Mục tiêu của luận án là tuyển chọn được chủng virus PRRS phân lập từ lợn mắc PRRS ở Việt Nam sử dụng làm giống gốc phục vụ sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt PRRS. Giống gốc là chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam, có tính đại diện cho các chủng virus đang lưu hành tại Việt Nam, có đặc tính sinh học và sinh học phân tử ổn định qua nhiều đời cấy chuyển, đạt các tiêu chí về vô trùng, thuần khiết, có khả năng kích thích miễn dịch ở lợn để sản sinh kháng thể kháng virus PRRS tương ứng và có tương đồng kháng nguyên rộng rãi với các chủng thực địa. Sản xuất thử nghiệm thành công vacxin vô hoạt PRRS từ giống gốc PRRS đã được tuyển chọn đạt các tiêu chí về vô trùng, thuần khiết, an toàn và hiệu lực.
Trang 1HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
PHẠM VĂN SƠN
NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TỪ CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018
Trang 2HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
PHẠM VĂN SƠN
NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TỪ CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM
Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi
Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Nguyễn Bá Hiên
2 TS Nguyễn Văn Cảm
HÀ NỘI, 2018
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của bản thân Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Tác giả luận án
Phạm Văn Sơn
Trang 4LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận án, tác giả đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rất nhiều người, sau đây là lời cảm ơn chân thành của tác giả:
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Bá Hiên
và TS Nguyễn Văn Cảm, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án Nhờ có sự hướng dẫn nhiệt tình và những ý kiến đóng góp quý báu của các thầy mà luận án của tôi đã được hoàn thành
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, cùng toàn thể các thầy, cô giáo và cán bộ của Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này
Trân trọng cảm ơn nhóm các nhà Khoa học nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất vacxin vô hoạt phòng Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp
ở lợn” Thuộc chương trình KC-04 do PGS.TS Nguyễn Bá Hiên chủ nhiệm đã tạo điều kiện cho chúng tôi tham gia nhiều công đoạn nghiên cứu và cho phép tôi
sử dụng một số kết quả nghiên cứu trong luận án này
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp và cơ quan mà tôi đang công tác đã tạo điều kiện về thời gian, động viên, chia sẻ vật chất, tinh thần, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Nghiên cứu sinh
Phạm Văn Sơn
Trang 5MỤC LỤC
Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục chữ viết tắt vii
Danh mục bảng ix
Danh mục hình xi
Trích yếu luận án xiv
Thesis abstract xvi
Phần 1 Mở đầu 1
1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1
1.2 Mục tiêu của đề tài 2
1.2.1 Mục tiêu chung 2
1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2
1.3 Phạm vi nghiên cứu 2
1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 2
1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 3
1.4 Những đóng góp mới của đề tài 3
1.5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3
1.5.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 3
1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 4
Phần 2 Tổng quan tài liệu 5
2.1 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn 5
2.1.1 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới 5
2.1.2 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn tại Việt Nam 8
2.2 Căn bệnh 14
2.2.1 Cấu trúc virus PRRS 14
2.2.2 Phân loại virus PRRS 17
2.2.3 Khả năng gây bệnh và sức đề kháng của virus PRRS 18
2.3 Truyền nhiễm học 19
2.3.1 Loài vật mắc bệnh 19
Trang 62.3.2 Chất chứa mầm bệnh và quá trình truyền lây 19
2.3.3 Cơ chế sinh bệnh, phương thức truyền lây và đáp ứng miễn dịch 20
2.4 Triệu chứng và bệnh tích 22
2.4.1 Triệu chứng lâm sàng 22
2.4.2 Bệnh tích 23
2.5 Chẩn đoán và phòng trị bệnh 24
2.5.1 Chẩn đoán 24
2.5.2 Các biện pháp phòng trị bệnh 25
2.6 Giống gốc trong sản xuất vacxin 27
2.6.1 Định nghĩa 27
2.6.2 Cách chế tạo giống gốc 27
2.6.3 Cách quản lý giống gốc 27
2.6.4 Các phương pháp bảo quản giống gốc PRRSV trong phòng thí nghiệm 28
2.7 Nghiên cứu sản xuất vacxin phòng PRRS 30
2.7.1 Sản xuất vacxin bằng phương pháp vô hoạt virus 30
2.7.2 Sản xuất vacxin bằng phương pháp nhược độc virus trên môi trườngtế bào 31
2.7.3 Phương pháp sản xuất vacxin thế hệ mới 32
Phần 3 Nội dung, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 36
3.1 Địa điểm nghiên cứu 36
3.2 Thời gian nghiên cứu 36
3.3 Vật liệu nghiên cứu 36
3.4 Nội dung nghiên cứu 36
3.4.1 Nghiên cứu biến đổi bệnh lý của lợn ở những ổ dịch PRRS và thu thập mẫu 36
3.4.2 Phân lập và tuyển chọn chủng giống gốc PRRSV 36
3.4.3 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt nhũ dầu phòng PRRS 37
3.5 Phương pháp nghiên cứu 37
3.5.1 Phương pháp mổ khám 37
3.5.2 Phương pháp RT - PCR 37
3.5.3 Phương pháp làm tiêu bản vi thể 40
3.5.4 Phương pháp nuôi cấy tế bào 41
3.5.5 Phương pháp nhân virus PRRS 43
3.5.6 Phương pháp xác định hiệu giá virus 43
Trang 73.5.7 Phương pháp xác định quy luật sinh trưởng của virus 43
3.5.8 Phương pháp giải trình tự gen 44
3.5.9 Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein 45
3.5.10 Phương pháp gây tối miễn dịch trên chuột 45
3.5.11 Phương pháp trung hòa virus (phương pháp virus cố định và huyết thanh pha loãng) 46
3.5.12.Phương pháp IPMA 47
3.5.13.Phương pháp kiểm tra vô trùng của giống PRRS (master seed và working seed) 48
3.5.14 Phương pháp kiểm tra thuần khiết của giống (master seed và workingseed) bằng kỹ thuật PCR/RT-PCR 50
3.5.15.Phương pháp nuôi cấy tế bào MARC-145 trên hệ thống Bioreactor 50
3.5.16.Phương pháp cô đặc virus PRRS bằng lọc tiếp tuyến 50
3.5.17 Phương pháp vô hoạt virus 51
3.5.18 Phương pháp kiểm tra sau vô hoạt 51
3.5.19 Phương pháp nhũ hóa vacxin 52
3.5.20 Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của vacxin 52
3.5.21.Kiểm tra chỉ tiêu an toàn 53
3.5.22.Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin 53
3.5.23.Phương pháp Realtime RT-PCR 54
3.5.24 Phương pháp ELISA 55
3.5.25 Phương pháp thống kê, xử lý số liệu 56
Phần 4 Kết quả và thảo luận 57
4.1 Nghiên cứu một số biểu hiện bệnh lý của lợn mắc PRRS 57
4.1.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm 57
4.1.2 Chẩn đoán PRRS bằng phương pháp RT-PCR 58
4.1.3 Nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể 60
4.1.4 Nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể 62
4.2 Phân lập và tuyển chọn chủng giống gốc PRRS 65
4.2.1 Phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145 65
4.2.2 Nghiên cứu sự ổn định một số đặc tính sinh học của các chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam 71
4.2.3 Đặc tính sinh học phân tử của các chủng virus PRRS 79
Trang 84.2.4 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm với các chủng virus
PRRS nghiên cứu 98
4.2.5 Sản xuất giống gốc 102
4.3 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt nhũ dầu phòng PRRS 107
4.3.1 Nhân giống sản xuất (Working seed) vacxin 107
4.3.2 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt PRRS 109
4.3.3 Nghiên cứu kiểm nghiệm vacxin vô hoạt PRRS 115
Phần 5 Kết luận và kiến nghị 123
5.1 Kết luận 123
5.2 Kiến nghị 123
Danh mục công trình đã công bố có liên quan đến luận án 124
Tài liệu tham khảo 125
Phụ lục 137
Trang 9DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Viết đầy đủ
BEI Binary Ethylenimine
CSF Classical swine fever
CPE Cytophathogenic Effect
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
DMSO Dimethyl sulfoxide
DNA Deoxyribonucleic acid
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EMCV Encephalomyocarditis virus
ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
FBS Fetal Bovine Serum
GP Glyco protein
HE Haematoxylin – Eosin
IFA Immunofluorescence assay
IHC Immuno Histochemistry
IPMA Immunoperoxidase monolayer Assay
KKT Kháng kháng thể
MLV Modifier Live Vacine
MOI Multiplicity Of Infection
MSD Mystery Swine Disease
