Luận án tiến sĩ Sinh học: Tách dòng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất của endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam

Mục đích nghiên cứu của đề tài là tuyển chọn được chủng vi khuẩn B. thuringiensis bản địa có khả năng sinh chitinase cao và biểu hiện được chitinase tái tổ hợp trong E. coli phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm hỗ trợ khả năng diệt côn trùng của chế phẩm BT và ức chế nấm hại cây trồng.

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRỊNH THỊ THU HÀ

TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH

CHẤT CỦA ENDOCHITINASE TỪ Bacillus thuringiensis

PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 9420107

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRỊNH THỊ THU HÀ

TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH

CHẤT CỦA ENDOCHITINASE TỪ Bacillus

thuringiensis PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 9420107

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Ngô Đình Bính

Viện Công nghệ sinh học

2 PGS.TS Đồng Văn Quyền

Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2018

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngô Đình Bính, giáo viên hướng dẫn khoa học, người đã tạo điều kiện và luôn ở bên truyền dạy kiến thức, kinh nghiệm và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Tôi xin trân trọng cám ơn người hướng dẫn khoa học - PGS TS Đồng Văn Quyền - Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận án này

Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám đốc Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học cùng các cán bộ thuộc Trung tâm đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu Tôi xin cám ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện làm việc thuận lơi nhất cho tôi hoàn thành khóa học và bản luận án này

Tôi xin cám ơn Bộ phận đào tạo, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành mọi thủ tục trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến các đồng nghiệp, bạn bè trong và ngoài Viện Công nghệ sinh học đã luôn quan tâm, động viên và chỉ dẫn cho tôi để tôi hoàn thành luận án

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người thân trong gia đình, những người luôn bên tôi động viện, chia sẻ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày……tháng… năm 2018

Tác giả

Trịnh Thị Thu Hà

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả;

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các số liệu, nội dung đã trình bày trong luận án

Hà Nội, ngày … tháng …….năm 2018

Tác giả

Trịnh Thị Thu Hà

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……… 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1 Vi khu n Bacillus thuringiensis……… 5

1.1.1 S c v thuringi nsis……… 5

1.1.2 S phát tri n và ng ng c chitin s t thuringi nsis tr n th gi i 7 1.2 Chitinase t nhiên……… 10

1.2.1 Ngu n g c c chitin s ……… 11

1.2.2 Ph n o i chitin s ……… 12

1.2.3 Cấu trúc c chitin s ……… 14

1.2.4 C ch ho t ộng c chitin s ……… 16

1.2.5 Các y u t nh h ng n ho t t nh c chitin s ……… 18

1.2.6 Các y u t nh h ng n quá tr nh sinh t ng h p chitin s 20

1.3 Chitinase tái tổ h p 22

1.3.1 Hệ i u hiện Esch richi co i 26

1.3.2 Một s y u t nh h ng n quá tr nh n m n t ng h p chitin s tái t h p……… 29

1.3.3 Thu h i và tinh s ch chitin s tái t h p……… 30

1.4 Ứng d ng c a chitinase 31

1.4.1 Trong nông nghiệp và o vệ môi tr ng 31

1.4.2 Ứng d ng trong công nghiệp 33

1.4.3 Ứng d ng trong y c 34

1.4.4 Ứng d ng trong c tính sinh kh i nấm 34

1.4.5 Ứng d ng trong công nghệ sinh học 35

1.5 Sơ lư c về tình hình sâu bệnh hại cây trồng……… 36

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.1 Vật liệu nghiên cứu 39

2.1.1 Ch ng gi ng và p smi ……… 39

2.1.2 Thi t bị……… 39

2.1.3 Hóa chất……… 40

2.1.4 Môi tr ng nuôi cấy……… 40

2.1.5 Dung dịch 41

2.2 Phương pháp nghiên cứu 41

2.2.1 Ph ng pháp vi sinh 41

2.2.2 Ph ng pháp hó sinh 43

2.2.3 Ph ng pháp sinh học phân tử 45

2.2.4 T i u i u kiện i u hiện th o ph ng pháp mặt áp ng 52

2.2.5 Nghiên c u tính chất hóa lý c a chitinase tái t h p 52

2.2.6 Ph ng pháp thử nghiệm 54

2.2.7 Xử lý s liệu……… 56

2.2.8 S nghi n c u 57

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 58 3.1 Phân lập vi khu n Bacillus thuringiensis có khả năng sinh chitinase ở Việt Nam……… 58

3.1.1 Ph n p vi khu n thuringi nsis……… 58

3.1.2 Phân lo i i loài các ch ng B thuringiensis phân l p………… 61

3.1.3 Sàng ọc ho t t nh th y ph n chitin c các ch ng thuringi nsis s rov r kurst ki……… 63

3.1.4 Sàng ọc g n n ochitin s chi c các ch ng thuringi nsis s rov r kurst ki……… 65

3.1.5 Sàng ọc ho t t nh kháng nấm c các ch ng thuringi nsis s rov r kurst ki……… 66

3.2 Khảo sát iều kiện sinh tổng h p chitinase c a ch ng Bacillus thuringiensis var kurstaki MSS1.1……… 66

3.2.1 Th i gian nuôi cấy……… 67

3.2.2 Nhiệt ộ nuôi cấy……… 67

3.2.3 Ngu n c chất……… 67

3.2.4 N ng ộ c chất……… 68

3.2.5 pH môi tr ng nuôi cấy……… 68

3.2.6 Ngu n c c on……… 69

3.2.7 Ngu n ni t ……… 69

3.2.8 Môi tr ng thay th ……… 70

3.3 Nhân d ng gen chiA mã h a chitinase từ ch ng vi khu n B thuringiensis var kurstaki MSS1.1 70

3.4 Biểu hiện gen chiA trong vi khu n E coli BL21……… 74

3.4.1 Thi t k vector bi u hiện gen chiA trong vi khu n E.co i L21…… 74

3.4.2 Bi u hiện chiA tái t h p trong E coli L21 DE3 ……… 77

3.4.3 Nghiên c u i u kiện bi u hiện gen chiA c a ch ng tái t h p…… 79

3.4.4 T i u kh năng i u hiện rChi ằng ph ng pháp mặt áp ng……… 84

3.4.5 Ki m tra s t ng th ch giữa mô hình và th c nghiệm 88

3.4.6 Tinh s ch và xác ịnh ho t tính c a chitinase tái t h p……… 89

3.5 Nghiên cứu tính chất c a chitinase tái tổ h p……… 90

3.5.1 Nhiệt ộ t i u và ộ b n nhiệt……… 90

3.5.2 pH t i u và ộ b n pH……… 91

3.5.3 Ảnh h ng c a ion kim lo i và EDTA lên ho t t nh chitin s ……… 92

3.5.4 Ảnh h ng c a chất t y rử ……… 92

3.5.5 Ảnh h ng c a dung môi hữu c ……… 93

3.5.6 Động học c a ph n ng nzym ……… 93

3.5.7 S n ph m c a s th y ph n c chất b i chitin s ……… 95

3.6 Th nghiệm khả năng kháng nấm gây bệnh th c vật và tăng hoạt tính diệt sâu c a chitinase tái tổ h p……… 95

3.6.1 Kh năng kháng nấm gây bệnh th c v t c a chitinase tái t h p… 95

3.6.2 Hỗ tr ho t tính diệt sâu Bộ cánh v y c a chitinase tái t h p…… 97

Chương 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ 99 4.1 Phân lập vi khu n Bacillus thuringiensis có khả năng sinh chitinase ở Việt Nam……… 99

4.1.1 Ph n p vi khu n thuringi nsis……… 99

4.1.2 Phân lo i i loài kurstaki các ch ng B thuringiensis phân l p… 100 4.1.3 Sàng ọc ho t t nh th y ph n chitin c các ch ng thuringi nsis s rov r kurst ki……… 100

