Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng lên men kombucha từ chè tân trào, tuyên quang (2017)

Trà lên men Kombucha là loại đồ uống thông dụng và phổ biến ở cácnước Đông Âu, nó được biết đến là một loại đồ uống có lợi cho sức khỏe.Kombucha là một cấu trúc có dạng như thạch màu xám

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN - -

NGUYỄN THỊ HỒNG

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC

CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN KOMBUCHA TỪ CHÈ TÂN

TRÀO, TUYÊN QUANG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật

Người hướng dẫn khoa họcPGS.TS Đinh Thị Kim Nhung

HÀ NỘI, 2017

LỜI CẢM ƠN

Từ những kết quả đạt được này, em xin chân thành cám ơ n :

PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung đã trực tiếp hướng dẫn, dạy bảo, độngviên và cho em nhiều ý kiến quý báu, đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi để

em thực hiện đề tài tốt nghiệp này

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộmôn Thực vật – Vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trường Đại học sư phạm HàNội 2 đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gianthực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệmkhoa Sinh – KTNN, Trung tâm thông tin thư viện, Phòng thí nghiệm Vi sinhvật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoànthành khóa luận này

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân,những người luôn quan tâm, động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt quátrình học tập, lựa chọn, tiến hành và hoàn thiện đề tài

Hà Nội, tháng 5 năm 2017Sinh viên

Nguyễn Thị Hồng

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân em, tất

cả những số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê,hoàn toàn không có số liệu sao chép, bịa đặt Đề tài nghiên cứu này khôngtrùng với công trình nghiên cứu của các tác giả khác

Hà Nội, tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Hồng

PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU……….……… ……1

Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

5.1 Ý nghĩa khoa học 2

5.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

6 Điểm mới của đề tài 3

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về kombucha 4

1.1.1 Sơ lược về kombucha 4

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo 5

1.2 Tổng quan về nguyên liệu 6

1.2.1 Hệ vi sinh vật trong kombucha 6

1.2.1.1 Vi khuẩn acetic 6

1.2.1.2 Nấm men 7

1.2.1.3 Vi khuẩn lactic 8

1.3 Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha 11

1.4 Thành phần và công dụng của kombucha 14

1.4.1.Thành phần kombucha 14

1.4.2 Công dụng của kombucha 15

1.5 Nguồn nguyên liệu trà Tân Trào, Tuyên Quang 17

1.6 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 18

1.6.1 Trên thế giới 18

1.6.2 Ở Việt Nam 18

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu và thiết bị hóa chất 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 20

2.1.3 Các loại môi trường 21

2.1.4 Phạm vi nghiên cứu 21

2.1.5 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phương pháp lên men 22

2.2.2 Phương pháp vi sinh 22

2.2.2.1 Phương pháp phân lập các chủng VSV và quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram 22

2.2.2.2 Bảo quản chủng giống 23

2.2.3 Phương pháp hóa sinh 23

2.2.3.1 Xác định đường khử 23

2.2.3.2 Xác định độ cồn 25

2.2.3.3 Phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphthalein 0,1% làm chỉ thị 25

2.2.3.4 Phát hiện hoạt tính catalaza 26

2.2.3.4 Thử nghiệm khả năng sinh acid lactic bằng thuốc thử Uffelmann 26

2.2.3.5 Phát hiện khả năng ôxy hóa axid lactic 27

2.2.4 Phương pháp cảm quan 27

2.2.5 Xử lí số liệu bằng thống kê toán học 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ chè

3.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn lactic 30

3.1.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng lên men tốt 38

3.2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng tới lên men kombucha từ trà Tuyên Quang41 3.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng đường 41

3.2.2 Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 đến khả năng lên men Kombucha 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

1 Kết luận 47

2 Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Lớp màng kombucha 6

Hình 1.2 Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men 11

Hình 3.1 Dịch trà kombucha 31

Hình 3.2: Chủng có hoạt tính catalaza âm tính 35

Hình 3.3: Chủng có hoạt tính catalaza dương tính 35

Hình 3.4 Chủng sinh acid lactic 37

Hình 3.6 Kombucha lên men từ các chủng vi khuẩn lactic phân lập được 39

Hình 3.7 Hàm lượng acid tổng số chủng vi khuẩn Lctobacillus 40

Hình 3.8 Kombucha ở các hàm lượng đường khác nhau 42

Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường sót 42

Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi acid tổng số 43

Hình 3.11 Biểu đồ biểu diễn chất lượng cảm quan của sản phẩm ở các hàm lượng đường khác nhau 43

Hình 3.12 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường sót 45

phụ thuộc vào hàm lượng (NH4)2SO4 45

Hình 3.13 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường sót 45

phụ thuộc vào hàm lượng (NH4)2SO4 45

Hình 3.14 Biểu đồ biểu diễn chất lượng cảm quan của sản phẩm phụ thuộc vào hàm lượng (NH4)2SO4 46