NSP Non structural protein
OD Optical Density
OIE Office International des Epizooties
ORF Open Reading Frame
PAM Porcine Alveolar Macrophage
PBS Photphat Buffer Saline
PCR Polymerase Chain Reaction
PCV2 Porcine circovirus type 2
PEDV Porcine epidemic diarrhea virus
PEARS Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome
Trang 10Từ viết tắt Viết đầy đủ
PPV Porcine parvovirus
PPLO Pleuropneumonia-like organism
PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus PRV Porcine Pseudorabies virus
RNA Ribonucleic acid
RT- PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SIRD Swine Infertility and Respiratory Disease
SIV Swine Influenza Virus
S/P Sample/Positive
SP Structural protein
TAE Tris-acetate-EDTA
TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose
TGE Transmissible gastroenteritis
TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine
TPB Triptose phosphas broth
Trang 11DANH MỤC BẢNG
2.1 Lịch sử phát hiện bệnh 6
2.2 Một số tên thường gặp trong các tài liệu 6
2.3 Protein cấu trúc của PRRSV 7
2.4 Tổng hợp các ổ dịch PRRS xảy ra ở Việt Nam từ 2007-2016 10
2.5 Cấu trúc và chức năng protein phi cấu trúc 16
2.6 Các vacxin đã thử nghiệm sản xuất 33
3.1 Thành phần phản ứng RT – PCR 38
3.2 Các mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR: 38
3.3 Chu kỳ nhiệt trong máy PCR 39
3.4 Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0,2ml 44
3.5 Chương trình chạy PCR giải trình tự 44
4.1 Số lượng mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập được 57
4.2 Kết quả phản ứng RT-PCR chẩn đoán PRRS 59
4.3 Bệnh tích đại thể ở phổi lợn mắc PRRS 60
4.4 Bệnh tích đại thể ở một số khí quan khác của lợn mắc PRRS 60
4.5 Bệnh tích vi thể ở phổi, hạch phổi và hạch amidan của lợn mắc PRRS 62
4.6 Bệnh tích vi thể ở gan, lách và thận của lợn mắc PRRS 63
4.7 Bệnh tích vi thể ở tim, hạch ruột và ruột của lợn mắc PRRS 63
4.8 Kết quả phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145 65
4.9 Khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus PRRS phân lập được 66
4.10 Kết quả lựa chọn các chủng virus PRRS xác định hiệu giá 67
4.11 Kết quả xác định hiệu giá của các chủng PRRSV phân lập được 68
4.12 Các chủng virus PRRS được lựa chọn nghiên cứu quy luật nhân lên 69
4.13 Kết quả lựa chọn sơ bộ các chủng virus PRRS cho nghiên cứu 72
4.14 Khả năng gây bệnh tích tế bào theo thời gian của các chủng virus qua 5 đời cấy chuyển 73
4.15 Hiệu giá của các chủng virus PRRS nghiên cứu qua 5 đờicấy chuyển 75
4.16 Kết quả lựa chọn chủng virus PRRS để nghiên cứu các đặc tính sinh học phân tử 79
Trang 124.17 Tương đồng nucleotide gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu
và các chủng tham chiếu 81
4.18 Tương đồng axit amin gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu 83
4.19 Tương đồng nucleotide gen ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu và một số chủng tham chiếu 86
4.20 Tương đồng axit amin gen ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu và một số chủng tham chiếu 88
4.21 Kết quả tinh chế kháng nguyên các chủng virus PRRS nghiên cứu 98
4.22 Kết quả của phản ứng IPMA kiểm tra kháng thể kháng PRRSV ở thời điểm 14 ngày sau khi tiêm kháng nguyên PRRS cho chuột 99
4.23 Kết quả phản ứng IPMA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV 100
4.24 Phản ứng trung hòa xác định tương đồng kháng nguyên giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu 101
4.25 Kết quả kiểm tra vô trùng của giống gốc PRRS 103
4.26 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của giống gốc PRRS 104
4.27 Kết quả nhân giống sản xuất vacxin PRRS 108
4.28 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của các lô giống sản xuất 108
4.29 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của các lô giống sản xuất 109
4.30 Hiệu giá virus sau khi cô đặc bằng phương pháp lọc tiếptuyến 110
4.31 Kết quả xác định nồng độ formalin sử dụng vô hoạt virus vacxinPRRS 110
4.32 Kết quả quá trình vô hoạt virus vacxin PRRS bằng Formalin 111
4.33 Lịch tiêm các loại vacxin vô hoạt cho các lô lợn thí nghiệm 112
4.34 Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV của lợn sau khi tiêm vacxin sử dụng chất bổ trợ khácnhau 113
4.35 Kết quả sản xuất vacxin vô hoạtnhũ dầu PRRS 115
4.36 Kết quả kiểm tra cảm quan các lô nhũ hoá 115
4.37 Kết quả kiểm tra vô trùng vacxin vô hoạt PRRS 116
4.38 Kết quả kiểm tra thuần khiết vacxin vô hoạt PRRS 116
4.39 Kết quả theo dõi chỉ tiêu an toàn của vacxin PRRS ở lợn thí nghiệm 117
4.40 Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phương pháp ELISA 118
4.41 Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phương pháp IPMA 118
4.42 Kết quả đánh giá công cường độc 120
4.43 Phản ứng Realtime - PCR xác định virus trong máu của lợn sau công cường độc 121
Trang 13DANH MỤC HÌNH
2.1 Bản đồ dịch tễ phân bố của PRRS tại Việt Nam từ 2007-2010 9
2.2 Bản đồ dịch tễ phân bố của PRRS tại Việt Nam từ 2011-2013 10
2.3 Cấu trúc virus PRRS 15
2.4 Cấu trúc genome virus PRRS 16
2.5 Cây phả hệ của virus PRRS 17
2.6 Gen từ các chủng virus khác nhau 34
4.1 Tai sung huyết 58
4.2 Viêm mí mắt, có rử mắt 58
4.3 Ủ rũ, mệt mỏi, kém ăn 58
4.4 Sảy thai 58
4.5 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR 59
4.6 Viêm phổi thùy 61
4.7 Hạch lympho sưng to 61
4.8 Thận xuất huyết 61
4.9 Lách nhồi huyết 61
4.10 Viêm phổi (HE×10) 64
4.11 Dịch tiết trong lòng phế nang (HE×40) 64
4.12 Gan sung huyết (HE×10) 64
4.13 Gan thâm nhiễm tế bào viêm (HE×40) 64
4.14 Đường biểu diễn quy luật nhân lên trên môi trường nuôi cấy của các chủng virus PRRS phân lập được 70
4.15 Bệnh tích tế bào (CPE) do PRRS gây ra trên tế bào MARC-145ở các thời điểm khác nhau 74
4.16 Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus 010TB ở P0 và P5 tại các thời điểm khác nhau 76
4.17 Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus 012NA ở P0 và P5 tại các thời điểm khác nhau 77
4.18 Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus 049HY ở P0 và P5 tạicác thời điểm khác nhau 77
Trang 144.19 Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus 052TH ở P0 và P5 tại các
thời điểm khác nhau 77
4.20 Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus 008HN ở P0 và P5 tại các thời điểm khác nhau 78
4.21 Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide của đoạn gen ORF5 nghiên cứu 80
4.22 So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 của các chủng virus PRRS
nghiên cứu 80
4.23 So sánh trình tự axit amin gen ORF5 của các chủng virus PRRS
nghiên cứu 82
4.24 So sánh trình tự nucleotide gen ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu và một số chủng tham chiếu 85
4.25 So sánh trình tự axit amin gen ORF7 của các chủng virus PRRS
nghiên cứu 87
4.26 Cây phả hệ dựa trên trình tự gen ORF5 90
4.27 Cây phả hệ dựa trên trình tự gen ORF7 91
4.28 Kết quả điện di sản phẩm đoạn gen ORF5 và ORF7 sau 5 đời cấy chuyển của chủng KTY-PRRS-01 92
4.29 So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-01 qua 5 đời cấy chuyển 93
4.30 So sánh trình tự nucleotide gen ORF7 của virus KTY-PRRS-01 qua 5 đời cấy chuyển 94
4.31 So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-02 qua 5 đời cấy chuyển 94
4.32 So sánh trình tự nucleotide gen ORF7 của virus KTY-PRRS-02 qua 5 đời cấy chuyển 95
4.33 So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-03 qua 5 đời cấy chuyển 96
4.34 So sánh trình tự nucleotide gen ORF7 của virus KTY-PRRS-03 qua 5 đời cấy chuyển 97
4.35 Hình ảnh điện di kiểm tra tạp nhiễm của giống với virus CSF, PCV2, PPV 105
Trang 154.36 Hình ảnh điện di kiểm tra tạp nhiễm của giống với virus giả dại và
Mycoplasma 105
4.37 Hình ảnh điện di kiểm tra tạp nhiễm của giống với virus PED, TGE 106
4.38 Tế bào MARC-145 âm tính với KT PRRSV 119
4.39 Tế bào MARC-145 dương tính với KT PRRSV bằng kỹ thuật IPMA 119
4.40 Kết quả Realtime-PCRxác định virusPRRSV 121
1 Môi trường dinh dưỡng trước khi kiểm tra vô trùng 137
2 Môi trường dinh dưỡng sau khi kiểm tra vô trùng 137
3 Môi trường dinh dưỡng sau khi kiểm tra vô trùng 137
4 Giống sản xuất được lấy để kiểm tra vô trùng 138
5 Kiểm tra vô trùng giống sản xuất trên thạch Macconkey 138
