng là 0,5 kb Chương trình nhiệt phản ứng PCR: 94oC/4 phút (94oC/30 giây, 50-54oC/1 phút, 72oC/30-90 giây), 72oC/10 phút, với 35 chu kỳ Hỗn hợp các thành phần của phản ứng PCR gồm có 5 l buffer PCR 5X, 0,5 l dNTP

10 mM, 0,25 l taq polymerase 5 U/l, 2 l mồi

xuôi 1 M, 2 l mồi ngược 1 M, 1 l DNA plasmid, thêm nước cất đủ thể tích 25 l [7]

Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D lên quá trình tạo

mô sẹo từ lá non

Phần lõi lá non bên trong ngọn mía, thường

ở tình trạng vô trùng, được cắt thành các khoanh dày 2 mm và tách các lớp lá để nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo gồm thành phần khoáng

MS, vitamin MS, casein 0,5 g/l và agar 10 g/l,

có bổ sung 2,4-D ở các nồng độ khác nhau

PUbi

P70S

bar

T35S

RB

LB KaR

P35S

bar

T35S

(0; 1; 2; 3; 4 mg/l) để đánh giá ảnh hưởng của

2,4-D lên quá trình tạo mô sẹo của mẫu [19]

Khảo sát ảnh hưởng của BAP và NAA lên quá

trình tái sinh chồi từ mô sẹo

Mô sẹo sau thời gian nuôi sẽ được cho tái

sinh chồi trên môi trường có thành phần khoáng

MS, vitamin B5, bổ sung tổ hợp chất điều hòa

sinh trưởng BAP (1; 2 mg/l) NAA (0,2; 0,5; 1

mg/l) [23]

Khảo sát ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT lên

sự phát triển mô sẹo, cây con in vitro

Nuôi cấy tạo mô sẹo và nuôi cấy cây con

trên môi trường có bổ sung PPT ở các nồng độ

khác nhau (0; 1; 2; 3; 4; 5 mg/l) vào môi trường,

để đánh giá ảnh hưởng của PPT lên sự phát

triển của mô sẹo và cây con [13]

Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens và chọn lọc

mô chuyển gen

Vi khuẩn A tumefaciens được nuôi cấy lắc

qua đêm ở 28oC trong môi trường LB có bổ

sung kháng sinh kanamycin 100 mg/l và

rifampicin 50 mg/l, sau đó, được ly tâm lấy

sinh khối ở 4000 g, trong 5 phút và chuyển sang

nuôi mới trong môi trường AB ở các điều kiện

như trên có bổ sung thêm acetocyringone 200

M trong 1 giờ Mô sẹo được để khô bớt độ ẩm

trong tủ cấy vô trùng khoảng 30 phút, rồi ngâm

10 phút trong dịch vi khuẩn ở điều kiện áp suất

thường, sau đó đưa vào điệu kiện chân không

-50 kPa trong 3 phút rồi đưa trở lại môi trường

áp suất thường 5 phút, trước khi được mang ra

thấm khô và chuyển sang ủ chung với vi khuẩn

trên môi trường tạo mô sẹo, khoảng 2-3 ngày

Mô sẹo sau đó được rửa sạch bằng dung

dịch kháng sinh cefotaxime 500 mg/l để diệt

khuẩn Agrobacterium tumefaciens, rồi chuyển

sang chọn lọc mô chuyển gen trên môi trường

tạo mô sẹo, có bổ sung cefotaxime ở nồng độ

500 mg/l và PPT ở nồng độ ngưỡng gây chết

[17]

Khảo sát sự biểu hiện của gen chỉ thị gus bằng

kỹ thuật hóa mô [13]

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Biến nạp tạo chủng vi khuẩn E coli chứa

vector plasmid pCRY1B-1Ab

Để có thể lưu giữ và nhân bản, plasmid

pCRY1B-1Ab được biến nạp vào dòng E coli

DH5 bằng phương pháp xung điện Vi khuẩn sau khi chuyển gen được cấy trải để chọn lọc trên môi trường LB rắn có bổ sung kanamycin

100 mg/l Sau 2 ngày, nhận được khoảng 70 khuẩn lạc mọc trên đĩa petri nuôi cấy, được giả định đã biến nạp plasmid pCRY1B-1Ab, trong

khi ở đĩa đối chứng nuôi cấy vi khuẩn E coli

DH5 không biến nạp, không có khuẩn lạc nào xuất hiện

Các khuẩn lạc giả định biến nạp plasmid được chọn và nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung kanamycin 100 mg/l để tách plasmid và phân tích

