Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nuôi trồng thủy sản: Nghiên cứu sản xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch

Luận án đã xây dựng được quy trình sản xuất chế phẩm oligochitosan bằng cách sử dụng bức xạ gamma coban 60 để phân cắt chitosan dạng vẩy với cường độ 166kGy. Oligochitosan thu được sau khi chiếu xạ có 3 phân đoạn và có khả năng kháng 5 loại vi khuẩn: E. coli O157:H7, Salmonella typhimurium, S. aureus, B. subtilis và Listeria monocytogenes.

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VŨ THỊ HOAN

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN TÔM NGUYÊN

LIỆU SAU THU HOẠCH

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

Chuyên ngành: Công nghệ chế biến thủy sản

Khánh Hòa - 2018

2

Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Nha Trang

Người hướng dẫn khoa học: 1 GS.TS Trần Thị Luyến

Phản biện 1: PGS TS Nguyễn Anh Dũng

Trường Đại học Tây Nguyên

Phản biện 2: PGS TS Ngô Đăng Nghĩa

Phản biện 3: GS TS Nguyễn Thị Hiền

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án cấp trường họp tại Trường Đại học Nha Trang vào hồi ……… giờ, ngày …… tháng …… năm 2018

Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia

Thư viện Trường Đại học Nha Trang

3

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Đề tài luận án: Nghiên cứu sản xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm

nguyên liệu sau thu hoạch

Ngành/Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản

có mật độ tế bào 2.10 9 cfu/ml, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1/1, tỷ lệ rỉ đường bổ sung 11,15% (w/w),

tỷ lệ dịch vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 bổ sung 11,20% (v/w), lên men ở nhiệt độ phòng, trong thời gian 6,19 ngày với pH ban đầu là 7,0; Sử dụng enzyme flavourzyme khử protein còn lại

ở đầu vỏ tôm thẻ chân trắng sau lên men với tỷ lệ enzyme sử dụng 0,06%, nhiệt độ thủy phân 50 o C

ở pH 7,5, trong thời gian 8h Sử dụng acid HCl 3% khử khoáng còn lại ở chitin thô với tỷ lệ dung dịch acid/chitin thô: 2/1 Quá trình khử khoáng còn lại thực hiện ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10h Chitin sản xuất có chi phí nguyên vật liệu là 111.000 đồng/kg

Quy trình sản xuất này giảm thiểu lượng hóa chất sử dụng nên giảm nguy cơ gây ô nhiễm môi trường Mặt khác sản phẩm phụ: protein, astaxanthin, tách ra từ quá trình lên men đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L plantarum VTCC-B431 hoàn toàn có thể sử dụng làm thức ăn chăn nuôi Do vậy, quy trình sản xuất này vừa có ý nghĩa khoa học và vừa có ý nghĩa thực tiễn lớn trong bảo vệ môi trường đồng thời tạo ra sản phẩm chitin theo sản xuất theo phương pháp sinh học “xanh” và “sạch” hơn

2) Luận án đã xác định được các thông số thích hợp cho quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl trên 90%: deacetyl chitin bằng NaOH 50% ở nhiệt độ phòng trong thời gian 120h và tỷ

lệ dung dịch NaOH so với chitin 4/1 Chitosan sản xuất theo quy trình có độ deacetyl trên 93% và

có chi phí nguyên vật liệu là 361.365 đ/kg

Đóng góp mới của kỹ thuật này ở chỗ quá trình deacetyl chitin thành chitosan được tiến hành ở nhiệt độ phòng mà không sử dụng nhiệt độ cao như các phương pháp khác Vì thế về mặt công nghệ, quy trình sản xuất sẽ đơn giản và dễ thực hiện hơn Do vậy, công nghệ này có thể dễ

Việc sản xuất oligochitosan theo kỹ thuật sử dụng bức xạ gamma coban 60 để phân cắt chitosan dạng vẩy có ưu điểm là sản phẩm sau phân cắt không cần phải kết tủa bằng cồn, tinh sạch và sấy khô như các phương pháp phân cắt chitosan thành oligochitosan bằng enzyme và hóa học Mặt khác, sản phẩm oligochitosan lại có khả năng kháng 5 loại vi khuẩn và dễ bảo quản, vận chuyển Do vậy về mặt công nghệ, phương pháp này có tính khả thi cao và dễ dàng triển khai sản xuất đại trà chế phẩm oligochitosan