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của trà kombucha 14

Bảng 2.1 Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm 27

Bảng 2.2 Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha 28

Bảng 2.3 Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu 29

Bảng 3.1: Đặc trưng khuẩn lạc 31

Bảng 3.2: Hình dạng vi khuẩn 33

Bảng 3.3: Kích thước vòng phân giải CaCO3 38

Bảng 3.4: Đánh giá khả năng hình thành màng của các chung vi khuẩn lactic phân lập được 39

Bảng 3.5 Chất lượng cảm quan của sản phẩm 40

BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

1 ATP Adenozin triphotphat

2 STT Số thứ tự

3 SCOBY Symbiotic colony of Bacteria and Yeast

4 NADP Nicotiamide adenine photphat

5 Nxb Nhà xuất bản

6 TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

1 Lý do chọn đề tài

MỞ ĐẦU

Cùng với xu hướng phát triển mới, khi vấn đề sức khỏe con người đượcđặt lên hàng đầu, thì các loại thực phẩm gần gũi với thiên nhiên ngày càngđược ưa chuộng Trong đó dòng sản phẩm lên men đang dần chiếm ưu thế.Đối với người Việt Nam, trà đã trở nên khá quen thuộc và gần gũi Đã cónhiều loại thức uống được chế biến từ trà nhưng sản phẩm trà lên men thì hầunhư còn mới đối với người Việt Nam.

Trà "thủy sâm", người Pháp gọi là Champignon De Longuc Vie (nấmtrường sinh), người Nhật gọi nó là kombucha, người Trung Quốc gọi là thủyhoài sâm, Nga gọi là nấm trà Đây là một loại men (giống như men giấm),được nuôi trong dung dịch nước trà đường Lọc nước (trà giấm) để uống Do

dễ uống nên được dùng như một loại nước giải khát

Trà lên men Kombucha là loại đồ uống thông dụng và phổ biến ở cácnước Đông Âu, nó được biết đến là một loại đồ uống có lợi cho sức khỏe.Kombucha là một cấu trúc có dạng như thạch màu xám do sự cộng sinh giữa nấm men và vi khuẩn Trên thế giới, kombucha được sản xuất trên quy môcông nghiệp và đã có khá nhiều các công trình nghiên cứu liên quan Ở ViệtNam đã có bán các loại kombucha dưới dạng đóng chai, đồ hộp, nước giảikhát nhập khẩu từ nước ngoài Lên men kombucha tại các hộ gia đình mớichỉ manh nha xuất hiện với các nguồn nguyên liệu khác nhau như trà đường,lipton, trà xanh

Thành phần trà kombucha có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợpchất hữu cơ Trà kombucha còn chứa một lượng nhỏ cafein vì được lên men

từ các loại trà như trà xanh, trà đen, trà ô long Là sản phẩm lên men nênchứa cồn, acid axetic, acid gluconic, acid glycuronic, acid L-lactic, acidcacbonic, acid caprilic, acid xitric, acid oxalic, acid usnic, acid folic, amino

acid, nhiều vitamin nhóm B như B1, B2, B3, B5, B6, B12, vitamin C và một

số hợp chất có tác dụng kháng sinh, sát trùng và giải độc

Hiện nay trà kombucha được phổ biến ở các nước trên thế giới nhưPháp, Nhật, Trung Quốc, Nga… Ở Việt Nam đã có bán các loại kombuchadưới dạng đóng chai, đồ hộp, nước giải khát nhập khẩu từ nước ngoài kombucha còn được lên men tại các hộ gia đình từ các nguồn nguyên liệukhác nhau như trà đường, lipton, trà xanh Tuy nhiên, ở nước ta các côngtrình nghiên cứu về kombucha vẫn chưa đầy đủ và hoàn chỉnh Đặc biệt là các

vi sinh vật lên men kombucha trên môi trường nước chè đường Vì vậy, tôitiến hành: “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng lên menkombucha từ chè Tân Trào , Tuyên Quang”

2 Mục tiêu của đề tài

Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng lênmen kombucha từ chè Tân Trào,Tuyên Quang

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Phân lập một số chủng vi khuẩn lactic trên môi trường nước chè đường3.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng lên men kombucha3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng và điều kiện lênmen đến quá trình lên men kombucha

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Chủng vi khuẩn lactic có khả năng lên men kombucha từ chè Tân Trào,Tuyên Quang

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

5.1 Ý nghĩa khoa học

Tìm ra một số chủng vi kuẩn lactic có khả năng lên men kombucha thơmngon, bổ dưỡng trên môi trường nước chè đường

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Sử dụng chè Tân Trào, Tuyên Quang lên men kombucha tạo ra sản phẩmmới, góp phần làm đa dạng các sản phẩm lên men đáp ứng nhu cầu ngày càngcao của người tiêu dùng Tận dụng được nguồn nguyên liệu rẻ tiền, phổ biếnlên men tạo sản phẩm thơm ngon, bổ dưỡng, có lợi cho sức khỏe con người.