6 Kết quả kiểm tra giống sản xuất trên thạch Sabouraud 138
7 Kết quả kiểm tra giống sản xuất trên thạch Macconkey 138
8 Kết quả kiểm tra giống sản xuất trên Canh thang PPLO 138
9 Kết quả kiểm tra giống sản xuất trên Thioglycollat 138
10 Phổi lợn được tiêm vacxin vô hoạt PRRS sau công cường độc 139
11 Phổi lợn được tiêm vacxin vô hoạt sau công cường độc (10X) 139
12 Phổi lợn không tiêm vacxin sau công cường độc, viêm, xuất huyết 139
13 Phổi lợn không tiêm vacxin sau công cường độc, viêm kẽ phổi (10X) 139
14 Triệu chứng lâm sàng của lợn không tiêm vacxin sau công cường độc (tím tai) 139
15 Bệnh tích đại thể của lợn không tiêm vacxin sau công cường độc (thận xuất huyết điểm) 139
Trang 16TRÍCH YẾU LUẬN ÁN
Tên tác giả: Phạm Văn Sơn
Tên Luận án: “Nghiên cứu tạo giống gốc và thử nghiệm sản xuất vacxin vô hoạt phòng
hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn từ chủng virus phân lập tại Việt Nam”
Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9.64.01.02
Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
Tuyển chọn được chủng virus PRRS phân lập từ lợn mắc PRRS ở Việt Nam sử dụng làm giống gốc phục vụ sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt PRRS Giống gốc là chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam, có tính đại diện cho các chủng virus đang lưu hành tại Việt Nam, có đặc tính sinh học và sinh học phân tử ổn định qua nhiều đời cấy chuyển, đạt các tiêu chí về vô trùng, thuần khiết, có khả năng kích thích miễn dịch
ở lợn để sản sinh kháng thể kháng virus PRRS tương ứng và có tương đồng kháng nguyên rộng rãi với các chủng thực địa Sản xuất thử nghiệm thành công vacxin vô hoạt PRRS từ giống gốc PRRS đã được tuyển chọn đạt các tiêu chí về vô trùng, thuần khiết, an toàn và hiệu lực
Phương pháp nghiên cứu
Để nghiên cứu các nội dung của đề tài, chúng tôi đã áp dụng các phương pháp nghiên cứu sau: những phương pháp thường quy để nghiên cứu virus như: nuôi cấy tế bào, xác định hiệu giá virus, xác định quy luật sinh trưởng của virus, gây tối miễn dịch, phương pháp trung hòa virus Phương pháp sinh học phân tử trong nghiên cứu virus như: giải trình tự gen Phương pháp sản xuất vacxin vô hoạt trên môi trường tế bào như: nuôi cấy tế bào trên Bioreactor, vô hoạt virus Phương pháp kiểm nghiệm vacxin vô hoạt PRRS như: kiểm tra vô trùng, thuần khiết, kiểm tra chỉ tiêu an toàn và hiệu lực
Kết quả chính và kết luận
Đề tài đã thu thập mẫu từ 57 ca bệnh nghi mắc PRRS ở lợn được nuôi tại Việt Nam Chẩn đoán được 33 ca bệnh dương tính với virus PRRS bằng kỹ thuật RT-PCR Xác định các triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS chúng tôi thấy rằng các triệu chứng lâm sàng chủ yếu là sốt cao, bỏ ăn, thân ửng đỏ, tiêu chảy, tai xanh tím, chảy nước mũi, khó thở và rối loạn sinh sản ở lợn nái Bệnh tích đại thể bao gồm các biến đổi chủ yếu ở phổi, hạch lympho với hiện tượng viêm, xuất huyết Bệnh tích vi thể ở phổi, hạch phổi rất rõ ràng, 100% các tiêu bản đọc thấy xuất huyết, thâm nhiễm tế bào viêm, các phế nang chứa đầy dịch rỉ viêm
Trang 17Phân lập được 33 chủng virus PRRS từ lợn mắc PRRS tự nhiên ở Việt Nam Các chủng virus này khả năng gây bệnh tích tế bào sau 48h đến 60h gây nhiễm và tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 84h đến 108h Các chủng virus phân lập có hiệu giá từ 1,44 x 102 đến 3,16 x 106 TCID50/ml Xác định quy luật nhân lên của các chủng virus trên môi trường nuôi cấy thấy hiệu giá virus đạt cao nhất ở thời điểm 72h sau gây nhiễm Qua khảo sát, sàng lọc các đặc tính sinh học lựa chọn được 10 chủng virus PRRS điển hình để nghiên cứu sự ổn định đặc tính sinh học qua 5 đời cấy chuyển Kết quả nghiên cứu sự ổn định đặc tính sinh học lựa chọn được 03 chủng virus PRRS là KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02, KTY-PRRS-
03 để nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử và khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên lợn Kết quả kiểm tra đáp ứng miễn dịch và tương đồng kháng nguyên của 3 chủng virus nghiên cứu thấy rằng lựa chọn chủng virus KTY-PRRS-01 là thích hợp nhất cho nghiên cứu tiếp để làm giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt PRRS Chủng virus KTY-PRRS-01 có hiệu giá đạt 3,16x106TCID50/ml, có đặc điểm sinh trưởng ổn định trên môi trường tế bào MARC-145, sau 5 đời cấy chuyển đã ổn định về đặc tính sinh học và đặc tính sinh học phân tử của gen ORF5 và ORF7, có khả năng kích thích cơ thể lợn sản sinh kháng thể trung hòa cao
Giống gốc virus PRRS phục vụ sản xuất vacxin vô hoạt đạt chỉ tiêu vô trùng và thuần khiết Nhân được 3 lô giống, mỗi lô 1 lít bằng hệ thống Bioreactor, 100% các lô đạt giống tiêu chí vô trùng và thuần khiết Cô đặc virus PRRS bằng hệ thống lọc tiếp tuyến thu được virus sau cô đặc đạt hiệu giá 4,0 x107 TCID50/ml phục vụ sản xuất vacxin Virus vacxin được vô hoạt bằng formalin nồng độ 0,03% ủ trong thời gian 24 giờ và được trung hòa bằng L-glutamin 3% Lựa chọn chất bổ trợ nhũ dầu (ISA740) bổ sung vào vacxin theo tỉ lệ 1:1 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm thành công 3 lô vacxin vô hoạt PRRS từ giống gốc KTY-PRRS-01 Mỗi liều vacxin chứa ít nhất 107TCID50 virus PRRS đã vô hoạt Vacxin vô hoạt PRRS nghiên cứu sản xuất ra đạt các chỉ tiêu về vô trùng, thuần khiết, an toàn và hiệu lực trong phòng thí nghiệm
Trang 18THESIS ABSTRACT
PhD candidate: Pham Van Son
Thesis title: Study on selected master seed virus and testing manufacture of inactivated
vaccine for prevention of PRRS in pigs using virus strain isolated from pigs in Vietnam
Major: Veterinary pathology and Therapeutics of the diseases of domestic animals Code: 9.64.01.02
Educational organization: Vietnam National University of Agriculture
Research Objectives
PRRS virus strain isolated from infected pigs will have been selected as master virus seed for experimental manufacture of PPRS inactivated vaccine Master virus seed was PRRS virus strain isolated from pigs in Vietnam that representative of existing virus in Vietnam with stable biological and molecular characteristic through many passages in culture reaching standard of purification and sterilization, having potential
to stimulate immune system to produce antibodies against PRRS virus respectively and will have similar antigenicity to that of field virus isolates Successful manufacture of PPRS inactivated vaccine from selected master virus seed will reach standard of sterilization, purification, safety and efficacy
Materials and Methods
In order to perform the main content of the dissertation, we used the methods as follows: traditional methods for studying virus including cultures of viruses, determiation of virus titer in infected pigs in Vietnam
Determination of virus growth rules, virus neutralization test, biological molecules test in virus study including gene sequence, inducing immunity, methods for manufacture of inactivated vaccine in cells such as culture of cells on Bioreactor, inactivating virus, methods for testingPRRS inactivated vaccine includingsterilization, purìfication testing, and safety and efficacy testing
Main results and conclusions
The study findingindicated that 57 suspicious PPRS infected cases were found, 33 cases positive with RT-PCR were diagnosed by using RT-PCR Main clinical manifestation of PPRS infected Pigs included high fever, anorexiarash, diarrhea, blue ear, lesions in the lung, lymphadenitis with hemorrchage Microscopic lesions mainly in
Trang 19the lung included swelling of lymph nodes in the lung 100% of smear of the lung showed hemorrchage, infiltrated with inflamed cells Alveoli were filled with exudate
33 PRRS virus strains from PRRS infected pigs in Vietnam were isolated These strains were capable of causing cellular lesions 48h - 60h after infection and the cells were completely destroyed from 84h - 108h after infection The titer of strains isolated was from 1.44 x 102 to 3.16 x 106 Determination of the replication of virus strains on culture medium showed the highest viral titer at 72h post-infection Through the investigation and screening of their biological characteristic, 10 typical PRRSV strains were selected in order to study stability of their biological characteristics through 5 passges to cell cultures As the results of the study on the stability of biological characteristics, 3 PRRSV strains were selected including KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-