4) Luận án đã xác định được cấu trúc phân tử của oligochitosan có 13 monomer

5) Luận án đã tiến hành thử nghiệm độc tính của oligochitosan trên chuột thí nghiệm và phân tích máu, nước tiểu, giải phẫu, cắt lát quan sát vi thể gan thận, lách của chuột sử dụng oligochotosan cho thấy oligochitosan hoàn toàn an toàn và không gây độc cho chuột qua con đường tiêu hóa cũng như không có bất cứ một ảnh hưởng nào tới các nội quan của chuột

Đây là nghiên cứu đầu tiên tiến hành thử nghiệm oligochitosan trên chuột thí nghiệm Việc thử nghiệm đã chứng minh rằng chế phẩm oligochitosan sản xuất theo kỹ thuật phân cắt chitosan bằng bức xạ gamma coban 60 hoàn toàn an toàn với chuột thí nghiệm tức là an toàn với con người

- đây chính là một hướng mới trong sản xuất và sử dụng oligochitosan cho lĩnh vực thực phẩm và dược học

6) Luận án đã nghiên cứu và xây dựng quy trình bảo quản tôm bạc biển bằng cách nhúng chế phẩm oligochitosan với nồng độ 1% trong thời gian 1 phút Tôm bạc nguyên liệu sau xử lý oligochitosan 1% có thể bảo quản 6 ngày trong điều kiện mát mà vẫn đạt tiêu chuẩn chất lượng dùng làm nguyên liệu chế biến

Nghiên cứu này cho thấy hoàn toàn có thể sử dụng oligochitosan trong bảo quản thủy sản

- nghiên cứu này nếu được triển khai trong thực tế sẽ góp hạn chế việc lạm dụng hóa chất trong bảo quản nguyên liệu thủy sản

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NGHIÊN CỨU SINH

GS TS Trần Thị Luyến PGS TS Vũ Ngọc Bội Vũ Thị Hoan

5

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Nguyên liệu thủy sản thường dễ bị dập nát hư hỏng trong quá trình lưu giữ, bảo quản sau thu hoạch Vì thế, người dân có xu thế lạm dụng các loại phụ gia độc hại, có khả năng kháng khuẩn như kháng sinh, hàn the, ure để kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu thủy sản sau thu hoạch gây nên tình trạng mất an toàn thực phẩm Vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng các chất kháng khuẩn

có nguồn gốc tự nhiên, không độc hại trong bảo quản nguyên liệu thủy sản đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu

Theo hướng nghiên cứu này, các nhà nghiên cứu đang quan tâm tới việc nghiên cứu sử dụng oligochitosan - tác nhân sinh học có nguồn gốc từ đầu vỏ tôm, có khả năng kháng khuẩn, chống

oxy hóa và không độc hại trong bảo quản nguyên liệu thủy sản Do vậy việc “Nghiên cứu sản

xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch” là một hướng

nghiên cứu mới, cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn

2 Mục đích của luận án

- Sử dụng phương pháp sinh học phối hợp giữa vi khuẩn lactic và enzyme protease để khử protein và khoáng chất ở đầu vỏ tôm thẻ trong quá trình sản xuất chitin nhằm giảm thiểu hóa chất

sử dụng trong quá trình này

- Sản xuất chitosan có độ deacetyl cao bằng NaOH nồng độ cao trong điều kiện nhiệt độ thường để dễ dàng triển khai sản xuất ở quy mô lớn

- Sản xuất được oligochitosan bằng công nghệ bức xạ Coban 60 và sử dụng oligochitosan

sản xuất được trong bảo quản tôm biển

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Đầu vỏ tôm: đầu vỏ tôm dùng trong nghiên cứu sản xuất oligochitosan là phế liệu đầu vỏ

tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) thu nhận tại bàn chế biến của Công ty Cổ phần Nha

Trang SeaFood (F17)

3.2 Phạm vi nghiên cứu

1) Nghiên cứu sử dụng phối hợp vi khuẩn lactic L plantarum VTCC-B và enzyme flavourzyme để khử protein và các tạp chất còn lại ở đầu vỏ tôm thẻ chân trắng trong sản xuất chitin

