Thiết lập chất đối chiếu PP. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng hoạt chất PP và xác định giới hạn tạp chất PZA trong chế phẩm bột khô phun sấy.
Trang 1THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU PALMITOYL PYRAZINAMID;
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PALMITOYL PYRAZINAMID
VÀ XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN TẠP CHẤT PYRAZINAMID
TRONG CHẾ PHẨM BỘT KHÔ PHUN SẤY
Huỳnh Thị Thanh Hằng * , Phan Thị Hương Giang ** , Lê Quang Hiển *** , Nguyễn Trường Thịnh *** ,
Võ Thị Quỳnh Như *** , Phạm Đình Duy * , Phan Văn Hồ Nam *
TÓM TẮT
Mở đầu: Các tiểu phân xốp mang tiền chất thuốc kháng lao pyrazinamid (PZA), palmitoyl
pyrazinamid (PP), có thể khắc phục được những khuyết điểm của PZA trong hệ thống trị liệu tại phổi Để góp phần kiểm soát chất lượng của nguyên liệu và chế phẩm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thiết lập chất đối chiếu PP, đồng thời xây dựng và thẩm định quy trình định lượng hoạt chất PP và xác định giới hạn tạp chất PZA trong chế phẩm bột khô phun sấy
Mục tiêu: Thiết lập chất đối chiếu PP Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng hoạt chất PP và xác định giới hạn tạp chất PZA trong chế phẩm bột khô phun sấy
Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Thiết lập chất đối chiếu PP theo hướng dẫn ISO Guide 35
Giá trị ấn định, độ lệch chuẩn, độ không đảm bảo đo chuẩn được tính toán theo hướng dẫn của ISO 13528 Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích theo hướng dẫn của ASEAN
Kết quả: PP đã được thiết lập chất đối chiếu với độ tinh khiết là 99,35% Đã xây dựng được quy trình
định lượng PP trong chế phẩm bột khô phun sấy bằng HPLC: Cột sắc ký HiQ sil C18HS (250 x 4,6 mm; 5μm), pha động 100% ACN, bước sóng phát hiện 268 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 20 μl, nhiệt độ cột 30 °C Đã xây dựng được quy trình định lượng tạp chất PZA trong chế phẩm bột khô phun sấy bằng HPLC: cột sắc ký Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm; 5μm), pha động ACN – Dung dịch acid acetic pH
3 (5:95), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 20 μl, nhiệt độ cột 30 °C, giới hạn phát hiện (LOD) của PZA được xác định là 0,005 ppm
Kết luận: PP đối chiếu đạt yêu cầu của một chất chuẩn sử dụng trong công tác kiểm tra và đánh giá
chất lượng nguyên liệu PP và chế phẩm Đồng thời đã xây dựng được quy trình định lượng PP và quy trình xác định giới hạn tạp chất PZA trong chế phẩm bột khô phun sấy bằng HPLC
Từ khóa: Palmitoyl pyrazinamid, pyrazinamid, thiết lập chất đối chiếu
ABSTRACT
ESTABLISHMENT OF REFERENCE STANDARD SYNTHESIZED PALMITOYL PYRAZINAMIDE
AS WELL AS QUANTITATIVE DETERMINATION OF PALMITATE PYRAZINAMIDE AND DETERMINATION OF PYRAZINAMIDE AS IMPURITY IN SPRAY-DRIED POWDER
BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
Huynh Thi Thanh Hang, Phan Thị Huong Giang, Le Quang Hien, Nguyen Truong Thinh,
Vo Thi Quynh Nhu, Pham Dinh Duy, Phan Van Ho Nam
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 489 – 498
* Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Trang 2Introduction: The small particles carrying the precursor of pyrazinamide (PZA), palmitoyl
pyrazinamide (PP), could overcome some PZA’s imperfection in lung-distributing system To monitor the quality of the new material and its products, the study on establishment of reference standard synthesized