02, KTY-PRRS-03 to study molecular biology and ability of Immune response of pigs From the results of testing immune respond and antigenic similarity of the 3 virus strains studied It was found that KTY-PRRS 01 was the most appropriate for further study that can be used as master virus seed for manufacture of PRRS inactivated vaccine KTY PRRS virus strain 01 had high titer reaching 3.16x106/ml that had stable growth on Marc 145 cell line medium After 5 passages to cell cultures, their biological and molecular characteristics were stable, which were capable of stimulating pig to produce high neutralizing antibodies
PRRS master seed used for inactivated vaccines achieved criteria of sterility and purity It was propagated in 3 batches of PRRS Master seed by using Bioreactor system Each batch contained 1 liter of PRRS virus, 100% of Master seed batches met criteria of sterility and purity PRRS virus was concentrated by using tangential filtration system After being concentrated, the virus titer reached 4.0 x 107/ml that was used for vaccine production Vaccines were inactivated by using 0.03% formalin, incubated for 24 hours and neutralized with 3% L-glutamine Oil emulsion as vaccine adjuvant (ISA740) was added to viral vaccine at ratio 1:1 appropriate for manufacture of PRRS inactivated vaccine Study on manufacture of 3 batches of PRRS inactivated vaccine from KTY-PRRS-01 isolated from PRRS high virulent virus strain in Vietnam used as master seed was sucessful Each vaccine dose contained at least 107TCID50 inactivated PRRSV virus Inactivated PRRS vaccine produced met criteria of sterility, purity, safety and efficacy in the laboratory
Trang 20PHẦN 1 MỞ ĐẦU
1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) hay bệnh tai xanh được đặc trưng bởi những rối loạn sinh sản của lợn nái và những vấn đề về đường hô hấp ở lợn con và lợn
trưởng thành (Meulenberg et al., 1993) Bệnh gây ra bởi virus PRRS, thuộc bộ
Nidovirales, họ Arteriviridae, chi Arterivirus (Cavanagh, 1997) Virus PRRS được nhóm thành hai kiểu gen, châu Âu (type 1) và Bắc Mỹ (type 2), các dấu hiệu lâm sàng của nhiễm trùng đều giống nhau, nhưng các chủng phân lập lại
khác nhau về độc lực ở động vật nhiễm bệnh (Halbur et al., 1995b) và khác nhau
về đặc tính kháng nguyên, di truyền (Meng, 2000; Nelsen et al., 1999; Nelson et
al., 1993) Dịch PRRS xuất hiện ở hầu hết các khu vực chăn nuôi lợn quy mô
lớn trên khắp thế giới Tổn thất hàng năm cho ngành chăn nuôi lợn ở Hoa Kỳ do
PRRSV gây ra ước tính khoảng 664 triệu USD (Holtkamp et al., 2013) Đối với
lợn nái, bệnh gây hậu quả nghiêm trọng như: lợn con sơ sinh yếu ớt, giảm số con
sơ sinh sống sót/ổ, tình trạng bệnh âm ỉ, rối loạn sinh sản, động dục kéo dài, chậm động dục trở lại Đối với đực giống, số lượng tinh dịch giảm, chất lượng
tinh dịch kém, ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ thai và chất lượng đàn con (Pejsak et al.,
1997) Kháng thể kháng PRRSV lần đầu tiên được phát hiện ở Việt Nam năm
1997 trên một đàn lợn nhập từ Mỹ Từ năm 2007 đến nay, PRRS liên tục xảy ra
và bùng phát ở rộng khắp các tỉnh thành trong cả nước gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi Tình hình PRRS ngày càng phức tạp đòi hỏi sự chủ động trong phòng chống dịch, trong đó phương pháp phòng PRRS hiệu quả nhất là sử dụng vacxin Tuy nhiên chính sự đa dạng di truyền và thay đổi kháng nguyên của các chủng PRRSV là một trở ngại lớn trong việc phát triển một loại vacxin có hiệu quả để kiểm soát PRRS Các vacxin sống đã được sử dụng phổ biến để kiểm soát PRRS vì chúng có khả năng bảo vệ tốt hơn so với vacxin đã vô hoạt hoặc
các vacxin tái tổ hợp (Charerntantanakul, 2012; Hu and Zhang, 2014; Kim et al., 2011; Zuckermann et al., 2007) Nhưng ngày càng có nhiều quan ngại về sự an
toàn của việc sử dụng vacxin sống vì sự hồi phục nhanh chóng độc lực của
PRRSV trong quá trình sao chép ở lợn (Hu and Zhang, 2014; Mengeling et al., 2003; Pejsak et al., 1997) Vacxin vô hoạt có ưu điểm lớn nhất là an toàn do
Trang 21chúng không có khả năng truyền lây sang các đàn lợn khác và không có khả năng phục hồi độc lực Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng vacxin vô hoạt PRRS trong các đàn nái có nhiễm PRRS và thấy rằng vacxin vô hoạt không gây các phản ứng phụ như rối loạn sinh sản ở các đàn lợn nái, kéo dài thời gian
sử dụng nái, tăng cường khả năng sinh sản như tăng số lứa đẻ, tăng tình trạng sức khỏe và số lượng lợn con sau cai sữa ở những đàn lợn đã bị phơi nhiễm
virus PRRS (Papatsiros, 2012; Kim et al., 2011) Hiện nay, nước ta chưa có
vacxin vô hoạt phòng PRRS cho lợn nói chung và lợn nái nói riêng
Nhằm chủ động trong nguồn cung cấp vacxin hiệu quả, an toàn và giảm chi phí nhập khẩu vacxin, thì việc sản xuất được vacxin vô hoạt từ chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam là việc làm cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao Để sản xuất được vacxin hiệu quả cần phải có chủng giống gốc đại diện cho các chủng virus PRRS lưu hành ở Việt Nam, do vậy việc tiến hành thực hiện nghiên cứu tạo giống gốc và thử nghiệm sản xuất vacxin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn từ chủng virus phân lập tại Việt Nam là vấn đề cần thiết, với mục tiêu là lựa chọn được giống gốc sử dụng trong sản xuất vacxin vô hoạt PRRS ở Việt Nam, sản xuất được vacxin vô hoạt PRRS đạt tiêu chí an toàn,
có hiệu lực cao để phòng bệnh cho lợn
1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
1.3.1 Đối tượng nghiên cứu
Các chủng virus PRRS cường độc phân lập từ lợn mắc PRRSở Việt Nam
Trang 221.3.2 Phạm vi nghiên cứu
Phạm vi về không gian nghiên cứu: Các chủng virus PRRS được phân lập từ
lợn mắc PRRS thu thập tại các tỉnh: Hà Nội, Thái Bình, Nam Định, Hưng Yên, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, TP Hồ Chí Minh, Tiền Giang, Cần Thơ
Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học
Thú y và phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2014 - 2017
1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Đề tài lần đầu tiên tuyển chọn được chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam để làm giống gốc sử dụng cho sản xuất vacxin vô hoạt PRRS phòng PRRS cho lợn Giống gốc PRRS được thẩm định tại cơ quan thú y có thẩm quyền và đạt các tiêu chí vô trùng, thuần khiết, có hiệu giá cao, có khả năng kích thích miễn dịch tốt Kháng thể do vacxin tạo ra có thể trung hòa được các chủng virus đang lưu hành ở Việt Nam
Đề tài của luận án đã đưa ra được một quy trình phân lập, sàng lọc và tuyển chọn giống gốc Trên cơ sở này, có thể áp dụng để tạo ra một chủng Master seed mới thay thế những chủng cũ không còn đáp ứng tính tương đồng kháng nguyên
Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm thành công vacxin vô hoạt PRRS từ chủng virus thực địa, đây là vacxin vô hoạt đầu tiên về PRRS của Việt Nam được nghiên cứu sản xuất Quy trình sản xuất vacxin vô hoạt PRRS có thể chuyển giao để sản xuất vacxin phục vụ phòng PRRS cho đàn lợn, giúp người chăn nuôi giảm thiệt hại kinh tế do PRRS gây ra
1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài
Những kỹ thuật, quy trình được áp dụng trong đề tài góp phần nâng cao năng lực nghiên cứu cho người làm trong lĩnh vực thú y Các kết quả nghiên cứu phản ảnh đầy đủ về đặc điểm sinh học, sinh học phân tử, đặc tính kháng nguyên
và tính sinh miễn dịch của các chủng virus PRRS đang lưu hành ở Việt Nam Cung cấp các thông tin tham khảo, tham chiếu cho các nhà khoa học nghiên cứu
về virus PRRS ở Việt Nam cũng như trên thế giới
Trang 23Luận án là tài liệu khoa học, tài liệu tham khảo có giá trị cho nghiên cứu
và giảng dạy ở bậc đại học và sau đại học
1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Giống gốc được tuyển chọn là chủng virus PRRS đại diện cho các chủng virus đang lưu hành ở Việt Nam có thể sử dụng để sản xuất kháng thể đơn dòng,
