Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED) tại miền Bắc Việt Nam

Mục đích của luận án nhằm làm rõ tình hình dịch PED ở 10 tỉnh miền Bắc, bao gồm vùng đồng bằng sông Hồng và vùng trung du- miền núi. Trên cơ sở xác định được sự lưu hành của PEDV, đặc điểm dịch tễ học được phân tích đa chiều, đi sâu tìm hiểu những biến đổi có liên quan đến đáp ứng miễn dịch trung hòa virus. Đặc biệt, phân tích mối liên hệ về gen được thực hiện trên cơ sở dữ liệu lớn nhằm làm rõ nhiều đặc điểm dịch tễ học phân tử chưa được đề cập trong nhiều nghiên cứu trước đây.

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯

NGUYỄN TRUNG TIẾN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN (PED)

TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯

NGUYỄN TRUNG TIẾN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN (PED)

TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM

Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Bá Hiên

HÀ NỘI - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của bản thân Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn

và các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Tác giả luận án

Nguyễn Trung Tiến

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án, tác giả đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rất nhiều người, sau đây là lời cảm ơn chân thành của tác giả:

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo PGS.TS Nguyễn Bá Hiên, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án Nhờ có sự hướng dẫn nhiệt tình và những ý kiến đóng góp quý báu của thầy mà luận án của tôi đã được hoàn thành

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, cùng toàn thể các thầy, cô giáo và cán bộ Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Trân trọng cảm ơn Lãnh đạo, toàn thể cán bộ công nhân viên Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW1, các bạn bè và đồng nghiệp đã luôn tạo điều kiện về thời gian, động viên, chia sẻ vật chất, tinh thần, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Trung Tiến

MỤC LỤC

Lờ i cam đoan i

Lờ i cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các từ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Trích yếu luận án x

Thesis abstract xii

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Phạm vi nghiên cứu 3

1.4 Những đóng góp mới của đề tài 3

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Giới thiệu chung 4

2.2 Lịch sử bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn 4

2.3 Tình hình dịch PED trên thế giới và Việt Nam 5

2.3.1 Tình hình dịch PED trên thế giới 5

2.3.2 Tình hình dịch PED ở Viê ̣t Nam 6

2.4 Căn bệnh 8

2.4.1 Phân loại và hình thái của PEDV 8

2.4.2 Cấu trúc phân tử của virus gây bệnh 9

2.4.3 Đặc tính nuôi cấy của virus 12

2.4.4 Sức đề kháng của virus gây bệnh PED 12

2.4.5 Dịch tễ học lâm sàng 13

2.5 Dịch tễ học phân tử 16

2.6 Triệu chứng và bệnh tích của lợn mắc PED 18

2.6.1 Triệu chứng lâm sàng 18

2.6.2 Bệnh tích 19

2.7 Các phương pháp chẩn đoán PEDV 20

2.7.1 Phát hiện virus 20

2.7.2 Chẩn đoán phân biệt 23

2.7.3 Phân lập virus 24

2.8 Phòng và điều trị bệnh 25

Phần 3 Nội dung - nguyên liệu - phương pháp nghiên cứu 30

3.1 Địa điểm nghiên cứu 30

3.2 Thời gian thực hiện đề tài 30

3.3 Nội dung nghiên cứu 30

3.3.1 Nghiên cứu tình hình dịch PED tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam 30

3.3.2 Phân tích đặc điểm về trình tự gen 30

3.3.3 Nghiên cứu một số đặc điểm đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV 30

3.4 Vật liệu nghiên cứu 31

3.5 Phương pháp nghiên cứu 31

3.5.1 Phương pháp điều tra một số đặc điểm dịch tễ 32

3.5.2 Phương pháp theo dõi lâm sàng 32

3.5.3 Phương pháp mổ khám 32

3.5.4 Phương pháp lấy mẫu 32

3.5.5 Phương pháp tách ARN tổng số 32

3.5.6 Phương pháp tổng hợp cDNA 33

3.5.7 Phương pháp phát hiện PEDV 34

3.5.8 Phương pháp giải trình tự gen 34

3.5.9 Phương pháp xác định khoảng cách di truyền 35

3.5.10.Phương pháp xây dựng cây phả hệ 35

3.5.11.Phương pháp phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử 35

3.5.12.Phương pháp xử lý số liệu 36

Phần 4 Kết quả và thảo luận 37

4.1 Tình hình dịch PED ở một số tỉnh miền Bắc từ 2013-2015 37

4.1.1 Kết quả thiết lập phản ứng RT-PCR phát hiện PEDV 37

4.1.2 Kết quả phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm từ 2013-2015 41

4.1.3 Tình hình dịch PED ở một số tỉnh miền Bắc theo trang trại 42

4.1.4 Kết quả theo dõi triệu chứng, bệnh tích của lợn mắc PED 44

4.2 Kết quả phân tích đặc điểm về trình tự gen 48

4.2.1 Đặc điểm gen S của các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam 48

4.2.2 Đặc điểm gen ORF3 của PEDV lưu hành ở Việt Nam 61

4.3 Nghiên cứu một số đặc điểm về dịch tễ học phân tử của PEDV 67

4.3.1 Đặc điểm về sự lưu hành của PEDV theo nhóm di truyền 67

4.3.2 Hiện tượng tái tổ hợp của PEDV lưu hành ở Việt Nam 73

4.3.3 Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV theo không gian và thời gian 75

Phần 5 Kết luận và đề nghị 85

5.1 Kết luận 85

5.2 Đề nghị 85

Danh mục công trình công bố có liên quan đến luận án 87

Tài liệu tham khảo 87

Phụ lục 103

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Chữ viết đầy đủ

DANH MỤC BẢNG

3.1 Thông tin về mồi đặc hiệu được dùng trong nghiên cứu 31

3.2 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 34

4.1 Tương đồng trình tự nucleotide và amino acid của 11 chủng PEDV với các chủng tham chiếu 39

4.2 Kết quả phát hiện PEDV trong mẫu thu thập từ 2013-2015 41

4.3 Tình hình dịch PED ở lợn của một số tỉnh miền Bắc theo trang trại 43

4.4 Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PED 44

4.5 Kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể của lợn mắc PED 46

4.6 Danh sách các chủng PEDV thuộc genogroup 1 75

4.7 Danh sách các chủng PEDV thuộc genogroup 2 nhóm châu Á 80

DANH MỤC HÌNH

2.1 Hạt virus PED chủng KPEDV-9 phân lập tại Hàn Quốc 9

2.2 Mô hình cấu trúc và bộ gen PEDV 10

2.3 Hiệu giá của PEDV tồn tại trên bề mặt vật liệu theo thời gian 13

2.4 Con đường truyền lây của PEDV 17

2.5 Bệnh tích đại thể ở lợn sơ sinh mắc PED 19

2.6 So sánh độ nhạy của một số phương pháp phát hiện PEDV 22

4.1 Kết quả RT-PCR phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm 37

4.2 Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR nhân lên bởi cặp mồi P1/P2 38

4.3 Triệu chứng của lợn con theo mẹ mắc PED 45

4.4 Bệnh tích đại thể của lợn con theo mẹ mắc PED 47

4.5 Tỷ lệ % tương đồng về trình tự gen S của 38 chủng PEDV 49

4.6 Phân loại các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam dựa vào gen S 50

4.7 Khoảng cách di truyền của gen S giữa các chủng PEDV 51

4.8 Đột biến thêm- xóa ở gen S của 38 chủng PEDV 52

4.9 Tốc độ thay đổi nucleotide tại các vị trí codon của gen mã hóa vùng quyết định kháng nguyên 54

4.10 Trình tự amino acid ở vùng COE của 38 chủng PEDV 56

4.11 Trình tự amino acid ở vùng S1D của 38 chủng PEDV 58

4.12 Trình tự amino acid ở vùng S10 của 38 chủng PEDV 60

4.13 Trình tự nucleotide gen ORF3 của 12 chủng PEDV 62

4.14 Tỷ lệ % tương đồng về trình tự gen ORF3 của 12 chủng PEDV 63

4.15 Phân loại chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam dựa vào gen ORF3 64

4.16 Khoảng cách di truyền của gen ORF3 giữa các chủng PEDV 65

4.17 Trình tự amino acid ORF3 protein của 12 chủng PEDV 66

4.18 Cây phả hệ của các chủng PEDV dựa vào trình tự gen S 68

4.19 Đặc điểm phân nhánh cây phả hệ dẫn tới các chủng của Việt Nam dựa vào trình tự gen S 69

4.20 Cây phả hệ của PEDV dựa vào trình tự gen ORF3 70

4.21 Đặc điểm phân nhánh cây phả hệ dựa vào gen ORF3 của genogroup 1 của

genogroup 2 nhánh châu Á 82

genogroup 2 nhánh Bắc Mỹ 83

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Tên tác giả: Nguyễn Trung Tiến

Tên Luận án: Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh tiêu chảy thành dịch ở

lợn (PED) tại miền Bắc Việt Nam

Phương pháp nghiên cứu

Có hai nhóm phương pháp chính được dùng trong nghiên cứu này, bao gồm: (i) phương pháp RT-PCR dùng trong phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm và giải trình

tự gen virus (ii) Phương pháp phân tích đặc điểm sinh học phân tử và đặc điểm dịch tễ học phân tử dựa vào các phần mềm như BioEdit, MEGA, MAFFT, BEAST, v.v

