Mục đích cơ bản của luận án này là khảo sát một số đặc điểm mô bệnh học, lâm sàng trong carcinôm tuyến đại - trực tràng. Xác định tỉ lệ đột biến KRAS, NRAS,BRAF, PIK3CA, mất biểu hiện protein PTEN và mối liên quan với một số đặc điểm mô bệnh học, lâm sàng trong carcinôm tuyến đại - trực tràng.
Trang 1ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN HỒNG PHONG
NGHIÊN CỨU TỶ LỆ CÁC BIẾN ĐỔI PHÂN TỬ
KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA VÀ PTEN
TRONG CARCINÔM TUYẾN ĐẠI - TRỰC TRÀNG
Chuyên ngành: Giải phẫu bệnh và pháp y
Mã số: 62720105
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
TP Hồ Chí Minh - Năm 2017
Trang 2ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Người hướng dẫn khoa học:
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường
Họp tại ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Vào hồi: giờ ngày tháng năm
Có thể tìm luận án tại:
1 Thư viện quốc gia Việt Nam
2 Thư viện khoa học tổng hợp TP.HCM
3 Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM
Trang 3GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1.ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo GLOBOCAN 2012, ung thư đại - trực tràng (UTĐTT) là một trong năm loại ung thư thường gặp ở cả hai giới trên toàn cầu và đứng hàng thứ 5 trong số các nguyên nhân tử vong do ung thư Nhiều nghiên cứu đã chứng minh đột biến tăng chức năng một trong
các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA hoặc mất biểu hiện protein
PTEN sẽ gây kháng thuốc cetuximab và panitumumab trong UTĐTT
di căn Ngoài ra, UTĐTT có đột biến PIK3CA là một yếu tố thuận lợi
cho việc điều trị hỗ trợ bằng aspirin, giúp giảm tỉ lệ tái phát cho bệnh nhân Bên cạnh đó, các nghiên cứu đã cho thấy đột biến tăng chức
năng các gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA và mất biểu hiện PTEN
là các yếu tố tiên lượng xấu trong ung thư đại - trực tràng Cho đến hiện tại, chỉ có nghiên cứu của Hoàng Anh Vũ xác định đột biến
KRAS trong carcinôm tuyến đại - trực tràng dựa trên kỹ thuật giải
trình tự gen trực tiếp của Sanger, là tiêu chuẩn vàng trong xác định đột biến gen và có thể phát hiện tất cả các đột biến mới Chưa có nghiên cứu nào được công bố ở Việt Nam về đặc điểm đột biến gen
NRAS, BRAF, PIK3CA và biểu hiện protein PTENtrong carcinôm
tuyến đại - trực tràng Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu
tỉ lệ các biến đổi phân tử KRAS, NRAS, BRAF,PIK3CA và PTEN
trong carcinôm tuyến đại - trực tràng” với hai mục tiêu sau:
- Khảo sát một số đặc điểm mô bệnh học, lâm sàng trong carcinôm tuyến đại - trực tràng
- Xác định tỉ lệ đột biến KRAS, NRAS,BRAF, PIK3CA, mất biểu hiện
protein PTEN và mối liên quan với một số đặc điểm mô bệnh học, lâm sàng trong carcinôm tuyến đại - trực tràng
2 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
UTĐTT là loại ung thư có xuất độ mắc và tử vong cao trên thế giới, trong đó có Việt Nam Kết quả điều trị chưa cao khi bệnh ở giai đoạn tiến xa Nhưng từ khi thuốc nhắm trúng đích EGFR ra đời, kết quả điều trị cho nhóm bệnh nhân này đã được cải thiện Biến đổi các