PP as well as quantitative determination of palmitate pyrazinamide and determination of PZA as impurity
in spray-dried powder by high performance liquid chromatography was conducted
Objectives: The aim of this study was establishment of reference standard synthesized PP as well as
quantitative determination of palmitate pyrazinamide and determination of PZA as impurity in spray-dried powder by high performance liquid chromatography
Materials and Methods: Establishment of PP reference standard was carried out basing on general
guidelines of ISO 35 The standard uncertainty, assigned value, and standard deviation were calculated basing on ISO 13528 Development and validation of HPLC method for analysis of PZA and PP was carried out basing on ASEAN guidelines
Results: The assigned value of PP reached the purity of 99.35% HPLC conditions for assay of PP in
spray-dried powder were HiQ sil C18HS column (250 x 4.6 mm x 5 μm); column temperature of 30 o C; wavelength of 268 nm; mobile phase containing ACN 100%; flow rate of 1mL/min; injection volume of
20 μL; this method met requirements of system suitability, repeatability, linearity and accuracy HPLC conditions for determination of PZA impurity, in spray-dried powder were Phenomenex C18 column (250 x 4.6 mm x 5 μm); column temperature of 30 o C; wavelength of 268 nm; mobile phase containing ACN – acid acetic pH 3 (5:95); flow rate of 1mL/min; injection volume of 20 μL This method met requirements of system suitability, selectivity and the limit of PZA detection was 0.005 ppm
Conclusion: PP can be accepted as a reference standard for quality control of PP materials and
products thereof The HPLC method for qualification of PP was successfully developed
Key words: Palmitoyl pyrazinamide, pyrazinamide, establishment of reference standard
ĐẶT VẤN ĐỀ
Palmitoyl pyrazinamid (PP) được sử dụng
để bào chế các dạng trị liệu tại phổi nhằm hạn
chế pyrazinamid (PZA) phóng thích phóng
vào hệ thống tuần hoàn, tăng nồng độ thuốc
tại chỗ để duy trì hiệu quả điều trị lao phổi(5-7)
Để kiểm soát chất lượng của nguyên liệu và
các dạng bào chế từ hoạt chất này, cũng như
theo dõi nồng độ thuốc trong huyết tương
người trong các nghiên cứu dược động học,
dược lực học tiếp theo, nghiên cứu này được
tiến hành với mục tiêu thiết lập chất đối chiếu
PP đồng thời xây dựng quy trình định lượng
PP và thử giới hạn tạp chất PZA trong chế
phẩm bột khô phun sấy nhằm góp phần trong
việc tiêu chuẩn hóa sản phẩm
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
PP đã được tổng hợp và được xác định
độ tinh khiết trên 99% tính trên chế phẩm nguyên trạng theo nghiên cứu của Nguyễn Duy Phương và các cộng sự(5), tại bộ môn Hóa hữu cơ – Khoa Dược – Đại học Y Dược
TP Hồ Chí Minh Mẫu thuốc bột khô phun sấy PP được bào chế tại Khoa Dược, Đại học
Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Công thức: Palmitoyl pyrazinamid 0,3 g; tá dược vừa đủ 4,0 g
Chất đối chiếu
Pyrazinamid có hàm lượng tính trên chế phẩm khan là 99,94%, số lô 0212154 của Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương
Trang 3Hóa chất – dung môi
Acetonitril, methanol đạt tiêu chuẩn sắc ký
lỏng (Merck), acid acetic băng đạt tiêu chuẩn
phân tích (Merck), ethanol đạt tiêu chuẩn
phân tích (Prolabo)
Trang thiết bị
Hệ thống HPLC Alliance 2695e-2996, thiết
bị DSC Q20 TA Instrument, hệ thống LCMS
Ionization (Micromass), máy cộng hưởng từ