Kết quả chính và kết luận

Có 5 nhóm kết quả nghiên cứu chính đã đạt được trong nghiên cứu này, bao gồm: (i) Bằng phản ứng RT-PCR, đã xác định được dịch PED đã xuất hiện ở một không gian trải rộng ở 10/10 tỉnh miền Bắc với tỷ lệ trung bình là 41,98% và liên tục theo thời gian (trong các năm thu thập mẫu từ 2013-2015) Các trang trại ở vùng đồng bằng có tỷ

lệ trang trại dương tính PEDV cao hơn rõ rệt so với các trang trại ở các tỉnh trung du- miền núi (68,42% so với 35,29%)

(ii) Lợn mắc PED có triệu chứng và bệnh tích điển hình của bệnh: phân tanh và

có mùi gây đặc trưng (64%), phân có sữa không tiêu (38%); ruột non trong (60%) và có cục sữa không tiêu ở các đoạn ruột (20%)

(iii) Tính đa dạng di truyền của gen S và gen ORF3 của 38 chủng PEDV của Việt Nam được phân tích đa chiều về tỷ lệ % tương đồng, phân loại theo nhóm di truyền và khoảng cách di truyền giữa các chủng virus Qua đó đã xác định được PEDV lưu hành ở

Việt Nam không có nguồn gốc từ các chủng virus vacxin và có tính đa dạng di truyền với mức tương đồng trình tự gen S là 63,7% - 87,9% và gen ORF3 là 93% - 99% Các chủng virus mang đột biến thêm- xóa và đột biến điểm ở vùng quyết định kháng nguyên của gen S được dự đoán không dẫn tới dẫn tới khả năng lẩn tránh kháng thể trung hòa (iv) Phân tích cây phả hệ của PEDV dựa vào trình tự gen S và gen ORF3 được thực hiện với dung lượng mẫu lớn (n = 911 trình tự gen S, n = 886 trình tự gen ORF3) được tạo ra trong nghiên cứu này và thu thập từ ngân hàng gen Nghiên cứu này đã khẳng định sự lưu hành của 2 genogroup PEDV ở Việt Nam Trong đó genogroup 2 bao gồm nhóm châu Á và nhóm Bắc Mỹ Một số chủng là kết quả của quá trình tái tổ hợp ở gen S giữa 2 chủng virus thuộc genogroup 1 và genogroup 2

(v) Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV lưu hành ở Việt Nam được cho từng genogroup virus, với hai kết luận quan trọng được rút ra Thứ nhất, PEDV lưu hành ở Việt Nam có nguồn gốc đa dạng: virus thuộc genogroup 1 và nhánh châu Á của genogroup 2 có nguồn gốc trực tiếp từ Trung Quốc Trong khi đó virus thuộc nhánh Bắc

Mỹ có nguồn gốc từ Mỹ Thứ hai, chủng virus tổ tiên của PEDV hiện lưu hành được dự đoán tồn tại trước thời điểm xảy ra dịch PED khoảng 6-9 năm Sau khi xâm nhập, các chủng PEDV của Việt Nam bắt đầu tạo thành những nhánh di truyền riêng biệt và lây lan ra các địa phương khác

THESIS ABSTRACT

PhD candidate: Nguyen Trung Tien

Thesis title: Epidemiological study of porcine epidemic diarrhea in pig populations in

the north of Vietnam

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives

This study firstly investigated the prevalence of PED in northern provinces which were divided in to the river delta and the mountainous areas Based on the identification

of PEDV in each region, the molecular epidemiology of PEDV was analyzed under different aspects For example, genetic substitutions which are related to neutralizing epitopes were focused Especially, based on a large data for phylogenetic inferences, this study revealed several important aspect of molecular epidemiology which was missed in several publications

Materials and Methods

This study used two major methods, which were: (i) RT-PCR based method for viral detection and Sanger sequencing (ii) Method for molecular epidemiological analyses was relied on several state-of-the-art tools, such as: BioEdit, MEGA, MAFFT, BEAST, etc

Main findings and conclusions

Five main results were drawn from this study, as the follows

(i) The result of RT-PCR screening confirmed the emergence of PED in all 10/10 investigated provinces The outbreaks were found consecutively from 2013-2015, and the average rate of prevalence was 41.98% Farms located in the river delta region tended to have a higher PEDV positive rate (68.42%) in compare to those located in the mountainous area (35.29%)

(ii) PEDV infected piglets displayed typical clinical symptoms as well as gross lesions of PED, such as: typical odor (64%), un-digested milk in feces (38%); thin-wall small intestine (60%) and milk curved in the intestinal lumen (20%)

(iii) The genetic diversities of S and ORF3 genes of 38 field strains were analyzed under different aspects It was concluded that field strains of PEDV in Vietnam were

not related to vaccine strain The sequence similarities between field viruses were 63.7% - 87.9% for the S gene and were 93% - 99% for the ORF3 gene Genetic insertion- deletions as well as point mutations in important epitopes of the spike protein were predicted not resulting escape mutants

(iv) Phylogenetic analyses were done on the large data of both S and ORF3 gene The results confirmed the prevalence both genogroup 1 and genogroup 2 of PEDV in pig population in Vietnam Of the genogroup 2, PEDVs in Vietnam were separated into the emerging Asian and North American clades Several strains were determined to be the result of recombination on the S gene between genogroup 1 and genogroup 2

(v) The molecular epidemiology was inferred for each genogroup Firstly, Vietnamese PEDVs were predicted originating from the viruses circulating in China (for genogroup 1 and Asian clade of genogroup 2) Meanwhile, the North American clade was predicted to derive from USA Secondly, the most recent common ancestor of Vietnamese PEDV was predicted to emerge in Vietnam 6-9 years prior to the first PED outbreak After the introduction, the viruses diversified locally to form Vietnamese clade and started to diffuse spatial-temporally into different locations

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bệnh tiêu chảy thành dịch trên lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc họ

Coronaviridae Về mặt lâm sàng, biểu hiện của bệnh PED rất giống với bệnh

viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE) mặc dù chúng là hai virus hoàn toàn khác nhau cùng họ Cornonaviridae Bệnh gây ra trên lợn ở tất cả các lứa tuổi với triệu chứng lâm sàng là nôn và tiêu chảy Tỷ lệ lây lan và tử vong ở lợn con dưới 5 ngày tuổi có thể tới 100% bởi tiêu chảy và mất nước nặng Bê ̣nh PED xảy ra quanh năm nhưng thường phổ biến hơn vào mùa đông và trên 90% ca bệnh xảy

ra ở lợn con dưới 7 ngày tuổi Dịch PED xuất hiện lần đầu tiên ở châu Âu vào năm 1971 (Wood, 1977), sau đó bệnh lây lan ra nhiều quốc gia khác ở châu Á như Trung Quốc, Đài Loan, Nhật, Hàn Quốc và Thái Lan

Trong thời gian gần đây, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào phân tích đặc điểm di truyền của các chủng virus gây bệnh PED, so sánh sự khác nhau về mặt di truyền, đặc điểm phát sinh loài của các chủng phân lập ở những địa điểm khác nhau, từ đó đưa ra các dự đoán, khuyến cáo và biện pháp đối phó hiệu quả

trước sự biến đổi của virus Park et al (2007) đã phân tích sự phát triển di truyền

của gen S (spike glycoprotein gene) và gen M trên các mẫu virus PED thực địa phân lập tại Hàn Quốc và chia các chủng virus thành 3 nhóm G1, G2, G3, (G1 có 3dưới nhóm: G1-1, G1-2 và G1-3), các chủng đó rất khác biệt với các chủng từ Châu Âu Khi phân tích trình tự gen mã hóa cho màng virus (gen M) từ các mẫu

phân lập tại Trung Quốc, Chen et al (2008) đã phát hiện có một nhóm mới

(genotype) của virus PED đang lưu hành

Ở Việt Nam, bê ̣nh tiêu chảy thành dịch ở lợn lần đầu tiên được phát hiện

vào năm 2008, đầu năm 2009 (Do Tien Duy et al., 2011; Nguyễn Tất Toàn và

cs., 2012) Theo các nghiên cứu đã công bố bệnh tiêu chảy thành dịch xảy ra trên lợn mọi lứa tuổi, lần đầu tiên được xác định là do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) tại Việt Nam Bệnh lan rộng nhanh chóng ở các tỉnh miền Đông Nam bộ, gây ảnh hưởng lớn đến kinh tế chăn nuôi heo do làm tăng

tỷ lệ bệnh, tỷ lệ chết cao đặc biệt trên lợn con theo mẹ từ 50 - 100% Cho đến nay có rất ít công trình trong nước tiến hành nghiên cứu về loại virus này Do

Tien Duy et al (2011) ở Thái Lan đã phân lập và giải trình một số chủng virus

PED trên các mẫu được lấy ở miền Nam Việt Nam trong thời gian từ 2009 đến

2010 Ở miền Bắc, theo báo cáo không chính thức từ các công ty, trang trại, dịch tiêu chảy do PEDV đã xảy ra nghiêm trọng từ đầu năm 2010 Việc phòng chống bệnh tiêu chảy do PEDV gây ra chủ yếu dựa vào sử dụng vacxin Trong khi các chủng virus thực địa thường xuyên có những biến đổi phức tạp về mặt

di truyền, do đó việc nắm bắt và cập nhật được các đặc tính phân tử của các chủng PEDV đóng vai trò quan trọng, giúp cho việc lựa chọn được vacxin thích hợp và hiệu quả phục vụ cho công tác tiêm phòng Trong khi đó, việc đánh giá

và phân tích đặc điểm di truyền của các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam còn hạn chế, đã gây khó khăn trong việc định hướng sử dụng vacxin trong công tác phòng bệnh Do đó, nghiên cứu về dịch tễ học phân tử, xác định các type virus đang lưu hành trong nước cũng như tìm hiểu nguồn gốc phát sinh phân loại, biến đổi di truyền của các type virus này là rất cần thiết cho việc phòng chống dịch PED cũng như định hướng cho việc nhập khẩu và triển khai sử dụng vacxin một cách hiệu quả, đồng thời cũng là một nền tảng quan trọng trong việc định hướng sản xuất vacxin trong nước nhằm đạt hiệu quả miễn dịch cao hơn cũng như chủ động được nguồn vacxin và tiết kiệm chi phí cho việc nhập khẩu