đa dòng, phục vụ sản xuất kháng thể trị bệnh cũng như kháng thể trong chẩn đoán bệnh Giống gốc có thể sử dụng để sản xuất kháng nguyên trong chế tạo Kít ELISA chẩn đoán bệnh, Kít phát hiện bệnh nhanh, góp phần vào công cuộc phòng và chống PRRS cho toàn ngành chăn nuôi
Đề tài đã nghiên cứu sản xuất thành công vacxin vô hoạt PRRS đạt các chỉ tiêu về vô trùng, thuần khiết, an toàn và hiệu lực Đây là cơ sở quan trọng để ứng dụng nghiên cứu sản xuất các loại vacxin virus khác giúp nâng cao năng lực sản xuất vacxin vật nuôi của ngành Thú y nước nhà, hạn chế nhập khẩu vacxin ngoại
Vacxin vô hoạt PRRS có thể chuyển giao sản xuất trên quy mô công nghiệp, tạo ra một vacxin có hiệu quả và rẻ so với các vacxin ngoại nhập trên thị trường, góp phần khống chế dịch bệnh cho ngành chăn nuôi cũng như đảm bảo
an toàn cho lợn khi sử dụng
Trang 24PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 LỊCH SỬ VÀ TÌNH HÌNH DỊCH PRRS Ở LỢN
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome-PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, lây lan nhanh và
tỷ lệ chết cao Hiện nay, bệnh này đã trở thành dịch địa phương ở nhiều nước trên thế giới, kể cả các nước có ngành chăn nuôi lợn phát triển, gây ra những tổn thất rất lớn cho người chăn nuôi và đến nay các biện pháp khống chế bệnh vẫn chưa thành công Những tổn thất liên quan đến PRRS vẫn còn tiếp tục xảy ra ở nhiều nước trên thế giới Vì vậy, việc nắm rõ về bệnh, đặc biệt về miễn dịch học PRRS là một trong những khâu quan trọng trong công tác phòng chống dịch nhằm giảm thiểu những tổn thất không đáng có
2.1.1 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn được ghi nhận lần đầu tiên
ở Mỹ vào năm 1987 (Keffaber, 1989) với tên là "bệnh bí hiểm" (Mystery swine disease) bởi tính tự nhiên khó hiểu của bệnh nguyên Bệnh được phát hiện trên đàn lợn nái ở phía Bắc California, Iowa, và Minnesota Đáng ngạc nhiên là bệnh này đã không được xác định cho đến khi có các báo cáo về một vài dịch bệnh trên đàn lợn nái ở Ấn Độ "Bệnh bí hiểm" đặc trưng bởi các biểu hiện rối loạn sinh sản (sảy thai, đẻ non, chết non, xác cứng, sức sống yếu, tỷ lệ chết của lợn con cao và rối loạn hô hấp trên đàn lợn choai (Keffaber, 1989; Loula, 1991) Bệnh lưu hành rộng rãi ở Mỹ sau đó lan sang Canada vào năm
1988 Cuối năm 1990, vụ dịch đầu tiên ở châu Âu được công bố ở Đức từ đó bệnh lan truyền nhanh chóng khắp châu Âu Giữa tháng 1 năm 1991, bệnh xuất hiện trên đàn lợn giống của Hà Lan Cuối tháng 3 năm đó, dịch bệnh lây lan ra cả nước với số lượng trại mắc ngày càng tăng Bệnh cũng được phát hiện ở Tây Ban Nha, Bỉ và Anh năm 1991 và ở Đan mạch năm 1992
(Mortensen et al., 2002) Bệnh được phát hiện và lan truyền nhanh chóng trên
các đàn lợn ở khắp châu Âu với các dấu hiệu tương tự như bệnh PRRS ở Mỹ Đến năm 1994, PRRS được chính thức công bố xuất hiện ở 16 nước thuộc 3 châu lục (châu Mỹ, châu Á và châu Âu) (Bảng 2.1)
Trang 25Hà Lan 1991 (Wensvoort et al., 1991)
Tây Ban Nha 1991 (White, 1991)
Pháp 1991 (Mengeling and Lager, 1990)
Anh 1991 (Paton et al., 1991)
Đan Mạch 1992 (Mortensen et al., 2002)
Thời gian đầu khi phát hiện ra bệnh người ta đã gọi bệnh này bằng nhiều tên khác nhau như: "Bệnh mới ở lợn", "Bệnh thần bí ở lợn" (Keffaber, 1989), "Hội
chứng kém phát triển và hô hấp ở lợn" (PEARS) (Terpstra et al., 1991), "Bệnh
lợn tai xanh" (White, 1991) Hội nghị quốc tế về bệnh này được tổ chức tại St Paul, Minnesota đã nhất trí dùng tên PRRS và đã được Tổ chức Thú y thế giới công nhận, chính thức gọi là "Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên lợn" (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome-PRRS), căn nguyên bệnh được gọi là virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus - PRRSV) (Bảng 2.2)
Bảng 2.2 Một số tên thường gặp trong các tài liệu
sản và hô hấp ở lợn
Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS)
Rối loạn sinh sản và bệnh ở đường hô hấp
Nguồn: Cục Thú y (2010)
Trang 26PPRS được xếp vào nhóm B trong danh mục các bệnh của Tổ chức sức
khỏe động vật thế giới Hiện nay, dựa theo cấu trúc gen của virus, người ta đã xác
định được hai nhóm virus: nhóm I gồm những virus thuộc dòng châu Âu mà đại
diện là virus Lelystad và nhóm II gồm những virus thuộc dòng Bắc Mỹ mà tiêu biểu
cho nhóm này là chủng virus VR-2332 (Collins, 1991; Murtaugh et al., 1995)
Bảng 2.3 Protein cấu trúc của PRRSV
STT ORF Protein được
Nsp1α Cystein protease, giống
định huyết thanh học Nsp7β Chưa biết Chưa biết
Nsp8 Chưa biết Chưa biết
2 ORF1b
Nsp9 Polymerase RNA
phụ thuộc Chưa biết Nsp10 Helicase Chưa biết Nsp11 Endoribonuclease chất đối kháng IFN
mạnh Nsp12 Chưa biết Chưa biết
3 ORF2a
Protein cấu trúc
GP2a Protein vỏ nhỏ tương tác
với CD163 Epitop trung hòa nhỏ
4 ORF2b GP2b Protein vỏ nhỏ Chưa biết
5 ORF3 GP3 Protein vỏ nhỏ Epitop trung hòa nhỏ
6 ORF4 GP4 Protein vỏ nhỏ tương tác
với CD163 Epitop trung hòa nhỏ
7 ORF5 GP5 Protein vỏ chính Epitop trung hòa chính
8 ORF6 M
protein Protein vỏ chính Epitop trung hòa nhỏ
9 ORF7 N
protein Nucleocapside Epitop không trung hòa
Nguồn: Hoàng Bùi Tiến và cs (2013)
Trang 27Năm 1998, bệnh được phát hiện ở Hàn Quốc, Nhật Bản thuộc khu vực châu Á Từ năm 2005 trở lại đây, bệnh lây lan khắp các nước trên toàn thế giới
Ở Trung Quốc, trong vòng hơn 3 tháng của năm 2006, chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn có độc lực cao đã gây ra đại dịch ở 10 tỉnh phía Nam, làm cho hơn hai triệu lợn ốm, trong đó chết khoảng 400.000 con Tháng 7 năm 2007, dịch tiếp tục lan rộng ở các đàn lợn thuộc 25 tỉnh, thành phố với trên 180.000 lợn ốm; chết trên 45.000 con
Từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước và vùng lãnh thổ trên hầu hết các châu lục đều đã báo cáo về sự lưu hành của virus PRRS Đặc biệt, kể từ năm 2006, một biến chủng mới của virus PRRS xuất hiện ở Trung Quốc và nhanh chóng lan
rộng ra nhiều nước ở Đông Nam Á như Việt Nam (Feng et al., 2008), Ấn Độ,
Campuchia, Lào, v.v (OIE, 2005)
Các nghiên cứu ngoài nước về PRRS
Đã có rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu về căn nguyên bệnh, đặc tính sinh học của virus, cơ chế sinh bệnh, phương thức truyền lây, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích, các phương pháp chẩn đoán và các biện pháp phòng chống hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
Wensvoort et al (1991) đã nghiên cứu phản ứng miễn dịch gắn enzyme
trên tế bào đơn lớp (IPMA) là test huyết thanh học đầu tiên được phát triển và sử
dụng rộng rãi ở châu Âu Pol et al (1991) nghiên cứu cho thấy rằng bệnh tích
viêm phổi kẽ là một biến đổi bệnh lý cố định duy nhất được phát hiện bằng
phương pháp tổ chức học Segales et al (1998) nghiên cứu siêu cấu trúc đại thực
bào ở phế nang phổi lợn bị nhiễm in-vitro với virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp đối với trường hợp có hoặc không có Haemophilus-Parasuis Van
Nieuwstadt et al (2002) nêu ra loại kháng nguyên PRRS dùng để phát hiện ra
chuỗi peptide đồng đẳng của PRRSV dùng trong sản xuất vacxin hoặc xét nghiệm chẩn đoán Mengeling and Lager (1990) đã nghiên cứu phân lập virus từ mẫu bệnh phẩm là dịch rửa phế quản - phế nang trong vòng vài tuần sau thời điểm kết thúc tình trạng nhiễm virus huyết
2.1.2 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn tại Việt Nam
Lần đầu tiên trong lịch sử vào năm 1997, kháng thể kháng PRRSV được phát hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh miền Nam Kết quả kiểm tra thấy 10/51
Trang 28lợn giống nhập khẩu có huyết thanh dương tính với PRRS Toàn bộ số lợn này đã được xử lý vào thời gian đó Tuy nhiên, trong những năm tiếp theo, các nghiên cứu
về bệnh trên những trại lợn giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau từ 1,3% cho tới 68,29% (Cục Thú y, 2008)
Điều tra huyết thanh học của các tác giả Akemi Kamakawa và Hồ Thị Viết Thu từ năm 1999-2003 cho thấy tỷ lệ lợn có kháng thể kháng virus PRRS tại Cần Thơ là 7,7% (37/478 mẫu dương tính với virus PRRS)