2) Nghiên cứu sản xuất chitosan có độ deacetyl trên 90%

3) Nghiên cứu sản xuất oligochitosan bằng phương pháp sử dụng bức xạ gamma coban 60 4) Nghiên cứu xác định cấu trúc của oligochitosan

6

5) Nghiên cứu đánh giá độc tính oligochitosan

6) Thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của oligochitosan

7) Thử nghiệm sử dụng oligochitosan trong bảo quản tôm nguyên liệu

4 Phương pháp nghiên cứu

Luận án sử dụng các phương pháp nghiên cứu chuẩn của Thế giới và Việt Nam trong nghiên

cứu thu nhận oligochitosan từ phế liệu đầu vỏ tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei), có sử

dụng toán học để tối ưu hóa nhằm đảm bảo kết quả thí nghiệm có độ tin cậy cao

5 Kết cấu của luận án

Luận án gồm 157 trang, trong đó 38 trang tổng quan, 13 trang phương pháp nghiên cứu, 87 trang kết quả nghiên cứu, kết luận 2 trang, 35 bảng số liệu, 91 hình, 136 tài liệu tham khảo (tiếng Việt 28 tài liệu, tiếng Anh 108 tài liệu) và phụ lục 32 trang

7

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHITIN VÀ CHITOSAN

Chitosan là một dẫn xuất của chitin, được hình thành khi thực hiện quá trình deacetyl hóa chitin (tách nhóm acetyl) khỏi chitin Chitosan là một polyme sinh học gồm các nhóm D-glucosamine (80%) và N-acetyl-D-glucosamine (20%) liên kết với nhau nhờ liên kết β(1 →4)

và được mô tả là “vật liệu sinh học đa năng nhất của tạo hóa” là một dẫn xuất chứa rất nhiều nhóm amin Công thức cấu tạo của chitosan gần giống như chitin và cellulose, chỉ khác là chitosan chứa nhóm amin ở cacbon thứ 2

Oligochitosan, thu được nhờ thủy phân chitosan, là một loại oligosaccharide có chứa một số lượng có hạn các phân tử D-glucosamine

Không giống như chitosan chỉ tan trong acid, oligochitosan do có cấu trúc mạch ngắn hơn nên dễ tan trong nước hơn Mặt khác oligochitosan lại có khả năng kháng khuẩn nên người ta có thể dễ dàng sử dụng oligochitosan trong nhiều lĩnh vực thực phẩm chẳng hạn như sử dung làm phụ gia giúp kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm, sử dụng làm tác nhân kháng khuẩn ứng dụng trong sản xuất các chế phẩm sinh học dùng làm phân bón lá,…

Nhóm N-acetyl

Nhóm amin

lệ acid sử dụng phải phải đủ lớn để đảm bảo tách hoàn toàn các muối khoáng trong đầu vỏ tôm Thường người ta sử dụng acid HCl để khử khoáng ở nhiệt độ phòng, trong thời thời gian từ 2 – 3h Quá trình tẩy trắng chitin thường sử dụng các chất tẩy trắng như NaOCl, H2O2,… và hầu hềt tiến hành ở nhiệt độ phòng

Quá trình deacetyl chitin thành chitosan có thể được thực hiện bằng dung dịch NaOH hoặc KOH đặc (40% - 50%) và được thực hiện ở nhiệt độ cao từ 80oC - 100oC Chitin và chitosan có thể được thủy phân bằng HCl đậm đặc ở nhiệt độ cao để tạo ra các monome glucosamine Tuy nhiên, quá trình thủy phân chitin hoặc chitosan bằng phương pháp hóa học thường tạo ra các oligose có trọng lượng phân tử không định hướng được và một số lượng lớn các monome Mặt khác, quá trình thủy phân chitin hoặc chitosan bằng phương pháp hóa học có thể tạo ra các hợp chất không mong muốn và nguy cơ ô nhiễm môi trường