Để hạn chế dịch PED, việc nghiên cứu xác định được các chủng virus gây bệnh, đồng thời giải mã, phân tích hệ gen, xác định được nguồn gốc tiến hóa và sự biến đổi di truyền của các chủng PEDV là vô cùng quan trọng và là công việc nghiên cứu hết sức cần thiết mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn to lớn để từ đó góp phần quan trọng trong định hướng chiến lược cho việc sản xuất vacxin phòng bệnh trong tương lai

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh PED tại 10 tỉnh/ thành phố khu vực phía Bắc;

- Làm rõ được đặc điểm di truyền, đặc điểm dịch tễ học phân tử của các genotype PEDV đang lưu hành ở miền Bắc

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Trang trại nuôi lợn tại 10 tỉnh miền Bắc có lợn mắc tiêu chảy nghi do PEDV giai đoạn 2013 - 2015.Các tỉnh/ thành phố thuộc đồng bằng châu thổ sông Hồng (Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Thái Bình và Vĩnh Phúc) và Trung du - Miền núi (Hòa Bình, Bắc Giang, Thái Nguyên và Lào Cai)

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

- Đây là một nghiên cứu có hệ thống về PED và PEDV ở Việt Nam

- Đã làm rõ đặc điểm dịch tễ học bệnh PED trên địa bàn 10 tỉnh/ thành phố của miền Bắc Việt Nam Trên cơ sở xác định những biểu hiện bệnh lý của bệnh, đặc điểm dịch tễ học phân tử của căn bệnh, đã khẳng định sự lưu hành phổ biến của PED trong các trang trại chăn nuôi

- Nghiên cứu này đã giải mã được 15 trình tự gen S hoàn chỉnh và 8 trình

tự gen ORF3, so sánh và chứng minh được những chủng PEDV đang lưu hành tại thực địa không có cùng nguồn gốc với các chủng vacxin đang sử dụng

- Xác định được một số đặc điểm dịch tễ học phân tử, từ đó chứng minh được nguồn gốc đa dạng của các chủng PEDV đang lưu hành tại Việt nam

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

- Luận án đã phân tích và chỉ ra một số đặc điểm dịch tễ học của PED tại

10 tỉnh/ thành phố thuộc miền Bắc Việt Nam và mức độ lưu hành của bệnh, chứng minh được nguồn gốc của các chủng PEDV đang lưu hành tại thực địa

- Là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho nghiên cứu về PED và PEDV; là

tư liệu tham khảo cho giảng dạy của chuyên ngành Thú y và Chăn nuôi-Thú y

- Từ kết quả phân tích dịch tễ học phân tử của PEDV đã chỉ rõ mức tương đồng trình tự gen giữa những chủng PEDV phân lập từ thực địa và những chủng vacxin đang sử dụng, từ đó giúp cho việc hoạch định các biện pháp phòng chống bệnh, trong đó có lựa chọn vacxin phòng bệnh phù hợp

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG

Dịch tiêu chảy cấp ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea, PED) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc giống

Alphacoronavirus, họ Coronaviridae gây ra Dịch PED thường xảy ra ở lợn con

dưới 7 ngày tuổi với tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết có thể lên đến 100% Dịch PED đã và đang gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi lợn ở nhiều quốc

gia trên thế giới (Laude et al., 1993; Lee, 2015) Dịch PED lần đầu tiên được

phát hiện ở Anh vào năm 1971, sau đó các ổ dịch liên tục được phát hiện và xảy

ra phổ biến ở các quốc gia châu Âu khác như Bỉ, Đức, Pháp, Hà Lan, Thụy Sỹ,

và ở châu Á như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan (Chen et al., 2010; Chen et al., 2008; Song and Park, 2012; Puranaveja et al., 2009) Ở Việt Nam,

dịch PED lần đầu tiên được phát hiện vào năm 2008 và từ đó đến nay dịch bệnh thường xuyên xảy ra và gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn

trong cả nước (Do Tien Duy et al., 2011)

2.2 LỊCH SỬ BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN

Bệnh tiêu chảy thành dịch trên lợn được phát hiện đầu tiên tại nước Anh vào năm 1971 (Oldham, 1972) Bệnh xảy ra trên lợn vỗ béo với các biểu hiện lâm sàng giống với bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE), chỉ khác một đặc điểm quan trọng đó là lợn con đang bú mẹ không mắc bệnh TGEV và các tác nhân gây bệnh đường tiêu hóa khác đã được xác định không phải là nguyên nhân gây ra bệnh trên Sau đó căn bệnh này đã lây lan sang các nước châu Âu và được gọi là bệnh “tiêu chảy thành dịch do virus” (Epidemic viral diarrhea - EVD) Năm 1976 căn bệnh tiêu chảy giống TGE lại xuất hiện nhưng xảy ra trên tất cả lợn ở mọi lứa tuổi, gồm cả lợn con đang trong giai đoạn bú sữa mẹ (Wood, 1977), khả năng nguyên nhân gây bệnh là TGEV và các tác nhân gây bệnh đường tiêu hóa khác cũng đã được loại trừ Khi đó, tên EVD loại 2 được đưa ra

để phân biệt với EVD loại 1 là bệnh bùng phát năm 1971 với sự khác nhau đó là lợn con đang bú mẹ chỉ mắc EDV loại 2 mà không mắc EDV loại 1

Năm 1978, Coronavirus đã được chứng minh là nguyên nhân gây ra các đợt bùng phát EVD loại 2 (Chasey and Cartwright, 1978) Kết quả gây bệnh nghiệm thực cho lợn bằng một chủng virus phân lập được (CV777) cho thấy bệnh tích đường tiêu hoá biểu hiện điển hình trên cả lợn con và lợn vỗ béo Rõ ràng là Coronavirus này liên quan tới sự bùng phát EVD loại 1 và loại 2, từ đó tên bệnh đã được đổi thành “tiêu chảy thành dịch trên lợn” (Porcine Epidemic Diarrhea, PED)

2.3 TÌNH HÌNH DỊCH PED TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

2.3.1 Tình hình dịch PED trên thế giới

Từ đầu những năm 2000 trở lại đây, những trận dịch bùng phát cấp tính đã trở nên hiếm có ở những vùng mà virus trước kia đã từng lan rộng Hiện nay, các

ổ dịch PED ít được ghi nhận ở châu Âu và ngày càng có ít nghiên cứu về bệnh này Hơn nữa, bệnh thường được thấy nhất ở lợn choai, lợn trưởng thành và lợn mới sinh sản, trong khi lợn con bú mẹ lại ít khi nhiễm bệnh

Trong thập niên 70 và 80 của thế kỷ XX, dịch PED lưu hành rộng rãi ở châu Âu, gây bệnh ở lợn mọi lứa tuổi Trong khoảng thời gian từ cuối thập niên

80 đến thập niên 90, dịch có xu hướng giảm đáng kể, với rất ít ổ dịch rời rạc được ghi nhận ở một số nước như Tây Ba Nha, Hungary, Anh và cộng hòa Séc

(Carvajal et al., 2015) Trong năm 2005- 2006, dịch PED xảy ra nghiêm trọng ở

Ý, với tỷ lệ chết ở lợn con theo mẹ từ 8,3% đến 11,9% (Martelli et al., 2008)

Từ năm 2014 đến nay, PED được mô tả xuất hiện trở lại ở một số nước như Đức (Hanke et al., 2015), Ý (Boniotti et al., 2016), Bỉ, Pháp (Grasland et al.,

50.000 con), chủ yếu là lợn dưới 7 ngày tuổi (Chen et al., 2012) Ở Nhật, dịch

PED xuất hiện lần đầu tiên năm 1993, gây chết 14.000 con, tỉ lệ chết từ 30 tới

100% lợn con, dịch PED năm 1996 gây chết 39.509 con Ở Hàn Quốc, dịch PED xuất hiện đầu tiên năm 1992, sau đó đến năm 2007-2008, dịch liên tiếp xuất hiện

ở các Quốc gia Ðông Nam Á như Thái Lan, Philippines và Việt Nam Trong thời gian cuối năm 2007-2008, tại Thái Lan, dịch phát hiện đầu tiên ở tỉnh Nakornpathom trước khi nó lan rộng trong cả nước Dịch lan rộng đã gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn của Thái Lan Phân tích cây phát sinh loài, thấy tất cả các PEDV phân lập được trong thời gian bùng phát dịch đều giống chủng ở Trung Quốc JS - 2004 - 2

2.3.2 Tình hình dịch PED ơ ̉ Viê ̣t Nam

Năm 2008, virus PED đã được phát hiện trong một số đàn lợn bị tiêu chảy ở Việt Nam Trong năm 2008 - 2009, bệnh lan rộng nhanh chóng ở các tỉnh miền Đông Nam Bộ gây ảnh hưởng lớn đến ngành chăn nuôi lợn nước ta Bệnh xảy ra rất nhanh, trên toàn đàn lợn và gây chết gần như 100% lợn con theo mẹ Tỷ lệ tử vong giữa các tỉnh dao động từ 65 - 91% Theo nhận định của các chuyên gia thì nguyên nhân của tiêu chảy cấp có thể là do bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED) hoặc do viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE) gây ra Năm 2010, dịch vẫn tiếp tục xảy ra ở một số trại, thậm chí tái phát ở những trại đã từng xảy ra dịch trong năm 2009 Theo thống kê của phòng xét nghiệm nhanh công ty C.P Việt Nam trong 5 tháng đầu năm 2010 cả nước có 31 trại bị nhiễm PED và tỉnh có nhiều ca bệnh nhất là Đồng Nai với 15 ca bệnh Các trại bị nhiễm bệnh này chủ yếu tập trung ở miền Nam (Đồng Nai, Lâm Đồng, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình Phước, Củ Chi) Ở miền Bắc, theo báo cáo không chính thức các công ty, trang trại tại Hải Dương, Thái Nguyên, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hưng Yên, Thái Bình,