Plasmid sau khi tách chiết, được cắt bằng

enzyme giới hạn HindIII và điện di kiểm tra

trên gel agarose, cho thấy có 1 băng DNA 17 kb phù hợp với kích thước plasmid pCRY1B-1Ab

chứng tỏ các dòng E coli DH5 đã được biến

nạp plasmid pCRY1B-1Ab (hình 2)

Hình 2 Kiểm tra plasmid cry1B-cry1Ab sau khi biến nạp vào dòng vi khuẩn E.coli DH5

L Thang chuẩn DNA -HindIII; 1 Plasmid kiểm tra được cắt bằng enzyme HindIII có kích thước khoảng

17 kb

Biến nạp tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab và dòngvi khuẩn A tumefaciens mang plasmid pCRY1B-1Ab

Hai dòng E coli mang plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab và pCRY1B-1Ab được nhân lên và tách plasmid Biến nạp plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab và pCRY1B-1Ab vào

L 1

17 kb

vi khuẩn Agrobacterium tumefacien EHA 105

được thực hiện bằng phương pháp xử lý nhiệt

với CaCl2

Vi khuẩn sau khi biến nạp được cấy chọn

lọc trên môi trường LB rắn có bổ sung

kanamycin 100 mg/l và rifampicin 100 mg/l (hệ

thống binary vector) ở 28oC Sau 2 ngày, trên

các đĩa nuôi cấy xuất hiện khoảng 20 khuẩn lạc

Agrobacterium tumefaciens EHA 105 giả định

đã biến nạp plasmid

Tách khuẩn lạc và kiểm tra sự có mặt của

các gen cry1Ab và cry1B-cry1Ab trong cấu trúc

bằng phương pháp PCR với các mồi đặc hiệu

Kết quả biểu hiện trên gel agarose với marker

1 kb cho thấy, ở dòng A tumefaciens biến

nạp plasmid pCAMBIA-Cry1Ab và dòng

A tumefaciens biến nạp plasmid pCRY1B-1Ab,

sản phẩm PCR từ các plasmid được tách đều có

băng khuếch đại của gen cry1Ab giống với đối

chứng dương (được khuếch đại từ

pCAMBIA3301-cry1Ab của E coli), phù hợp

với trình tự mục tiêu là 559 bp (hình 3) Trong

khi đó ở dòng A tumefaciens biến nạp

pCRY1B-1Ab còn có thêm băng khuếch đại

trình tự đặc hiệu của đoạn DNA cry1B-cry1Ab

giống với đối chứng dương (được khuếch đại từ

pCRY1B-1Ab của E coli) phù hợp với trình tự

mục tiêu là khoảng 0,5 kb (hình 4)

Hình 3 Kết quả kiểm tra bằng PCR sự hiện diện

gen cry1Ab trên các plasmid của vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens

L Thang chuẩn DNA 1 kb; PC Băng DNA 559 bp

được khuếch đại từ vi khuẩn E coli mang

pCAMBIA3301-cry1Ab; 1 Băng DNA 559 bp được

khuếch đại từ vi khuẩn A tumefaciens biến nạp

pCAMBIA3301-cry1Ab; 2 Băng DNA 559 bp được

khuếch đại từ vi khuẩn A tumefaciens biến nạp

pCRY1B1Ab

Hình 4 Kết quả kiểm tra bằng PCR sự hiện diện

của gen cry1B-cry1Ab trên plasmid của vi khuẩn A tumefaciens bằng PCR

L Thang chuẩn DNA 1 kb; PC Băng DNA 0,5 Kb

được khuếch đại từ vi khuẩn E coli mang

pCRY1B-Ab; 1 Băng DNA 0,5 Kb được khuếch đại từ vi

khuẩn A tumefaciens biến nạp pCRY1B-1Ab.

