Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương

Mục tiêu của luận án là phát hiện đặc điểm đột biến gen β globin trên bệnh nhân β thalassemia và người mang đột biến dị hợp tử bằng các kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR, ARMSPCR và giải trình tự gen Sanger;...

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LÝ THỊ THANH HÀ

LÝ THỊ THANH HÀ

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN  GLOBIN VÀ CHẨN ĐOÁN

TRƯỚC SINH BỆNH  THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN

NHI TRUNG ƯƠNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2018

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

L LÝ THỊ THANH HÀ THANH HÀ

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN  GLOBIN VÀ CHẨN ĐOÁN

TRƯỚC SINH BỆNH  THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN

NHI TRUNG ƯƠNG

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 9 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Trần Vân Khánh

Trường Đại học Y Hà Nội

2 GS.TS Trương Nam Hải

Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội - 2018

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này tôi đã nhận được sự hỗ trợ, tạo điều kiện của rất nhiều người đã thông cảm, sẻ chia, động viên và giúp đỡ tôi Tôi xin được trân trọng cảm ơn và luôn luôn ghi nhớ!

Tôi vô cùng biết ơn PGS TS Trần Vân Khánh, Phó giám đốc Trung tâm gen

và protein, Trường đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và góp ý tận tình cho tôi trong quá trình thực hiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn GS.TS Trương Nam Hải, Viện Công nghệ sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong thời gian qua.

Tôi xin được cảm ơn các vị lãnh đạo Bệnh viện Nhi Trung Ương và Khoa Di truyền và Sinh học phân tử, đã tạo điều kiện giúp đỡ trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể Phòng công nghệ gen Viện nghiên cứu tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec đã giúp đỡ trong những chặng đường đã qua Tôi thực sự xúc động và tự hào bởi sự hỗ trợ nhiệt tình, sự động viên, chia sẻ của các các đồng nghiệp tại nơi đây tôi đang công tác, đã giúp tôi hoàn thành nhiệm vụ và nghiên cứu này!

Bố, mẹ là những người đã mang tôi đến với cuộc sống;chồng và các con của tôi đã luôn động viên và yêu thương vô bờ bến! Tôi xin được chia sẻ thành quả này với bố, mẹ và gia đình tôi Họ là động lực để tôi luôn luôn cố gắng không ngừng

Hà Nội, ngày 1 tháng 2 năm 2018

Tác giả

Lý Thị Thanh Hà

sLỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày 1 tháng 2 năm 2018

Tác giả

Lý T Lý Thị Thanh Hà

hị Thanh Hà

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Cấu trúc và các dạng phân tử Hemoglobin 4

1.1.1 Cấu trúc phân tử Hb ở người bình thường 4

1.1.2 Các dạng phân tử hemoglobin 5

1.2 Bệnh  thalassemia 6

1.2.1 Khái niệm 6

1.2.2 Dịch tễ học bệnh  thalassemia 6

1.2.3 Cơ chế bệnh sinh 6

1.2.4 Đặc điểm lâm sàng bệnh β thalassemia 9

1.2.5 Đặc điểm cận lâm sàng bệnh  thalassemia 10

1.2.6 Chẩn đoán bệnh  thalassemia 10

1.3 Đột biến gen  globin 11

1.3.1 Cấu trúc gen  globin 11

1.3.2 Các dạng đột biến trên gen  globin và một vài cơ chế đột biến trong tổng hợp chuỗi  globin 13

1.3.3 Tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình 15

1.3.4 Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định các đột biến gen β globin 16