Hà Nam, Nam Định, Hòa Bình,… dịch tiêu chảy do PEDV đã xảy ra nghiêm trọng từ đầu năm 2010 và cho đến nay tình hình dịch bệnh tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam ngày càng trầm trọng hơn Các nghiên cứu trước đó tại Viện Thú y Quốc gia, Trung tâm chẩn đoán Thú y TW, Phòng thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y - Học Viện Nông nghiệp Việt Nam đã xác định được các ca nhiễm PED trên lợn ở phía Bắc Việt Nam

Ở Việt Nam, hiện tại có rất ít nghiên cứu tiến hành về bệnh PED Bệnh

được phát hiện từ năm 2008 (Do Tien Duy et al., 2011; Nguyễn Tất Toàn và cs.,

2012) Sau đó, bệnh ngày càng lan rộng và bùng phát ở nhiều khu vực Bệnh gây thiệt hại nặng nề cho các trang trại bởi tỉ lệ mắc toàn đàn rất cao (gần 100%) Theo thống kê không chính thức của phòng xét nghiệm nhanh công ty C.P Việt Nam trong năm tháng đầu năm 2010 cả nước có 31 trại bị nhiễm PED Các trại bị nhiễm bệnh này chủ yếu tập trung ở các tỉnh nam bộ như Đồng Nai, Lâm Đồng, Bình Phước, Bà Rịa - Vũng Tàu

Cũng tại các tỉnh phía Nam, một số nghiên cứu xác định các yếu tố liên quan lây truyền dịch bệnh cũng như đặc điểm về triệu chứng và bệnh tích của dịch tiêu chảy cấp xảy ra ở các trại heo khu vực phía nam để góp phần định hướng trong việc chẩn đoán bệnh PED và xây dựng biện pháp hạn chế sự lây lan bệnh này ở các trại heo tại Việt Nam (Nguyễn Tất Toàn và Đỗ Tiến Duy, 2012) Qua khảo sát các ổ dịch tiêu chảy cấp, tỷ lệ bệnh và tỷ lệ chết xuất hiện trên heo con theo mẹ là rất cao (tương ứng 93,94% và 81,67%) Hai tỷ lệ này giảm dần theo lứa tuổi Các yếu tố liên quan đến việc lan truyền dịch bệnh giữa các trại phụ thuộc vào: khoảng cách đến với trại heo bị bệnh (trại càng gần có nguy cơ lây bệnh càng cao), vệ sinh sát trùng (thực hiện trên 2 tuần, một lần có tỷ lệ nhiễm bệnh cao hơn so với 1 tuần, một lần), quy mô chăn nuôi (tỷ lệ nhiễm bệnh cao ở trại có quy mô chăn nuôi nhỏ, dưới 50 heo nái), và nguồn nước sử dụng (tỷ

lệ nhiễm bệnh cao ở trại có nguồn nước chưa qua xử lý) Triệu chứng lâm sàng đặc trưng của dịch tiêu chảy cấp trên heo con là tiêu chảy phân lỏng (100%), ói mửa (90,33%), sau đó suy nhược, mất nước và chết nhanh Các bệnh tích thường gặp ở cơ quan tiêu hóa của heo con là dạ dày căng phồng, chứa sữa đông, thức ăn không tiêu hóa (94,42%) và thành ruột non mỏng, phồng to, chứa nhiều nước và dịch chất bên trong (86,33%) Bệnh tích vi thể cũng xảy ra trên cả dạ dày và 3 đoạn của ruột non với sự hư hại nặng phần niêm mạc và các tuyến Các kết quả này góp phần định hướng trong việc chẩn đoán bệnh PED và xây dựng biện pháp

hạn chế sự lây lan bệnh này ở các trại heo tại Việt Nam

Ở khu vực phía Bắc, các nghiên cứu đã xác định được bệnh tiêu chảy thành dịch trên lợn (Porcine epidemic diarrhea: PED) xảy ra tại 26 trại ở 6 tỉnh, trong

đó một số trại cộng nhiễm cả TGEV và Rotavirus Tại các trại, PED thường bùng phát vào mùa lạnh (từ tháng 11 đến tháng 4), thời gian lây lan nhanh, thường xảy

ra đầu tiên trên đàn lợn nái, tỷ lệ lợn biểu hiện tiêu chảy cao (trung bình 76,8%)

Lợn ở tất cả các lứa tuổi đều bị tiêu chảy (có thể lên tới 100%), tỷ lệ chết cao ở lợn con theo mẹ (68,6%) Có sự khác biệt lớn về mức độ cảm nhiễm, tỷ lệ biểu hiện tiêu chảy, tỷ lệ chết, thời gian tiêu chảy giữa các trại và giữa các nhóm tuổi, giới tính Triệu chứng chủ yếu ở lợn mắc PED là tiêu chảy, nôn mửa, bỏ ăn, kèm theo các rối loạn về hô hấp, thần kinh, mức độ trầm trọng tăng dần theo tuổi Bệnh tích đại thể ở lợn con thường gặp là thành ruột non mỏng, căng phồng toàn

bộ hoặc từng đoạn (61,3 - 94%); dạ dày sung huyết, xuất huyết (19,4 - 84%); hạch lympho màng treo ruột, gan sung huyết, ứ huyết; tĩnh mạch màng treo ruột sung huyết nặng, khó quan sát thấy mạch bạch huyết ở màng treo ruột Bệnh tích

vi thể chủ yếu đường tiêu hóa: lông nhung đứt nát, ngắn lại; tế bào biểu mô hấp thu thoái hóa không bào; biểu mô phủ dạ dày, ruột bong tróc; sung huyết, xuất huyết, thâm nhiễm tế bào viêm ở lớp đệm và lớp hạ niêm mạc đường tiêu hóa

(Nguyễn Văn Điệp và cs., 2014)

Việc ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn đoán bệnh tiêu chảy do virus PED ở lợn con theo mẹ dưới 10 ngày tuổi, cho thấy: Các lợn con bị mắc PED thường có biểu hiện sốt, chán ăn, bỏ ăn, tiêu chảy phân nhiều nước, màu vàng xám, có sữa không tiêu, lợn gầy yếu, ủ rũ, mệt mỏi Dạ dày căng phồng chứa thức ăn không tiêu, ruột non căng phồng, thành ruột bị bào mỏng, chứa dịch màu vàng, hạch màng treo ruột sưng to Kết quả phản ứng RT-PCR đã chỉ ra rằng các lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng, bệnh tích như trên đều mắc PED (Nguyễn

Văn Điệp và cs., 2014)

Bệnh tiêu chảy do virus PED gây ra có tính lây lan nhanh tuy nhiên chưa có loại vacxin nào phòng bệnh thì nguy cơ tái phát, nguy cơ biến chủng của virus cũng là vấn đề rất đáng lo ngại Trước tình hình đó, việc hiểu biết về đặc điểm căn bệnh và chẩn đoán nhanh là hết sức cấp thiết trong phòng chống dịch bệnh, bảo vệ sức khỏe vật nuôi và kinh tế cho người chăn nuôi

2.4 CĂN BỆNH

2.4.1 Phân loại và hình thái của PEDV

Dựa trên đặc điểm kháng nguyên và di truyền, virus PED (PEDV) được xếp vào chi Coronavirus, họ Coronaviridae, cùng với TGEV, coronavirus ở mèo, chó

và coronavirus 229E ở người (Gonzalez et al., 2003) Hạt PEDV mang những

điểm đặc trưng của họ Coronaviridae Theo phân loại về huyết thanh học, người

ta xác định vius PED hiện mới chỉ có 1 serotype Các chủng PEDV phân lập từ châu Âu, Hàn Quốc và Trung Quốc đều tương đồng về mặt huyết thanh với

chủng CV777 phân lập từ thực địa ở Bỉ năm 1978 (Kweon et al., 1993)

Hình thái của PEDV trong tế bào biểu mô đường tiêu hoá tương tự như các

coronavirus khác (Ducatelle et al., 1982) Virus có một nhân đậm đặc điện tử với

quầng sáng ở giữa và những phần toả ra từ nhân dạng chuỳ dài xấp xỉ 20 nm Hạt virus xác định từ mẫu phân có hình thái đa dạng và đường kính từ 90 đến 190 nm

(minh họa tại hình 2.1) (Debouck et al., 1981) Virus nhân lên thông qua việc nẩy

chồi từ các màng bên trong bào tương tế bào vật chủ

Hạt virus được nhuộm với urany acetat 2%, chiều dài thanh nằm ngang tương đương 100nm

Hình 2.1 Hạt virus PED chủng KPEDV-9 phân lập tại Hàn Quốc

Nguồn: Kweon et al (1993)

2.4.2 Cấu trúc phân tử của virus gây bệnh

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, PEDV là một virus có vỏ ngoài, vật chất di truyền là RNA dạng sợi dương có kích thước khoảng 28 kb (hình 2.2) Hệ gen bao gồm ít nhất bảy khung đọc mở mã hoá cho 4 loại protein cấu trúc [gai (S), vỏ (E), màng (M) và nucleocapsid (N)] và 3 loại protein không cấu trúc (replicase 1a, 1b và ORF3), với thứ tự trên hệ gen 5’-replicase (1a/1b)-S-ORF3-E-M-N-3’