Ngoài phương pháp hóa học, người ta cũng có thể sản xuất chitin, chitosan bằng phương pháp sinh học sử dung enzyme hay vi sinh vật Trong sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học

sử dụng enzyme hoặc vi sinh vật để khử protein và khoáng chất ở đầu vỏ tôm, hàm lượng protein còn lại ở chitin thường cao hơn phương pháp hóa học Do vậy người ta có thể kết hợp giữa phương pháp sinh học sử dụng enzyme và phương pháp hóa học để đảm bảo hàm lượng protein còn lại ở chitin thấp Hiện trên thị trường có sẵn một số enzyme protease thương mại có khả năng khử protein ở đầu vỏ tôm như alcalase (EC 3.4.21.62), chymotrypsin (EC 3.4.21.2), papain (EC 4.3.22.2) và bromelain (EC 3.4.22.32) Sau khi thu được chitin, người ta thưởng sử dụng phương pháp hóa học để deacetyl chitin tạo thành chitosan

Từ chitosan thu được, người ta có thể sử dụng enzyme thủy phân liên kết glycosid để thủy phân chitosan thành oligochitosan Người ta cho rằng có một số enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật có khả năng thủy phân chitosan như chitinase, chitosanase, … Theo một số nhà nghiên cứu, phương pháp sử dụng enzyme thủy phân chitosan thành oligochitosan có ưu điểm là hiệu suất thủy phân cao hơn và oligomer thu được có chiều dài mạch lớn hơn phương pháp hóa học Mặc dù, chitosanase vi khuẩn được cho là khá tuyệt vời cho sản xuất oligochitosan, song phương pháp này được coi là quá đắt đối với sản xuất ở quy mô công nghiệp

Hiện nay, người ta có thể chia phương pháp sản xuất oligochitosan từ chitosan thành 3 loại

9

như sau:

- Phân cắt chitosan bằng tác nhân hoá học: acid vô cơ (HCl, H2SO4, H3PO4, HNO2…), acid hữu cơ (CH3COOH, HCOOH…), chất oxi hoá (O3, H2O2…),…

- Phân cắt bằng tác nhân lý học: tia X, ánh sáng, vi sóng hay chiếu xạ gamma, …

- Phân cắt bằng tác nhân sinh học (enzyme): chitosanase, chitinase, cellulase, hemicellulase,…

Trong các phương pháp kể trên, phương pháp sử dụng chiếu xạ gamma để phân cắt chitosan được nhiều nhà khoa học cho rằng có triển vọng lớn do giá thành sản xuất thấp và quan trọng hơn oligomer thu được có kích cỡ và trọng lượng phân tử có thể điều chỉnh được thông qua điều chỉnh liều chiếu xạ

1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG OLIGOCHITOSAN

Oligochitosan là hợp chất có nguồn gốc tự nhiên, không độc hại, là sản phẩm của quá trình thủy phân chitosan nhưng khả năng tan trong nước tốt hơn và có những tính chất sinh học gần giống chitosan như có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, Vì vậy, oligochitosan theo một số nhà khoa học sẽ được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực bảo quản và chế biến thực phẩm Tuy nhiên, hiện các nhà nghiên cứu chủ yếu tập trung vào nghiên cứu ứng dụng chitin, chitosan còn các nghiên cứu ứng dụng oligochitosan chỉ mới được quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây Theo một số tài liệu nghiên cứu được công bố gần đây, oligochitosan có một số tác dụng như: kháng và hạn chế sự phát triển của vi sinh vật, chống oxy hóa, chống phát triển của tế bào ung thư và có một số hoạt tính sinh học khác nữa

Một số nhà nghiên cứu cho rằng có thể thủy phân chitosan thành chitosan oligosaccharide bằng phương pháp hóa học sử dụng acid HCl đậm đặc (oligochitosan) Sản phẩm sản xuất theo quy trình này đạt hiệu suất 70% Các tác giả này bước đầu cũng nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất oligochitosan bằng cách sử dụng enzyme cellulase, hemicellulase, papain để thủy phân chitosan Ngoài ra, một số tác giả còn thử nghiệm sử dụng enzyme cellulase kỹ thuật từ xạ khuẩn

ưa nhiệt để thủy phân chitosan tạo thành oligochitosan với hiệu suất thu oligochitosan từ chitosan

là 52,6% Một số tác giả còn cho rằng sử dụng enzyme hemicellulase thương phẩm để thủy phân chitosan tạo thành oligochitosan có thể thu được 88,9% oligochitosan từ chitosan