hạt nhân Bruker AM500 FTNMR Spectrometer
(Viện hóa học và Công nghệ Việt nam) Tủ
đóng ống Labconco Protector Glove Box (Viện
KN thuốc TP Hồ Chí Minh) Hệ thống HPLC
Shimadzu 20 AD với đầu dò PDA SPD-M20A
(Nhật Bản), cân phân tích Mettler Toledo AB
265- S, độ chính xác 0,1 mg (Thụy Sĩ), cân
phân tích Mettler Toledo AB 204, độ chính xác
0,01 mg (Thụy Sĩ), máy đo pH Mettler DL25
(Thụy Sĩ), Hanna- HI 2211 (Romania), bể siêu
âm Nahita 626 (Tây Ban Nha)
Phương pháp nghiên cứu
Quá trình thiết lập chất đối chiếu PP được
thực hiện theo các bước: đóng gói, đánh giá độ
đồng nhất giữa các lọ sau khi đóng gói theo
hướng dẫn của ISO guide 35:2006(2), đánh giá
kết quả định lượng liên phòng thí nghiệm tại
hai phòng thí nghiệm đạt GLP, xác định giá trị
công bố và độ không đảm bảo đo theo hướng
dẫn của ISO 13528:2005(1) Các lọ chuẩn được
đánh giá tại Khoa thiết lập chất chuẩn và chất
đối chiếu, Khoa Vật lý đo lường - Viện kiểm
nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh
Điều kiện sắc ký để xác định độ tinh khiết
theo phương pháp qui về 100% diện tích pic
là: Cột sắc ký C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm),
bộ phận phát hiện PDA, bước sóng phát hiện
20 μl, nhiệt độ cột 30°C, pha động ACN 100%, theo nghiên cứu của Nguyễn Duy Phương và các cộng sự(6) Đồng thời cũng dựa vào điều kiện sắc ký này để tiến hành thẩm định quy trình định lượng PP trong bột khô phun sấy theo hướng dẫn của ASEAN về thẩm định quy trình phân tích(4) Quy trình xác định tạp chất PZA trong bột khô phun sấy được tham khảo từ USP41(8): Pha tĩnh: Cột C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm), detector: PDA, bước sóng phát hiện: 268 nm, tốc độ dòng: 1,0 ml/phút, thể tích tiêm: 20 μl, nhiệt độ cột: 30 °C, pha động: ACN – Dung dịch acid acetic pH 3 (5:95)
KẾT QUẢ
Thiết lập chất đối chiếu PP
PP được đóng gói trong lọ thuỷ tinh nâu, nút có lớp đệm Teflon, môi trường khí trơ N2 99,99%, độ ẩm tương đối 10%, bảo quản ở nhiệt độ 2-8 oC 5 g PP được đóng 100 lọ, mỗi
lọ 50 mg và 6 lọ được lấy ngẫu nhiên theo phần mềm excel Kết quả xác định tính tương thích hệ thống quy trình xác định độ tinh khiết PP bằng HPLC tại 2 phòng thí nghiệm đều đạt yêu cầu, các thông số sắc ký đều có RSD 2% (Bảng 1) Kết quả đánh giá độ đồng nhất quá trình đóng lọ được trình bày trong Bảng 2 cho thấy độ lặp lại tương đối của độ tinh khiết PP giữa các lọ trong quá trình đóng gói đạt yêu cầu (RSD<1%) Như vậy, điều kiện đóng gói ổn định và phù hợp, các lọ đồng nhất trong quá trình đóng gói
Bảng 1: Kết quả tính tương thích hệ thống quy
trình xác định độ tinh khiết PP bằng HPLC tại 2 phòng thí nghiệm
Thời gian lưu (phút)
S peak (μV×s)
Độ tinh khiết (%)
Số đĩa lý thuyết biểu kiến
Hệ số kéo đuôi
PTN
1
TB 11,336 6520047 99,35 2586,66 1,18
PTN
2
TB 11,333 6516261 99,35 2573,74 1,19
Trang 4Bảng 2: Kết quả đánh giá độ đồng nhất lọ trong
quá trình đóng ống
Bảng 3: Kết quả đánh giá độ đồng nhất lọ liên
phòng thí nghiệm
Bảng 4: Kết quả phân tích robust A của chất đối
chiếu PP
Sử dụng phân tích ANOVA bằng phần
mềm Excel 2016 để đánh giá dữ liệu trong
Bảng 3, kết quả giá trị Ftn = 0,02 < F0,05 = 4,96,
kết quả thu được cho thấy kết quả xác định
độ tinh khiết của PP giữa 2 phòng thí nghiệm khác biệt không có ý nghĩa thống
kê Như vậy độ tinh khiết sắc ký không phụ thuộc vào phòng thí nghiệm tham gia đánh giá
Theo hướng dẫn của ISO 13528, từ kết quả phân tích robust A của chất đối chiếu