(Bridgen et al., 1993; Bridgen et al., 1998; Duarte et al., 1994; Kocherhans et al.,

2001) Gen polymerase gồm 2 khung đọc mở (Open Reading Frame - ORF) 1a

và 1b, chiếm 2/3 bộ gen tính từ đầu 5’ và mã hoá cho các polyprotein tái bản không cấu trúc (replicase 1a và 1b) Các gen mã hoá cho protein cấu trúc chính như S (150-220 kDa), E (7 kDa), M (20-30 kDa) và N (58 kDa) nằm ở vị trí tiếp nối gen polymerase Gen ORF3 là một gen phụ trợ, nằm giữa các gen cấu trúc

Nó mã hoá cho một protein bổ trợ, số lượng và trình tự của các gen thay đổi ở

các coronavirrus khác nhau (Narayanan et al., 2008)

Hình 2.2 Mô hình cấu trúc và bộ gen PEDV

Nguồn: Song et al (2012)

Protetin cấu trúc của PEDV tương tự như các coronavirus khác Virus có một protein gai (S) với trọng lượng phân tử khoảng 180-200 kDa, một protein màng (M) 27-32 kDa, một protein nucleocapsid gắn với ARN nặng 57-58 kDa

(Duarte et al., 1994; Duarte et al., 1994) Protein S của PEDV là glycoprotein loại 1 gồm 1383 amino acid (aa) Nó chứa một chuỗi peptid tín hiệu (1-18 aa), các epitop trung hoà (499-638, 748-755), 764-771, và 1368-1374), một vùng

xuyên màng (1334 – 1356), và một vùng ngắn nằm trong bào tương Protein S cũng có thể được chia thành vùng S1 (1-789 aa) và vùng S2 (790-1383 aa) dựa trên tính tương đồng của nó ở coronavirus khác nhau Giống như các protein S của coronavirus khác, protein S của PEDV là một loại gai glycoprotein (kháng nguyên bề mặt) trên bề mặt virus, chúng đóng vai trò quan trọng trong việc điều hoà tương tác với các glycoprotein thụ thể đặc hiệu trên tế bào vật chủ trong quá trình xâm nhập, kích thích tạo kháng thể trung hoà ở vật chủ tự nhiên

(Chang et al., 2002) Ngoài ra, glycoprotein S cũng liên quan tới sự thích nghi

sinh trưởng trong điều kiện phòng thí nghiệm và sự giảm độc lực khi gây bệnh

trên động vật (Park et al., 2007) Trong nghiên cứu chế tạo vacxin phòng bệnh, hiện tại các nhà khoa học chủ yếu tập trung vào glycoprotein này (Puranaveja et al., 2009)

ORF3 là gen mã hoá cho protein không cấu trúc và là protein phụ trợ, không cần thiết cho quá trình nhân lên của PEDV Tuy nhiên các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra chức năng quan trọng của protein này trong việc quyết định độc tính của PEDV Sự biến đổi của gen ORF3 trong quá trình cấy chuyển nhiều lần trên tế bào có thể làm giảm độc tính của chủng thực địa Sự khác biệt của gen ORF3 cũng được thể hiện rõ rệt giữa các chủng thực địa và các chủng

nuôi cấy trong phòng thí nghiệm (Wongthida et al., 2017; Park et al., 2008)

Protein M là thành phần vỏ lớn nhất của virus PED, glycoprotein cấu trúc màng với một đầu tận cùng gắn amin ngắn phía ngoài virus và một đầu tận cùng

gắn carboxy ở bên trong (Utiger et al., 1995) Protein M không chỉ đóng vai trò quan trọng trong chu trình lắp ráp virus (Nguyen and Hogue, 1997) mà còn trong việc tạo ra kháng thể trung hoà virus với sự có mặt của bổ thể (Saif, 1993)

Protein M có thể đóng một vai trò trong quá trình tạo ra α-interferon (Laude et al., 1992) Việc đồng thời biểu hiện protein M và N cho phép tạo thành các hạt

giả virus có khả năng biểu lộ hoạt tính sinh interferon tương tự như hạt virus hoàn chỉnh Việc tiến hành thêm các nghiên cứu về glycoprotein M sẽ làm tăng thêm hiểu biết của chúng ta về mối quan hệ di truyền, sự đa dạng giữa các chủng

PEDV và tình trạng dịch tễ của PEDV trên thực địa (Chen et al., 2010)

2.4.3 Đặc tính nuôi cấy của virus

Đặc tính nuôi cấy trong môi trường tế bào: ban đầu, việc nhân PEDV được thực hiện bằng cách gây nhiễm cho lợn con theo đường miệng (Debouck and Pensaert, 1980), bằng cách cho lợn con uống virus Việc nuôi cấy virus trong điều kiện phòng thí nghiệm thời gian đầu gặp rất nhiều khó khăn, người ta

đã thử nghiệm nuôi cấy trên nhiều loại tế bào nhưng rất ít thành công Phân lập virus có ý nghĩa rất quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh, dịch tễ học, và công tác quản lý dịch bệnh

Hofmann and Wyler (1988) đã nghiên cứu thành công môi trường tế bào thích hợp để PEDV phát triển, nhân lên và có thể phân lập được virus Đến nay, tế bào Vero (thận khỉ xanh châu Phi) có thể cấy chuyển được PEDV, gây bệnh tích tế bào, tuy nhiên, sự phát triển của virus phụ thuộc vào sự có mặt của men trypsin trong môi trường nuôi cấy Trong môi trường nuôi cấy, virus tác động lên tế bào hình thành các không bào và thể hợp bào (có thể lên tới

100 nhân) Hiệu giá virus đạt tối đa sau khi nuôi cấy 15 giờ Ngoài ra, PEDV

đã được nhân lên thành công trên các tế bào thận lợn và bàng quang lợn ở

Nhật Bản (Shibata et al., 2000) Chủng virus phân lập tại Nhật Bản (P-5V) đã

được sử dụng làm chủng virus vacxin và được nuôi cấy trên các dòng tế bào lợn KSEK6 và IB - RS2

2.4.4 Sức đề kháng của virus gây bệnh PED

PEDV ổn định giữa pH 5 – 9 tại 4oC và giữa pH 6,5 – 7,5 tại 37oC, bất hoạt khi pH < 4 và pH > 9 Trong môi trường nuôi cấy thích nghi, virus bị mất khả năng lây nhiễm ở nhiệt độ 60oC trong vòng 30 phút, nhưng ổn định ở

50oC Virus mẫn cảm với ether, chloroform và không gây ngưng kết hồng cầu của nhiều loài PEDV bị bất hoạt bởi hầu hết các chất khử trùng bao gồm cả: cresol, natri hydroxyt 2% (NaOH 2%), formol 1%, natri cacbonate (4% muối khan hoặc 10% dạng tinh thể với 0,1% chất tẩy rửa), chất tẩy rửa có ion và không ion, iodophor mạnh (1%) trong acid phosphoric và chloroform

(Callebaut et al., 1982)

Hình 2.3 Hiệu giá của PEDV tồn tại trên bề mặt vật liệu theo thời gian

Nguồn: Kim et al (2018)

Về sức đề kháng với nhiệt độ, PEDV không bền với nhiệt độ, bị bất hoạt nhanh chóng ở nhiệt độ phòng sau 2 ngày Ngược lại, ở nhiệt độ 4oC, virus tồn

tại trong khoảng 2 tuần (Kim et al., 2018)

2.4.5 Dịch tễ học lâm sàng

2.4.5.1 Loài vật mắc bệnh

Bệnh xảy ra ở loài lợn, ở mọi lứa tuổi Trong nhiều ổ dịch tỷ lệ lợn ốm lên đến 100%, tỷ lệ chết trung bình ở lợn con là 50% nhưng cũng có thể rất cao đến 100% (Lee, 2015) Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi 0 - 5 ngày tuổi: tỷ lệ chết 100% Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi 6 - 7 ngày tuổi: tỷ lệ chết khoảng 50% Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi > 7 ngày tuổi: tỷ lệ chết khoảng 30%

2.4.5.2 Phương thức truyền lây

Phương thức truyền lây của PEDV tương tự với TGEV, nhưng PEDV có

xu hướng tồn tại dễ dàng hơn trên lợn đã bị nhiễm bệnh Đường truyền phân miệng có thể là phương thức chủ yếu để virus truyền sang vật chủ khác PED cấp tính thường xảy ra ở thời điểm 4 – 5 ngày sau khi lợn bán hoặc mua về Virus có thể xâm nhập vào trại thông qua lợn nhiễm virus được chuyển về hoặc các dụng cụ có mang virus như: xe vận chuyển, ủng, quần áo bảo hộ… đây là những nguồn lây nhiễm tiềm năng cho lợn mẫn cảm PEDV không khác nhiều TGEV về đường truyền lây nhưng virus này có vẻ tồn tại lâu hơn trong các trang trại sau khi dịch PED cấp tính đã qua đi Khi dịch xảy ra ở trại lợn sinh sản, virus có thể được bài thải từ đàn mắc bệnh hoặc trở thành dịch địa phương Một chu kỳ dịch địa phương có thể được hình thành nếu số lợn được sinh ra và lợn cai sữa trong trại đủ lớn để duy trì sự lưu hành của virus thông qua việc lây nhiễm giữa các lứa kế tiếp nhau khi lợn con mất khả năng miễn dịch tại thời điểm cai sữa PEDV có thể gây ra tiêu chảy dai dẳng trên lợn con sau cai sữa ở những trại như vậy Nguyên nhân khác dẫn tới bệnh PED lưu hành ở một trang trại là do hiện tượng mang và thải virus một cách liên tục,

trong vòng 1 tháng kể từ khi lợn bị nhiễm và qua khỏi (Crawford et al., 2015)