4.1.4 Sàng ọc g n n ochitin s chi c các ch ng thuringi nsis s rov r kurst ki……… 101

4.1.5 Sàng lọc ho t tính kháng nấm c các ch ng thuringi nsis serovar kurst ki……… 101

4.2 Khảo sát iều kiện sinh tổng h p chitinase c a ch ng Bacillus thuringiensis var kurstaki MSS1.1……… 102

4.2.1 Th i gi n nuôi cấy……… 102

4.2.2 Nhiệt ộ nuôi cấy……… 103

4.2.3 Ngu n c chất……… 103

4.2.4 N ng ộ c chất……… 104

4.2.5 pH môi tr ng nuôi cấy……… 104

4.2.6 Ngu n các on……… 105

4.2.7 Ngu n ni t ……… 105

4.2.8 Môi tr ng thay th ……… 106

4.3 Phân tích trình t gen chiA và cấu trúc mô phỏng c a protein ChiA ……….……… 107

4.4 Biểu hiện rChiA trong vi khu n E coli BL21 (DE3)……… 108

4.4.1 Bi u hiện rChiA trong vi khu n……… 108

4.4.2 T i u i u kiện bi u hiện……… 109

4.4.3 T i u kh năng i u hiện rChiA bằng ph ng pháp mặt áp ng……… 112

4.4.4 Tinh s ch và xác ịnh ho t tính c a chitinase tái t h p……… 113

4.5 Nghiên cứu tính chất c a chitinase tái tổ h p……… 114

4.5.1 Nhiệt ộ t i u và ộ b n nhiệt……… 114

4.5.2 pH t i u và ộ b n pH……… 115

4.5.3 Ảnh h ng c a ion kim lo i và EDTA lên ho t t nh chitin s ……… 115

4.5.4 Ảnh h ng c chất t y rử 116

4.5.5 Ảnh h ng c a dung môi hữu c 117

4.5.6 Động học c a ph n ng enzym 117

4.5.7 S n ph m c a s th y ph n c chất b i chitinase 118

4.6 Th nghiệm khả năng kháng nấm gây bệnh th c vật và tăng hoạt tính diệt sâu c a chitinase tái tổ h p 118

4.6.1 Kh năng kháng nấm gây bệnh th c v t c a chitinase tái t h p 118

4.6.2 Hỗ tr ho t tính diệt sâu Bộ cánh v y c a chitinase tái t h p 119

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 122

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 123

TÓM TẮT KẾT QUẢ LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH.……… 124

TÀI LIỆU THAM KHẢO……….……… 130

PHỤ LỤC

Btk Bacillus thuringiensis serovar kurstaki

Colloidal chitin Chitin dạng keo

dNTP deoxyribo Nucleotide 5‟- Triphosphate

DNS 3,5 - dinitrosalicylic

E coli Escherichia coli

EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid

LB Luria –Bertani – môi trường nuôi cấy vi khuẩn

OD Optical density - mật độ quang học

PCR Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi

PDA Môi trường khoai tây

rChiA Chitinase tái tổ hợp

SDS-PAGE Điện di trên gel polyacrylamide có chứa sodium

doecyl sulfat

DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần các môi trường nuôi cấy……… 40

Bảng 2.2 Thành phần và nồng độ các loại dung dịch……… 41

Bảng 3.1 Kết quả phân lập và kết quả xác định hình dạng tinh thể của

Bảng 3.2 Phân loại Bt bằng phương pháp huyết thanh……… 62

Bảng 3.3 Hoạt tính thủy phân chitin của các chủng Btk……… 64

Bảng 3.4 Hoạt tính kháng nấm của các chủng sinh chitinase………… 66

Bảng 3.5 Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide và amino acid……… 72

Bảng 3.6 Sinh trưởng của tế bào và hoạt tính enzym ở các nhiệt độ cảm

Bảng 3.7 Kết quả của 20 thí nghiệm cho 3 yếu tố ảnh hưởng………… 84

Bảng 3.8 Kết quả phân tích hồi quy hoạt độ chitinase……… 85

Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra giữa mô hình và thực nghiệm……… 88

Bảng 3.10 Kết quả tinh sạch chitinase tái tổ hợp……… 90

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA lên hoạt tính

Bảng 3.12 Các thông số động học của rChiA với các cơ chất khác nhau 95

Bảng 3.13 Nồng độ gây chết 50% (LC50) của protein tinh thể Cry và

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo tế bào Bt……… 6

Hình 1.2 Phản ứng ngưng kết của vi khuẩn Bt với kháng nguyên

Hình 1.3 Cấu trúc không gian họ chitinase 19….……… 14

Hình 1.4 Sự tương đồng vùng xúc tác của chiA74 với chitinase của

Hình 1.5 Cơ chế hoạt động của enzym chitinase ở Trichoderma.…… 17

Hình 2.1 Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng N-acetyl glucosamine

theo phương pháp Miller……… 44

Hình 2.2 Đồ thị đường chuẩn hàm lượng BSA theo Bradford……… 45

Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu……… 57

Hình 3.1 Bản đồ 7 vùng địa lý của Việt Nam……… 58

Hình 3.2 Khuẩn lạc vi khuẩn Bt trên môi trường MPA sau 72 giờ

Hình 3.3 Hình dạng tinh thể dưới kính hiển vi của một số chủng Bt 61

Hình 3.4 Hình ảnh ngưng kết của Bt với huyết thanh đ c hiệu 4D4 63

Hình 3.5 Hình ảnh sàng lọc hoạt tính thủy phân chitin của một số

chủng Bt (A) và hoạt tính chitinase của 11 chủng Bt có đường kính vòng phân giải ≥ 25mm (B)… ……… 65

Hình 3.6 Kết quả sàng lọc gen chiA t các chủng Btk phân lập ở Hà

Hình 3.7 Ảnh kháng nấm R solani (A) và F oxysporum (B) của các

Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian (A) và nhiệt độ nuôi cấy (B) lên

khả năng sinh tổng hợp chitinase……… 67

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất (A) và nồng độ cơ chất (B)

lên khả năng sinh tổng hợp chitinase……… 68

Hình 3.10 Ảnh hưởng của pH môi trường (A) và nguồn các bon (B)

lên khả năng sinh tổng hợp chitinase……… 69

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nguồn ni tơ lên khả năng sinh tổng hợp

Hình 3.12 Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen chiA t các dòng

khuẩn lạc trắng (A) và điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết t các khuẩn lạc dòng pGEM-Teasy/MSS1.1 trên

Hình 3.13 So sánh trình tự nucleotide đoạn gen chiA của chủng B

thuringiensis MSS1.1 với trình tự EF581163.2……… 73

Hình 3.14 So sánh trình tự amino acid của chủng B thuringiensis

serovar kurstaki MSS1.1 với trình tự có mã số

ABQ65137.2 trên ngân hàng dữ liệu……… 73

Hình 3.15 Cấu trúc 3 vùng của protein ChiA……… 74

Hình 3.16 Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện gen chiA……… 75

Hình 3.17 Điện di đồ gen chiA (A) và vector pET28b(+) tinh sạch (B) 76

Hình 3.18 Kết quả PCR khuẩn lạc các dòng biến nạp mang gen chiA

với c p mồi đ c hiệu (A) và cắt vector tái tổ hợp

pET28b/chiA với EcoRI và XhoI (B)……… … 77

Hình 3.19 Phổ điện di protein trên gel SDS-PAGE …….……… 77 Hình 3.20 Phân tích Western blot (A) và kết quả kiểm tra hoạt tính

chitinase của dịch chiết protein tái tổ hợp trên đĩa thạch

Hình 3.21 Phổ điện di protein ChiA tái tổ hợp biểu hiện ở các nhiệt độ

Hình 3.22 Kết quả điện di protein ChiA tái tổ hợp biểu hiện ở các

nồng độ IPTG khác nhau (A) và ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng đến hoạt tính protein tái tổ hợp (B)………… 81

Hình 3.23 Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng (A) và mật độ tế bào (B)

đến hoạt tính protein tái tổ hợp……… 82

Hình 3.24 Ảnh hưởng của nồng độ lactose đến hoạt tính chitinase,

sinh trưởng của chủng E coli tái tổ hợp (A) và phổ điện di

protein tái tổ hợp khi cảm ứng bằng lactose (B)……… 83

Hình 3.25 Bề m t đáp ứng của t ng c p các yếu tố ảnh hưởng đến

sinh tổng hợp chitinase của chủng E coli tái tổ hợp.……… 87

Hình 3.26 Điện di SDS-PAGE chitinase tinh sạch (A); kiểm tra hoạt

tính chitinase bằng Zymogram (B) và phân tích Western

Hình 3.27 Nhiệt độ tối ưu (A) và độ bền nhiệt (B) của rChiA……… 91

Hình 3.28 pH tối ưu (A) và độ bền pH (B) của rChiA ………… …… 91

Hình 3.29 Ảnh hưởng của chất tẩy rửa (A) và dung môi hữu cơ (B)

lên hoạt tính enzym của rChiA……… 93

Hình 3.30 Biến đổi vận tốc phản ứng theo nồng độ chitin (A) và

4-MU-(GlcNAc)3 (C) Đồ thị Linewever-Burk của rChiA với

cơ chất chitin (B) và cơ chất 4-MU-(GlcNAc)3 (D)……… 94

Hình 3.31 Phân tích bản mỏng (TLC) các sản phẩm thủy phân chitin

Hình 3.32 Sự ức chế phát triển nấm F oxysporum (A), R solani (B)

và Mucor sp (C) của rChiA sau 3 ngày……… 96

Hình 3.33 Sợi nấm F oxysporum, R solani và Mucor sp khi xử lý

với enzym đã bất hoạt (A, C, E) và với rChiA (B, D, F) … 97

Hình 3.34 Thử nghiệm khả năng diệt sâu tơ (A) và sâu khoang (B)

của protein tinh thể Cry, rChiA……… 98

Hình 3.35 Hình ảnh thử sâu tơ (A) và sâu khoang (B)………… …… 98

Hình 4.1 Cấu trúc không gian mô phỏng của protein ChiA t chủng Btk

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn ề

Trong nhiều năm qua, thuốc tr sâu sinh học t vi khuẩn Bacillus

thuringiensis (Bt) đã được nghiên cứu và ứng dụng để diệt tr các loại côn trùng hại

cây trồng và bảo vệ sức khỏe cộng đồng Cùng với sự phát triển kinh tế - xã hội, nhu cầu sử dụng các sản phẩm nông nghiệp sạch, hạn chế mức thấp nhất thuốc tr sâu hóa học trong sản xuất nông nghiệp của con người ngày càng cao Thuốc tr sâu sinh học Bt đã được sử dụng, do chúng khắc phục được tính kháng thuốc của côn trùng và chỉ diệt các loài côn trùng có hại mà không ảnh hưởng đến môi trường sinh thái cũng như sức khỏe con người

Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn Bt sản sinh một số chất chuyển hóa có tiềm năng ứng dụng như: enzym thủy phân chitin (chitinase) và chất kháng sinh Các sản phẩm chuyển hóa này có thể ức chế vi khuẩn gây bệnh qua thực phẩm ho c kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh như vi khuẩn, nấm Vì vậy, việc tạo

ra một lượng lớn enzym, đ c biệt là chitinase bổ sung vào chế phẩm sinh học Bt để tăng hoạt tính diệt côn trùng là rất cần thiết

Chitinase (EC 3.2.1.14) thuộc nhóm enzym thủy phân, xúc tác quá trình phân hủy cơ chất chitin không tan trong nước thành các sản phẩm chitin-oligosaccharide hòa tan trong nước thông qua quá trình thủy phân liên kết β-(1,4)- glucoside giữa C-

1 và C4 của hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau trong chitin Hiện nay, chitinase được ứng dụng chủ yếu trong sản xuất chitooligosaccharide, nano-chitin, N-acetyl-D-glucosamine Đây là những sản phẩm giá trị ứng dụng cao và được sử dụng trong thực phẩm, nông nghiệp, y dược Ngoài ra, chitinase đ c biệt là endochitinase còn được sử dụng như thuốc tr sâu sinh học trong nông nghiệp nhờ khả năng phân hủy chitin cấu trúc trong thành tế bào của nấm, côn trùng gây bệnh

và xử lý các chất thải giàu chitin Do kiểu phân cắt mà endochitinase phân cắt cơ chất chitin và vách tế bào nấm chứa chitin tốt hơn so với chitobiosidase và N –

acetylglucosaminidase Vì vậy, việc phân lập tìm ra chủng Bt sinh endochitinase

cao và qui trình tạo ra endochitinase có hoạt tính cao bằng công nghệ gen nhằm góp

phần tăng hiệu quả của chế phẩm sinh học là rất cần thiết

Xuất phát t những lý do trên, chúng tôi tiến hành lựa chọn đề tài luận án:

“Tách d ng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất c a endochitinase từ Bacillus

thuringiensis phân lập ở Việt Nam”

2 M c tiêu nghiên cứu

(1) Sàng lọc và thu nhận được chủng vi khuẩn B thuringiensis Việt Nam có

khả năng sinh tổng hợp chitinase cao và xác định được trình tự nucleotide của gen

mã hóa chitinase t chủng vi khuẩn Bt đã tuyển chọn

(2) Biểu hiện và tinh sạch được chitinase tái tổ hợp (rChiA) trong E coli BL21

(DE3)

(3) Đánh giá được tác dụng tương hỗ của chitinase tái tổ hợp với protein tinh thể Cry trong diệt côn trùng và khả năng ức chế nấm gây bệnh thực vật

3 Nội dung nghiên cứu

(1) Phân lập và nghiên cứu đ c điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn B

thuringiensis Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao;

(2) Nghiên cứu một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp

chitinase của chủng B thuringiensis tuyển chọn;

(3) Nghiên cứu tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa chitinase phân lập

t chủng B thuringiensis tuyển chọn;

(4) Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chitinase t chủng B thurigiensis tuyển

chọn được và tinh sạch chitinase tái tổ hợp;

(5) Nghiên cứu một số tính chất hóa lý của chitinase tái tổ hợp;

(6) Nghiên cứu khả năng ức chế nấm gây bệnh thực vật của chitinase tái tổ hợp và tác dụng hỗ trợ của chitinase đối với khả năng diệt côn trùng của protein tinh thể Cry

4 Nh ng ng g p mới c a luận án

(1) Tuyển chọn được 36 chủng vi khuẩn B thuringiensis Việt Nam có khả

năng sinh tổng hợp chitinase cao

(2) Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ

thống về endochitinase (tự nhiên và tái tổ hợp) t chủng B thuringiensis serovar

kurstaki MSS1.1 của Việt Nam có khả năng bảo vệ kép (Dual control) - v a kháng

nấm Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani gây bệnh thực vật v a tăng hoạt tính

diệt côn trùng của chế phẩm BT nhằm phục vụ cho phát triển thuốc tr sâu bệnh sinh học thế hệ mới

(3) Bổ sung cơ sở dữ liệu nguồn gen chitinase của các chủng B thuringiensis

Việt Nam phục vụ cho nghiên cứu, đào tạo và ứng dụng sau này

5 Ý nghĩa khoa học và th c tiễn c a ề tài

có hiệu suất cao

Công trình đã làm phong phú thêm thông tin trong lĩnh vực công nghệ enzym nhờ những nghiên cứu về sinh tổng hợp, tinh sạch, đ c tính lí hóa và định hướng ứng dụng của chitinase

5.2 Ý nghĩa th c tiễn

Kết quả luận án góp phần khai thác có hiệu quả tiềm năng nguồn gen vi sinh

vật trong nước nói chung và gen chiA nói riêng nhằm tạo ra các sản phẩm enzym

công nghiệp có giá trị ứng dụng trong các lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp,

hướng tới phát triển công nghệ sạch và sản phẩm sạch có ích cho sức khỏe con người, không gây ô nhiễm môi trường

Tạo được chủng E coli tái tổ hợp biểu hiện cao chitinase t chủng B

thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 của Việt Nam và bước đầu nghiên cứu phát

triển chế phẩm sinh học BT diện côn trùng và nấm gây bệnh nhằm hỗ trợ và thay thế thuốc tr sâu hóa học

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi khu n Bacillus thuringiensis

l c v B thuringiensis

Bacillus thuringiensis (Bt) là vi khuẩn đất thuộc chi Bacillus, môi trường sống

chính của Bt gồm đất, côn trùng, hạt ngũ cốc, bề m t thực vật B thuringiiensis có

dạng hình que, gram dương, hô hấp hiếu khí ho c kị khí không bắt buộc, sinh bào

tử, bào tử hình oval, trong quá trình hình thành bào tử hầu hết các chủng Bt đều tổng hợp protein tinh thể Tinh thể có kích thước 0,6 - 2 µm, có hình dạng không cố định có thể là hình lập phương, hình lưỡng tháp ho c hình cầu Tinh thể có thể chiếm tới 30% trọng lượng khô của tế bào Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm coomassie brilliant blue và quan sát dưới kính hiển vi, tinh thể Bt bắt màu xanh đậm còn bào tử bắt màu xanh nhạt Trong môi trường lỏng Bt có khả năng chuyển động nhờ các lông roi trên bề m t tế bào (Hình 1.1) (Ngô Đình Bính, 2011) Bt có khả năng sinh trưởng, phát triển trong khoảng nhiệt độ 20 - 40ºC, nhiệt độ tối ưu là 28 -32ºC, Bt phát triển tối ưu ở pH = 7

Bt được phân loại theo nhiều phương pháp khác nhau: dựa trên đ c điểm hình thái và đ c điểm sinh hoá, theo ngoại hình enzym lipase, theo typ huyết thanh kháng nguyên - O, theo typ huyết thanh kháng protein tinh thể, theo typ huyết thanh kháng nguyên - H, theo nguồn bệnh và theo gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng Trong đó, phương pháp phân loại theo de Barjac và Bonnefoi dựa trên nguyên lý của phản ứng kháng nguyên - kháng thể được sử dụng rộng rãi (khi kháng nguyên tiêm mao kết hợp với kháng thể xảy ra phản ứng ngưng kết tạo c n lắng màu trắng xuống đáy ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường Dưới kính hiển vi quang học ho c đối pha có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lại không chuyển động được (Hình 1.2) Đến năm 1999, đã phát hiện được 69 typ huyết thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh khác nhau của Bt (de Barjac và Bonnefoi, 1962)

Hình đồ cấu tạo tế bào B thuringiensis

(Ngu n: Ngô Đ nh nh, 2011

Các tinh thể protein được hình thành trong quá trình tạo bào tử, chúng được tạo thành t một ho c một vài gen cry (crystal) và gen cyt (cytolytic) mã hóa tinh thể độc nằm trên các plasmid lớn và một số ít xuất hiện cả trên nhiễm sắc thể Tùy theo thành phần protein cấu tạo khác nhau mà các tinh thể có hình dạng khác nhau Hầu hết các tinh thể có hoạt tính với côn trùng bộ cánh vảy có dạng hình lưỡng tháp, tinh thể có hoạt tính với côn trùng bộ hai cánh có dạng hình cầu, tinh thể có hoạt tính với côn trùng bộ cánh cứng có dạng hình cầu, hình khối lập phương

Ngoài ra, trong quá trình sinh trưởng, phát triển vi khuẩn Bt còn sản sinh chất chuyển hóa có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: môi trường, thực phẩm, y tế, nông nghiệp, công nghiệp, công nghệ sinh học…đó chính là enzym

Tế bào vi khuẩn

với kháng nguyên

bề m t

Phân tử kháng thể với hai vị trí liên kết đ c hiệu

Plasmide

Mezosome

thủy phân chitin (chitinase)