Trang 4gen KRAS, NRAS, BRAF,PIK3CA và protein PTEN đã được chứng
minh có giá trị tiên đoán đáp ứng với thuốc nhắm trúng đích EGFR, cũng như có giá trị tiên lượng bệnh UTĐTT
Tại Việt Nam, dữ liệu về đột biến các gen KRAS chưa nhiều và chưa có nghiên cứu về NRAS, BRAF, PIK3CA và biểu hiện protein
PTEN trên carcinôm tuyến đại trực tràng Đề tài nghiên cứu này góp
phần xác định tỉ lệ và kiểu đột biến 4 gen KRAS, NRAS, BRAF,
PIK3CA và tỉ lệ mất biểu hiện protein PTEN nhằm giúp ích trong
đánh giá đáp ứng điều trị nhắm trúng đích và tiên lượng cho bệnh nhân ung thư đại - trực tràng Việt Nam
3 Ý NGHĨA THỰC TIỄN VÀ ĐÓNG GÓP MỚI
3.1 Bằng phương pháp hóa mô miễn dịch ghi nhận: tỉ lệ mất biểu hiện protein PTEN là 14% Có liên quan có ý nghĩa thống kê giữa tình trạng mất biểu hiện PTEN với tình trạng di căn hạch vùng và di căn xa
3.2 Bằng phương pháp giải trình tự gen trực tiếp của Sanger ghi nhận:
- Tỉ lệ đột biến KRAS là 34% Tất cả đều là đột biến điểm
- Vị trí đột biến thường gặp nhất là codon 12 (73,7%), tiếp theo là codon 13 (21%) và 1 trường hợp đột biến hiếm gặp ở codon 10 (5,3%)
- Có 6 loại đột biến bao gồm 5 loại đột biến thường gặp: Gly12Asp, Gly12Ser, Gly12Val, Gly13Asp, Gly13Ser và 1 loại hiếm gặp: Gly10Glu
- Loại đột biến thường gặp nhất là Gly12Asp và Gly12Val (26,32%) tiếp theo là Gly12Ser (21,05%)
- Đột biến gen BRAF: 1 trường hợp đột biến ở codon 601 là Lys601Glu (K601E) Tỉ lệ đột biến BRAF là 2%
- Đột biến gen PIK3CA: tỉ lệ đột biến PIK3CA là 3/50 (6%) Với các
loại đột biến là Met1055Ile, Trp1057X và Glu545Ala
- Tỉ lệ đột biến KRAS ở trực tràng (48%) cao hơn ở đại tràng (17%)
Tỉ lệ đột biến KRAS ở nhóm pT1/2 (67%) cao hơn ở nhóm pT3/4
(27%)
Trang 5- Tỉ lệ đột biến PIK3CA ở nhóm <50 tuổi cao hơn ≥50 tuổi
- Có 26/50 (52%) bệnh nhân carcinôm tuyến đại - trực tràng có ít nhất một yếu tố tiên đoán đáp ứng kém với kháng thể đơn dòng
kháng EGFR như: có đột biến KRAS; BRAF; PIK3CA; mất biểu hiện protein PTEN
4 CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN
Luận án dài 122 trang, bao gồm: đặt vấn đề - mục tiêu nghiên cứu 3 trang, tổng quan tài liệu 37 trang, đối tượng và phương pháp nghiên cứu 10 trang, kết quả nghiên cứu 27 trang, bàn luận 42 trang, kết luận 2 trang và kiến nghị 1 trang Có 192 tài liệu tham khảo với 7 tài liệu tiếng Việt, 185 tài liệu tiếng Anh Ngoài ra còn có 30 bảng,
24 biểu đồ, 2 sơ đồ và 28 hình ảnh minh họa
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về một số gen, protein liên quan đường truyền tín hiệu hạ nguồn EGFR
1.1.1 Giới thiệu chung về đường truyền tín hiệu EGFR
EGFR là một thành viên trong gia đình Her Bốn đường truyền tín hiệu chính trong tế bào được kích hoạt bởi EGFR là lộ trình RAS/RAF/MEK/MAPK; lộ trình PI3K/PTEN/AKT; lộ trình phospholipase C và lộ trình JAK/STAT Bốn lộ trình tín hiệu này dẫn đến các đáp ứng của tế bào như tăng sinh, tăng trưởng, di cư, biệt hóa, và chết tế bào theo lập trình Do vậy, lộ trình tín hiệu khởi nguồn từ EGFR có vai trò quan trọng trong cơ chế sinh ung thư, trong đó có ung thư đại - trực tràng