Ngoài con đường bài thải qua phân, một số công bố gần đây còn cho thấy PEDV có khả năng bài thải qua sữa Do đó, các tác giả này giả thiết rằng sữa là

một con đường truyền dọc quan trọng của PEDV từ mẹ sang con (Sun et al.,

2012) Hiện vẫn còn ít nghiên cứu về đường truyền lây này của PEDV

2.4.5.3 Cơ chế sinh bệnh

Cơ chế sinh bệnh của PEDV được nghiên cứu trên lợn con không được uống sữa đầu Cho lợn con 3 ngày tuổi uống chủng CV777 sau khoảng 22 đến 36

giờ lợn bắt đầu nôn và tiêu chảy (Debouck et al., 1980)

Vị trí và sự nhân lên của virus được xác định thông qua kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang và kính hiển vi điện tử PEDV nhân lên trong bào tương của các tế bào lông nhung, phá huỷ các tế bào biểu mô và làm ngắn lông nhung niêm mạc

ruột, tỷ lệ chiều cao giữa lông nhung và tuyến ruột có thể giảm từ 7:1 xuống còn

3:1 (Pospischil et al., 2002) Các tế bào biểu mô hấp thu ở lông nhung rất mẫn

cảm với PEDV, những tế bào biểu mô nhiễm virus có thể được quan sát sau

12-18 giờ gây nhiễm, rõ nhất sau khoảng 24 đến 36 giờ, tuy nhiên ít quan sát thấy có

sự phá hủy tế bào biểu mô ở kết tràng (Guscetti et al., 1998) Đặc điểm sinh bệnh

của PEDV ở ruột non của lợn con rất giống với TGEV So với TGEV, sự nhân lên và lây lan trong ruột non của virus PED diễn ra chậm hơn và thời gian nung bệnh lâu hơn

Cơ chế sinh bệnh của PEDV ở lợn giai đoạn lớn hơn vẫn chưa được nghiên cứu chi tiết, nhưng bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang có thể quan sát thấy virus có mặt trong tế bào biểu mô kết tràng của lợn mắc bệnh tự nhiên hoặc được gây nhiễm Ý nghĩa của việc virus xâm nhiễm ở kết tràng có làm cho bệnh nặng hơn hay không vẫn chưa được rõ Hiện vẫn chưa có cơ chế thích hợp nào được đưa ra để lý giải hiện tượng lợn chết đột ngột kèm theo việc hoại tử cơ lưng cấp tính quan sát thấy ở lợn vỗ béo và lợn trưởng thành

(Nguyễn Văn Điệp và cs., 2014)

Vị trí nhân lên của virus được xác định thông qua kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang và kính hiển vi điện tử Nghiên cứu của Shibata và cộng sự đã chỉ ra rằng

ở lợn sạch bệnh (specific pathogen free) khi được uống virus PED phân lập từ thực địa ở độ tuổi từ 2 ngày đến 12 tuần, sức đề kháng tăng dần theo tuổi và lợn

chỉ bị chết khi trong giai đoạn từ 2 - 7 ngày tuổi (Shibata et al., 2001) Cơ chế

sinh bệnh của PEDV ở lợn giai đoạn lớn hơn vẫn chưa được nghiên cứu chi tiết, nhưng bằng kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang có thể quan sát thấy virus có mặt trong tế bào biểu mô kết tràng của lợn mắc bệnh tự nhiên hoặc được gây nhiễm

Ý nghĩa của việc virus xâm nhiễm ở kết tràng có làm cho bệnh nặng hơn hay không vẫn chưa rõ

Biểu hiện và tiến triển lâm sàng của lợn sạch bệnh bị gây nhiễm chủng PEDV đã thích nghi trên môi trường nuôi cấy tế bào (ca - PEDV) nhẹ hơn nhiều

so với lợn nhiễm chủng thể hoang dại (wt - PEDV), độc lực của chủng ca - PEDV yếu hơn nhiều, tốc độ sinh sản của virus chậm hơn và sự biến đổi về mặt

vi thể ở các cơ quan của lợn nhiễm virus cũng kém rõ ràng hơn (Lin et al., 2017)

2.5 DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ

Để xác định mối quan hệ giữa các chủng PEDV, các phân tích về cây phả

hệ (phylogenetic tree) và đặc điểm di truyền được tiến hành dựa trên các trình tự

gen S, M, và ORF3 (Song and Park, 2012) đôi khi cả gen E (Park et al., 2011)

Nghiên cứu trên một phần của gen S và toàn bộ gen M đã gợi ý chia PEDV thành

3 nhóm (G1, G2, và G3), mỗi nhóm cũng được chia thành các nhóm nhỏ hơn

(G1-1, G1-2, và G1-3) (Park et al., 2007) Phân tích cây phả hệ dựa trên trình tự

gen S và M đều chỉ ra rằng các chủng PEDV phân lập được ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam có độ tương đồng cao và khác biệt với các chủng

PEDV phân lập được từ các quốc gia thuộc châu Âu (Do Tien Duy et al., 2011; Puranaveja et al., 2009; Park et al., 2007; Park et al., 2011)

Phân tích mối liên hệ gen giữa các chủng PEDV có thể được thực hiện trên

cơ sở phân tích toàn bộ hệ gen của virus Nhiều nghiên cứu cho thấy trình tự của gen mã hóa spike protein hoặc phân đoạn gen mã hóa vùng S1 của spike protein

(amino acid 1- 735) là phù hợp để phân tích đặc điểm tiến hóa của virus (Chen et al., 2014; Lee et al., 2010; Chung et al., 2015) Theo tác giả Lee (2015), mặc dù

chỉ có 1 serotyp duy nhất, PEDV có thể được chia làm 2 genogroup: nhóm G1 cổ điển (G1, classical) và nhóm G2 (field epidemic/ pandemic) Mỗi nhóm lại được chia thành nhiều dưới nhóm: 1a, 1b và 2a, 2b

Nhóm G1a bao gồm chủng nguyên mẫu CV777, chủng virus vacxin và các chủng virus thích nghi trên tế bào Nhóm G1b bao gồm một số biến chủng mới

được phát hiện lần đầu tiên ở Trung Quốc vào năm 2011 (Li et al., 2012), sau đó được phát hiện ở Mỹ vào năm 2014 (Wang et al., 2014), ở Hàn Quốc năm 2013 (Lee et al., 2014; Cho et al., 2014) và một số nước châu Âu (Hanke et al., 2015; Theuns et al., 2015; Grasland et al., 2014) Nhóm G2 bao gồm các chủng virus

thực địa, được chia thành dưới nhóm 2a (gây ra các vụ dịch PED ở châu Á trước đây) và dưới nhóm 2b (gây ra các vụ dịch PED ở châu Á và bắc Mỹ gần đây) Theo tác giả Lee (2015), các nhóm di truyền của PEDV có hiện tượng truyền lây qua lại giữa các nước trong khu vực và giữa các châu lục (châu Á- châu Mỹ) Các con đường truyền lây được tóm tắt ở hình 2.4

Mũi tên nét liền biểu hiện đường truyền lây đã được biết giữa các nước;

mũi tên nét chấm là đường truyền lây dự đoán

Hình 2.4 Con đường truyền lây của PEDV

Nguồn: Lee (2015) Nhóm cổ điển G1a lưu hành ở Trung Quốc có thể xuất phát từ việc sử dụng các chủng virus vacxin hoặc do nhập lậu chủng virus vacxin nhược độc từ Hàn Quốc Nhóm G2a bắt nguồn từ Hàn Quốc, lây lan sang Trung Quốc và sau đó lây sang các nước Đông Nam Á như: Thái Lan, Việt Nam Nhóm G2a ở các nước Đông Nam Á cũng có thể bắt nguồn trực tiếp từ Hàn Quốc Nhóm di truyền mới nổi G1b và G2b hình thành ở Trung Quốc có thể là kết quả của quá trình tái tổ hợp giữa virus thuộc nhóm G1a và G2a lưu hành tại nước này Cả 2 nhóm này sau đó lây lan gần như đồng thời sang Mỹ, và sau đó xuất hiện ở Hàn Quốc, một

số nước bắc Mỹ, nam Mỹ và có thể cả Nhật Bản và Đài Loan

Trong một nghiên cứu khác, dựa vào hiện tượng thêm - xóa ở gen mã hóa spike protein, có thể chia PEDV làm 2 nhóm: NON- S INDEL và S INDEL) Ở

Mỹ, những biến thể thuộc nhóm S INDEL gây ra các ổ dịch có triệu chứng lâm

sàng nhẹ (Vlasova et al., 2014) Các chủng PEDV phân lập được ở châu Âu

(Đức, Ý, Bỉ, Hà Lan và Pháp) vào năm 2014 và 2015 đều thuộc nhóm S INDEL cùng với nhóm lưu hành ở Mỹ PEDV thuộc nhóm non - S INDEL đã được phát hiện ở Ukraina, gây bệnh nghiêm trọng ở lợn dưới 10 ngày tuổi, với tỷ lệ chết lên

tới 100% (Dastjerdi et al., 2015)