Như vậy có thể thấy kháng thể kháng PRRSV đã xuất hiện và lưu hành tại nước ta trong một thời gian dài Tuy nhiên, kể từ khi xác định được lợn có kháng thể kháng virus PRRS ở đàn lợn giống nhập từ Mỹ, tại Việt Nam chưa từng có vụ dịch PRRS nào xảy ra
Ổ dịch đầu tiên xảy ra năm 2007 tại 4 tỉnh Hưng Yên, Hải Dương, Hải Phòng và Thái Nguyên Sau đó dịch PRRS xuất hiện khắp 3 miền Bắc, Trung, Nam Đến năm 2008, dịch PRRS gây hậu quả nghiêm trọng trên địa bàn các tỉnh thành trong cả nước và từ đó tới nay không năm nào dịch PRRS không xảy ra, đe dọa tổn thất cho ngành chăn nuôi lợn Dưới đây là những dẫn liệu sơ bộ về không gian và thời gian các ổ dịch PRRS đã xảy ra tại Việt Nam từ 2007-2016
Hình 2.1 Bản đồ dịch tễ phân bố của PRRS tại Việt Nam từ 2007-2010
Nguồn: Đỗ Hữu Dũng (2015)
Trang 29
Hình 2.2 Bản đồ dịch tễ phân bố của PRRS tại Việt Nam từ 2011-2013
Nguồn: Đỗ Hữu Dũng (2015)
Bảng 2.4 Tổng hợp các ổ dịch PRRS xảy ra ở Việt Nam từ 2007-2016
Năm Tỉnh Quận/Huyện Xã/Phường Số lợn mắc Số con bị tiêu hủy
Các nghiên cứu trong nước về PRRS
Mặc dù ở Việt Nam PRRS, mới xuất hiện từ năm 2007, song với sự quan tâm và nỗ lực của nhiều nhà nghiên cứu trong nước, nhiều vấn đề liên quan đến nguyên nhân gây bệnh, loài vật mắc bệnh, biến đổi bệnh lý của lợn bệnh ở Việt Nam đã từng bước được làm sáng tỏ, mang lại những giá trị khoa học và kinh tế trong phòng chống bệnh
Trang 30Báo cáo về đặc điểm dịch tễ của bệnh, Cục Thú y (2008) cho rằng lợn nái
và lợn con theo mẹ bị mắc PRRS với tỷ lệ cao Tỷ lệ chết của các loại lợn mắc PRRS cao hơn so với những nghiên cứu, đánh giá của quốc tế về PRRS Trong nghiên cứu điểm dịch tễ không gian và thời gian của PRRS ở lợn Việt Nam trong giai đoạn 2007-2012 của Đỗ Hữu Dũng và cs (2013) cho thấy lợn thịt và lợn vỗ béo là đối tượng mắc PRRS cao nhất (65,30%) và chết (55,11%) sau đó đến lợn con, lợn nái và lợn đực giống Trong khi đó Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan (2007), Nguyễn Đức Hiền và cs (2013) đã phát hiện những loại
vi khuẩn gây bệnh kế phát ở phổi khi lợn mắc PRRS thường gặp là: Mycoplasma
hyopneumonia (suyễn lợn); Pasteurella multocida (tụ huyết trùng); Bordetella bronchiseptica (viêm teo mũi); Streptococcus suis type 2 (liên cầu khuẩn) và Haemophilus parasuis (viêm đường hô hấp), Actinobacillus pleuropneumoniae
Nguyễn Văn Thanh (2007) đã xác định các con đường truyền lây PRRS và cho rằng trong tất cả các con đường truyền lây bệnh thì việc lây truyền qua thụ tinh nhân tạo là mối nguy hiểm nhất Nguyễn Văn Cảm và cs (2011) đã điều tra sự lưu hành của PRRS trên đàn lợn ở một số tỉnh Việt Nam và chỉ ra rằng tỉ lệ lưu hành kháng thể PRRS trong các đàn lợn điều tra đạt 82,6% trong đó kháng thể PRRS của chủng Bắc Mỹ chiếm 80,8%, chủng Châu Âu chiếm 3,4% như vậy trong quần thể lợn lưu hành kháng thể của cả 2 chủng virus PRRS
Đặc điểm bệnh lý của lợn mắc PRRS theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2002), Tiêu Quang An và Nguyễn Hữu Nam (2011) thì một số bệnh tích thường gặp của lợn mắc PRRS là phổi viêm tụ huyết hoặc xuất huyết, khí quản, phế quản chứa nhiều bọt khí và dịch nhày Thận xuất huyết như đầu đinh ghim, não sung huyết, hạch hầu họng, amidan sưng, sung huyết, gan sưng, tụ huyết; lách sưng và nhồi huyết Hạch màng treo ruột xuất huyết Bệnh tích vi thể ở phổi, hạch lympho là sự tăng sinh và thoái hóa tế bào, phế nang sung huyết, xuất huyết, chứa đầy dịch rỉ viêm, tăng sinh các nang lympho Nguyễn Thị Lan và cs (2014)
đã đánh giá khả năng gây bệnh thực nghiệm trên lợn của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) chủng BN-10 phân lập tại Việt Nam Kết quả cho thấy không có sự sai khác nhiều về triệu chứng lâm sàng giữa lợn mắc PRRS tự nhiên và lợn được thử độc lực của PRRS
Xác định các phương pháp chẩn đoán PRRS hiệu quả thì Nguyễn Ngọc Hải và cs (2007) đã đưa ra kết luận: quy trình RT-PCR có tính ổn định và độ tin cậy cao, hoàn toàn cho phép phát hiện được ARN của PRRSV trong mẫu nghiên cứu
Trang 31Trần Thị Bích Liên và cs (2007) đã ứng dụng kỹ thuật ELISA nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chủng PRRSV tại một số cơ sở chăn nuôi lợn miền Đông Nam Bộ đưa ra kết luận: "Bệnh tai xanh" do PRRSV đã hiện diện tại một số cơ
sở chăn nuôi lợn thuộc 2 tỉnh Đông Nam Bộ với tỷ lệ nhiễm chung là 36,78% (số mẫu huyết thanh xét nghiệm có kháng thể dương tính) và 85,71% (số trại và
hộ chăn nuôi lợn có mẫu huyết thanh dương tính)
Nghiên cứu về đặc điểm di truyền của virus PRRS, Nguyễn Ngọc Hải và
Võ Khánh Hưng (2012) đã nghiên cứu tính đa dạng của kiểu gen virus PRRS nhiễm trên một số đàn heo nuôi tại TP Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Bà Rịa Vũng Tàu, Bắc Giang và Hà Nội Kết quả cho thấy tình trạng nhiễm các dòng virus PRRS ở các trại rất phức tạp, có thể phân chia thành 3 kiểu: (1) nhiễm 1 kiểu gen virus PRRS Bắc Mỹ dòng Trung Quốc (65,22%), (2) nhiễm 1 kiểu gen virus Bắc Mỹ cổ điển (32,60%), (3) nhiễm 2 kiểu gen virus PRRS, kiểu gen Bắc Mỹ và kiểu gen Châu Âu (1,28%) Trong khi đó Đỗ Hữu Dũng và Nguyễn Viết Không (2014) đã nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và
hô hấp ở lợn (PRRS) phân lập từ ổ dịch năm 2013 cho thấy genome của virus PRRS phân lập tại Việt Nam có độ tương đồng cao về trình tự nucleotide với chủng CH-1a và JXA1 (93% và 97,3%) lưu hành ở Trung Quốc và với đại diện chủng Bắc Mỹ VR2332 (88,2%) So với chủng tham chiếu VR2332, cấu trúc gen NSP2 của chủng virus phân lập tại Việt Nam giống các virus đại diện chủng độc lực cao lưu hành tại Trung Quốc, có đột biến mất axit amin 481 và đoạn 29 amino axit (vị trí 53-561) Phân tích sự đa dạng di truyền trên vùng gen mã hóa protein NSP2 của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên lợn (PRRS) Nguyễn Ngọc Hải và cs (2015) chỉ ra rằng so với chủng JXA1 các chủng virus PRRS phân lập được ở miền nam có sự biến đổi lớn với 25-30 đột biến điểm trong vùng gen NSP2 Các chủng virus PRRS thực địa đang có sự biến đổi rõ rệt trên vùng nsp2, trong đó đáng chú ý là 5 chủng virus PRRS ở Đồng Nai với nhiều khả năng biến chủng trong tương lai Phân tích đa dạng di truyền vùng gen ORF5 của các chủng virus PRRS phân lập được ngoài thực địa từ năm 2011-2013 của virus PRRS, Đỗ Hải Quỳnh và cs (2016) đã báo cáo trình tự nucleotde và axit amin có mức độ tương đồng với nhau rất cao (96,5%-99,8% về nucleotide, 94,0%-99,5% về axit amin) Phân tích cây phả hệ cho thấy các chủng virus đều thuộc dòng Bắc Mỹ Đỗ Tiến Duy và Nguyễn Tất Toàn (2016) đã so sánh tương đồng gen giữa các chủng PRRSV độc lực cao thu thập với các chủng vacxin thương mại Kết quả cho thấy 3
Trang 32đoạn gen NSP2, ORF5 và ORF7 của 36 chủng HP-PRRSV thu thập tại các ổ dịch thực địa trong các năm 2009 - 2014 từ nhiều tỉnh thành đã được giải trình tự và phân tích tương đồng gen so với các chủng vacxin thương mại có mặt trên thị trường Ở gen ORF5, các chủng thực địa có mức tương đồng nucleotid/axit amin (%) lần lượt: 86,8-99,7/84,0-99,5; 89,0-93,8/83,2-96,9; 84,1-98,8/88,1-92,1; 83,7-98,8/83,8-97,4; 83,3-98,5/81,4-96,9; 42,6-46,2/46,8-51,1 và 42,3-45,5/42,3-47,7 tương ứng so với chủng vacxin JXA1-R, P129 Fostera, ATCC VR-2332 Ingelvac, Resp PRRS Ingelvac, BCL-PS 100, Amervac PRRS và Porcilis PRRS Ở gen ORF7, các chủ ng thực địa có sự tương đồng nucleotid (%) lần lượt 91,1-99,7/94,7-99,1; 90,3-95,6/94,7-99,9; 90,6-99,7/94,7-99,9; 90,6-99,7/94,7-99,9; 41,9-46,0/52,8-55,8 và 42,3-46,1/52,8-56,9 so với chủ ng vacxin JXA1-R, P129 Fostera, ATCC VR-2332 Ingelvac, Resp PRRS Ingelvac, Amervac PRRS và Porcilis PRRS Sự đa dạng cao củ a các chủng thực địa dựa trên phân tích ORF5 và ORF7 dẫn đến mức tương đồng biến động lớn so với các chủng vacxin, nên việc xác định chủ ng nhiễm trên đàn lợn hay vùng chăn nuôi có giá trị cho việc chọn vacxin phù hợp và hiệu quả tốt hơn
Phân lập virus PRRS và lựa chọn chủng virus phục vụ sản xuất vacin, Trần Thị Thanh Hà và cs (2012) đã thực hiện phản ứng trung hòa virus PRRS trên nuôi cấy tế bào Kết quả cho thấy huyết thanh lợn nhiễm PRRS chủng Việt Nam chỉ trung hòa virus phân lập nội địa, không trung hòa các virus có nguồn gốc Châu Âu và Bắc Mỹ Nguyễn Bá Hiên và cs (2013) đã nghiên cứu chọn chủng vacxin virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản để sản xuất vacxin phòng bệnh bằng việc khảo sát các đặc tính sinh học và sinh học phân tử của các chủng virus phân lập được từ các lợn mắc PRRS ngoài thực địa