Như vậy, dòng vi khuẩn A tumefaciens EHA

105 biến nạp plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab

và dòng vi khuẩn A tumefaciens EHA 105 biến

nạp plasmid pCRY1B-1Ab đã được thực hiện thành công và có thể dùng để chuyển gen vào thực vật

Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D lên quá trình tạo mô sẹo của mô lá

Mô lá non mía được nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D ở các nồng độ khác nhau Mô sẹo bắt đầu hình thành sau 12 ngày ở các mép mô

Mô sẹo của giống Suphanbury 7 mềm và ướt hơn ở giai đoạn đầu, màu sắc khối mô vàng nhạt hơn so với giống VN84 4137 (hình 5) Sau 28 ngày, tỉ lệ mô sẹo hình thành khác biệt rõ rệt nhất giữa các công thức Công thức với nồng độ 2,4-D 3 mg/l cho tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo cao nhất

ở giống VN84 4137 và 2,4-D 2 mg/l ở giống Suphanbury 7 (bảng 1) Tiếp tục nuôi cấy khoảng 1,5 tháng, mô sẹo phát triển thành các khối mô chắc, có bề mặt căng láng (hình 6)

500 bp

L PC H2O 1

559 bp

L PC H2O 1

2

Bảng 1 Kết quả tạo mô sẹo của giống VN84 4137 và giống Suphanbury 7 trên môi trường MS có

bổ sung nồng độ 2,4-D khác nhau

Công thức

thí nghiệm 2,4-D (mg/l)

Tỷ lệ mẫu hình thành mô sẹo

ở giống VN84 4137 (%)

Tỷ lệ mẫu hình thành mô sẹo ở giống Suphanbury 7 (%)

Các giá trị trung bình không theo cùng nhóm có mẫu chữ giống nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p = 0,01 dựa theo kiểm định thống kê LSD

Giống VN84 4137 Giống Suphanbury 7

Hình 6 Mô sẹo phát triển hình thành

các khối tế bào có khả năng tái sinh

Hình 5 Khối mô sẹo phát sinh từ mô lá non mía sau

khoảng 20 ngày nuôi cấy Các khối mô này được mang đi tái sinh trên

môi trường MS có bổ sung các tổ hợp chất điều

hòa sinh trưởng BAP và NAA khác nhau Sau 1

tuần, chồi có dấu hiệu hình thành Số liệu được

lấy ở các công thức đạt tỷ lệ tạo chồi tuyệt đối

sau 21 ngày

Kết quả kiểm tra ở ngày 21 cho thấy, ở

công thức gồm tổ hợp NAA 1 mg/l và BAP 2 mg/l có 100% mẫu tạo chồi ở cả hai giống mía,

số lượng chồi trên mẫu nhiều, chồi có hình dạng bình thường Các công thức khác cũng hình thành chồi nhưng chậm hơn, số lượng ít hơn và các chồi có hình dạng không đồng đều trên cùng khối mô hoặc dị dạng (bảng 2, hình 7)

Bảng 2 Kết quả tái sinh chồi của giống mía VN84 4137 và giống Suphanbury 7 trên môi trường

MS có bổ sung các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP và NAA khác nhau

Công

thức

TN

BAP

(mg/l)

NAA (mg/l)

Tỷ lệ mô sẹo hình thành chồi trên một nghiệm thức ở giống VN84 4137 (%)

Tỷ lệ mô sẹo hình thành chồi trên một nghiệm thức ở giống Suphanbury 7 (%)

Các giá trị trung bình không theo cùng nhóm có mẫu chữ giống nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở

mức p = 0,01 dựa theo kiểm định thống kê Duncan

VN84 4137 Suphanbury 7

Hình 7 Chồi giống VN84 4137 và Suphanbury 7 hình thành từ mô sẹo

trên môi trường có các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP 2 mg/l và NAA 1 mg/l

Nghiên cứu ảnh hưởng của PPT lên khả năng

phát triển mô sẹo, cây con in vitro

Mô sẹo sau một tháng nuôi cấy của cả hai

giống mía VN84 4137 và Suphanbury 7 được

chuyển sang môi trường có bổ sung PPT ở các

nồng khác nhau Từ nồng độ 1 mg/l các khối

mô sẹo bắt đầu chuyển sang màu vàng đậm hơn

do tích tụ ammonia sau 2 tuần Ở nồng độ 3

mg/l tất cả các mô sẹo hóa nâu đen và chết ở cả

hai giống mía sau một tháng, trong khi ở các nồng độ cao hơn thời gian chết trong khoảng

1-2 tuần (hình 8)

Các cây mía con in vitro của cả hai giống

mía VN84 4137 và Suphanbury 7 được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung PPT ở các nồng độ khác nhau như trên Sau 10 ngày, ở nồng độ PPT từ 3 mg/l, các cây con đều vàng lá

và chết dần (hình 9)