6 Điểm mới của đề tài

Tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn lactic L1 và L4 có khả năng lênmen Kombucha từ chè Tân Trào, Tuyên Quang tốt Xác định được nguồndinh dưỡng thích hợp cho quá trình lên men như hàm lượng đường 100 (g/l)hàm lượng (NH4)SO4 2 (g/l)

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về kombucha

1.1.1 Sơ lược về kombucha

Trà kombucha là một sản phẩm được bắt nguồn từ phương Đông Loạinước uống lên men này biết đến đầu tiên ở Trung Quốc từ 221 trước CôngNguyên tên gọi là thủy hoài sâm và được xem như một loại thần dược

Trà “thủy sâm” kombucha là một loại nước uống có lợi cho sức khỏe.Đây là một cấu trúc có dạng như thạch màu xám do sự cộng sinh giữa nấmmen và vi khuẩn [22]

Nấm kombucha là một khối vi sinh vật được phân loại theo tên khoa học

là “Zoogleal mat” liên kết với nhau thành màng phủ kín trên bề mặt nước tràđường Trong quá trình lên men, màng nấm kombucha lớn dần tạo thành khốidày giống như một cái bánh, thường được gọi là “nấm”, “cái giấm” hoặc bằngcác từ viết tắt SCOBY (Symbiotic colony of Bacteria and Yeast: khối cộngsinh của vi khuẩn và nấm men) Các vi khuẩn và nấm men trong nấmkombucha làm chuyển hóa đường trong dung dịch nước trà đường thành rượu

và axit hữu cơ và có thể một số chất tan từ trà cũng được chuyển hóa trongquá trình lên men, tạo thành một loại nước giải khát có độ cồn thấp, vị chuangọt, chát nhẹ Các vi sinh vật biến đổi đường thành gluconic acid, đồng thờisản xuất ra một lượng nhỏ alcohol, alcohol này sau đó biến đổi thành aceticacid Thành phần trà sau cùng chứa: acid folic, gluco Thành phần tràKombucha có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ Vì đây làsản phẩm lên men nên chứa cồn, acid axetic, acid gluconic, acid glycuronic,acid L-lactic, acid cacbonic, acid caprilic, acid xitric, acid oxalic, acid usnic,acid folic, amino acid, nhiều vitamin nhóm B như B1, B2, B3, B6, B12,

vitamin C và một số hợp chất có tác dụng kháng sinh, sát trùng và giải độc.Trà Kombucha còn chứa một lượng nhỏ cafein vì nó được lên men từ các loạitrà như trà xanh, trà đen, trà ô long hoặc trà kukicha.

Nồng độ acid và rượu trong kombucha giúp chống nhiễm các nấm mốctrong không khí và các bào tử vi khuẩn Kết quả là kombucha có thể tươngđối dễ dàng lên men trong điều kiện thường Các vi khuẩn và nấm men trongkombucha cũng sản xuất ra các kháng sinh

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo

Kombucha là môi trường cộng sinh của vi khuẩn và nấm men Hệ visinh vật trong kombucha rất phong phú, chủ yếu là các chủng Acetobacter

như: Acetobacter xylinum, Acetobacter xylinoides, Acetobacter Ketogenum…

và nấm men: Saccharomycodes ludwigii, Saccharomycodes apiculatus,

Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe… Ngoài ra còn có

thể có các chủng Lactobacillus, Brettanomyces, Pediococcus, Bacterium

gluconicum… Chính sự có mặt của các chủng Acetobacter (đặc biệt là Acetobacter xylinum) đã hình thành nên cấu trúc của kombucha Kombucha

còn được gọi là nấm trà Chúng sinh trưởng tốt trong môi trường nước tràđường Bởi vậy, thường được sử dụng để lên men dung dịch trà đường, nêngọi là nấm trà Trong quá trình lên men kombucha sẽ tạo ra một lớp màngmỏng trên bề mặt dịch trà và dần dần tăng bề dày, hình thành nên mộtkombucha thứ hai (thường gọi là kombucha con) tách biệt với kombucha banđầu Hình dạng và kích thước của kombucha phụ thuộc vào hình dạng tiếtdiện của bình chứa

Hình 1.1 Lớp màng kombucha

1.2 Tổng quan về nguyên liệu

1.2.1 Hệ vi sinh vật trong kombucha

Hệ vi sinh vật lên men kombucha là một tập đoàn vi sinh vật cộng sinh

bao gồm các loài vi khuẩn thuộc giống Acetobacter, giống Lactobacillus, các loài nấm men Nhưng chủ yếu là vi khuẩn Acetobacter và nấm men [28], [29].