Một nghiên cứu cho thấy có thể sử dụng enzyme hemicellulase để thủy phân chitosan thành oligochitosan và điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân chitosan bằng enzyme hemicellulase của nấm mốc: nhiệt độ thích hợp là 37oC, pH thích hợp 5, nồng độ enzyme 2%, thời gian thủy phân 5 giờ Oligochitosan thu được có thể sử dụng trong bảo quản sữa tươi với tỷ lệ sử dụng oligochitosan thích hợp cho bảo quản sữa là 0,2% - 0,3%

Nghiên cứu chế tạo oligochitosan bằng kỹ thuật bức xạ cho thấy khối lượng phân tử chitosan

Một số nghiên cứu sử dụng chitosan oligosaccharide trong bảo quản nông, thủy sản sau thu hoạch:

- Trong bảo quản cá ngân: sử dụng oligochitosan nồng độ 1% có khả năng giữ tươi cá sau 8 giờ ngay cả ở nhiệt độ phòng, nếu kết hợp với bảo quản lạnh ở nhiệt độ 8 – 10oC thì sau 36 giờ,

da cá vẫn còn sáng bóng như tự nhiên, chưa xuất hiện mùi lạ Oligochitosan có tác dụng làm giảm

sự gia tăng hàm lượng NH3 trong cá do oligochitosan có khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật gây thối, ngoài ra, nó còn có tác dụng đáng kể sự giảm lượng vi sinh vật tổng

số trên bề mặt cá

- Trong bảo quản thịt bò, thịt heo tươi: nồng độ oligochitosan tối ưu để giữ tươi thịt là 2%, khi kết hợp giữ tươi thịt ở nhiệt độ thấp (8 – 10oC) thì hiệu quả giữ tươi tăng lên đáng kể, có thể giữ tươi được 5 ngày Ở điều kiện nhiệt độ thường, oligochitosan đã có tác dụng làm giảm 90% vi sinh vật trên bề mặt thịt Nếu dùng oligochitosan 2% kết hợp với sorbitol 2% thì thời gian bảo quản dài hơn, làm giảm trên 95% lượng vi sinh vật tổng số trên bề mặt thịt

- Khi so sánh khả năng bảo quản dứa của chitosan và oligochitosan thì màng bao chitosan

có tác dụng hạn chế sự hao hụt trọng lượng tốt hơn oligochitosan Tuy nhiên khi kết hợp với bảo quản lạnh thì khả năng diệt khuẩn của oligochitosan lại tốt hơn chitosan

Từ các nghiên cứu về chitosan trong nước và trên thế giới cho thấy chitosan có nhiều đặc tính phù hợp cho việc sử dụng trong bảo quản thực phẩm như có nguồn gốc tự nhiên từ vỏ tôm cua nên không độc hại và có tính kháng khuẩn Mức độ kháng khuẩn của chúng phụ thuộc vào cấu trúc và mức độ deacetyl Độ deacetyl càng lớn, cấu trúc mạch nhỏ ở một mức độ nhất định sẽ

có tính kháng khuẩn mạnh hơn và việc ứng dụng trong bảo quản thực phẩm càng có hiệu quả hơn Hiện tại, các nghiên cứu ứng dụng oligochitosan trong bảo quản thực phẩm mới chỉ được bắt đầu nghiên cứu và chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ mặc dù đã có một số nghiên cứu chứng minh oligochitosan có tính kháng khuẩn tốt

11

CHƯƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Đầu vỏ tôm dùng sản xuất oligochitosan

Đối tượng dùng để nghiên cứu sản xuất oligochitosan là phế liệu đầu và vỏ tôm thẻ chân

trắng (Litopenaeus vannamei) thu nhận tại bàn chế biến của Công ty Cổ phần Nha Trang SeaFood

(F17) Từ các phần sau đây của tóm tắt luận án, thuật ngữ “đầu và vỏ tôm thẻ chân trắng” được gọi tắt là “đầu vỏ tôm” cho tiện sử dụng

2.1.2 Tôm bạc biển

Tôm bạc biển (Metapenaeus brevicornis) tươi được thu mua trực tiếp tại ghe đánh bắt tại

Cảng Cá Lương Sơn - Vĩnh Lương - Nha Trang Tôm tươi đạt tiêu chuẩn TCVN 3726-89 và có trọng lượng trung bình 30-40 con/kg