Hiện nay, trên thế giới có khoảng 38 gen chitinase đã được công bố thuộc các

dưới loài khác nhau như: kenyea, pakistani, colmeri, canadiensis, entomocidus,

kurstaki, israelensis và konkukian Trong đó chủ yếu được tách dòng ở Trung Quốc

(55%), còn lại là ở Mexico, M , Ai Cập, Thổ Nhĩ Kỳ, Thái Lan, Ấn Độ, Pakistan, Tunisia và Hàn Quốc (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)

2 phát tri n v ứng ng của chitinase t B thuringiensis trên thế giới

Enzym thủy phân chitin (chitinase) t Bt được biết đến t đầu những năm

1970 do tác dụng tương hỗ giữa chitinase và thuốc tr sâu sinh học Ấu trùng của

Choristoneura fumiferana gây bệnh trên cây thông khi xử lý với hỗn hợp

Bt-chitinase thì chết nhanh hơn và nhiều hơn khi xử lý với một mình Bt-chitinase ho c Bt (Smirnoff, 1973; Morris, 1976) Trộn chitinase với Bt cho thấy t lệ chết của bướm

đêm (Lymantria dispar) tăng nhanh hơn khi thử nghiệm chỉ với Bt (Dubois, 1977)

Hoạt tính diệt ấu trùng sâu bướm tăng khoảng 5 lần khi có sự tương trợ của

chitinase vi khuẩn Bt (Gunner et al., 1985) Độc tính với Spodoptera littoralis đã

tăng đáng kể khi sử dụng hỗn hợp độc tố Bt tái tổ hợp ở nồng độ thấp và

endochitinase t Serratia marcescens (Regev et al., 1996)

Để tăng hiệu quả diệt côn trùng của độc tố Bt và khắc phục tính kháng thuốc của côn trùng gây hại, các nhà nghiên cứu đã sử dụng hỗn hợp giữa protein độc tố

với chitinase làm tăng hiệu quả của Cry1Ac chống ấu trùng Helicoverpa armigera

và Cry1C chống Spodoptera littoralis (Regev et al., 1996)

Độc tính của hỗn hợp bào tử và tinh thể t chủng B thuringiensis var kurstaki

HD-1 đối với ấu trùng sâu bướm tăng lên rõ rệt khi bổ sung chitinase t Bt, đồng thời đối với côn trùng thử nghiệm xuất hiện tổn thương và sự phân hủy tế bào ở tế bào biểu mô ruột giữa (Wiwat et al., 2000)

Năm 2002, Liu và cộng sự đã chứng minh chitinase sản sinh t Bt pakistani

có khả năng làm tăng hoạt tính diệt ấu trùng Spodoptera exigua của chủng Bt

DL5789 lên 2,35 lần (Liu et al., 2002)

Năm 2003, Lertcanawanichakul và cộng sự đã chuyển gen chitinase vào chủng

vi khuẩn Bt aizawai, kết quả thu được hoạt tính chitinase tăng gấp 15 lần và độc

tính đối với ấu trùng bướm đêm cũng cao hơn so với bố m Cũng trong năm này,

Arora và cộng sự đã biểu hiện gen chitinase tách t chủng Bt HD-1 trong E coli,

sau đó sử dụng chitinase tái tổ hợp kết hợp với protein Vip của Bt để tăng hoạt tính

chống lại ấu trùng sâu khoang - Spodoptera litura

Năm 2004, Reyes-ramirez và cộng sự đã nghiên cứu và chứng minh chitinase

t Bt israelensis ức chế 100% nấm Sclerotium rolfsii, ức chế 55 - 82% đối với các loài nấm gây bệnh khác như: A terreus, A flavus, Nigrospora sp., Rhizopus sp., A

niger, Fusarium sp., A candidus, Absidia sp và Helminthosporium sp., 45% đối

với Curvularia sp và 10% với nấm A fumigatus Khi hạt đậu tương bị nhiễm nấm

S rolfsii, tỉ lệ nảy mầm đã giảm t 93% xuống 25%, nhưng khi bổ sung chitinase

(0,8 U/mg protein) tỉ lệ nảy mầm tăng lên đến 90%

Năm 2005, Driss và cộng sự đã tìm ra gen chitinase chi255 là một gen mới t Bt

kurstaki, enzym này được xếp vào lớp chitobiosidase và có hoạt tính kháng nấm cao.

Năm 2007, Kamil và cộng sự đã phân lập được chủng Bt MS4 sinh chitinase ở

mức độ cao và kháng mạnh với loài nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh thực vật

Năm 2011, Usharani phân lập được gen exochitinase có kích thước 1129bp,

mã hóa 360 axit amin và kháng 4 loại nấm gây bệnh thực vật

Năm 2012, Gomaa đã chứng minh được chitinase t Bt có hiệu quả hơn

chitinase t B licheniformis trong việc làm tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu lây

nhiễm nấm gây bệnh Cũng trong năm này Kuzu và cộng sự đã phân lập được

chủng B thuringiensis subsp kurstaki HBK-51 t đất Chủng Bt này sản sinh

chitinase có khả năng chịu nhiệt và kiềm (ở 110ºC, hoạt tính còn lại 96% và ở pH

9-12 thì còn lại 98% hoạt tính) Vì vậy, đây được coi là một chủng rất quan trọng có thể sử dụng như nhà máy sản xuất chitinase, ứng dụng trong một số lĩnh vực quan trọng (Kuzu et al., 2012)

Vào năm 2015, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập gen chiA mã hóa chitinase họ 18 t chủng B thuringiensis YBT-9602, rồi tiến hành gây đột biến gen

và biểu hiện trong E coli Hoạt tính thủy phân chitin của đột biến ChiW50A tăng

60% với yêu cầu về pH, nhiệt độ, ion kim loại tương tự như chủng dại Hơn nữa, đột biến ChiW50A thể hiện khả năng kiểm soát sâu bệnh và hoạt động kháng nấm Tác động cộng hưởng đáng kể của đột biến này với các chế phẩm

bào tử - tinh thể của B thuringiensis chống lại ấu trùng Helicoverpa armigera

và Caenorhabditis elegans và khả năng ức chế sự phát triển một số nấm gây

bệnh thực vật (Ni et al., 2015)

Qua thời gian dài phát triển đến năm 2016, gen chiA mã hóa endochitinase của chủng B thuringiensis subsp tenebrionis DSM-2803 đã được tạo dòng và biểu hiện trong E coli Protein tái tổ hợp có gắn thêm đoạn 6-Histidine được tinh sạch bằng

sắc ký ái lực Emzym tái tổ hợp tinh sạch có tác dụng làm giảm sự tăng trưởng của

nấm Colletotrichum gloeosporioides – tác nhân gây bệnh thán thư ở thực vật (de la

Fuente-Salcido et al., 2016)

Dựa vào khả năng diệt côn trùng của vi khuẩn Bt, các nghiên cứu hiện nay phát triển theo các hướng chính: đi sâu khai thác nguồn gen của vi khuẩn Bt để phát triển chế phẩm sinh học diệt côn trùng và cung cấp nguyên liệu cho công tác chuyển gen kháng sâu bệnh vào cây trồng; tìm hiểu vai trò của hệ enzym (chitinase, protease, lipase, amylase) do vi khuẩn Bt sinh ra trong quá trình sinh trưởng phát triển

Các nghiên cứu về chitinase t vi khuẩn Bt đã được thực hiện theo một số hướng chính sau: 1) nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase; 2) tinh sạch và xác định hoạt tính diệt côn trùng, khả năng kháng nấm của chitinase; 3) hiệu suất

tiết protein chitinase trong E coli; 4) tối ưu quá trình sinh tổng hợp chitinase Tuy

nhiên, hoạt tính chitinase thu được còn thấp M t khác, ở các điều kiện môi trường khác nhau thì quá trình sinh chitinase của các chủng Bt luôn thay đổi Vì vậy, quá trình nghiên cứu đầy đủ về chitinase t khâu phân lập chủng Bt có khả năng sinh chitinase đến việc lựa chọn điều kiện môi trường thích hợp cho việc nâng cao khả năng tổng hợp chitinase, xác định các điều kiện ảnh hưởng tới hoạt tính enzym;

cũng như việc nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase t vi khuẩn Bt trong E

coli để nâng cao hoạt tính thủy phân chitin nhằm hỗ trợ hoạt tính diệt sâu của chế

phẩm BT và khả năng kháng nấm gây bệnh thực vật là hướng nghiên cứu cần thiết

để tăng hiệu quả của chế phẩm sinh học

1.2 Chitinase t nhiên

Chitinase là enzym xúc tác quá trình phân hủy cơ chất chitin không hòa tan trong nước thành các sản phẩm chitooligosaccharide hòa tan trong nước thông qua quá trình thủy phân liên kết glucosyl

Chitin là một polysacharide mạch thẳng không cuộn xoắn, có màu trắng, cứng và không đàn hồi được tạo nên t các đơn phân N-acetyl glucosamine thông qua liên kết 1,4-β glycoside Chitin là chất hữu cơ đứng thứ 2 trong tự nhiên sau cellulose

Công thức phân tử của chitin: (C8H13O5N)n Khối lượng phân tử: (203,09)n với thành phần các nguyên tố: C = 47,29%; H = 6,4%; O = 39,4%; N = 6,91%