1.2.1.1 Vi khuẩn acetic

Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadieae, phân bố rộng

rãi trong tự nhiên và có thể phân lập được các vi khuẩn này từ không khí, đất,nước, lương thực, thực phẩm, dấm, rượu, bia, hoa quả… Có khoảng 20 loài

thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có

ý nghĩa kinh tế

Dạng hình que, tùy điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi

trường nuôi cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra các tế bào có

hình thái khác biệt dạng kéo dài hoặc phình to ra Kích thước thay đổi tùy loài(0.3-0.6 x 1.0-8.0µm) Có thể di động, hoặc không di động Không sinh nhabào tử, hiếu khí bắt buộc và chịu được độ acid cao Tế bào đứng riêng rẽ hoặcthành từng chuỗi

Có khả năng tạo thành váng trên môi trường lỏng, khả năng tạo thànhváng thay đổi tùy loại:

- Acetobacter xylinum: tạo thành váng cellulose khá dày và chắc.

Acetobacter orleanoe: tạo thành váng mỏng nhưng chắc.

- Acetobacter pasteurianum: tạo thành váng khô và nhăn nheo.

- Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng dễ tan rã.

Acetobacter có khả năng đồng hóa muối (NH4)+ và phân giải pepton.Một số đòi hỏi có acid amin nhất định như acid pentothenic và các chấtkhoáng K, Mg, Ca, Fe, P, S…ở dạng muối vô cơ, hữu cơ hoặc hợp chất hữu

cơ Ngoài khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic, một số loài

Acetobacter còn tổng hợp vitamin B1, vitamin B2, oxy hóa sorbit thành

đường sorbose (dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C)…

1.2.1.2 Nấm men

Hình thái và cấu tạo

Tế bào nấm men thường có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ…,thường có kích thước rất lớn gấp từ 5-10 lần tế bào vi khuẩn Kích thướctrung bình: chiều dài: 9 ÷ 10 µm, chiều rộng: 2 ÷ 7 µm Hình dạng và kíchthước tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổikhác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau

Sự sinh sản của nấm men

Nấm men có hai hình thức sinh sản chủ yếu: sinh sản hữu tính bằng cáchhình thành bào tử túi và sinh sản vô tính bằng nảy chồi [20] Nấm men là visinh vật hóa dị dưỡng vì chúng sử dụng các hợp chất hữu cơ làm nguồn cungcấp năng lượng cho sự sinh trưởng và phát triển Nấm men có thể tồn tại trong

cả điều kiện hiếu khí và kỵ khí với khoảng nhiệt độ tương đối rộng, pH acidthích hợp cho sự phát triển của nấm men [20]

Phân loại: Chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungi imperfecti) Lớp nấm men thật (Ascomyces): phần lớn nấm men dùng trong công nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống

Saccharomyces, giống Endomyces, giống Schizosaccharomyces Lớp nấm

men giả (Fungi imporfecti), Crytococus (toscula, tornlopsis), Mycoderma,

Candida, Geotrichum (đã được xếp vào lớp nấm mốc), Rhodotorula [20]

1.2.1.3 Vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae Các chủng vi khuẩn thuộc

nhóm này có đặc điểm sinh thái khác nhau nhưng đặc tính sinh lý tương đốigiống nhau Tất cả đều có đặc điểm chung là vi khuẩn Gram dương, khôngtạo bào tử, không di động, hô hấp tùy tiện ( kị khí và hiếu khí ) không chứacác men hô hấp như xitocrom và catalaza Chúng thu nhận năng lượng nhờquá trình phân giải hydrat cacbon và sinh ra axit lactic, sinh sản bằng hìnhthức phân đôi tế bào

Nhóm vi khuẩn lactic bao gồm nhiều giống khác nhau: Streptococcus,

Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc Ngày nay người ta bổ sung vào

nhóm vi khuẩn lactic những chủng vi khuẩn thuộc giống Bifidobacterium.

Đặc điểm hình thái

Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thànhdạng hình cầu và hình que Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài

- Giống Streptococcus có dạng hình tròn hoặc hình ovan, đường kính tế

bào 0.5-1µm Sau khi phân chia theo một phương chúng thường xếp riêngbiệt, cặp đôi hoặc chuỗi ngắn

- Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính

từ 0.5-0.8µm và chiều dài khoảng 1.6µm trong một số điều kiện chúng cũng

có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng 1-3µm Sau khi phân chia chúng thườngsắp xếp thành chuỗi, không tạo thành đám tập trung

- Giống Lactobacillus có dạng hình que Tùy vào điều kiện của môi

trường sống mà hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn đến dài Sắpxếp thành chuỗi hay đứng riêng rẽ

- Giống Pedicoccus là những tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn Có

hoạt tính thủy phân protein rất yếu

- Giống Bifidobacterium là những trực khuẩn, khi mới phân lập có thể

phân nhánh dạng chữ Y, V và tập hợp thành khối Sau nhiều lần cấy truyềnchúng trở thành dạng trực khuẩn dạng thẳng hoặc hơi uốn cong

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khácnhau Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố

cở bản như cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một sốchất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ…

- Nhu cầu dinh dưỡng cacbon:

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ cácmonosaccarit (glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza, lactoza,maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin)

Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựngcấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữucơ

- Nhu cầu dinh dưỡng nitơ:

Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chấtchứa nitơ Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sửdụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường

Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấmmen, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,…Hiện nay cao nấm men

là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất Tuy nhiên ở quy

mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém

- Nhu cầu về Vitamin:

Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của

tế bào nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên đa số các loài vi khuẩnlactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ sung vào môitrường các loại vitamin Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nướcchiết từ khoai tây, ngô, cà rốt …

- Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác:

Ngoài các axit amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chấthữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các axit hữu cơ

Một số axit hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của

vi khuẩn lactic như axit xitric, axit oleic, nên hiện nay người ta sử dụng cácmuối xitrat, dẫn xuất của axit oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phânlập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic

- Nhu cầu các muối vô cơ khác:

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rấtcần các muối vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt,natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan giúpngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào

Quá trình trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiệnthông qua việc lên men lactic Dựa vào khả năng lên men lactic người ta chia

vi khuẩn lactic làm hai nhóm:

- Vi khuẩn lên men lactic đồng hình: thực hiện quá trình lên men tạo rasản phẩm chủ yếu là axit lactic Do trong hệ enzyme của chúng có chứa

aldolaza và triozophotphatizomeraza nên quá trình lên men này xảy ra theocon đường EMP.

- Vi khuẩn lên men lactic dị hình: thực hiện quá trình lên men, ngoàiaxit lactic chúng còn tạo ra các sản phẩm phụ khác như axit axetic, rượuetylic, CO2, một số chất thơm Đây là quá trình lên men rất phức tạp, khôngtheo con đường EMP vì chúng không có hai enzyme cơ bản là aldolaza vàtriozophotphatizomeraza

1.3 Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha

Theo kết quả nghiên cứu về thành phần cấu tạo của kombucha thì quátrình lên men dịch trà có thể xảy ra các quá trình sau:

Lên men ethanol:

Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấmmen, chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol và CO2 Quá trìnhlên men rượu chia làm hai thời kỳ chính: thời kỳ phát triển sinh khối (với sự

có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối), thời kỳ lên men chuyểnđường thành rượu và CO2 (giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinhdưỡng và sử dụng các enzym sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh họctrong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO2) Saukhi được vận chuyển vào trong tế bào chất, đường hexose được chuyển hóatheo chu trình đường phân để tạo thành acid pyruvic Tiếp theo acid pyruvic

sẽ được chuyển hoá thành acetaldehyde rồi thành ethanol Dihydroxyacetonephosphat là một sản phẩm trung gian trong chu trình đường phân, hợp chấtnày có thể chuyển hoá thành glyxerol Trong môi trường pH acid, glycerol chỉđược tạo ra với hàm lượng nhỏ Ngược lại, trong môi trường pH kiềm lượngglycerol sinh ra tăng lên rất nhiều và glycerol sẽ trở thành một trong nhữngsản phẩm chủ yếu của quá trình lên men

Phương trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trường pH acid:

C6H12O6 + 2ADP +2Pi → 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP

bào chất của nấm men Đây là quá trình trao đổi năng lượng của nấm mentrong điều kiện kỵ khí Ethanol và CO2 trong tế bào chất sẽ được nấm menthải vào môi trường lên men Ngoài ra tế bào nấm men còn tổng hợp và thảivào dịch lên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác, nhữnghợp chất này được tìm thấy với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4nhóm: glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este Trong quátrình lên men ethanol, nhiều acid hữu cơ được tạo thành (The Moll, 1990).Một số acid hữu cơ được sinh tổng hợp từ chu trình Krebs, nếu như quá trìnhlên men không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các acid hữu cơ

chiếm hàm lượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic,lactic

Lên men acetic

Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic dướitác dụng của vi khuẩn

C2H5OH + O2 → CH3CHO (Acetaldehyde) + H2O

CH3CHO + H2O → CH3CH(OH)2 (Hydrat acetaldehyde)

CH3CH(OH)2 + O2 → CH3COOH + H2O

Lên men lactic

Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lượng Các phân tử ATPđược hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất sẽ được vi khuẩn giữ lạitrong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinhvật Ngược lại, các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn thảivào môi trường lên men Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môitrường lên men ngày càng tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo nhữngbiến đổi hóa lý khác Bản chất là quá trình chuyển hóa đường thành acidlactic nhờ vi sinh vật

Tùy theo cơ chế lên men bắt buộc hoặc chủ yếu mà người ta xác định là

vi khuẩn lên men lactic đồng hình hay vi khuẩn lên men lactic dị hình Một số

vi khuẩn lên men đồng hình cũng có khả năng lên men dị hình trong nhữngđiều kiện sinh trưởng không thuận lợi hoặc tùy thuộc vào nguồn đường sửdụng