Nguyễn Bá Tiếp và Đoàn Anh Tuấn (2014) đã đánh giá ảnh hưởng của hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp đến kháng thể kháng virus dịch tả lợn trên các đàn lợn nuôi công nghiệp cho thấy PRRS có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của vacxin phòng dịch tả lợn Nguyễn Đức Tân và cs (2015) đã phân lập và tuyển chọn một số chủng virus PRRS độc lực cao từ năm 2007-2011 để sản xuất vacxin phòng bệnh cho lợn Nghiên cứu đã chọn chủng đại diện có độc lực cao để sản xuất thử nghiệm 3 lô vacxin tiểu phần theo công nghệ của công ty MJ-Biologics, Hoa Kỳ, vacxin sản xuất đã được đánh giá là đạt các chỉ tiêu về an toàn và hiệu lực Nguyễn Thị Lan và cs (2016) đã nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-04 được phân lập từ lợn mắc bệnh tai xanh qua các đời cấy
Trang 33truyền chỉ ra rằng virus được nhân lên nhanh trong tế bào và gây bệnh tích điển hình là các tế bào co cụm lại với nhau, bong tróc khỏi đáy bình nuôi cấy Bệnh tích tế bào (CPE) xuất hiện sớm sau 24 giờ gây nhiễm; sau 72 giờ các tế bào đều bong tróc khỏi đáy bình nuôi cấy Hiệu giá virus đời 1 và đời 10 đạt 105
(TCID50/25µl), từ đời 20 đến đời 40 là 106 Số lượng virus giải phóng tự do trong môi trường nhiều hơn số lượng virus ở trong tế bào Lượng virus nhân lên bên trong cũng như lượng virus giải phóng ra ngoài tế bào ở đời thứ nhất thấp hơn đời thứ 10, 20 (thể hiện ở giá trị log10TCID50/25µl, trung bình đạt: 2,66 và 3,04
so với 2,87 và 3,66) và đời 10, 20 lại thấp hơn đời 30, 40 (2,87 và 3,66 so với 3,16 và 3,71) Nghiên cứu ảnh hưởng của Interferon α (IFN- α) đối với virus PRRS, Trần Xuân Hạnh và cs (2012) đã chỉ ra rằng tế bào được xử lý IFN- α với nồng độ 1250-2500IU/ml đã hạn chế sự phát triển của virus PRRS và ở nồng độ 5000IU/ml gây ức chế hoàn toàn virus nhân lên Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng IFN- α ức chế sự nhân lên của virus PRRS và kích thích đáp ứng miễn dịch khi sử dụng kết hợp với vacxin vô hoạt PRRS.Trong khi đó nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng tiềm năng của Interferon α trong đáp ứng miễn dịch của lợn được tiêm kháng nguyên GP5 tái tổ hợp, Trần Thị Thanh Hà và cs (2017) đã ứng dụng
hệ thống biểu hiện baculovirus để sản xuất protein GP5 của virus PRRS phân lập tại Việt Nam Kết quả nghiên cứu cho thấy protein GP5 tái tổ hợp được sản xuất bằng hệ thống baculovirus mang hoạt tính sinh học và hoạt tính miễn dịch, đồng thời việc kết hợp protein GP5 tái tổ hợp và interferon- α đã làm tăng đáp ứng kháng thể đặc hiệu với virus PRRS, điều này được xác nhận bởi kết quả IDEXX ELISA và trung hòa virus Kết quả nghiên cứu này cho thấy mức độ phát triển vacxin tái tổ hợp GP5 bằng hệ thống baculovirus tại Việt Nam Đánh giá sự ổn định độc lực của chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp KTY-PRRS-06 qua 5 đời tiêm truyền, Trịnh Đình Thâu và cs (2017) cho thấy chủng virus KTY-PRRS-06 có khả năng gây bệnh cho lợn và có độc lực ổn định qua 5 đời tiêm truyền trên lợn thí nghiệm
2.2 CĂN BỆNH
2.2.1 Cấu trúc virus PRRS
Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRSV) thuộc chi
Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales Hạt virus thường có hình oval với
Trang 34đường kính xấp xỉ 60nm và bề mặt có gai được cấu tạo từ phức hợp protein màng Virus PRRS là virus sợi đơn dương với kích thước phân tử 15.1- 15.5 kb (Dokland, 2010) Virus bao gồm một lõi Nucleocapsid có kích thước khoảng 20-
30 nm gồm nhiều tiểu phần giống nhau, bao quanh lõi là phần vỏ, đó là lớp màng lipid khá trơn nhẵn Kết quả quan sát bằng kính hiển vi điện tử cho thấy, trên bề mặt virus có các mấu lồi có kích thước khoảng 2 nm hoặc một số gai có đường kính 10 - 15 nm do các protein vỏ virus tạo thành
Hình 2.3 Cấu trúc virus PRRS
Nguồn: Dokland (2010)
Genome của virus PRRS có kích thước khoảng 15kb, gồm ít nhất 10 khung đọc mở ORF (open reading frames): ORF1a, ORF1b, ORF2, ORF2b, ORF3, ORF4, ORF5, ORF5a, ORF6, ORF7 mã hóa cho các protein cấu trúc và phi cấu trúc (hình 3.4) Trong đó ORF 1a, ORF 1b chiếm tới 80% cấu trúc bộ gen, hai ORF này mã hóa cho ít nhất 14 protein phi cấu trúc NSP (non-structure protein), bao gồm: bốn proteases (NSP1α, NSP1β, NSP2 và NSP4); RNA polymerase (NSP9); helicase (NSP10); endonuclease (NSP11) Đầu 3’ của ORF1a được lồng vào đầu 5’ ORF1b bởi 16 nucleotide Tại đầu 3’ của ORF1a có chuỗi trình tự gồm 7 nucleotide (UUUAAAC) tạo thành một vòng (loop) và cấu trúc này được coi là rất quan trọng và rất cần thiết cho quá trình sao chép và biểu hiện của ORF1b trong quá trình dịch khung ở riboxom
Trang 35Hình 2.4 Cấu trúc genome virus PRRS
Nguồn: Dokland (2010)
Bảng 2.5 Cấu trúc và chức năng protein phi cấu trúc
(non - structure proteins)
NSP1α
NSP1α cóđầu N-terminal (vị trí amino axit 1-55) chứa vùng zinc finger
NSP1α giống papain của protease (vị trí amino axit 66-166) Zinc finger
là nhân tố phổ biến trong quá trình phiên mã, cho thấy vai trò của NSP1 trong quá trình tổng hợp RNA của virus PRRS
NSP1β
NSP1α-NSP1β nối với nhau ở vị trí amino axit Gly383-Ala384 NSP1β
có ba vùng (i) N-terminal nuclease (NTD), (ii) vùng liên kết ở giữa, (iii) vùng C– terminal PCPβ (Beura, 2011)
NSP2
NSP2 là protein lớn có nhiều domain: (i) vùng N-terminal cysteine protease, (ii) vùng hypervariable chưa biết chức năng, (iii) màng, (iv) đuôi C-terminal NSP2 thuộc lớp gian bào nơi mà liên kết với màng tế bào và có nguồn gốc từ mạng lưới nội chất
NSP3 NSP3 được dự đoán hình xoắn ốc, có vai trò quan trọng trong hình thành
nên phức hệ tái bản của virus PRRS
NSP4
Amino axit từ 1-153 được xác định là chymotrypsin cuộn gấp lại bao gồm 6 nếp gấp Nếp gấp này được tìm thấy ở genome của một số giống virus bao gồm coronaviruses, picornaviruses và alphaviruses; do đó được gọi là protease 3C
NSP5-8 và
NSP12 Chưa xác định được rõ cấu trúc và chức năng
NSP9 Mã hóa cho RNA polymerase thuộc đầu cuối C – terminal
NSP10 Mã hóa cho helicase
NSP11 Bao gồm vùng endoribonuclease và được coi như là một gen chỉ thị của
bộ Nidovirales
Nguồn: Dokland (2010)
Trang 36Các khung đọc mở: ORF2a, ORF2b, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6, ORF7 nằm ở đầu 3’ của genome mã hóa cho các protein cấu trúc tương ứng GP2 (Glycoprotein 2), ORF2b (hay còn gọi là protein vỏ E, Envelope), GP3, GP4, GP5, M (Membrane protein) và protein capsid N- ORF7 (Nucleocapside protein) Nucleocapsid N, E và protein màng M không được glycosyl hóa; trong khi đó GP2, GP3, GP4 và GP5 đều được glycosyl hóa Gần đây, trình tự ORF5a
đã được phát hiện tại vị trí đầu 5’ của ORF5 Tuy nhiên, vai trò của protein ORF5a vẫn chưa được xác định
2.2.2 Phân loại virus PRRS
Hiện nay, PRRSV đã được xác lập với 2 kiểu gen chính là kiểu gen có nguồn gốc từ châu Âu (EU) và kiểu gen có nguồn gốc từ Bắc Mỹ (NA) Việc so sánh chuỗi gen đã cho thấy sự khác biệt di truyền quan trọng giữa 2 nhóm này Ở Bắc Mỹ chỉ tìm thấy kiểu gen NA, mặc dù cũng có một báo cáo đã cô lập được
kiểu gen EU (Fang et al., 2004)
Hình 2.5 Cây phả hệ của virus PRRS
Nguồn: Amonsin et al (2009)
Trang 37Ở châu Âu thì kiểu gen EU trội hơn và cho đến nay vẫn chưa có chủng
nào thuộc kiểu gen NA được xác lập ở phía tây châu Âu (Madsen et al., 1998; Oleksiewicz et al., 1998) Ở châu Á và Nam Mỹ cả hai kiểu gen trên đã được
xác lập Tuy nhiên, năm 2006 đại dịch PRRS ở Trung Quốc lại do nhiễm
PRRSV độc lực cao (Tian et al., 2007) Chủng độc lực cao xuất hiện ở Trung
Quốc là tổ tiên của các PRRSV đã phát triển trong suốt quá trình tiến hóa dưới một số áp lực về chọn lọc tại địa phương Hiện nay, tại Việt Nam chủng gây PRRS chủ yếu là chủng độc lực cao có quan hệ di truyền gần gũi với các chủng PRRS lưu hành tại trung Quốc