1.3.5 Phát hiện người lành mang gen bệnh 22

1.4 Chẩn đoán trước sinh bệnh  thalassemia 23

1.4.1 Dịch nước ối (Amniotic fluid sampling) 24

1.4.2 Mẫu gai rau (Chorionic villus sampling - CVS) 24

1.4.3 Chẩn đoán tiền phôi (Pre-implantation genetic diagnosis - PGD) 26

1.5 Tình hình nghiên cứu bệnh  thalassemia tại Việt Nam 26

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 28

2.2 Đối tượng nghiên cứu 28

2.2.1 Nhóm bệnh nhân bị bệnh  thalassemia thể nặng 28

2.2.2 Nhóm người mang gen bệnh  thalassemia 28

2.2.3 Nhóm làm chẩn đoán trước sinh 29

2.3 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 29

2.4 Trang thiết bị cần thiết 29

2.4.1 Trang thiết bị 29

2.4.2 Hóa chất 29

2.5 Phương pháp nghiên cứu 32

2.6 Quy trình xác định đột biến gen  globin 32

2.6.1 Thu thập mẫu máu và tách DNA từ mẫu máu ngoại vi 32

2.6.2 Kỹ thuật tách DNA tổng số từ máu ngoại vi và tế bào ối 33

2.6.3 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 33

2.6.4 Kỹ thuật PCR xác định đột biến trên gen β globin 34

2.6.5 Kỹ thuật giải trình tự gen xác định đột biến trên gen β globin 36

2.6.6 Kỹ thuật Gap PCR 37

2.6.7 Nuôi cấy tế bào ối 37

2.7 Vấn đề đạo đức 38

2.8 Sơ đồ nghiên cứu 39

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 40

3.1 Đặc điểm của nhóm nghiên cứu 40

3.2 Kết quả xác định đột biến gen β globin 40

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA 40

3.2.2 Kết quả xác định đột biến của bệnh nhân mắc  thalassemia thể nặng 48

3.2.3 Kết quả xác định đột biến gen β globin ở người mang gen bệnh  thalassemia 67

3.2.4 Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia 81

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 88

4.1 Vai trò của kỹ thuật Multiplex ARMS PCR, giải trình tự gen và Gap PCR trong chẩn đoán xác định bệnh  thalassemia 88

4.1.1 Kỹ thuật Multiplex ARMS PCR 88

4.1.2 Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger 90

4.1.3 Kỹ thuật Gap PCR 91

4.2 Đặc điểm và tỷ lệ các đột biến các đột biến gen  globin trên nhân  thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương 91

4.2.1 09 đột biến sàng lọc bằng kỹ thuật Multiplex PCR 91

4.2.2 Đặc điểm và tỷ lệ đột biến gen β globin trên bệnh nhân  thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương 92

4.2.3 Một số ca không điển hình có lâm sàng đặc biệt 93

4.3 Đặc điểm và tỷ lệ các đột biến gen  globin trên người mang gen  thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương 97

4.4 Chẩn đoán trước sinh bệnh  thalassemia 100

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 103

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 104

TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 105

TÀI LIỆU THAM KHẢO 116 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PCR Polymerase Chain Reaction, phản ứng đồng trùng hợp C-ARMS-PCR Combine-Amplification Refractory Mutation System-PCR,

RT-PCR Reverse transcrip PCR

MLPA Multiplex ligation dependent probe amplification

Sequencing Giải trình tự gen

Multiplex Phản ứng đa mồi

ASO Allele specific oligonucleotide dot blot, lai đặc hiệu oligo RDB Reserve dot blot, lai ngược

RE - PCR Restriction enzyme – PCR, phản ứng PCR sử dụng enzyme

HPFH Hội chứng tồn dư huyết sắc tố bào thai di truyền

HPLC Điện di hemogobin bằng sắc ký lỏng cao áp

/ Người mang gen  kết hợp mang gen  thalassemia

/E Người mang gen  kết hợp mang gen HbE

RBC (1012/L) Red Blood Cells, số lượng hồng cầu

HGB (g/dL) Khối lượng hemoglobin (g/dL)

MCV (fL) Mean Corpuscular Volume, thể tích trung bình hồng cầu MCH (pg) Mean Corpuscular Hemoglobin, số lượng hemoglobin trung

bình hồng cầu (pg) MCHC (%) Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration, nồng độ

hemoglobin trung bình hồng cầu (%) cffDNA Cell free fetal DNA, ADN tự do của thai nhi

NIPD Non invasive Prenatal Diagnosis, chẩn đoán trước sinh

không xâm lấn

PGD Pre-implantation genetic diagnosis, chẩn đoán tiền làm tổ IVF In vitro fertilization, thụ tinh ống nghiệm

EQA External Quality Assessment, tổ chức ngoại kiểm

WHO World Health Organization, tổ chức y tế thế giới

TIF Thalassemia International Fondation, Hiệp hội Thalassemia

quốc tế

BV Nhi TƯ Bệnh Viện Nhi Trung Ương

DT-SHPT Khoa Di truyền - Sinh Học Phân Tử

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần globin của các Hb bình thường 5

Bảng 1.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh  thalassemia 11

Bảng 1.3 Kiểu hình, kiểu gen bệnh  thalassemia 16

Bảng 1.4 Các kĩ thuật sinh học phân tử được áp dụng trong phát hiệnđột biến gây bệnh  thalassemia 17

Bảng 1.5 Tình hình mang gen bệnh  thalassemia tại Việt Nam 26

Bảng 1.6 Tỉ lệ các loại đột biến  thalassemia ở người Việt Nam 27

Bảng 2.1 Tên và trình tự mồi sử dụng trong quy trình xác định 09 đột biến trên trên gen β globin 31