* Lên men lactic đồng hình: Là loại lên men hầu như chỉ cho sản phẩm

là axit lactic Đây là các vi khuẩn thuộc các chi như Lactococcus,

Streptococcus, chúng phân giải cacbonhydrat theo con đường EMP (Embden

– Meyrhof – Parnas) và bằng con đường này acid lactic sinh ra chiếm 90 –

Phương trình tổng quát của quá trình lên men lactic đồng hình:

C6H12O6 → 2 CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J

* Lên men lactic dị hình: Là quá trình lên men, ngoài axit lactic còn có

quá trình lên men này thuộc các chi: Leuconostoc, Bifidobacterium Do vi

khuẩn lên men lactic dị hình thiếu hai enzym chủ yếu của con đường EMP làaldolase và triozophosphat izomerase nên giai đoạn đầu của quá trình phângiải glucose theo con đường PP (Pentose phosphat) [20] Sau đó quá trìnhchuyển hóa triozophosphat thành axit lactic xảy ra tương tự như lên men đồnghình Phương trình tổng quát của quá trình lên men lactic dị hình:

C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH +

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của trà kombucha

1.4.2 Công dụng của kombucha

1.4.2.1 Giải độc

Kombucha có chứa nhiều acid glucuronic (GA) GA giúp giải độc ganbằng cách kết hợp với các chất thải, độc tố sinh ra từ các dược phẩm và ônhiễm môi trường rồi chuyển hoá chúng thành các hợp chất dễ hoà tan mà

cơ thể có thể dễ dàng đẩy ra ngoài

Trong một nghiên cứu, nhờ uống Kombucha mà các tế bào gan đãđược bảo vệ khỏi sự oxy hóa và vẫn duy trì sinh lý bình thường mặc dù bịtiếp xúc với một chất độc cụ thể Theo các nhà nghiên cứu, đây là "do cáchoạt động chống oxy hóa của Kombucha và có thể có lợi đối với bệnh gan,nơi stress oxy hóa (oxidative stress) xảy ra"

1.4.2.2 Hỗ trợ tiêu hóa

Kombucha có khả năng chống oxy hóa nên có thể chống lại các gốc tự

do gây rối loạn tiêu hóa Bên cạnh đó, vì là men tiêu hóa, Kombucha giúp giatăng lượng vi khuẩn bifida có lợi trong ruột, nhờ sản sinh acid lactic Vikhuẩn này tác động giống như vi khuẩn acidophilus thường có trong các loạisữa chua Ngoài ra, hai loại acid lactic và acid acetic giúp tăng nhanh quátrình lên men trong ruột, giúp ngừa táo bón, nhiễm trùng đường ruột, kiết

lỵ, rối loạn tiêu hóa, chữa viêm loét ruột và dạ dày

Một số nghiên cứu đã cho thấy, trong một số trường hợp, Kombuchathậm chí còn có hiệu quả như thuốc Prilosec (thường được chỉ định dùng vớichứng ợ nóng, trào ngược dạ dày thực quản và loét dạ dày)

Nhờ các probiotics, Kombucha còn có thể giúp chữa lành nhiễm trùngnấm men (nấm candida) trong ruột và giúp khôi phục lại sự cân bằng cho hệtiêu hóa

1.4.2.3 Tăng thêm năng lượng

Kombucha có thể tiếp thêm sinh lực con người nhờ sự hình thành củachất sắt trong quá trình lên men trà đen Nó cũng chứa một lượng rất nhỏcaffeine và vitamin B có khả năng tăng năng lượng cho cơ thể

Kombucha giàu chất sắt có thể giúp tăng lượng hemoglobin trongmáu, cải thiện nguồn cung cấp oxy đến các mô và kích thích quá trìnhsản xuất năng lượng ở cấp độ tế bào Nói cách khác, bằng cách giúp cơ thểtạo ra nhiều năng lượng (ATP), loại trà cổ xưa này còn có thể giúp nhữngngười thường xuyên uống nó tràn đầy sinh lực

1.4.2.4 Tăng cường miễn dịch

Kombucha có thể kiểm soát các gốc tự do thông qua các biện phápchống oxy hóa, nhờ đó giúp tăng cường miễn dịch Bởi lẽ, stress oxy hoá làmsuy yếu hệ thống miễn dịch nhưng sẽ bị triệt tiêu nhờ một chất chống oxyhóa mạnh mẽ được gọi là acid D -Arabino-1,4-lactone (DSL) đã được pháthiện trong quá trình lên men Kombucha Các nhà khoa học cho rằng DSL vàcác vitamin C hiện diện trong Kombucha chính là bí mật giúp nó chống lạicác tổn thương tế bào, chống viêm, các khối u và trầm cảm