1.1.2 KRAS và NRAS
Gen KRAS nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 12, vị trí
12.1, bao gồm 46.148 cặp base với 6 exon Nó có liên quan đến lộ trình truyền tín hiệu MAPK và PI3K/Akt Tính hiệu từ lộ trình MAPK rất cần thiết để duy trì các quá trình sinh lý bình thường bao gồm tăng sinh và biệt hóa tế bào
Trang 6Gen NRAS là một thành viên của gia đình gen RAS, nằm trên
nhiễm sắc thể 1 vị trí 1p13.2, gồm có bảy exons Protein NRAS cũng tham gia vào lộ trình RAS/RAF/MEK/MAPK tương tự như KRAS
1.1.3 BRAF
Gen BRAF nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 7 ở vị trí
34 (7q34), gồm 18 exon, với 190284 cặp base.Sau khi RAS gắn GTP (RAS ở trạng thái hoạt hóa) sẽ gắn với vùng RBD trên protein BRAFđể đưa BRAF về trạng thái hoạt hóa và thực hiện vai trò kích hoạt các protein chức năng khác như: MEK, Cyclin D1, D2 và D3 (thúc đẩy phân bào), VEGF (sinh mạch), c-myc (mất nhạy cảm với các tín hiệu chống tăng trưởng), b3-integrin (xâm lấn và di căn) và mdm2 (tránh apoptosis, tiềm năng nhân lên vô hạn và sự sinh mạch)
1.1.4 PIK3CA
Gen PIK3CA nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 3 vị trí
3q26.32, bao gồm 21 exon Sau khi nhị trùng EGFR sẽ làm hoạt hóa tyrosine kinase nhằm kích hoạt p85 gắn kết với PIK3CA để tạo nên phức hợp PI3K hoạt động PIK3CA trong PI3K có chức năng của một kinase với vai trò chính là kích hoạt các phân tử khác ở hạ nguồn dòng tín hiệu như PDK1/Akt Các kinase này đến lượt chúng lại kích hoạt hoặc ức chế các protein khác như: PKC, PKN, BRCA1, CREB, p21, p27…, thực hiện chức năng tế bào như chuyển hóa, sinh tồn, tăng sinh, tăng trưởng, chết tế bào theo lập trình,…
1.1.5 Protein PTEN
Protein PTEN có tên đầy đủ là Phosphatase and
tensinhomolog, được mã hóa bởi gen PTEN nằm trên nhánh dài
nhiễm sắc thể số 10 tại vị trí 10q23.31.PTEN hoạt động như một protein phosphatase kép đặc biệt, khử gốc phosphate của các protein
đã được phosphoryl hóa như tyrosine, serine và threonine Đồng thời
nó cũng hoạt động như một lipid phosphatase, loại bỏ gốc phosphate
ở vị trí D3 của vòng inositol của PIP3 nhằm đối kháng đường truyền tín hiệu PI3K-Akt bởi sự khử gốc phosphate của PIP3 trở thành PIP2 Như vậy, nó có vai trò điều hòa âm tính đường truyền tín hiệu PI3K/Akt và qua đó điều chỉnh chu kỳ tế bào, sinh mạch và sự sinh
Trang 7tồn tế bào Do đặc điểm chức năng chuyên biệt như vậy nên gen
PTEN được xem như là một gen đè nén u
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu: 50 trường hợp ung thư đại - trực tràng có
kết quả giải phẫu bệnh là carcinôm tuyến được chẩn đoán và điều trị phẫu thuật tại Bệnh viện Ung bướu Thành phố Cần Thơ từ tháng 01/2011-12/2014
2.1.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu: Có bệnh phẩm phẫu thuật của mô u
nguyên phát
2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ:
- Bệnh nhân có 2 ung thư
- Bệnh nhân có tiền sử xạ trị vùng bụng bất kể vì nguyên nhân gì
- Bệnh nhân có tiền sử hóa trị
- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu
2.1.3 Cỡ mẫu và cách chọn mẫu: 50 trường hợp carcinôm tuyến đại