2.1.3 Enzyme protease

* Alcalase (B4882): do hãng Novozyme - Đan Mạch sản xuất và Công ty TNHH Thương

Mại và Dịch vụ Nam Giang - TP Hồ Chí Minh cung cấp Alcalase có hoạt tính 2,4 AU/mg Nhiệt

độ thích hợp của enzyme: 50oC – 60oC, khoảng pH thích hợp 7,5 - 8

* Neutrase (P1236): do hãng Novozyme - Đan Mạch sản xuất và Công ty TNHH Thương

Mại và Dịch vụ Nam Giang - TP Hồ Chí Minh cung cấp Neutrase có hoạt tính 50.000 UI/g Nhiệt

độ thích hợp của enzyme: 45oC – 55oC, khoảng pH thích hợp: 5,5- 7,5

* Flavourzyme 1000MG: do hãng Novozyme - Đan Mạch sản xuất và Công ty TNHH

Thương Mại và Dịch vụ Nam Giang - TP Hồ Chí Minh cung cấp Flavourzyme có hoạt tính 1.000 LAPU/g Nhiệt độ thích hợp khoảng 50oC, khoảng pH thích hợp: 5,0- 7,0

* Enzyme pepsin: Pepsin P7000 do công ty Sigma-Aldrich cung cấp Enzyme này được thu

nhận từ niêm mạc dạ dày lợn, có khoảng pH thích hợp 1,5 ÷4,0; pH tối thích từ 2,0-2,5; khoảng nhiệt độ thích hợp 37 ÷ 42oC

2.1.4 Nguyên vật liệu dùng cho xác định độc tính trên chuột

Chuột thí nghiệm: chuột lang (Cavia porcellus), có trọng lượng trung bình 300-350g: 80

con

2.1.5 Vi khuẩn lactic

Sử dụng 3 chủng vi khuẩn lactic do Bảo tàng giống chuẩn Việt Nam (VTCC) - Đại học Quốc

gia Hà Nội cung cấp: L plantarum (VTCC-B 431), L bulgaricus VTCC 703, L thermophillus

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

12

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm theo sơ đồ nghiên cứu tổng quát sau:

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm trên, tiến hành nghiên cứu xác định từng công đoạn cho quá trình nghiên cứu, chẳng hạn, xác định loại tác nhân sinh học (enzyme protease hay vi khuẩn thích hợp) cho công đoạn khử protein ra khỏi đầu vỏ tôm thẻ chân trắng Từ kết quả lựa chọn tác nhân khử protein sẽ tiến hành tối ưu hóa quá trình khử protein Trên cơ sở đó, sản xuất chitin và nghiên cứu deacetyl để tạo ra chitosan có độ deacetyl cao sử dụng trong quá trình nghiên cứu phân cắt thành oligochitosan bằng công nghệ bức xạ coban 60… Sau khi đánh giá độc tính của oligochitosan,

Nghiên cứu khử protein bằng tác nhân khác nhau

Chọn chế độ khử protein

Nghiên cứu khử protein và khoáng còn lại

Đầu vỏ tôm

Chitin Enzyme protease Vi khuẩn lactic

Nghiên cứu deacetyl chitin Chitosan có độ deacetyl caoNghiên cứu phân cắt chitosan bức xạ Co-60

Oligochitosan Đánh giá chất lượng

và cấu trúcNghiên cứu bảo quản tôm nguyên liệu

Đánh giá độc tính

13

tiến hành thử nghiệm bảo quản tôm bằng chế phẩm oligochitosan đã thu được

2.2.2 Các phương pháp phân tích hóa học

+ Lấy mẫu và xử lý mẫu: theo TCVN 276 - 90

+ Phân tích cảm quan: đánh giá cảm quan nguyên liệu thủy sản bằng phương pháp cho điểm theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3215-79, sử dụng thang điểm 20 để đánh giá cảm quan sản phẩm + Xác định hàm ẩm: bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo phương pháp sấy ở 105oC của AOAC, 1990

+ Xác định hàm lượng tro tổng số: bằng phương pháp nung ở 550oC của AOAC, 1990 + Xác định hàm lượng NH3: bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

+ Định lượng nitơ tổng số: bằng phương pháp Kjeldal theo tiêu chuẩn TCVN 3705-90 + Định lượng lipid: bằng phương pháp Soclext theo tiêu chuẩn TCVN 3703-90