2.6 TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH CỦA LỢN MẮC PED

2.6.1 Triệu chứng lâm sàng

Các mức độ nghiêm trọng gây ra bởi PEDV là rất khác nhau, phần lớn phụ thuộc vào tình trạng miễn dịch và tình hình dịch bệnh ở các trang trại lợn Khi lợn mắc PED, biểu hiện chủ yếu và thường là duy nhất ở lợn đó là tiêu chảy mạnh, phân rất nhiều nước Lợn có hiện tượng bỏ ăn, mệt mỏi Lợn con theo mẹ: gầy, lười bú, ỉa chảy, phân lỏng, tanh, màu vàng, có sữa không tiêu; nôn mửa, lợn con sụt cân nhanh do mất nước Lợn con thích nằm lên bụng mẹ, điều trị bằng các loại kháng sinh đặc trị tiêu chảy không có kết quả

Lợn sinh sản: tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết rất khác nhau Lợn thường qua khỏi sau

1 tuần Bệnh xảy ra ở những trại giống mẫn cảm có tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong rất khác nhau Lợn ở tất cả các lứa tuổi đều có thể mắc với tỷ lệ có thể lên tới 100% Biểu hiện của PED tương tự TGE, tuy rằng PED lây lan chậm hơn và có tỷ lệ chết ở lợn con thấp hơn Lợn con dưới 1 tuần tuổi có thể chết do mất nước sau khi tiêu chảy 2 - 4 ngày Tỷ lệ chết ở lợn con trung bình khoảng 50%, nhưng có thể cao hơn tới 100% Ở giai đoạn lớn hơn, lợn thường tự hồi phục sau khi quá trình tiêu chảy kéo dài được 1 tuần Khi PED cấp tính ở 1 trại nào đó qua đi thì lợn con giai đoạn 2 - 3 tuần sau cai sữa vẫn có thể có biểu hiện tiêu chảy và lợn mới nhập về thường phát bệnh Vài năm gần đây, những đợt bùng phát cấp tính điển hình với tỷ lệ chết cao trên lợn sơ sinh hiếm xảy ra ở châu Âu, nhưng các ổ dịch tại Nhật Bản và Hàn Quốc lại cho thấy tỷ lệ lợn sơ sinh chết rất cao

(Sueyoshi et al., 1995; Chae et al., 2000)

Ở lợn trong giai đoạn nuôi vỗ béo, nếu PED bùng phát ở thể cấp tính, trong vòng một tuần, tất cả lợn sẽ có biểu hiện tiêu chảy Lợn có biểu hiện chán ăn, mệt mỏi, phân rất loãng, chứa nhiều nước Biểu hiện về mặt lâm sàng ở lợn mắc PED đang trong giai đoạn nuôi vỗ béo có thể nặng hơn so với mắc TGE Sau khoảng 7-10 ngày, lợn sẽ hồi phục Tỷ lệ tử vong ở lợn trong giai đoạn vỗ béo thường từ 1-3%, lợn chết nhanh, thường ở giai đoạn mới bắt đầu tiêu chảy hoặc trước khi

có biểu hiện tiêu chảy Tỷ lệ chết cao nhất được thấy ở những trại có lợn giống

mẫn cảm và chịu nhiều stress (Nguyễn Văn Điệp và cs., 2014)

2.6.2 Bệnh tích

Bệnh tích đại thể và vi thể của lợn mắc PED tương tự như ở bệnh TGE,

thậm chí khó phân biệt với bệnh do porcine deltacoronavirus gây ra (Chen et al.,

2015) Dạ dày trống rỗng do lợn nôn, và ống dưỡng chấp không chứa nhiều dịch dưỡng do sự kém hấp thu ở ruột Các đoạn ruột non chứa đầy dịch, căng phồng, thành ruột mỏng tới mức có thể nhìn thấy do sự teo lại của tầng niêm mạc Chất chứa trong ruột non lợn cợn

Lợn con đang theo mẹ chết do PED, xác gầy, khô do tiêu chảy nặng, phần mông dính nhiều phân vàng Ruột căng phồng, đầy dịch, màu vàng, chứa những cục sữa chưa tiêu Thành ruột mỏng và trong Hạch lâm ba màng treo ruột xuất huyết nhẹ Lát cắt ngang ruột non của lợn bị nhiễm virus PED Lông nhung ruột non của lợn bị ngắn lại

(A) lợn sơ sinh tiêu chảy và mất nước nghiêm trọng, (B) dạ dày ruột viêm và sung huyết, (C) “tia sữa” (mũi tên) quan sát ở lợn khỏe mạnh, (D) không quan sát được “tia sữa” ở lợn mắc PED

Hình 2.5 Bệnh tích đại thể ở lợn sơ sinh mắc PED

Nguồn: Puranaveja et al (2009)

Về mặt vi thể, sự hình thành không bào to, rõ trong bào tương tế bào biểu

mô và sự bong tróc của các tế bào này làm cho lông nhung ngắn và dồn lại, hoà lẫn vào nhau rõ rệt, tuy rằng các biểu hiện này không trầm trọng bằng bệnh TGE

(Coussement et al., 1982) Bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch, PEDV được phát hiện chủ yếu ở các tế bào biểu mô lông nhung ruột Ở kết tràng, chưa

có bệnh tích vi thể nào được báo cáo Điều thú vị là các nghiên cứu siêu vi thể đã cho thấy có sự hiện diện rõ rệt của các hạt virus bên trong bào tương tế bào và sự thay đổi tế bào ở các tế bào biểu mô ruột non và kết tràng Những sự thay đổi cấu trúc siêu vi thể được khởi đầu đặc trưng bằng sự mất đi của các bào quan, vi nhung, lưới tận và phần nhô ra của bào tương tế bào hấp thu vào trong xoang ruột

(Pospischil et al., 1981) Sau đó, các tế bào trở nên dẹt hơn, liên kết vòng bịt giữa

các tế bào biểu mô mất đi và tế bào được giải phóng vào bên trong lòng ống ruột

2.7 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PEDV

2.7.1 Phát hiện virus

Do các virus gây ra tiêu chảy có các đặc điểm lâm sàng tương đối giống nhau nên không thể dựa vào các đặc điểm này để chẩn đoán PEDV, do đó việc chỉ ra sự có mặt của PEDV được thực hiện trong các phòng thí nghiệm

(Kusanagi et al., 1992; Pijpers et al., 1993) Nhiều kỹ thuật được sử dụng trong

việc phát hiện PEDV như miễn dịch huỳnh quang, sử dụng kính hiển vi điện tử hoặc phản ứng ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

Kỹ thuật RT-PCR và các biến thể của nó được ứng dụng phổ biến để phát hiện sự có mặt của PEDV trong mẫu bệnh phẩm của lợn nghi mắc PED Trong phương pháp này các cặp mồi được thiết kế bắt cặp đặc hiệu với trình tự nucleotide ở một trong các gen sau: gen S, M hoặc gen mã hóa protein ORF3

Các kỹ thuật này có thể được phân loại như sau: (i) phản ứng RT-PCR đơn phát

hiện PEDV (Ishikawa et al., 1997; Kweon et al., 1997); (ii) phản ứng RT-PCR

phân biệt giữa chủng PEDV vacxin và chủng PEDV gây bệnh thực địa (Park et al., 2013; Zhu et al., 2016), hoặc phân biệt giữa các nhóm PEDV gây bệnh ở

thực địa (Liu and Wang, 2016); (iii) phản ứng RT-PCR nhiều đích phát hiện

đồng thời/ chẩn đoán phân biệt các nguyên nhân gây tiêu chảy: phân biệt PEDV

và TGEV (Kim et al., 2007; Jung and Chae, 2005); phân biệt PEDV và Porcine deltacoronavirus (Zhang et al., 2016); phát hiện PEDV, TGEV và group A rotavirus (Song et al., 2006; Ben et al., 2010); phát hiện PEDV, TGEV, group A rotavirus và PCV2 (Zhao et al., 2013)

Kỹ thuật chẩn đoán dựa trên phương pháp RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) được phát triển để phát hiện virus cả trong phòng thí

nghiệm và từ thực địa (Utiger et al., 1995) Để khẳng định sự có mặt của PEDV

trong mẫu bệnh phẩm, mồi đặc hiệu được thiết kết dựa trên trình tự gen M

(Kweon et al., 1997) Trong những năm gần đây, dựa trên kỹ thuật RT-PCR cơ

bản, đã có rất nhiều những cải tiến để cho những ứng dụng hiệu quả hơn, như việc sử dụng multiplex-RT-PCR để phát hiện PEDV trong sự có mặt của nhiều virus khác nhau, là một kỹ thuật thường được sử dụng cho chẩn đoán nhanh, độ nhạy và hiệu quả kinh tế cao trên các đối tượng với các virus gây ra viêm ruột-dạ

dày cấp tính ở lợn (Song et al., 2006) Kim and Chae (2002) đã so sánh ba kỹ

thuật (phản ứng RT-PCR, hóa miễn dịch và lai tại chỗ) để xác định PEDV Tác giả kết luận rằng RT-PCR xác định sự có mặt của PEDV thường xuyên hơn các phương pháp khác Mặc dù chỉ áp dụng được trên các mô cố định bằng formalin, hóa mô miễn dịch và lai tại chỗ có thể là một công cụ hiệu quả để xác định kháng nguyên PEDV và axit nucleic của virus