Hình 8 Ảnh hưởng của PPT ở nồng độ 3 mg/l gây chết mô sẹo

Hình 9 Ảnh hưởng của PPT ở các nồng độ khác nhau đối với sự phát triển của cây mía con VN84 4137 in vitro

Bước đầu chuyển gen mô sẹo mía thông qua

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Mô sẹo mía sau 1 tháng nuôi cấy trên môi

trường có 2,4-D ở 3 mg/l cho giống VN84 4137

và 2 mg/l cho giống Suphanbury 7 có hình thái

đồng nhất sẽ được xử lý chuyển gen với hai

dòng vi khuẩn A.tumefaciens mang plamid

pCAMBIA3301-cry1Ab và pCRY1B-1Ab Các

mô sẹo được tiếp tục nuôi cấy chọn lọc trên môi

trường tạo mô sẹo có bổ sung PPT 3 mg/l Sau 2

tuần chuyển gen, nhuộm sơ bộ một số cụm mô chuyển gen với plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab trong dung dịch X-Gluc thu được các

mô có màu xanh dương đậm đặc trưng, có thể giả định các mô này đã được chuyển gen và có

biểu hiện GUS (hình 10) Sau 4 tuần hầu hết các

mô sẹo nâu hóa và chết, một số cụm mô nhỏ có khả năng sống trên PPT ở nồng độ 3 mg/l tiếp tục phát triển mô mới Số lượng mô kháng được PPT 3 mg/l khoảng từ 2-4% mẫu chuyển gen (bảng 3, hình 11)

Hình 10 Mô sẹo chuyển gen plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab biểu hiện

gen gus khi nhuộm trong dung dịch X-Gluc

Giống VN84 4137 pCAMBIA3301-cry1Ab Giống Suphanbury 7 pCAMBIA3301-cry1Ab

Giống Suphanbury 7 pCRY1B-1Ab Giống VN84 4137 pCRY1B-1Ab

Hình 11 Mô sẹo chuyển gen được chọn lọc trên môi trường tạo mô sẹo

Bảng 3 Tỷ lệ mô sẹo phát triển trên môi trường chọn lọc PPT 3 mg/l sau 4 tuần chuyển gen

pCAMBIA3301-cry1Ab pCRY1B-1Ab

Thảo luận

Suphanbury 7 và VN84 4137 là hai giống

mía có năng suất và hàm lượng đường cao, CCS

trên 11% đang được trồng nhiều trong các vùng

nguyên liệu mía Việc có thể thích hợp nuôi cấy

in vitro, làm cơ sở cho các ứng dụng công nghệ

sinh học đối với hai giống mía này, mang ý

nghĩa thực tiễn cao

Mô lá non tạo mô sẹo 93,33-96,67% trên

môi trường có bổ sung 2,4-D ở nồng độ 2-3

mg/l tương tự với nghiên cứu của một số tác giả

trước đây [2, 19, 23], các mẫu mô sẹo tái sinh

chồi đạt tỉ lệ 100% trên môi trường có bổ sung

BAP 2 mg/l và NAA 1 mg/l là các điều kiện

thuận lợi để ứng dụng chuyển gen

Mô sẹo và cây mía con khá nhạy cảm với

PPT, là một chất chọn lọc mạnh, bị ức chế sinh

trưởng và chết ở nồng độ 3 mg/l, Điều này giúp

khả năng chọn lọc cây thuần cao, tuy nhiên, sẽ

khó nhân mô và tái sinh cây trong quá trình

chọn lọc

Các dòng Agrobacterium tumefaciens sau

khi được biến nạp plasmid

pCAMBIA3301-cry1Ab và pCRY1B-1Ab được dùng để chuyển

gen vào hai giống mía Kết quả bước đầu nhận

được các mô sẹo biểu hiện GUS ở hai giống mía

chuyển gen với plasmid

pCAMBIA3301-cry1Ab và các mô sẹo chuyển gen từ cả hai

plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab và

pCRY1B-1Ab có khả năng chống chịu và tiếp tục phát

triển trên môi trường có bổ sung PPT 3 mg/l,

điều này cho thấy, biến nạp gen từ

Agrobacterium vào mô sẹo mía đã được thực

hiện Các mô sẹo chuyển gen sẽ được tiếp tục

chọn lọc và cho tái sinh thành cây hoàn chỉnh

KẾT LUẬN

Tạo được hai chủng Agrobacterium

tumefaciens dùng để chuyển gen mía, gồm

chủng chứa plasmid pCRY1B-1Ab và chủng

chứa plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab

Xác định được nồng độ 2,4-D thích hợp

cảm ứng tạo mô sẹo ở giống mía VN84 4137 là

3 mg/l, Suphanbury 7 là 2 mg/l Tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng cho tỉ lệ tái sinh chồi 100% từ mô sẹo ở hai giống mía VN84 4137 và Suphanbury 7 cao nhất là BAP 2 mg/l, NAA 1 mg/l