Ở dạng tinh khiết chitin thường dai, nhưng khi tham gia vào thành phần cấu tạo ở hầu hết các động vật không xương chitin lại là nguyên liệu tổng hợp Trong vỏ giáp xác và động vật thân mềm, chitin kết hợp với canxi carbonate tạo thành hỗn hợp bền vững hơn Sự kết hợp này giúp cho chitin cứng và đ c hơn so với dạng tinh khiết, đồng thời bền vững và ít giòn hơn so với canxi carbonate

Trong tự nhiên, chitin gồm 3 dạng cấu trúc là , β và -chitin Ở dạng -chitin, các chuỗi polysaccharide xuôi và ngược được xếp xen k nhau, việc sắp xếp này làm cho liên kết hydro trở lên mạnh m hơn, do đó làm cho nó ổn định hơn (Sikorski et al., 2009) Đây là dạng phổ biến nhất trong tự nhiên Dạng -chitin là thành phần cấu tạo nên bộ xương ngoài của côn trùng, giáp xác, nhuyễn thể và vách

tế bào của nấm Dạng β-chitin thường hiếm hơn, có cấu trúc song song gồm các chuỗi polysaccharide xếp cùng hướng, xen k nhau và tồn tại ở dạng liên kết với protein Loại β thu được chủ yếu t động vật thân mềm như mực Trong khi đó loại -chitin được hình thành t hỗn hợp hai loại -chitin và β-chitin, cụ thể là 2 chuỗi xuôi xen k với 2 chuỗi ngược

Chitin là thành phần chính trong bộ xương ngoài của một số loài động vật không xương sống (giáp xác, côn trùng, nhện) và thành tế bào của hầu hết vi nấm

và tảo, ngoài ra chitin còn có trong một số loài vi sinh vật biển Nguồn chitin nhiều nhất là t các loài sinh vật có vỏ (tôm, cua, nhuyễn thể), mực, hàu Hàng năm, có khoảng 29,9; 1,4 và 0,7 triệu tấn chitin thu được t các loài động vật có vỏ, hàu và mực ống (Narayanan et al., 2014) Riêng ngành khai thác tôm thẻ chân trắng hàng năm đã thải ra khoảng 3,14 triệu tấn vỏ (trọng lượng khô) trên toàn cầu (Hongkulsup et al., 2016), trong đó lượng chitin chiếm 27%

Một trong những phương pháp chuyển hóa chitin tạo các dẫn xuất mạch ngắn chitin-oligosaccharide có giá trị kinh tế và ứng dụng cao, an toàn đối với con người

và môi trường là sử dụng chitinase Các enzym này có giá trị ứng dụng không chỉ

để sản xuất các dẫn xuất enzym hữu ích mà còn là tác nhân kiểm soát nấm gây bệnh

ho c tăng hoạt tính diệt côn trùng của vi khuẩn Bt (Barboza-Corona et al., 2008)

2 Nguồn g c của chitinase

Chitinase được tạo ra t nhiều sinh vật, t những loài có thành phần cấu trúc

là chitin như nấm, côn trùng, giáp xác, đến những loài không có chitin như vi khuẩn, thực vật Trong đó, vi sinh vật được xem là nguồn cung cấp chitinase nhiều hơn so với động vật và thực vật Các sinh vật khác tổng hợp chitinase với các mục đích khác nhau Vi khuẩn tổng hợp chitinase để phân hủy chitin tạo ra nguồn các bon Ở thực vật và động vật, chitinase nằm trong hệ thống chống lại các tác nhân gây bệnh như nấm bằng cách phá vỡ thành tế bào chứa chitin của nấm Đối với các tác nhân gây bệnh như nấm hay côn trùng chứa chitin, phản ứng tự vệ chính của thực vật là tạo ra chitinase

Vi khuẩn được xem là đối tượng có khả năng sinh chitinase rất phong phú Chitinase có thể là một loại enzym cảm ứng, trong các môi trường nuôi cấy vi khuẩn khi bổ sung chitin đã tăng khả năng sinh tổng hợp, đồng thời ổn định hoạt tính chitinase sau quá trình tách chiết Ngoài ra, vi khuẩn tổng hợp chitinase để phân giải chitin trong môi trường tạo nguồn các bon cung cấp cho hoạt động sinh trưởng và phát triển Vi khuẩn Bt sử dụng chitin như nguồn các bon để sản sinh chitinase trong quá trình sinh trưởng

Bên cạnh đó, có thể thu nhận chitinase t một số động vật nguyên sinh, t các

mô và tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật không xương như:

ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt (trong dịch ruột của ốc sên Helix

aspersa), Đối với động vật có xương sống, chitinase được tiết ra t tuyến tụy và

dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, trong dịch dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu bọ (Matsumiya et al., 1998)

Ngoài ra, enzym chitinase còn được thu nhận t dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài (cuticun) của chúng trong quá trình biến thái hay lột xác Chitinase đóng vai trò chính trong việc chống lại ký sinh trùng của côn trùng

Tuy nhiên, hoạt tính của chitinase thu t thực vật, động vật còn chưa cao, vì vậy việc thu nhận chitinase chủ yếu vẫn t vi sinh vật

2 2 Ph n loại chitinase

Theo danh pháp quốc tế, Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử quốc tế xếp chitinase vào phân lớp 3 - các enzym xúc tác phản ứng thủy phân (hydrolase,), tổ 2 - thủy phân các liên kết glycoside (glycosidase), nhóm 1 (thủy phân liên kết O- và S-glycoside) (International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 1992; http://www.cazy.org/GH18_structure.html)

1.2.2.1 Ph n o i th o tr nh t amino acid

Chitinase có thể được xếp thành các nhóm khác nhau tùy theo quan điểm của

t ng tác giả Dựa vào trình tự amino acid đầu ni tơ, sự định vị của enzym, điểm đẳng điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại chitinase thành 5 nhóm: Nhóm I: Là những đồng phân enzym trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycine ho c prolin ở đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết) Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzym và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác (Flach et al., 1992)

Nhóm II: Là những đồng phân enzym trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptide nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương tự chitinase ở nhóm I Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn;

chúng được cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài (Patil et al., 2000)

Nhóm III: Trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II (Patil

et al., 2000)

Nhóm IV: Là những đồng phân enzym chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I (Collinge et al., 1993)

41-Nhóm V: Dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao (Patil et al., 2000)

1.2.2.2 Ph n o i th o ph n ng ph n c t chitin

Dựa vào phản ứng phân cắt chitin, chitinase được phân thành 2 dạng: dạng 1

là endochitinase (EC.3.2.1.14), dạng 2 là exochitinase gồm 2 loại là chitobiosidase (EC.3.2.1.29) và N-acetyl glucosaminidase (EC.3.2.1.30)

Endochitinase phân cắt bên trong phân tử chitin và chitodextrin tạo ra các phân tử có khối lượng thấp như chitotriose, chitotetraose và diacetyl chitobiose Chitobiosidase xúc tác quá trình phân cắt các vi sợi chitin ở đầu không khử giải phóng ra các diacetyl chitobiose

N-acetyl glucosaminidase phân cắt các oligomer (sản phẩm của sự thủy phân bởi endochitinase và chitobiosidase) để tạo ra các đơn phân N-acetyl glucosamine

1.2.2.3 Ph n o i th o cấu trúc ph n tử

Dựa vào cấu trúc phân tử, chitinase được chia thành 3 họ: glycohydrolase 18,

19 và 20

Họ glycohydrolase 18 (GH18): Là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi

bao gồm những chitinase t thực vật (Arabidopsis, dưa leo, cây họ đậu, thuốc lá ), nấm (Aphanocladium, Rhizopus…), vi khuẩn (Alteromonas, Bacillus, Serratia, ),

virus và động vật Tâm hoạt động của các enzym này tạo thành t 8 sợi xoắn /β cuộn tròn Sợi số 8 của phiến cuộn vào bên trong cấu trúc hình nhộng với vòng xoắn thể hiện như một chiếc nhẫn hướng ra ngoài Chúng hoạt động thông qua một

cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn β polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm β monomer (Guthrie et al., 2005) GH18 phá vỡ tất cả các dạng cấu trúc của chitin ở mức độ khác nhau tùy thuộc vào enzym và cơ chất Chúng cũng hoạt động trên chitosan với mức độ acetyl hóa thấp (khoảng 13%) (Sorbotten et al., 2005) Hoạt tính của các chitinase họ 18 bị ức chế bởi allosamidin

Họ glycohydrolase 19 (Hình 1.3): Họ này gồm hơn 130 chi, bao gồm các lớp

I, II, và IV trong thực vật như: cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis

thaliana), đậu hà lan (Pisum sativum.,.ngoài ra còn có ở xạ khuẩn S griceus HUT

6037, vi khuẩn Haemophilus influenzae… Các loại chitinase thuộc họ 19 có cấu

trúc hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển Chitinase thuộc họ 19 không bị ức chế bởi allosamidin

Họ glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetyl hexosaminidase có nguồn gốc t vi khuẩn và người

Hình Cấu tr c kh ng gian h chitinase 9

(Ngu n: Hoell et al., 2006)

1.2.3 Cấu trúc của chitinase

1.2.3.1 Cấu trúc ph n tử

Các chitinase có nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc khác nhau Sự khác nhau đó thể hiện trước hết ở sự đa dạng về khối lượng phân tử, thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi polypeptide Ở loài thân mềm,