- trực tràng được chọn mẫu hàng loạt ca thỏa điều kiện chọn mẫu
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: cắt ngang mô tả loạt ca
2.2.2 Cách tiến hành:
* Ghi nhận thông tin lâm sàng của các đối tượng nghiên cứu: tuổi, giới, vị trí u
* Bệnh phẩm phẫu thuật được cố định trong formol đệm trung tính
10%, xử lý theo qui trình thường quy, nhuộm HE, đọc kết quả và ghi nhận thông tin giải phẫu bệnh: loại mô học, độ mô học, pT, pN, giai đoạn TNM theo WHO 2010
* Thực hiện nhuộm hóa mô miễn dịch với dấu ấn PTEN trên block bệnh phẩm u vùi nến bằng máy nhuộm hóa mô miễn dịch tự động IntelliPATH FLX của hãng Biocare Sử dụng kháng thể đơn dòng PTEN (clone 6H2.1) của hãng Biocare, Mỹ.Chứng dương là tế bào
Trang 8nội mô mạch máu hoặc các tế bào sợi bình thường (nội chứng) Chứng âm: không phủ kháng thể thứ nhất
Đánhh giá biểu hiện protein PTEN bằng hóa mô miễn dịch:
- Âm tính: không bắt màu trong bào tương các tế bào u hoặc bắt màu
nhạt hơn tế bào mô đệm <30% tế bào u vùng xâm lấn
- Dương tính + : >30% tế bào u bắt màu trong bào tương với cường
độ bắt màu nhạt hơn tế bào mô đệm
- Dương tính ++: > 30% tế bào u bắt màu trong bào tương với cường
độ tương đương hoặc đậm hơn tế bào mô đệm
Kết quả âm tính được xem là mất biểu hiện protein PTEN
* Thực hiện giải trình tự cả 4 gen KRAS, NRAS, BRAF và PIK3CA
bằng phương pháp giải trình tự gen trực tiếp của Sanger cho tất cả 50 trường hợp tại Trung tâm Y Sinh học phân tử - Đại học Y Dược TP
Hồ Chí Minh
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Biểu hiện protein PTEN
Có 7/50 trường hợp (14%) mất biểu hiện protein PTEN
Bảng 3.1-3.8: Liên quan giữa tình trạng mất biểu hiện PTEN với
đặc điểm mô bệnh học – lâm sàng Đặc điểm
Biểu hiện PTEN
p Mất biểu hiện
PTEN
Có biểu hiện PTEN Tuổi
Trang 9Đặc điểm
Biểu hiện PTEN
p Mất biểu hiện
PTEN
Có biểu hiện PTEN
Trang 103.2 Đặc điểm đột biến KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA
3.2.1 Đột biến gen KRAS
Trong 50 trường hợp, chúng tôi phát hiện 17 trường hợp có đột biến, tỉ lệ đột biến là 34% Tất cả trường hợp đều là đột biến điểm Đột biến chủ yếu xảy ra ở codon 12 chiếm 70,5%, tiếp theo là codon 13 chiếm 17,7%, còn lại 1 trường hợp đột biến ở codon 10 (5,9%) và 1 trường hợp đột biến ở cả 2 codon 12 và 13 (5,9%)
Các kiểu đột biến KRAS có tần suất cao nhất bao gồm:
Gly12Val, Gly12Asp, Gly12Ser (Hình 3.9, 3.10, 3.11) với số lượng
lần lượt là 4, 4 và 3 trường hợp Các trường hợp đột biến KRAS ở
codon 13 là: Gly13Asp (2 trường hợp) và Gly13Ser (1 trường hợp)
Có 2 trường hợp có đồng thời 2 đột biến điểm KRAS bao gồm: 1
trường hợp có 2 đột biến ở codon 12 là Gly12Asp và Gly12Val (Hình 3.14); 1 trường hợp có đột biến cùng lúc ở codon 12 và codon
13 là Gly12Ser và Gly13Asp (Hình 3.15) Có 1 trường hợp đột biến
KRAS kiểu Gly10Glu (Hình 3.16) là đột biến hiếm gặp
Trang 11Hình 3.11 Đột biến KRAS kiểu Gly12Ser (A11-2283)
Hình 3.14 Đột biến KRAS kiểu Gly12Val - Gly12Asp (A13-1873)
Hình 3.15 Đột biến KRAS kiểu Gly12Ser - Gly13Asp (A13-5160)