Xác định được nồng độ PPT gây chết mô sẹo và cây con có thể dùng làm nồng độ bắt đầu chọn lọc các đối tượng chuyển gen trong điều

kiện in vitro là 3 mg/l

Bước đầu thu được 2-4% mô sẹo chuyển

gen giả định có biểu hiện gen gus và phát triển

tốt trên môi trường chọn lọc với PPT 3 mg/l Các mô chuyển gen giả định sẽ được tiếp tục chọn lọc trên môi trường có bổ sung PPT ở nồng độ cao hơn (5 mg/l) để chọn lọc mô và tái sinh cây thuần Cây chuyển gen sẽ được phân tích bằng các kỹ thuật sinh học phân tử để xác định đặc điểm di truyền và biểu hiện gen

Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn

Bộ Khoa học và Công nghệ, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ về kinh phí cho

công trình này

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Arvinth S., Selvakesavan R K., Subramonian N., Premachandran M N.,

2009 Transmission and expression of transgenes in progeny of sugarcane clones

with cry1Ab and aprotinin genes, Sug Tech,

11(3): 290-295

2 Arvinth S., Arun S., Selvakesavan R K., Srikanth J., Mukunthan N., Ananda Kumar P., Premachandran M N., Subramonian N.,

2010 Genetic transformation and pyramiding of aprotinin-expressing

sugarcane with cry1Ab for shoot borer (Chilo infuscatellus) resistance, Plant Cell

Rep., 29: 383-395

3 Arencibia A D., Vaquez R I., Prieto D., Tellez P., Carmona E R., Coego A., Hernandez L., de La Riva G A., Housein G

S., 1997 Transgenic sugarcane plants

resistant to stem borer attack Mol Breed, 3:

247-255

4 Bano-Maqbool S., Riazuddin S., Loc N T.,

Gatehouse A M R., Gatehouse J A.,

Christou P., 2001 Expression of multiple

insecticidal genes confers broad resistance

against a range of different rice pests Mol

Breed, 7: 85-93

5 Bohorova N., Frutos R., Royer M., Estanol

P., Pacheco M., Rascon Q., Mclean S.,

Hoisington D., 2001 Novel synthetic

Bacillus thuringiensis cry1B gene and the

cry1B-cry1Ab translational fusion confer

resistance to southwestern corn borer,

sugarcane borer and fall armyworm in

transgenic tropical maize Theor Appl

Genet., 103: 817-826

6 Braga D P V., Arrigoni E D P.,

Silvia-Filho M C., Ulian E C., 2003 Expression

of the Cry1Ab protein in genetically

modified sugarcane for the control of

Diatraea saccharalis (Lepidoptera:

Crambidae) J New Seeds, 5: 209-222

7 Casali N., Preston A., 2003 Methods in

molecular Biology E.coli plasmid vector

Methods and applications, Humana Press,

235: 316

8 Chassy B.M and Flickinger J.L., 1987

Transformation of Lacobacillus casei by

electroporation FEMS Microbiol Lett, 44:

173-177

9 Christou P., Capell T., Kohli A., Gatehouse

J A., Gatehouse A M R., 2006 Recent

developments and future prospects in insect

pest control in transgenic crops TRENDS

in Plant Science, 11(6): 302-308

10 Cohen S N., Chang A C Y., Hsu L., 1972

Nonchromosomal antibiotic resistance in

bacteria: genetic transformation of

Escherichia coli by R-factor DNA Proc

Natl Acad Sci USA, 69: 2110-2114

11 Dagert M., Erlich S D., 1979 Prolonged

incubation in calcium chloride improves the

competence of Escherichia coli cells Gene,

6: 23-28

12 de Maagd R A., Bravo A., Crickmore N.,

2001 How Bacillus thuringiensis has

evolved specific toxins to colonize the insect world TRENDS in Genetics, 17(4): 193-199