+ Xác định hàm lượng protein hòa tan theo phương pháp Microbiuret (Hein và cộng sự, 2004)

+ Xác định hoạt độ của enzyme protease: theo phương pháp Anson cải tiến

+ Xác định độ nhớt bằng nhớt kế Ubbelohde theo phương pháp của Roberts và Domszy,

1982

+ Xác định độ hòa tan chitosan theo phương pháp của Kofuji, 2005

+ Xác định khả năng hút nước của chitosan theo phương pháp của No và cộng sự, 2000 + Xác định biến đổi cấu trúc oligochitosan bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân + Xác định hàm lượng chất không tan

Nguyên lý: hòa tan oligochitin/oligochitosan vào trong nước hoặc dung dịch đệm, sau một thời gian nhất định tiến hành lọc dung dịch, sau đó thu giấy lọc và bã, sấy khô, cân giấy lọc và bã không tan còn lại

+ Xác định độ deacetyl của chitosan bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại IR

+ Xác định khối lượng phân tử của chitosan bằng phương pháp sắc ký

+ Cắt mạch chitosan bằng cách sử dụng nguồn bức xạ gamma phát ra từ đồng vị Co-60

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn

* Phương pháp thu sinh khối vi khuẩn lactic

Các chủng vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431, L bulgaricus VTCC 703, L thermophillus

do bảo tàng giống chuẩn Việt Nam (VTCC) - Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp Các chủng vi khuẩn bảo quản ở dạng đông sâu ở - 69oC Trước khi sử dụng, được hoạt hóa và nhân giống trên

môi trường dinh dưỡng MRS

14

2.2.4 Các phương pháp phân tích vi sinh vật

+ Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí: theo tiêu chuẩn ISO 6887-1 (9/1999)

+ Xác định Coliforms: theo tiêu chuẩn ISO 4831 (8/2006)

+ Xác định E.coli: theo tiêu chuẩn ISO 7251 (7/2005)

+ Xác định Staphylococcus aureus: theo tiêu chuẩn ISO 6888-1 (1/2004)

+ Xác định Salmonella: theo tiêu chuẩn ISO 6579 (2/2006)

+ Xác định tổng số nấm men và nấm mốc: theo tiêu chuẩn ISO 7954 (8/1988)

+ Xác định Clostridium perfringens: theo tiêu chuẩn ISO 7937 (2/2005)

2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

Theo phương pháp thống kê Mỗi thí nghiệm đều tiến hành 3 lần, mỗi lần 3 mẫu và kết quả

là trung bình cộng của các lần thí nghiệm Tính toán và vẽ đồ thị bằng phần mềm Microsoft office excel 2007, xử lý kết quả theo thống kê kiểm định so sánh các giá trị trung bình giữa các nhóm bằng phần mềm SPSS (version 16), phân tích phương sai ANOVA Phân tích dữ liệu và tiên đoán

bề mặt đáp ứng bằng phần mềm Design Expert 8 trial

Bảng 3.1 Thành phần hoá học cơ bản của đầu vỏ tôm thẻ chân trắng

2 Hàm lượng khoáng tổng số (% theo trọng lượng chất khô) 25,2±0,6

3 Hàm lượng chitin (% theo trọng lượng chất khô) 17,9±0,5

4 Hàm lượng protein (% theo trọng lượng chất khô) 48,6±1,3

5 Hàm lượng lipid (% theo trọng lượng chất khô) 5,8±0,3

6 Hàm lượng astaxanthin (mg/kg, theo trọng lượng chất khô) 146 ± 6,2

3.2 NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỂ KHỬ PROTEIN VÀ CÁC TẠP CHẤT CÓ TRONG ĐẦU VỎ TÔM TRONG SẢN XUẤT CHITIN

3.2.1 Nghiên cứu sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng enzyme protease

3.2.1.1 Nghiên cứu lựa chọn enzyme protease

3.2.1.1.1 Ảnh hưởng của loại và tỷ lệ enzyme protease đến hiệu suất khử protein

Kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme flavourzyme có hiệu suất tách protein cao nhất đạt 71,3 ÷ 84,6%, enzyme alcalase và neutrase có hiệu suất tách protein tương đương nhau là 64,3 ÷ 77,5 và 65,8 ÷ 78,3 Enzyme pepsin có hiệu suất khử protein thấp nhất và hiệu suất khử protein của enzyem này nằm trong khoảng 36,9 ÷ 38,4% Tỷ lệ enzyme so với nguyên liệu thích hợp để khử protein ra khỏi đầu vỏ tôm thẻ là 0,08%