1.4.2.5 Tốt cho xương khớp

Kombucha có thể giúp chữa lành, sửa chữa và ngăn ngừa tổn thươngxương khớp theo nhiều cách: Kombucha kết hợp các glucosamine làmtăng sản xuất acid hyaluronic, hỗ trợ việc duy trì các collagen và ngănngừa cơn đau do viêm khớp Bên cạnh đó, nó cũng hỗ trợ sản xuất collagentrên toàn bộ cơ thể và làm giảm sự xuất hiện của các nếp nhăn

1.4.2.6 Phòng chống ung thư

Kombucha cũng có lợi trong việc phòng chống ung thư và tăng khả

thường xuyên giúp ngăn chặn sự phát triển ung thư ở giai đoạn đầunhờ

glucuronic, acid lactic và acid acetic cũng như các hợp chất kháng sinh của

nó Nó có thể có tác dụng chống ung thư đặc biệt là đối với các khối u phụthuộc vào hormone

Nhiều nghiên cứu cho thấy, Kombucha có thể hữu ích trongphòng ngừa và điều trị ung thư tuyến tiền liệt, chống ung thư phổi, u xương

ác tính, ung thư thận

1.4.2.7 Giảm cân

Theo các dữ liệu từ những nghiên cứu năm 2005, các nhà khoa họccho rằng Kombucha cải thiện sự trao đổi chất và hạn chế sự tích tụ chất béo.Mặc dù phải cần thêm nhiều nghiên cứu để khẳng định điều này, nhưng theonhiều người, uống Kombucha có thể hỗ trợ giảm cân vì nó có chứa acidacetic (giống như dấm táo) và polyphenol đã được chứng minh là giúpgiảm cân hiệu quả

Ngoài các công dụng chính nêu trên, Kombucha còn có nhiều lợi íchtrong hỗ trợ điều trị đái tháo đường, ngăn ngừa tăng huyết áp, giảm đáng kểnồng độ cholesterol LDL từ đó ngăn ngừa xơ vữa động mạch, ngăn ngừathiếu máu, giảm stress

1.5 Nguồn nguyên liệu trà Tân Trào, Tuyên Quang

Với các thành phần hóa học của lá chè tại Tuyên Quang đã làm cho cácsản phẩm chế biến từ chè Tuyên Quang có hương vị đặc biệt khác hẳn câychè ở những vùng đất khác Chè ngọt mát, thơm, hàm lượng tanin cao

Đối với chè xanh: Hình dáng màu xanh tự nhiên, cánh chè dài, xoănđều non, màu nước xanh và trong, hương thơm mạnh tự nhiên

Đối với chè đen: Hình xoăn, tương đối đều, đen tự nhiên, màu nước đỏ

nâu sáng, vị đậm, chát nhẹ, dịu, chè có vị ngọt, tính

1.6 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.6.1 Trên thế giới

Cavusoglu K., Gluer P (2010) đã phát hiện tác dụng bảo vệ của nấmtrà kombucha trên nhiễm sắc thể gây ra bởi bức xạ gamma trong tế bàobạch huyết ngoại vi của con người trong ống nghiệm Dutta D., Gachhui R.(2006) đã phân lập vi khuẩn Acetobacter nitrogen nifigens sp.nov cố địnhđạm từ trà kombucha Dutta D, Gachhui R (2007) đã phân lập từ tràkombucha vi khuẩn cố định đạm và cellulose là Gluconacetobacterkombucha sp.nov J Reiss, (1994) đã tìm hiểu ảnh hưởng của các loại đườngkhác nhau lên quá trình trao đổi chất của nấm trà Jayabalan R., Malini K.,Sathishkumar M Swaminathan K.,Yun S.-E (2010) tìm hiểu đặc điểm sinhhóa của nấm trà K.H Steinkraus, K.B Shapiro, J.H Hotchkiss, R.P.Mortlock,(1996) viết về hoạt động kháng sinh của trà nấm kombucha.Nguyen Vu Tuan; Flanagan, Bernadine; Gidley, Michael J.; Dykes, Gary A.(2008) tìm hiểu đặc tính của màng BC bởi chủng Gluconacetobacter xylinusphân lập từ kombucha Petrushevska-Tozi L., Bauer-petrovska B (2000) đãxác định được hàm lượng vitamin hòa tan và khoáng trong nước uốngkombucha R.A Ledford C.J Greenwalt, and K.H Steinkraus đã xác định và

mô tả đặc điểm của các hoạt động chống vi khuẩn của kombucha trà lênmen Velicanski, Aleksandra; Cvetkovic, Dragoljub; Markov, Sinisa; Tumbas,Vesna; Savatovic, Sladjana (2007) viết về hoạt động kháng khuẩn và chốngoxy hóa của kombucha Yapar K., Cavusoglu K., Oruc E, Yalcin E (2010) viết vềtác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha trên khả năng gây độc của phenol ởchuột bạch [2]