PP sau 3 chu kì (Bảng 4), giá trị s* không thay đổi Giá trị ấn định x*= 99,35%, độ lệch chuẩn thực của giá trị ấn định s* = 0,020 Z – score của tất cả 12 giá trị đều ≤ 2, giá trị công bố được tính từ 12 giá trị Giá trị công bố của chất đối chiếu PP có độ tinh khiết sắc ký là 99,35 % tính trên chế phẩm nguyên trạng Độ không đảm bảo đo là
Như vậy PP đủ điều kiện để đăng ký chuẩn quốc gia với hàm lượng được xác định 99,35 % tính theo hiện trạng Tiến hành lập hồ sơ chất chuẩn, dán nhãn lọ chuẩn và kmm theo phiếu kiểm nghiệm Bảo quản ở nhiệt độ 0 – 8 oC, tránh ánh sáng
Thẩm định quy trình phân tích định lượng PP và thử giới hạn tạp chất PZA trong bột phun sấy khô
Quy trình định lượng và thử giới hạn tạp chất được thẩm định với các chỉ tiêu: Tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, LOD, độ đúng và độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian) đạt yêu cầu theo hướng dẫn của ASEAN (Bảng 5)
Trang 5A Sắc ký đồ mẫu trắng D Sắc ký đồ mẫu thử
Hình 1: Sắc ký đồ của mẫu trắng (A), mẫu placebo (B), mẫu chuẩn (C), mẫu thử (D), mẫu placebo thêm
chuẩn (E) và mẫu thử thêm chuẩn (F), khi tiến hành thẩm định tính đặc hiệu của quy trình định lượng PP
trong bột khô sấy phun
Trang 6A Phổ UV-Vis của pic PP trong mẫu chuẩn B Phổ UV-Vis của pic PP trong mẫu thử
Hình 2: Phổ UV-Vis của pic PP trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn (A) và mẫu thử (B), và kết quả tính tinh
khiết pic của mẫu chuẩn (C) và mẫu thử (D) được tính bằng phần mềm của hệ thống HPLC khi thẩm định
tính đặc hiệu của quy trình định lượng PP trong bột khô sấy phun
Trang 7A Sắc ký đồ mẫu trắng C Sắc ký đồ mẫu chuẩn
B Sắc ký đồ mẫu placebo D Sắc ký đồ mẫu thử
E Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn
Hình 3: Sắc ký đồ của mẫu trắng (A), mẫu placebo (B), mẫu chuẩn (C), mẫu thử (D), và mẫu thử thêm chuẩn
(E), khi tiến hành thẩm định tính đặc hiệu của quy trình xác định tạp PZA trong bột khô sấy phun PP
Trang 8A Phổ UV của mẫu chuẩn B Phổ UV của mẫu thử
Hình 4: Phổ UV-Vis của pic PP trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn (A) và mẫu thử (B), và kết quả tính tinh
khiết pic của mẫu chuẩn (C) và mẫu thử (D) được tính bằng phần mềm của hệ thống HPLC khi thử tính
đặc hiệu của quy trình định lượng PP trong bột khô sấy phun
Trang 9Bảng 5: Kết quả thẩm định quy trình định lượng PP và thử giới hạn tạp chất PZA trong chế phẩm bột khô phun sấy
LƯỢNG PP
QUY TRÌNH THỬ GIỚI HẠN TẠP CHẤT PZA
Tính phù hợp
hệ thống
RSD của thời gian lưu và diện tích pic của pic chính
cần phân tích trong mẫu chuẩn và mẫu thử đều ≤ 2%; hệ số kéo đuôi (T) nằm trong khoảng 0,8-1,5; số
đĩa lý thuyết biểu kiến (N bk ) ≥ 2000
RSD tR = 0,05%;
RSD Spic = 0,12%;
T= 1,30; N bk = 3211
3211
RSD tR = 0,06%; RSD Spic = 0,3%; T= 1,25; N bk = 9670
Độ đặc hiệu Sắc ký đồ mẫu thử tương ứng với mẫu chuẩn và
được chứng minh không bị ảnh hưởng bởi tá dược
bằng thời gian lưu và tính năng kiểm tra độ tinh khiết
pic của phần mềm Phổ UV-vis của pic trong sắc ký
đồ mẫu thử và mẫu chuẩn giống nhau
Đạt (sắc ký đồ minh họa
ở Hình 1, Hình 2)
Đạt (sắc ký đồ minh họa
ở Hình 3, Hình 4)
Khoảng tuyến
tính
Sử dụng phân tích hồi quy với trắc nghiệm t để kiểm
tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy
và trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của
phương trình hồi quy
R2≥ 0,998
Phương trình tương quan hồi quy: ŷ = 29161x;
R2 = 0,9995