13 Enriquez-Obregon G A., 1998

Herbicide-resistant sugarcane (Saccharum offcinarum L.) plants by Agrobacterium-mediated

transformation Planta, 206: 20-27

14 Fauconnier R., 1993 Sugar cane, Macmillan Press Ltd, London, UK

15 Fiedler S., Wirth R., 1988 Transformation

of bacteria with plasmid DNA by

electroporation Anal Biochem., 170:

38-44

16 Hanahan D., 1983 Studies on the

transformation of Escherichia coli with

plasmids J Mol Biol., 166: 557-580

17 Joyce P., Kuwahata M., Turner N., Lakshmanan P., 2010 Selection system and co-cultivation medium are important

determinants of Agrobacterium-mediated

transformation of sugarcane Plant Cell Rep., 29: 173-183

18 Kim S., Kim C., Li W., Kim T., Li Y., Zaidi

M A., Altosaar I., 2008 Inheritance and

field performance of transgenic Korean Bt

rice lines resistant to rice yellow stem borer Euphytica, 164: 829-839

19 Rashid H., Khan S A., Zia M., Chaudhary

M F., Hanif Z., Chaudary Z., 2009 Callus induction and regeneration in elite sugarcane cultivar hsf-240 Pak J Bot., 41(4): 1645-1649

20 Schnepf H E., Crickmore N., Van Rie N., Dereclus J., Baum J., Feitelson J., Zeigler D.R., Dean D H., 1998 Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal

proteins Microbiol Mol Biol Rev., 62: 775-806

21 Valderrama A M., Velasquez N., Rodriguez E., Zapata A., Zaidi M A., Altosaar I.,

Arango R., 2007 Resistance to Tecia solanivora (Lepidoptera : Gelechiidae) in

three transgenic Andean varieties of potato

expressing Bacillus thuringiensis Cry1Ac

protein J Econ Entomol., 100: 172-179

22 Weng L X., Deng H., Xu J L., Wang L H.,

Jiang Z., Zhang H B., Li Q., Zhang L H.,

2006 Regeneration of sugarcane elite

breeding lines and engineering of stem borer

resistance Pest Manage Sci., 62:178-187

23 Xu L P., Que Y X., Xu J S., Fang S R.,

Zhang M Q., Chen Y Q., Chen R K.,

2008 Establishment of genetic

transformation system and obtaining

transgenic sugarcane (var badila)

transformed with RS gene Sugar Tech, 10(2): 128-132

24 Http://www.baodongnai.com.vn/tuvan/2012

04/Phong-tru-sau-benh-hai-mia-2150229/

25 Http: //www.thesaigontimes.vn/Home/ kinhdoanh/dautu/45285/10-nam-i-ach-1-trieu-tan-duong.html

PRELIMINARY TRANSFORMATION OF Saccharum officinarum L

WITH Bt GENE

Phan Tuong Loc, Hoang Van Duong, Mai Truong, Le Tan Duc, Tran Thi Ngoc Ha, Van Dac Thanh, Pham Duc Tri, Nguyen Thi Thanh, Nguyen Huu Ho

Institute of Tropcial Biology, VAST

SUMMARY

Borer is one of the major pests of sugarcane that can cause a loss of crop yield Spraying pesticides for the control of borer faces obstacles because the pest lives inside sugarcane stem and sugarcanes with sharp leaves are planted at high density in fields Transformation of two sugarcane varieties, VN 84 4137 and

Suphabury 7, with synthetic Bt genes, cry1Ab and hybrid cry1B-cry1Ab, aims to provide effective resistance against pests, mainly borer Two strains of Agrobacterium tumefaciens were transformed with plasmids containing cry1Ab gene or cry1B-cry1Ab gene for plant transformation Sugarcanes were investigated in vitro

conditions of cultivation, which indicated that the highest calli formation from the young leaf rolls was obtained on the medium with 3 mg/l 2,4-D for VN84 4137 at 93.33% and 2 mg/l 2,4-D for Suphanbury 7 at 96.67% The highest number of calli forming shoots was achieved on the medium with the combination of 2

mg/l BAP and 1 mg/l NAA at 100% for two varieties Preliminary Agrobacterium-mediated transformation of

sugarcane was obtained with calli expressing GUS and/or resistant to phosphinothricin at 3 mg/l, which was

the lethal threshold for wild-type callus and in vitro young plants

Keywords: Agrobacterium tumefaciens, Bt, sugarcane, gen-transformation

Ngày nhận bài: 21-6-2012