1.6.2 Ở Việt Nam

Hiện nay, các nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam còn khá mới mẻ,các công trình nghiên cứu về kombucha có rất ít Theo ông Vũ Văn Chuyênthì từ năm 1969, ở Bắc Thái (cũ) và Hà Nội, người ta đã phổ biến cho nhau

dùng nước thủy hoài sâm để bồi dưỡng và phục hồi sức khỏe, chống lại bệnhtật Theo tác giả Lê Kim Phụng, nguyên giảng viên Trường Đại học Y dượcthành phố Hồ Chí Minh, người đã có một số bài viết về thủy sâm, cho biết:

"Hiện nay ở nước ta đang xuất hiện một loại thuốc bổ ở dạng lỏng như trà

mà mọi người gọi là trà "thủy sâm", thực ra đây chính là một loại thức uống

có từ rất lâu được gọi tên là "The Remedy for Immortality", nghĩa là "Phươngthuốc trường sinh" Cũng theo tác giả Lê Kim Phụng, lợi ích từ trà thủy sâmrất nhiều Lương y Đinh Công Bảy, Tổng thư ký Hội Dược liệu thành phố

Hồ Chí Minh cho biết ông cũng nghe nói đến thủy sâm, tuy nhiên do chưanghiên cứu nên chưa thể trả lời về công dụng thực sự của loại trà này.Theo tác giả Hà Văn Hùng, Phó Viện trưởng Viện Y dược học dân tộc thànhphố Hồ Chí Minh cũng cho rằng cho đến nay Viện cũng chưa có công trìnhnào nghiên cứu về thủy sâm nên không biết rõ thành phần và công dụng của

nó Ở Việt Nam, cũng đã có một số công trình nghiên cứu về kombuchanhư: Vào năm

2012, Lê Nguyễn Thị Hồng Ngọc và cộng sự đã có công trình “ Nghiên cứu

hệ vi sinh vật của trà kombucha và hiệu quả tác dụng trên một số chỉ tiêusinh lý chuột” Kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra hệ vi sinh vật trongkombucha bao gồm: vi khuẩn acetic, vi khuẩn lactic và nấm men Đồng thờikhảo sát tác dụng của kombucha trên một số chỉ tiêu sinh lý của chuột như:cân nặng, tổng lượng hồng cầu, tổng lượng bạch cầu, sức khỏe của chuột thínghiệm qua mô hình bơi kiệt sức Sản phẩm kombucha có tác dụng tăngcường sức khỏe, không gây ảnh hưởng xấu tới các chỉ tiêu sinh lý của chuột Như vậy, có thể thấy các nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam còn rất ít

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu và thiết bị hóa chất

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Ethanol, glucose, fructose, sacrose, lactose

Cao men, pepton, (NH4)3C6H5O7, KH2PO4, MgSO4.7H2O, HCl, NaOH… Methylenblue, lugol, fucshin, tím gentian, phenolphtalein,methyl red, thạch agar

* Thiết bị

Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức)

Nồi hấp Tommy (Nhật)

Box vô trùng (Haraeus)

Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)

Máy li tâm Sorvall (Mỹ)

Micropipet Jinson (Pháp)

Máy đo pH

Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ

Máy cất nước 2 lần (Hamilton – Anh)

Kính hiển vi quang học

Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, quetrang, lamen, đèn cồn và nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng

khác

2.1.3 Các loại môi trường

2.1.3.1 Môi trường phân lập, cấy truyền giống vi khuẩn lactic: MRS đặc (g/l) Glucose: 20 g Pepton: 5 g

2.1.3.2 Môi trường hoạt hóa giống vi khuẩn lactic: MRS dịch thể (g/l)

Môi trường như trên nhưng bỏ

2.1.4 Phạm vi nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn lactic có khả năng lên men kombucha từ chè TânTrào, Tuyên Quang

2.1.5 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp lên men

Nguyên liệu sử dụng là trà đặc sản Tân Trào - Tuyên Quang và đường

để sản xuất kombucha Trước hết cần đun sôi 1000 ml nước, bổ sung 20 gchè để trong thời gian 5 phút Sau đó lọc lấy dịch trà đổ vào bình nhựa sạch,thêm

100 g đường khuấy đều, để nguội Sau 7 ngày ta thu được kombucha,bao gồm dịch trà đường lên men và miếng thạch nổi lên trên bề mặt Tiếnhành phân lập được các chủng vi sinh vật

Cách làm: lấy dịch lên men kombucha lắc đều bằng máy vôntex trong

10 phút thu được huyền phù vi sinh vật Pha loãng dịch huyền phù ở cácnồng

độ khác nhau từ 10-1 đến 10-8 Dùng pipet hút 50 μll mẫu ở các độ phaloãng

10-3 đến 10-8 nhỏ lên mặt môi trường thạch vô trùng trong hộp petri, dùngque trang trang đều Sau đó ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp trong 2 ÷ 3ngày Dựa vào sự khác nhau của hình thái khuẩn lạc tiến hành tách một sốkhuẩn lạc đặc trưng ra khỏi môi trường phân lập, cấy thuần sau đó chuyểnsang thạch nghiêng bảo quản trong tủ 4oC [3]