A

chân đốt, động vật có xương (cá, lưỡng cư, thú) chitinase có trọng lượng phân tử cao vào khoảng 90 - 120 kDa Chitinase của thực vật có trọng lượng phân tử t 25 -

40 kDa Trọng lượng phân tử của chitinase t vi khuẩn là 20 - 80 kDa Tuy nhiên, chitinase t các loài vi khuẩn khác nhau có khối lượng phân tử khác nhau Chitinase

t B thuringiensis var kurstaki HD73 có khối lượng 74 kDa, mã hóa 676 axit amin

Chitinase này thuộc nhóm I, họ glycosyl hydrolase 18, điểm đẳng điện pI là 5,75 (Barboza et al., 2008) Chitinase t chủng Bt HD1 có khối lượng 36 kDa (Arora et

al., 2003) Chitinase t chủng B cereus VITSD3 có khối lượng 55 kDa (Devi et al., 2015), t Streptomyces sp có khối lượng 25 kDa (Subramaniam et al., 2012)

Ở nấm, chitinase t chủng Trichoderma viride N9 có khối lượng phân tử 46

kDa mã hóa bởi 420 amino acid (Jenifer et al., 2014) Chitinase của xạ khuẩn nội

sinh Streptomyces hygroscopicus lại có khối lượng phân tử trong khoảng 76, 78 và

80,8 kDa (Haggag và Abdallh, 2012)

1.2.3.2 Cấu trúc không gi n

Sự khác nhau về cấu trúc của các enzym còn thể hiện ở sự sắp xếp trong không gian của các chuỗi polypeptide, các trung tâm xúc tác và các vùng liên kết cơ chất Sự khác nhau về cấu trúc không gian của các enzym dẫn tới sự khác nhau về các tính chất

hóa lý của chúng Cấu trúc của phân tử chitinase A t vi khuẩn B circulans gồm 3

vùng: vùng N-terminal với một nếp gấp giống như kháng thể tham gia vào quá trình liên kết với chitin; vùng thủy phân gồm 8 chuỗi /β và một vùng gấp nếp nhỏ chứa một chuỗi +β để chèn vào vùng thủy phân (Uchiyama et al., 2001)

Ngoài ra, cấu trúc của endochitinase chiA74 t vi khuẩn Bt gồm 3 vùng: vùng xúc tác (catalytic domain), vùng fibronectin (fibronectin - like domain: FLD) và vùng liên kết cơ chất (chitin - binding domain: CBD) Đây là cấu trúc điển hình của enzym phân hủy polymer sinh học như chitin và cellulose

Vùng xúc tác: vị trí hoạt động là giữa amino acid 203 và 211 Val-Asp-Leu-Asp-Trp-Glu), đây là dạng điển hình của họ chitinase 18 Các axit

(Phe-Asp-Gly-amin thơm Trp 245 và Phe232 của chiA t S marcescens 2170 tham gia vào quá

trình thu phân các tấm β-chitin (Uchiyama et al., 2001) Vì vậy, các axit amin

thơm được bảo tồn Trp171, Phe177 và Trp210 trong vùng xúc tác của chiA74 có vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân chitin

Vùng fibronectin: vùng này liên quan đến cơ chất kèm theo do hoạt động gắn kết của fibronectin

Vùng liên kết cơ chất (CBDs: Chitin biding domains): được cấu thành bởi các CBD ở đầu C của trình tự amino acid (t 587 đến 629) Vùng này phổ biến trong nhiều chitinase khác nhau Tương tự như chitinase và cellulose của các vi khuẩn khác, chiA74 có các axit amin thơm được bảo tồn (Trp-591, Tyr-595 và Trp-626) Các cơ chế gắn kết cơ chất chủ yếu xảy ra ở vùng CBDs

Hình 4 t ng đồng vùng x c tác của chiA74 với chitinase của các lo i khác

(Ngu n: Barboza et al., 2003)

Các tr nh t t S m rc sc ns Chi Sm , circu ns Chi41 ci , circu ns ChiA, B subtilis Chi (Bsub), B thuringiensis serovar kenyae ChiA74 (Btk), B thuringiensis serovar pakistani ChiA71 (Btp), C paraputrificum ChiA (Cp), E agglomerans ChiA (Ea) và B cereus ChiB (Bce)

2 4 C chế hoạt đ ng của chitinase

Chitinase xúc tác cho phản ứng thu phân liên kết 1,4-β-glycoside trong phân

tử chitin, phân cắt dọc theo mạch các bon Tùy theo dạng phân loại enzym là dạng

endo - chitinase hay exo - chitinasemà có cơ chế phân cắt khác nhau (Hình 1.5)

Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitodextrin, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau như chitotriose, chitotetraose, nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose

(GlcNAc)2 (Gary và Kubicek, 2002)

Chitobiosidase phân cắt chitin ở mức trùng hợp lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)nvới n ≥ 3] t đầu không khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2

N-acetyl glucosaminidase phân cắt các chitooligomer (sản phẩm của sự thủy phân bởi endochitinase và chitobiosidase) hay chitin một cách liên tục t đầu không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetyl glucosamine (GlcNAc)

Hình 5 C chế hoạt đ ng của enzym chitinase ở Tricho erma

(Ngu n: Gary và Kubicek, 2002)

Ngoài ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng oligosaccharide làm cơ chất Các oligosaccharide thường được thủy phân bên trong trên một vài vị trí xác định ho c một cách ngẫu nhiên Một số enyme chitinase có khả năng thủy phân trisaccharid, một số khác thì không Có hai dạng chitinase thủy phân pentasaccharide: một phân cắt bên trong tạo disaccharid và trisaccharid; một phân cắt bên ngoài tạo các monosaccharid và tetrasaccharid Tóm lại, chitinase thực chất là enzym cắt ngẫu nhiên

N-acetyl-chito-Endochitinase, chitobiosidase và N-acetylglucosaminidase có thể hoạt động trên cơ chất là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động

kém hơn trên chitin thô thu t vỏ tôm Chitin và vách tế bào nấm chứa chitin là những cơ chất thích hợp cho endochitinase hơn là chitobiosidase và N - acetylglucosaminidase Chitooligomer (GlcNAc)3 và cao hơn nữa là sợi chitin đều

là cơ chất của cả 3 loại enzym trên nhưng N-acetylglucosaminidase thì hoạt động chậm hơn trong việc làm giảm độ đục của huyền phù chitin Diacetylchitobiose (GlcNAc)2 là cơ chất tốt nhất của N-acetylglucosaminidase nhưng không là cơ chất của endochitinase hay chitobiosidase Chính vì thế có thể sử dụng để phân biệt hoạt tính giữa endochitinase, chitobiosidase và N-acetylglucosaminidase Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là N-acetyl glucosamine

2 5 Các yếu t ảnh h ởng đến hoạt t nh của chitinase

Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của chitinase mà hoạt tính enzym mạnh nhất ở nhiệt độ và pH khác nhau Ảnh hưởng của các ion kim loại, chất tẩy rửa, dung môi hữu cơ đối với chitinase t các nguồn thu nhận khác nhau cũng có sự khác nhau

1.2.5.1 Ảnh h ng c nhiệt ộ

Tùy theo nguồn gốc thu nhận mà chitinase có thể có những giá trị nhiệt độ tối

ưu khác nhau Dải nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của phản ứng là t 20 - 50ºC Vận tốc phản ứng do enzym xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc enzym Ở nhiệt độ quá cao, enzym bị biến tính làm hoạt độ giảm mạnh ho c mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dưới 0ºC hoạt độ của enzym giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độ thích hợp Theo những nghiên cứu trước đây, nhiệt độ tối ưu cho chitinase ở vi sinh vật là

khoảng 40ºC, ngoại tr chitinase của Aspergillus niger hoạt động trên cơ chất là glycol chitin có nhiệt độ tối thích là 50ºC Chitinase t B licheniformis phân lập t

suối nước nóng có khả năng hoạt động ở nhiệt độ 80ºC, tuy nhiên chitinase t côn trùng (tằm ) hoạt động kém ở nhiệt độ 40ºC có thể do côn trùng phát triển ở nhiệt

độ 25ºC nên nhiệt độ tối ưu của chitinase t côn trùng không cao Trong khi, chitinase t vi khuẩn Bt HBK-51 hoạt động tốt nhất ở 110ºC và được coi là một loại

enzym chịu nhiệt (Kuzu et al., 2012) Các loài nấm như Lecanicillium (Barghini et

al., 2013); Gliocladium catenulatum (Ma et al., 2012) hoạt động tốt ở dải nhiệt độ

t 4 đến 9 đối với các chitinase ở thực vật bậc cao và tảo, ở động vật là 4,8 đến 7,5

và ở vi sinh vật là 3,5 đến 8,0 Chitinase của nấm hoạt tính cao nhất ở pH = 5, tro ng

khi ở vi khuẩn pH tối thích là 8,0 Một số chitinase tái tổ hợp như chitinase t B

thuringiensis subsp tenebrionis DSM-2803 biểu hiện hoạt tính tối ưu ở pH =7

thuộc loại protein trung tính (de la Fuente-Salcido et al., 2016) Trong khi chitinase

t vi khuẩn B subtilis B298 (Lestari et al., 2017), vi khuẩn B subtilis TV-125

(Senol et al., 2014) hoạt động tốt nhất ở pH 4 - 5 và thuộc loại enzym ưa a xít

Chitinase thô t chủng B licheniformis DS23 hoạt động tốt trong khoảng pH5 - 7

(Quách Ngọc Tùng et al., 2012)