3.2.2 Đột biến gen NRAS: Khảo sát NRAS trên cả exon 2 và exon 3
cho toàn bộ 50 trường hợp carcinôm tuyến đại – trực tràng Chúng
tôi chưa ghi nhận trường hợp đột biến NRAS nào
3.2.3 Đột biến gen BRAF
Chúng tôi chỉ ghi nhận được 1/50 trường hợp có đột biến gen
BRAFkiểu Lys601Glu (K601E) (Hình 3.17)
Đây là một đột biến điểm ít gặp ở gen BRAF Trường hợp này là
bệnh nhân nam, 51 tuổi, u ở đại tràng sigma, loại mô học là carcinôm
tuyến không chế nhầy, độ mô học 3, giai đoạn IIIB và ba gen KRAS,
NRAS, PIK3CA không đột biến
Trang 12Hình 3.17 Đột biến ở codon 601: Lys601Glu (K601E) (A13-4920) 3.2.4 Đột biến gen PIK3CA
Chúng tôi ghi nhận được 3/50 trường hợp có đột biến
PIK3CA; trong đó có 2 trường hợp ở exon 20 (4%) và 1 trường hợp
đột biến ở exon 9 (2%) Với các kiểu đột biến lần lượt là Met1055Ile (Hình 3.18), Glu545Ala (Hình 3.19) và Trp1057X
Trang 133.2.5 Liên quan giữa đột biến KRAS và PIK3CA với đặc điểm mô bệnh
học, lâm sàng
Bảng 3.10-3.13 Liên quan giữa đột biến KRASvới đặc điểm mô
bệnh học, lâm sàng
Giai đoạn I/II, n (%)
Giai đoạn III/IV,n (%)
Trang 14Bảng 3 14, 3.15: Liên quan giữa đột biến PIK3CA với đặc điểm mô
bệnh học, lâm sàng Đặc điểm
Giai đoạn I/II, n (%)
Giai đoạn III/IV,n (%)
26 (93)
21 (95)
2 (7)1(5)
0,648
Trang 153.2.6 Liên quan giữa đột biến KRAS, BRAF, PIK3CA và mất biểu
hiện protein PTEN
Qua nghiên cứu 50 trường hợp UTĐTT, đột biến ở các gen
KRAS, BFAF, PIK3CA không xãy ra đồng thời Có 1 trường hợp vừa
đột biến KRAS vừa có mất biểu hiện PTEN Đây là trường hợp bệnh
nhân nam 28 tuổi, u ở trực tràng, giai đoạn IVA (di căn gan), đột
biến KRAS kiểu G12V và các gen NRAS, BRAF, PIK3CA không đột
biến
CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 4.1 Biểu hiện của protein PTEN và mối liên quan với đặc điểm
mô bệnh học, lâm sàng
Nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận có 7/50 (14%) trường hợp mất biểu hiện PTEN trong bào tương của tế bào u xâm nhập.Nghiên cứu của Eklof ghi nhận tỉ lệ mất biểu hiện protein PTEN là 12,5% khá thấp so với nghiên cứu của Naguib (30%), Loupakis (42%) Hiện tại, ở Việt Nam chưa có cơ sở nào thực hiện nhuộm hóa mô miễn dịch để đánh giá biểu hiện protein PTEN trong ung thư đại – trực tràng Mặt khác, chưa có một tiêu chuẩn quốc tế thống nhất về phương pháp nhuộm và đánh giá kết quả hóa mô miễn dịch biểu hiện protein PTEN trong UTĐTT Chúng tôi nhận thấy đây là một vấn đề cần được thống nhất và đồng thuận trong thời gian tới
Giá trị trong tiên đoán đáp ứng với điều trị bằng kháng thể đơn dòng kháng EGFR cho bệnh nhân ung thư đại – trực tràng di căn đã được nhiều nghiên cứu chứng minh Loupakis ghi nhận tỉ lệ đáp ứng với trong nhóm mất biểu hiện PTEN chỉ 5%, trong khi tỉ lệ đáp ứng đến 33% trong nhóm có biểu hiện PTEN Ngoài giá trị tiên đoán đáp ứng với điều trị nhắm trúng đích phân tử EGFR, PTEN cũng có giá trị trong tiên lượng bệnh về tái phát tại chỗ và sống còn của bệnh nhân UTĐTT Qua phân tích đa biến, Colakoglu ghi nhận mất biểu hiện PTEN là một yếu tố tiên lượng độc lập với tái phát tại chỗ Nghiên cứu của Loupakis cho thấy nhóm bệnh nhân mất biểu hiện