RT loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) cũng là một kỹ thuật hữu dụng được phát triển dựa trên kỹ thuật RT-PCR cơ bản Trong kỹ thuật này, 4-6 mồi được sử dụng để nhận biết 6-8 vùng ADN đích, điều này tạo ra tính đặc hiệu cao hơn so với kỹ thuật gel-based RT-PCR hay ELISA bởi vì nó tạo ra

số lượng lớn hơn các đoạn ADN (Ren and Li, 2011) Các kit phân tích Immunochromatography cũng được sử dụng phổ biến ở các trại chăn nuôi để phát hiện PEDV trên cơ sở protein S với độ nhạy 92% và độ đặc hiệu 98% Kỹ thuật này có độ chính xác kém hơn RT-PCR tuy nhiên cho phép chẩn đoán nhanh trong vòng 10 phút (Song and Park, 2012) Hiện nay, với sự phát triển của kỹ thuật nhân gen đặc hiệu sử dụng enzyme trong điều kiện đẳng nhiệt, một số phương pháp nhằm thay thế RT-PCR đã được phát triển như: reverse

transcription loop-mediated isothermal amplification (Ren and Li, 2011; Yu et al., 2015) Một số tác giả đã phát triển kỹ thuật nhân gen đẳng nhiệt kết hợp với

que thử nhanh (vertical flow visualization strip) cho phép phát hiện PEDV với độ

nhạy và độ đặc hiệu cao (Wang et al., 2016; Gou et al., 2015) Kết quả thực hiện

được minh họa ở hình 2.6

Hình ảnh que thử nhanh phát hiện PEDV (A); kết quả điện di kiểm tra độ nhạy phản ứng LAMP (B) và RT-PCR (C); kết quả LAMP dưới ánh sáng xanh (D) và quan sát bằng mắt thường (E)

Hình 2.6 So sánh độ nhạy của một số phương pháp phát hiện PEDV

Nguồn: Wang et al (2016)

Kết quả phát hiện PEDV bằng phương pháp reverse transcription mediated isothermal amplification kết hợp với vertical flow visualization strip (hình 2.6 A) có độ nhạy tương tự như phương pháp reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (hình 2.6 D, E)

loop-Ngoài các công cụ chẩn đoán trên, kit sắc ký miễn dịch khá tiện dụng bởi chúng có thể được sử dụng ngay tại trang trại dùng phát hiện protein S của PEDV với độ nhạy 92% và độ đặc hiệu 98% Kỹ thuật này tuy ít chính xác hơn RT-PCR nhưng lại cho phép có được kết quả chẩn đoán nhanh chỉ trong vòng 10

phút Do đó, nó đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần kết quả chẩn đoán nhanh, chính xác để kịp thời đưa ra những quyết định, chính sách liên quan đến công tác kiểm dịch bệnh và giết mổ động vật

Gần đây, kỹ thuật ELISA dựa vào protein đã được hoàn thiện để chẩn đoán virus PED Trong kỹ thuật này kháng thể đa dòng được tạo ra thông qua gây

miễn dịch cho thỏ từ sản phầm của gen M biểu hiện trên vi khuẩn E.coli Bằng

phương pháp miễn dịch huỳnh quang (IF) sử dụng kháng thể kháng protein M có thể xác định đặc hiệu sự có mặt của PEDV ở các tế bào bị nhiễm Kết quả sử dụng ELISA phong bế và miễn dịch huỳnh quang gián tiếp đã phát hiện được sự

có mặt của kháng thể kháng PEDV ở ngày thứ 7 và từ ngày 10 đến ngày 13 sau khi gây nhiễm Với các xét nghiệm ứng dụng hai phương pháp này, cần lấy mẫu huyết thanh lần thứ 2 (khi con vật đang hồi phục) và kiểm tra sau ít nhất 2-3 tuần

kể khi có hiện tượng tiêu chảy Kháng thể PED được xác định bằng xét nghiệm ELISA ức chế (ELISA-blocking test) và IF ức chế (IF-blocking test) đã cho thấy kháng thể duy trì ít nhất một năm trong cơ thể con vật

2.7.2 Chẩn đoán phân biệt

Ngoài tiêu chảy do PEDV, có nhiều bệnh khác cũng gây ra triệu chứng tiêu chảy, đó là phản ứng của cơ thể và hậu quả có liên quan đến đường ruột như: Bệnh viêm dạ dày, ruột truyền nhiễm (Transmissible gastroenteritis, TGE):

nguyên nhân do virus thuộc họ Coronavirus, bệnh lây lan nhanh và tỷ lệ chết của

lợn con rất cao Bệnh xảy ra ở lợn con dưới 2 tuần tuổi, lợn mất nước, sút cân nhanh, nôn mửa, ỉa chảy phân nhiều nước, màu vàng hoặc hơi xanh, lổn nhổn mùi khó chịu Bệnh tích là thành ruột non mỏng, dạ dày chứa sữa không tiêu màu trắng do TGEV phá hủy nhung mao ruột Ở lợn trưởng thành bệnh ở thể mang bệnh ít biểu hiện

Bệnh do Rotavirus: bệnh do virus thuộc họ Reoviridae gây ra, thường xảy

ra ở lợn 1-5 ngày tuổi, tỷ lệ chết cao 50 - 100% Triệu chứng điển hình là phân nhão như hồ sau phân lẫn nhiều nước màu vàng trắng hoặc xám, chứa nhiều chất vón Do virus cư trú, hủy hoại làm thoái hóa lớp nhung mao ruột làm khả năng tiêu hóa và hấp thu kém nên khi lợn khỏi bệnh nếu được nuôi tiếp lợn sẽ còi cọc

và chậm lớn

Bệnh do deltacoronavirus (PDCoV): các nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện được một loại virus mới được đặt tên là deltacoronavirus họ Coronaviridae Virus này được xác định gây bệnh với những bệnh tích rất dễ nhầm lẫn với bệnh

tích do PED và TGE (Jung et al., 2015): thành ruột non mỏng, trong suốt, tích tụ

một lượng lớn chất lỏng màu vàng (hình 2.7)

(A) Thành ruột non và kết tràng mỏng và trong (mũi tên), (B) hiện tượng teo lông nhung ở lợn gây nhiễm và (C) lông nhung ruột non bình thường của lợn đối chứng Tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu phát hiện PDCoV ở đoạn không tràng (J) và manh tràng (K) ở lợn gây nhiễm Không phát hiện được tín

hiệu huỳnh quang đặc hiệu ở lợn đối chứng (L)

Hình 2.7 Bệnh tích của lợn gây nhiễm bởi PDCoV

Nguồn: Jung et al (2015)

2.7.3 Phân lập virus

Trong các nghiên cứu đầu tiên, PEDV được cấy chuyển in vitro bằng cách

cho lợn uống huyễn dịch ruột của lợn mắc tiêu chảy trong giai đoạn đầu (Debouck

gây nhiễm cho lợn (pig infectious dose) Việc tiếp đời và thích nghi PEDV trên môi trường tế bào là tương đối khó, với nhiều loại tế bào kết hợp với bổ sung/ không bổ sung trypsin và pancreatin đều không phù hợp cho sự nhân lên của

virus Tuy nhiên, tế bào Vero (African green monkey kidney) có thể dùng để thích nghi và tiếp đời PEDV, trong điều kiện bổ sung trypsin (Hofmann and Wyler, 1988) Tế bào nhiễm PEDV hình thành không bào trong nguyên sinh chất

và hình thành thể hợp bào (syncytia) với số lượng nhân khác nhau, có thể lên tới

100 nhân (Hofmann and Wyler, 1988) PEDV thích nghi trên tế bào Vero có thể được tiếp đời trên các dòng tế bào khác như MA104, tế bào bàng quang của lợn,

tế bào thận lợn (Shibata et al., 2000; Kusanagi et al., 1992)

2.8 PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH

Cho tới khi được 4 - 13 ngày tuổi, lợn con sinh ra từ lợn mẹ đã có miễn dịch sẽ được bảo vệ khỏi PEDV nhờ kháng thể IgG truyền qua sữa đầu; độ dài miễn dịch phụ thuộc vào hiệu giá kháng thể của lợn mẹ Sau khi lợn mẹ cảm nhiễm với kháng nguyên trong ruột, các tế bào sinh miễn dịch IgA di chuyển tới tuyến vú nơi chúng cố định và chế tiết kháng thể IgA vào sữa đầu Do đó, khi thiết kế vacxin, cần lưu ý trục miễn dịch “ruột- tuyến vú” để tạo ra miễn dịch qua sữa hiệu quả

Lợn con thường xuyên bú sữa từ lợn mẹ đã có miễn dịch sẽ được bổ sung liên tục vào đường tiêu hoá của nó một lượng kháng thể IgA, đây là quá trình tiếp nhận miễn dịch thụ động Lượng IgG chiếm hơn 60% lượng Immunoglobulin trong sữa đầu Tuy nhiên IgA hiệu quả hơn trong việc trung hoà mầm bệnh lây nhiễm qua đường miệng hơn là IgG hay IgM bởi nó bền vững hơn trước sự phân huỷ protein trong đường ruột và có khả năng trung hoà virus cao hơn IgG và IgM Vì thế việc truyền IgA thụ động từ những con mẹ có miễn dịch sẽ gây ra khả năng miễn dịch tốt ở lợn con trong giai đoạn bú mẹ Tuy nhiên, những kháng thể này không thể bảo vệ chúng khỏi lây nhiễm PEDV qua đường tiêu hoá

Cho đến nay, một số vacxin phòng bệnh PED chế từ các chủng virus có trình tự gen, độc lực, cách thức phân bố khác nhau vẫn được tiếp tục nghiên cứu

và hoàn thiện Virus dòng CV777 đã thích ứng trên với môi trường tế bào có trình tự gen khác biệt rõ rệt so với chủng CV777 phân lập từ thực địa, sự khác biệt này liên quan tới việc suy giảm mạnh độc lực của virus cũng như việc giảm nhẹ mức độ thay đổi mô bệnh học ở lợn mắc bệnh Tuy nhiên ở châu Âu, bệnh gây bởi PEDV không quan trọng về mặt kinh tế đủ để người ta tiến hành sản xuất