Một số nghiên cứu gần đây còn cho thấy có sự khác biệt về tính di truyền trong những virus được phân lập từ các vùng địa lý khác nhau Bản thân các virus trong cùng một nhóm cũng có sự thay đổi về chuỗi nucleotide khá cao đến 20% Chủng Bắc Mỹ có 3 subtyp: VR-2332, Taiwan và 807/94 phân lập ở Canada Chủng châu Âu có 2 subtyp: I10 phân lập tại Hà Lan và Olot tại Tây Ban Nha Chính sự khác biệt và sự đa dạng về tính khánh nguyên, khả năng biến đổi cấu trúc kháng nguyên của virus đã làm tăng khó khăn cho việc sản xuất vacxin chống lại chúng
2.2.3 Khả năng gây bệnh và sức đề kháng của virus PRRS
Khả năng gây bệnh là một đặc tính sinh học quan trọng, nó phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố nhưng chủ yếu là độc lực của chính nguyên nhân gây bệnh đó Theo Tô Long Thành (2007) virus PRRS chỉ gây bệnh cho lợn, lợn ở tất cả các lứa tuổi đều cảm nhiễm, nhưng lợn con và lợn nái mang thai thường mẫn cảm hơn cả Loài lợn rừng cũng mắc bệnh, đây có thể coi là nguồn dịch thiên nhiên
Về mặt độc lực, người ta thấy PRRSV tồn tại dưới 2 dạng:
▪ Dạng cổ điển: có độc lực thấp, ở dạng này khi lợn mắc bệnh thì tỷ lệ chết thấp, chỉ từ 1%–5% trong tổng đàn
▪ Dạng biến thể độc lực cao: gây nhiễm và chết nhiều lợn
PRRSV là virus có vỏ bọc ngoài, sự sống sót của virus bên ngoài vật chủ chịu tác động của nhiệt độ, pH, chất tẩy uế PRRSV có thể tồn tại 1 năm trong nhiệt độ lạnh từ -200C đến -700C; trong điều kiện 40C virus có thể sống tới 1 tháng Cũng giống như các loại virus khác PRRSV đề kháng với nhiệt độ cao: ở 370C chịu được 48 giờ, 560C bị giết sau 1 giờ (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2007; Tô Long Thành, 2007)
Trang 38Với các hoá chất sát trùng thông thường và môi trường pH axit, virus dễ dàng bị tiêu diệt Ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng PRRSV vẫn bền vững ở pH từ 6,5-7,5; tuy nhiên tính gây nhiễm giảm ở pH<6,0 hoặc >7,65 (Cục Thú y, 2008)
2.3 TRUYỀN NHIỄM HỌC
2.3.1 Loài vật mắc bệnh
Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2007) cho rằng người và các động vật khác không mắc bệnh, tuy nhiên trong các loài thuỷ cầm chân màng, vịt trời (Mallard duck) lại mẫn cảm với virus PRRSV có thể nhân lên ở loài động vật này
và chính đây là nguồn reo rắc mầm bệnh trên diện rộng rất khó khống chế
2.3.2 Chất chứa mầm bệnh và quá trình truyền lây
Virus có trong dịch mũi, nước bọt, phân, nước tiểu của lợn ốm, hoặc mang trùng và phát tán ra môi trường Tinh dịch của lợn đực giống cũng được xác định
là nguồn phát tán mầm bệnh, virus ở tinh dịch cũng có thể lây nhiễm sang bào
thai (Pitkin et al., 2009b) Ở lợn mẹ mang trùng, virus có thể lây nhiễm qua bào
thai từ giai đoạn giữa thai kỳ trở đi và virus cũng được bài thải qua nước bọt và sữa Lợn trưởng thành có thể bài thải virus trong 14 ngày trong khi đó lợn con và lợn choai bài thải virus tới 1-2 tháng (Cho and Dee, 2006)
Virus có khả năng phân tán thông qua các hình thức: vận chuyển lợn mang trùng, phân tán theo gió (có thể đi xa tới 3 km), qua bụi, bọt nước, dụng cụ chăn nuôi và dụng cụ bảo hộ lao động nhiễm trùng, thụ tinh nhân tạo và có thể do một số chim hoang dã
Sự truyền lây qua không khí là quan trọng trong việc phát tán virus PRRS
Ở Anh, vận chuyển lợn làm lây lan virus làm cho chính phủ phải đề ra những hạn chế nghiêm ngặt trong việc vận chuyển lợn bệnh Các thống kê đưa ra thang bậc sau để biểu thị khả năng truyền qua không khí xung quanh đàn bị nhiễm:
- 57% các trại trong vòng 1 km bị nhiễm
- 31% giữa 1- 2 km bị nhiễm
- 11% giữa 2- 3 km bị nhiễm
- Những đàn > 3 km cách đàn bị nhiễm vẫn âm tính (Pitkin et al., 2009a)
Sự lây lan bệnh từ đàn lợn này sang đàn lợn khác thường theo tinh dịch
khi phối giống (Mortensen et al., 2002) Ngoài ra còn các đường như kim tiêm,
Trang 39nước uống, không khí, kí chủ không phải là lợn, côn trùng, vật liệu nhiễm khuẩn
(Dee et al., 2002; Thomas (2016)
Zimmerman et al (1997) đã gây bệnh qua đường miệng cho vịt trời, ngan,
gà lôi với khoảng 104 TCID50/ml virus PRRS Qua thí nghiệm có khả năng phân lập virus ở phân gà 5 ngày sau khi gây bệnh, gà lôi 5 ngày và 12 ngày, vịt trời khoảng 5 ngày Trong các thí nghiệm này triệu chứng lâm sàng không thấy ở bất
kỳ loài chim nào và chúng không có sự thay đổi phản ứng huyết thanh đối với virus PRRS Nhưng có những nghiên cứu chứng minh rằng chim di trú (như vịt trời) có thể bị nhiễm, bởi vậy chúng có khả năng truyền virus đi xa
Ở các cơ sở có lưu hành bệnh, môi trường bị ô nhiễm, bệnh lây lan quanh năm nhưng tập trung vào thời kỳ có nhiều lợn nái phối giống và bệnh phát sinh thành dịch, với tỷ lệ cao, lợn nái có hội chứng rối loạn sinh sản trong khi lợn con
bị viêm đường hô hấp phổ biến (Bierk et al., 2001; Dee et al., 2003)
Sự vận chuyển lợn bệnh, sự lây lan cục bộ qua không khí được coi như là
phương tiện truyền lây phổ biến nhất (Otake et al., 2002)
2.3.3 Cơ chế sinh bệnh, phương thức truyền lây và đáp ứng miễn dịch
2.3.3.1 Cơ chế sinh bệnh
Virus có ái lực cao với đại thực bào đặc biệt là đại thực bào phế nang Ở phổi, đại thực bào phế nang có vai trò quan trọng trong cơ chế bảo vệ Chúng tiêu hóa và loại trừ vi khuẩn, virus xâm nhập vào cơ thể Tuy nhiên, chúng không tiêu diệt được PRRSV Vì vậy virus nhân lên trong đại thực bào sau đó giết chết đại thực bào, có tới 40% đại thực bào bị phá hủy PRRSV loại bỏ phần lớn cơ chế bảo vệ của cơ thể, cho phép vi khuẩn, virus khác tăng sinh và gây hại Khi đã xâm nhập vào cơ thể, chúng tồn tại dai dẳng và hoạt động âm thầm Đại thực bào
bị tiêu diệt làm giảm chức năng đề kháng của cơ thể làm tăng nguy cơ nhiễm khuẩn kế phát Đặc biệt là tăng đột biến tỷ lệ viêm phổi ở lợn vỗ béo và lợn chuẩn bị giết thịt (Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan, 2007)
Phổi chắc đặc là nguyên nhân gây ra khó thở và hình thành tai xanh, tím ở nhiều vùng da của cơ thể; phổ biến nhất là mỏm tai, âm môn và các vùng da mỏng, vùng da có nhiều mạch quản (Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan, 2007)
Lợn chửa kỳ cuối thì nhu cầu oxy tăng cao vì phải nuôi thai, lợn bị bệnh thiếu hụt oxy nghiêm trọng gây nên những rối loạn chuyển hóa, thai bị suy dinh
Trang 40dưỡng, sảy thai và chết thai Sau khi sảy thai, tế bào nội mạc tử cung bị thoái hóa, hoại tử nên làm chậm quá trình sinh lý khác
2.3.3.2 Phương thức truyền lây
Done et al (1996) đã nghiên cứu và đưa ra kết luận: nhiễm bệnh dai dẳng
là một đặc trưng của nhóm Arterivirus PRRSV tồn tại dai dẳng trong cơ thể lợn
và giảm dần theo thời gian Virus có trong dịch mũi, nước bọt, phân, nước tiểu của lợn mắc bệnh hoặc lợn mang trùng và phát tán ra môi trường Virus có thời gian tồn tại và được bài thải ra ngoài môi trường tương đối dài: ở lợn mang trùng
và không có triệu chứng lâm sàng, virus có thể được phát hiện ở nước tiểu trong
14 ngày, ở phân khoảng 28-35 ngày, ở huyết thanh khoảng 21-23 ngày, ở dịch hầu họng khoảng 56-157 ngày, ở tinh dịch sau 92 ngày và đặc biệt trong huyết thanh của lợn con bị nhiễm bệnh từ bào thai sau 210 ngày vẫn có thể tìm thấy virus (Lê Văn Năm, 2007)
Bệnh có thể lây lan trực tiếp thông qua sự tiếp xúc giữa lợn ốm, lợn mang trùng với lợn khoẻ và có thể lây gián tiếp qua các nhân tố trung gian bị ô nhiễm virus như: dụng cụ, thiết bị chăn nuôi; các phương tiện vận chuyển; các loài côn trùng; các loài có vú khác và gia cầm (Tô Long Thành, 2007)
Terpstra et al (1991) đã chỉ ra rằng, lợn nái có virus trong huyết thanh
sớm lúc 1 ngày sau khi tiêm truyền, sau đó virus nhân lên ở đại thực bào phế nang Virus huyết kéo dài (lên tới 14 ngày) là điển hình ở lợn nái; vì vậy chúng
có đủ thời gian để tuần hoàn máu đưa virus tới nhau thai Virus vượt qua nhau
thai và nhiễm vào thai qua đại thực bào Christianson et al.(1992) đã tiêm virus
vào trong tử cung lợn có thai 45- 49 ngày tuổi và đã chứng minh rằng ở giai đoạn giữa thời kì mang thai giúp virus nhân lên nhưng chúng ít khi vượt qua nhau thai ở giai đoạn này
Người ta đã phân lập virus từ đại thực bào phế nang, phổi, tim, thận, não, lách, hạch lâm ba, tuyến ức, amidan, tuỷ xương, bạch cầu mạch máu ngoại vi, huyết tương và huyết thanh của lợn nhiễm bệnh Virus huyết có thể phát hiện ngay 1 ngày
sau khi tiêm truyền, tuy nhiên 28 ngày phổ biến hơn (Halbur et al., 1995a)
2.3.3.3 Đáp ứng miễn dịch
Nguyễn Đức Hiền (2012) đã đánh giá đáp ứng kháng thể tạo thành sau tiêm chủng một số loại vacxin phòng PRRS, đã thực hiện xét nghiệm 194 mẫu