Khoảng tuyến tính của
PP là: 0,6 – 150,0 µg/mL
-
Độ đúng Độ hồi phục trong khoảng ở 3 mức 80, 100, 120% là
98-102%
RSD ≤ 2%
Tỉ lệ phục hồi là 98,54%;
mẫu thử là 8,16% RSD=
0,32%
Độ chính xác
trung gian
Các kết quả thu được không được khác nhau có ý
nghĩa thống kê (sử dụng F-test với khoảng tin cậy
95% để kiểm tra) RSD ≤ 2%
Hàm lượng PP trong mẫu thử là 8,17%; RSD=
0,41%
LOD Xác định nồng độ tối thiểu mà tại đó có thể đọc được
0,005 ppm
BÀN LUẬN
Vì PP và PZA có độ phân cực hoàn toàn
ngược nhau, logP của PP và PZA lần lượt là
4,39(6) và -0,06(3), trên thực tế PP hoàn toàn không
tan trong pha động ACN – Dung dịch acid acetic
pH 3 (5:95), còn PZA thì hoàn toàn không bị lưu
giữ khi sử dụng pha động ACN – CH3COOH 1%
(95:5) (Hình 5) Do vậy quy trình phân tích được
xây dựng để xác định PP hoàn toàn không bị
ảnh hưởng bởi sự hiện diện của PZA và ngược
lại Việc sử dụng ACN 100% làm pha động trong
quy trình phân tích PP được cân nhắc giữa lợi
ích và nguy cơ, đảm bảo có thể áp dụng trên
thực tiễn Bao gồm thời gian phân tích là rút
ngắn còn 10 phút khi sử dụng ACN 100% so với
30 phút khi sử dụng hệ dung môi ACN –
CH3COOH 1% (95:5) (Hình 5) và quá trình giảm
số đĩa lý thuyết biểu kiến khoảng 5% sau 50 lần
tiêm mẫu
Hình 5: Sắc ký đồ của hỗn hợp gồm PP (30 ppm)
và PZA (ppm) trong ACN, khi tiến hành sắc ký với điều kiện sắc ký của quy trình định lượng PP trong bột sấy phun sử dụng pha động ACN –
CH 3 COOH 1% (95:5)
Trang 10KẾT LUẬN
PP đã được thiết lập chất đối chiếu với độ
tinh khiết 99,35 % tính trên chế phẩm nguyên
trạng độ không đảm bảo đo 0,007, độ lệch
chuẩn 0,020 (n=12), đạt yêu cầu của một chất
chuẩn sử dụng trong công tác kiểm tra và
đánh giá chất lượng nguyên liệu PP và chế
phẩm Quy trình định lượng PP và quy trình
xác định giới hạn tạp chất PZA trong chế
phẩm bột khô phun sấy bằng HPLC đã được
thẩm định và đã đạt các yêu cầu theo hướng
dẫn của ASEAN Có thể ứng dụng quy trình
định lượng PP và thử giới hạn tạp chất PZA
vào việc tiêu chuẩn hóa hệ thống phân phối
thuốc đến phổi
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 ISO 13528:2005, (2005) Statisticamle thods for use in
proficiency testing by inter-laboratory comparisons, p.64
2 ISO Guide 35:2006, (2006) Reference materials — General
and statistical principles, pp.48
3 National Center for Biotechnology Information, PubChem Compound Database, (2005) Pyrazinamide [online] [cited
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/1046
4 NCL ASEAN Experts, (2012) Asean guidline for validation
of analytical procedures, pp.1-17
5 Nguyễn Duy Phương, Phạm Đình Duy, Phạm Ngọc Tuấn Anh (2018) Nghiên cứu tổng hợp Palmitoyl Pyrazinamid Chuyên
đề Dược, Y học Thành phố Hồ Chí Minh, phụ bản 22(2): tr.13-17
6 Nguyễn Duy Phương, Phạm Đình Duy, Phan Văn Hồ Nam (2018) Xây dựng quy trình định lượng Palmitoyl pyrazinamid bằng phương pháp HPLC và ứng dụng để xác định hệ số phân bố log P của Palmitoyl pyrazinamid
Chuyên đề Dược, Y học Thành phố Hồ Chí Minh, phụ
bản22(2): tr.197-203
7 Pham DD, Grégoire N, Couet W, Gueutin C, Fattal E, Tsapis N (2015) Pulmonary delivery of
pyrazinamide-loaded large porous particles European Journal of
Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 94: pp.241-250
8 United States Pharmacopeial Convention, (2018) Pyrazinamide [online] [cited May 25, 2018] Available from: http://www.uspnf.com
Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019