3.2.1.1.2 Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất khử protein đầu vỏ tôm bằng enzyme protease

Kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy, nếu tính theo mức độ giảm dần của hoạt tính khử protein ra khỏi đầu vỏ tôm tại các pH thích hợp của enzyme thì thứ tự enzyme được sắp xếp như sau: flavourzyme, neutrase, alcalase, pepsin và pH thích hợp cho từng enzyme như sau: 7÷7,5; 7,5÷8; 7,5÷8; 2÷2,5

2, thời gian 12h

3.2.1.1.5 Đánh giá chitin thô sản xuất theo phương pháp sử dụng enzyme protease khử protein đầu vỏ tôm

Kết quả sử dụng enzyme protease khử protein đầu vỏ tôm được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Các chỉ tiêu chất lượng của chitin từ quy trình hoá học và quy trình sử

dụng enzyme protease để khử protein Chỉ tiêu Enzyme protease sử dụng khử protein đầu vỏ tôm

Alcalase Flavourzyme Neutrase Pepsin

Màu sắc Trắng hơi có mầu

hồng nhạt

Trắng hơi có mầu hồng nhạt

Trắng hơi có mầu hồng nhạt

Trắng hơi có mầu hồng nhạt Trạng thái Dạng vảy Dạng vảy Dạng vảy Dạng vẩy Tro (%) 13,65±0,36 6,29±0,26 9,00±0,12 15,00±0,36

Độ ẩm (%) 14,80±1,70 12,60±2,80 13,70±1,90 14,90±2,20 Hàm lượng

protein (%)

10,98±0,22 4,16±0,25 7,12±0,26 13,18±0,28

Kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme flavourzyme có khả năng khử protein tốt nhất trong số các enzyme đã sử dụng nhưng hàm lượng protein còn lại ở đầu vỏ tôm vẫn còn tới 4,16% Vì vậy vẫn cần tiếp tục khử tiếp protein còn lại ở chitin thô bằng NaOH loãng và khử khoáng chất bằng HCl loãng

Từ các nghiên cứu ở trên cho thấy enzyme flavourzyme có hiệu suất khử protein cao hơn các enzyme khác đã thử nghiệm Do vậy, luận án lựa chọn enzyme flavourzyme để khử protein ra khỏi đầu vỏ tôm

17

3.2.1.2 Nghiên cứu khử protein còn lại ở đầu vỏ tôm bằng NaOH loãng và khử khoáng bằng HCl loãng

3.2.1.2.1 Nghiên cứu khử protein còn lại ở đầu vỏ tôm bằng NaOH loãng

Kết quả nghiên cứu cho thấy có thể sử dụng xút 2% hoặc xút 3% để khử protein còn lại ở đầu vỏ tôm Nếu sử dụng xút 2% thì thời gian khử protein còn lại là 12 giờ và nếu dùng xút 3% thì thời gian khử là 10 giờ

3.2.1.2.2 Nghiên cứu khử khoáng còn lại ở đầu vỏ tôm bằng HCl loãng

Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ acid HCl sử dụng khử khoáng còn lại ở chitin thô là 3%, trong thời gian xử lý là 10 giờ

3.2.1.3 Đề xuất quy trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng enzyme flavourzyme khử protein

Từ các nghiên cứu đã làm, cho phép đề xuất quy trình sản xuất chitin từ phế liệu đầu vỏ tôm theo phương pháp sử dụng enzyme flavourzyme khử protein trình bày ở hình 3.1

* Thuyết minh quy trình

Hình 3.1 Sơ đồ qui trình sản xuất chitin từ phế liệu tôm bằng phương pháp sử dụng

enzym flavourzyme

Đầu vỏ tôm tôm thẻ Xay nhỏ 0,5 - 0,6cm

Khử protein

Khử protein còn lại bằng NaOH 2%, 12h, to phòng

pH: 7,5 Thời gian: 8h Dịch protein

Khử khoáng còn lại bằng HCl 3%, 10h, to phòng Thu hồi protein