1.2.5.3 Ảnh h ng c ion kim o i

Các ion kim loại làm biến đổi vận tốc phản ứng của enzym, chúng có thể kích thích ho c ức chế hoạt động của enzym Một số ion kim loại có khả năng liên kết phối trí với các nguyên tử oxy ho c nguyên tử ni tơ của nhóm cacboxyl, amin ho c peptide của các enzym, làm cho trung tâm hoạt động của enzym có độ bền rất lớn, đồng thời các ion kim loại này tạo ra các cấu trúc thuận lợi cho enzym ho c làm cho enzym gắn kết được với cơ chất, do đó tốc độ thủy phân của enzym được tăng lên

Chitinase t chủng Bacillus sp DAU101 bị ức chế mạnh m bởi Zn2+

, Cu2+ và EDTA Tuy nhiên, hoạt tính của enzym này lại tăng khi bổ sung các ion Co2+

, Mg2+,

Ca2+ và Ba2+, những cation này có thể bảo vệ các enzym chống lại sự biến tính nhiệt

và do đó duy trì hoạt động của enzym ở nhiệt độ cao (Yan và Qian, 2009)

Nghiên cứu chitinase t vi khuẩn B licheniformis DS23 cho thấy, một số ion

kim loại như Co2+

, Mn2+, Ca2+ ở nồng độ 1 và 100 mM làm tăng hoạt tính enzym; trong khi các ion Ba2+, Fe2+ và Sn2+ ở nồng độ tương ứng làm giảm hoạt tính enzym (Quách Ngọc Tùng et al., 2012)

1.2.5.4 Ảnh h ng c chất t y rử và ung môi hữu c

Các chất tẩy rửa và các dung môi hữu cơ cũng ảnh hưởng mạnh m đến hoạt tính của enzym Các chất tẩy rửa làm tăng hoạt tính chitinase bằng cách làm tăng khả năng gắn kết giữa trung tâm hoạt động của enzym và cơ chất thông qua việc giảm sức căng bề m t trong môi trường nước Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bản chất của enzym mà tính chất và mức độ ảnh hưởng tới hoạt động của enzym là khác nhau SDS ở nồng độ 1 mM không làm thay đổi hoạt tính chitinase (Rabeeth et al., 2011), trong khi đó các chất tẩy rửa Tween 80, Tween 20

và SDS ở nồng độ 0,1 mM làm tăng hoạt tính chitinase t vi khuẩn S marcescens

B4A Các chất iodoacetamide, axit iodoacetic axit, axit xitric và PMSF hoạt hóa

nh chitinase và làm tăng hoạt tính xúc tác của chitinase (Zarei et al., 2011)

Bên cạnh những chất ức chế thì huyết thanh albumin lại có vai trò ngược lại làm tăng hoạt tính của chitinase nhưng sự ảnh hưởng này chỉ rõ ràng sau 2 - 3 giờ đầu phản ứng

2 6 Các yếu t ảnh h ởng đến quá trình sinh t ng h p chitinase

Chitinase của vi sinh vật đã được sản xuất hàng loạt bằng lên men lỏng, lên men liên tục Ngoài ra, lên men rắn và hệ thống tế bào lưỡng pha cũng được sử dụng cho sản xuất chitinase Môi trường nuôi cấy, cụ thể là nguồn các bon, nguồn

ni tơ là nhân tố chìa khóa cho sự sinh trưởng cũng như quá trình sản sinh chitinase hiệu quả của vi sinh vật Tác giả Chauhan (2013) đã chứng minh chitin và cao nấm men là nguồn các bon và nguồn ni tơ thích hợp cho việc tăng sản lượng chitinase

của các chủng Bacillus subtilis phân lập t đất Trong khi, N-acetylglucosamine và amonium sulphate lại là nguồn các bon và nguồn ni tơ thích hợp cho chủng Bacillus

alvei NRC-14 sinh tổng hợp chitinase (Abdel-Aziz et al., 2012) Ngoài ra, một số

yếu tố vật lý khác như tốc độ sục khí, pH môi trường và nhiệt độ lên men cũng ảnh hưởng đến sản xuất chitinase

1.2.6.1 Ngu n các bon

Tùy loài vi sinh vật mà nguồn các bon được sử dụng để sinh chitinase là khác nhau, có loài chỉ thích hợp với một ho c một số ít nguồn các bon, có loài lại thích hợp với nhiều nguồn các bon Nguồn các bon có thể là các loại carbohydrate đơn giản như đường đơn, đường đôi ho c phức tạp như tinh bột, cellulose, xylan, chitin Nguồn các bon phức tạp này thường tồn tại ở hầu hết các phế thải nông nghiệp như cám gạo, cám mì, xơ d a, lõi ngô, bã mía, cũng như lớp vỏ chitin của các loài côn trùng, giáp xác Những chất này thường được sử dụng làm nguồn các bon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp chitinase

Vũ Thị Thanh và đồng tác giả (2013) đã phân lập được chủng nấm Penicillium

sp M4 có hiệu lực diệt rệp ngô cao (đạt 92,3% sau 7 ngày phun) và được sử dụng

để nghiên cứu khả năng sinh chitinase Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng nấm

Penicillium sp M4 sinh tổng hợp chitinase tối ưu trong môi trường lên men rắn với

nguồn cơ chất bột ngô (sử dụng làm nguồn các bon chính) có độ dày 17 mm, độ ẩm

cơ chất 60%, bổ sung 1,0% chitin ở pH 6,0; nồng độ urê 0,9%; nhiệt độ 30o

C Sau 5 ngày nuôi cấy hoạt tính chitinase đạt 8,02 U/ml (Vũ Thị Thanh et al., 2013)

Tác giả Bhushan và Hoondal cho rằng, khi gluco và chitin được thêm vào môi trường lên men thì quá trình tổng hợp chitinase đã tăng lên hiệu quả Trong khi đó,

chitin huyền phù và vỏ tôm là nguồn các bon thích hợp để chủng nấm A niger

LOCK 62 sinh tổng hợp chitinase (Brzezinska và Jankiewicz, 2012)

Ngoài ra, nồng độ chitin cũng ảnh hưởng đến hiệu quả sản sinh chitinase ở một số loài vi sinh vật Ở nồng độ chitin 0,3% đã làm tăng hoạt tính chitinase của

chủng B laterosporous MML2270, trong khi nồng độ cơ chất quá 0,3% thì hoạt

tính enzym lại giảm (Shanmugaiah et al., 2008) Tuy nhiên, việc sử dụng 2% bột vỏ tôm như nguồn các bon chính trong môi trường lên men lại kích ứng cho chitinase

được sản xuất tối đa trong Aspergillus terrus (Aida và Taghreed, 2014)

1.2.6.2 Ngu n ni t

Nguồn ni tơ ảnh hưởng mạnh tới tốc độ tiết enzym của các loài vi sinh vật Nguồn ni tơ tồn tại ở dạng vô cơ như urê, ammonium sulfate, natri nitrate và ở dạng

các hợp chất hữu cơ cao phân tử như cao thịt, bột đậu tương, bột cá hay peptone Tùy loài vi sinh vật mà nguồn ni tơ được sử dụng là khác nhau Đa số các loài có khả năng sử dụng cả nguồn ni tơ vô cơ và hữu cơ, tuy nhiên mức độ đồng hóa t ng loại ni tơ để sinh enzym lại phụ thuộc vào t ng loài

Gomaa (2012) khi tối ưu điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Bt và B licheniformis

nhận thấy, nguồn ni tơ là casein thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp chitinase (Gomaa, 2012) Nguồn ni tơ là cao nấm men ảnh hưởng mạnh tới quá

trình sinh tổng hợp chitinase t chủng nấm A niger LOCK 62 (Brzezinska và

Jankiewicz, 2012) Theo Shanmugaiah, khi nuôi cấy chủng vi khuẩn B

laterosporous MML2270 trên môi trường có sử dụng cao nấm men như nguồn ni

tơ và ở điều kiện nuôi cấy tối ưu thì hoạt tính chitinase đã tăng lên 3 lần (Shanmugaiah et al., 2008) Năm 2012, Quách Ngọc Tùng và đồng tác giả đã sử dụng phương pháp đáp ứng bề m t để lựa chọn môi trường tối ưu cho sinh tổng hợp

chitinase của vi khuẩn B licheniformis DS23 Trong môi trường tối ưu, sử dụng cao

nấm men và peptone như nguồn ni tơ Sau 48 giờ lên men ở 30o

C, hoạt tính chitinase đạt 110,3 U/ml, cao gấp 3,2 lần so với trước tối ưu Như vậy, nguồn ni tơ hữu cơ thích hợp cho quá trình tổng hợp chitinase t các chủng vi sinh vật

1.3 Chitinase tái tổ h p

T lâu, gen chitinase của nhiều đối tượng sinh vật khác nhau như thực vật, vi sinh vật, nấm… đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu Việc tạo dòng và biểu hiện gen này trong một đối tượng khác nhằm khai thác tối đa hiệu suất của gen chitinase đã được nghĩ tới t lâu Các vật chủ thường được các nhà nghiên cứu chọn để biểu hiện gen này là các vi sinh vật có khả năng sinh trưởng và

phát triển nhanh như E coli, nấm men (Nguyễn Hữu Quân, 2015)

Chitinase tái tổ hợp được tạo ra bằng k thuật DNA tái tổ hợp mang đến một

số thuận tiện trong quá trình sản xuất và tinh sạch Hơn nữa, chitinase tái tổ hợp còn

có thể có một số tính chất thay đổi theo hướng có lợi so với enzym tự nhiên Bên cạnh đó, việc sử dụng các hệ biểu hiện để tạo enzym tái tổ hợp cũng rất quan trọng cho sự phát triển các enzym mới và sản xuất lượng lớn các enzym này

Gen mã hóa chitinase đã được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu tạo dòng và

biểu hiện trong E Coli (Barboza-Corona et al., 2003; Yang et al., 2009;

Castañeda-Ramírez et al., 2013; de al Fuente-Salcido et al., 2016)

Ở Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu về chitinase, đ c biệt là các nghiên cứu về thu nhận, ứng dụng của chitinase trong việc kháng nấm gây bệnh cây trồng và xử lý chất thải giàu chitin bảo vệ môi trường

Nghiên cứu đ c tính endochitosanase tái tổ hợp và khả năng ứng dụng chuyển hóa chitosan thành đường chức năng chitooligosacharides đã được Nguyễn Thị Ngọc Liên và đồng tác giả (2012) thực hiện Trong nghiên cứu này, chitosanase bền trong dải nhiệt độ 20 - 70o

C, pH 4 - 8; nhiệt độ và pH tối ưu là 45oC và pH 5 Khi thủy phân chitosan bởi chitosanase, sản phẩm thu được là các oligosacharides C2-6

có nhiều tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và sản xuất đường chức năng Tác giả Nguyễn Ngọc Mai và Vũ Văn Hạnh (2013) đã nghiên cứu nâng cao khả năng sản xuất chitinase của chủng nấm ký sinh côn trùng bằng k thuật đột biến Kết quả đã tạo thành công 3 dòng đột biến chọn lọc N30.8, NV60.1 và NV150.2 với hoạt tính lần lượt là 1,12; 1,5 và 1,43 U/ml, cao hơn ban đầu (0,39

U/ml) Chủng nấm đột biến L Lecanii N30.8 được sử dụng để tối ưu sinh chitinase

trong môi trường lên men Sau tối ưu, hoạt tính đạt 1,611 U/ml, tăng 1,8 lần so với

trước tối ưu (Nguyễn Hồng Minh et al., 2013) Khi tinh sạch chitinase t nấm L lecanii

43H, tác giả đã thu được chitinase tinh sạch có kích thước 33 kDa, hoạt tính riêng 167,5 U/mg, hiệu suất thu hồi 1,9%, độ sạch 2,5 lần (Nguyễn Hữu Quân et al., 2013) Năm 2012, tác giả Đinh Minh Hiệp đã nghiên cứu chitinase và β-glucanase t

Trichoderma spp và khả năng kiểm soát sinh học đối với một số nấm gây bệnh

(Đinh Minh Hiệp, 2012) Tác giả Hà Hồng Hạnh và đồng tác giả (2013) đã phân lập gen mã hóa chitinase và thiết kế các vector biểu hiện thực vật

Quá trình tối ưu sinh tổng hợp chitinase cũng là hướng nghiên cứu được thực hiện Năm 2012, tác giả Quách Ngọc Tùng và đồng tác giả đã nâng cao sinh tổng hợp

chitinase của chủng B licheniformis DS23 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Ngoài việc ứng dụng các k thuật truyền thống trong nghiên cứu sản xuất

chitinase còn có một con đường khác là sử dụng công nghệ protein tái tổ hợp để sản xuất enzym, đây là hướng đi hiện đại phù hợp để sản xuất enzym ở qui mô công nghiệp mà các nước tiên tiến đã và đang thực hiện Hướng đi này giúp nâng cao năng suất sinh tổng hợp enzym đồng thời lượng enzym thu được dễ dàng tinh sạch hơn khi sử dụng chủng tự nhiên Quách Ngọc Tùng và đồng tác giả (2013) đã biểu

hiện gen chi mã hóa chitinase của B lichenniformis KNUC213 trong E coli, enzym

CHI tái tổ hợp thu được có khối lượng phân tử 60 kDa, hoạt tính chitinase tăng 9,5 lần so với chitinase t chủng tự nhiên (Quách Ngọc Tùng et al., 2013) Cũng trong thời gian này, Nguyễn Thị Ngọc Liên và đồng tác giả (2013) đã biểu hiện thành

công gen csn mã hóa chitosanase của chủng B cereus HN90 trong nấm men, kết

quả thu được dòng L6 sinh tổng hợp CSN hoạt tính cao nhất (đạt 322,4 U/ml) Năm

2015, tác giả Nguyễn Hữu Quân đã nghiên cứu chitinase tái tổ hợp được biểu hiện

trong nấm men t chủng nấm Lecanicillium lecanii (Nguyễn Hữu Quân, 2015)

Như vậy, các nghiên cứu về chitinase ở Việt Nam chủ yếu tập trung vào quá trình tối ưu sinh tổng hợp chitinase ở một số loài vi sinh vật nhằm thu nhận lượng enzym cao nhất, nghiên cứu tính chất của chitinase và biểu hiện gen chitinase trong thực vật giúp cây trồng có khả năng chống lại một số nấm gây bệnh Do đó quá

trình biểu hiện gen mã hóa chitinase t B thuringiensis nhằm thu enzym có hoạt

tính cao, có tác dụng ức chế sự phát triển của một số nấm gây bệnh cây trồng, đồng thời hỗ trợ hoạt tính diệt sâu của protein tinh thể Bt là một hướng nghiên cứu mới ở Việt Nam Hướng nghiên cứu này góp phần nâng cao hiệu quả của chế phẩm sinh học bảo vệ cây trồng

Trên thế giới, nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gen chitinase t vi khuẩn sống trong môi trường nước được Tsujibo và cộng sự thực hiện t năm 1993 đã phân lập

gen t vi sinh vật sống ở môi trường biển, gen chitinase của chủng Alterromonas sp

mã số 0-7 đã được tạo dòng trong E coli JM109 sử dụng vector pUC18, ở nghiên

cứu này enzym không tiết trực tiếp ra môi trường nuôi cấy mà tiết vào chu chất Đoạn gen mã hóa cho enzym tái tổ hợp dài 3394 bp nằm giữa 2 enzym cắt hạn chế

SphI và HindIII, trình tự chỉ giống 33,4% so với chitinase A và 15,3% so với

chitinase B của loài Seratia marcescens (Tsujibo et al., 1993) Gen này mã hóa cho

protein dài 820 amino acid và có khối lượng phân tử 87 kDa Chitinase tái tổ hợp

này có tính chất tương tự chitinase của chủng Alterromonas sp mã số 0-7

Bên cạnh việc phân lập gen chitinase t những vi sinh vật có trong đất ho c trong các giá thể ở trên cạn, các nhà nghiên cứu ở Nhật Bản đã phân lập gen này t môi trường nước Lan và cộng sự (2006) đã phân lập gen chitinase t chủng vi

khuẩn Aeromonas hydrophila SUWA-9 trong nước hồ Lake Suwa (Nagano

Prefecture, Nhật Bản) Kết quả cho thấy gen này thuộc nhóm endochitinase (chiA),

có trình tự mã hóa 865 amino acid và có khối lượng phân tử là 91,6 kDa thuộc họ

18 của nhóm glycosyl hydrolases, enzym này được biểu hiện thành công trong E

coli (DE3) Protein tái tổ hợp tinh sạch có hoạt tính mạnh nhất đối với colloidal

chitin (Lan et al., 2006)

Gen chi18 được tạo dòng t thư viện hệ gen của B subtilis CHU26 được

chuyển vào vector pGEM3Z và pYEP352 để hình thành plasmid tái tổ hợp pGCHI18 và pYCHI18 Hoạt tính chitinase có thể được quan sát trên đĩa thạch có

bổ sung chitin đối với các thể E coli có mang plasmid tái tổ hợp Dịch nuôi cấy tế bào của E coli chuyển gen có mang pYCHI18 làm giảm hoạt tính gây bệnh của R

solani hơn 90% trong kiểm tra đối kháng trên các cây củ cải (Raphanus sativus)

(Yang et al., 2009)

Năm 2013, Lobo và cộng sự đã biểu hiện gen chitinase t Chromobacterium

violaceum trong E coli Khung đọc mở của C violaceum ATCC 12472 mã hóa một

protein có chứa peptide tín hiệu, vùng gắn kết chitin, vùng thủy phân đầu các bon Protein tái tổ hợp có trọng lượng phân tử khoảng 43,8 kDa được tiết ra môi trường nuôi cấy và có hoạt tính thủy phân chitin cao Chitinase tái tổ hợp được tinh sạch dễ dàng bằng sắc ký ái lực (Lobo et al., 2013)

Cũng trong thời gian này, Castañeda-Ramírez và cộng sự đã biểu hiện gen

chiA74 của B thuringiensis trong E coli chủng K12 và chứng minh rằng hoạt tính

enzym tái tổ hợp được sinh ra ở mức độ rất cao, xấp xỉ 500% (Castañeda-Ramírez

et al., 2013)