Bảng 2.2 Các bước sàng lọc trên gene β globin 34

Bảng 2.3 Bộ mồi sử dụng trong kỹ thuật giải trình tự gen β globin 36

Bảng 3.1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo các nhóm 40

Bảng 3.2 Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin ở bệnh nhân  thalassemia 41

Bảng 3.3 Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin ở bệnh nhân  thalassemia theo vị trí đột biến 42

Bảng 3 4 Kiểu gen và kiểu hình của 214 bệnh nhân  thalassemia 43

Bảng 3.5 Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globintrên đối tượng người mang gen bệnh 69

Bảng 3.6 Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết sắc tố của bệnh nhân mã số WBbT110706 74

Bảng 3.7 Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu vàđiện di huyết sắc tố của bệnh nhân mã số PWBbT120505M 75

Bảng 3.8 Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máuvà điện di huyết sắc tố của bệnh nhân mã số WBbT150926 77

Bảng 3.9 Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu vàđiện di huyết

sắc tố của bệnh nhân mã số PWBbT120505F 78

Bảng 3.10 Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết

sắc tố của 3 gia đình có kiểu gen kết hợp  và  thalassemia 80

Bảng 3.11 Kết quả số lượng và tỷ lệ thai nhi chẩn đoán trước sinh 83 Bảng 3.12 Kết quả tần số và tỷ lệ alen đột biến trongchẩn đoán trước sinh cho

thai nhi 83

Bảng 3.13 Tần số và tỉ lệ kiểu gen đột biến xuất hiện ở 178 thai nhi 84 Bảng 4.1 Các đột biến gen β globin phổ biến ở một số quần thể trên thế giới 92

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

Hình 1.1 Thành phần globin của các Hb bình thường 4

Hình 1.2 Sơ đồ cơ chế bệnh sinh trong Thalassemia 8

Hình 1.3 Cấu trúc và quá trình tổng hợp chuỗi β globin 13

Hình 1.4 Nguyên lý kĩ thuật ARMS-PCR 18

Hình 1.5 Thủ thuật chọc ối trong chẩn đoán trước sinh 24

Hình 1.6 Thủ thuật lấy bệnh phẩm trong chẩn đoán trước sinh 25

Hình 2.1 Quy trình xác định đột biến gen  globin 32

Hình 2.2 Sơ đồ mồi quy trình xác định đột biến gen β globin 37

Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu 39

Hình 3.1 Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT081203 cóđột biến CD41/42(-TCTT), CD17 (AAG-TAG) 45

Hình 3.2 Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT081203 phát hiện kiểu gen CD41/42(-TCTT) (A) và CD17 (AAG-TAG) (B) 46

Hình 3.3 Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT081203 với đột biến dị hợp tử CD41/42(-TCTT) (A) và CD17 (AAG-TAG) (B) 47

Hình 3.4 Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT140713 cóđột biến IVS1-1 (G-T) 48

Hình 3.5 Kết quả ARMS PCR của bệnh nhânmã số WBbT140713 phát hiện kiểu gen IVS1-1(G-T) 49

Hình 3.6 Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhânmã số WBbT140713 cóđột biến IVS2-654 (C-T) 49

Hình 3.7 Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT140713 phát hiện kiểu gen IVS2-654(C-T) 50

Hình 3.8 Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT140713 với đột biến dị hợp tử IVS1-1 (G-T) (A) và IVS2-654 (C-T) (B) 51

Hình 3.9 Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhânmã số WBbT130504 có đột biến -28(A-G) 51

Hình 3.10 Kết quả ARMS PCR của bệnh nhânmã số WBbT130504 phát hiện

kiểu gen -28(A-G) 52

Hình 3.11 Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhânmã số WBbT130504

có đột biến CD71/72(+A) 53

Hình 3.12 Kết quả ARMS PCR của bệnh nhânmã số WBbT130504 phát hiện

kiểu gen CD71/72(+A) 54

Hình 3.13 Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT130504 với

đột biến dị hợp tử CD71/72 (+A) 55

Hình 3.14 Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhânmã số WBbT101215

có đột biến -28(A-G) 55

Hình 3.15 Kết quả ARMS PCR của bệnh nhânmã số WBbT101215 phát hiện

kiểu gen -28(A-G) 56

Hình 3.16 Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhânmã số WBbT101215

có đột biến IVS1-5 (G-C) 57

Hình 3.17 Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT101215phát hiện

kiểu gen IVS1-5 (G-C) 57

Hình 3.18 Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhânmã số WBbT130310

Hình 3.21 Kết quả ARMS PCR của bệnh nhânmã số WBbT130310 phát hiện

kiểu gen CD95 (+A) 60

Hình 3.22 Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhânmã số WBbT090304

có đột biến CD41/42(-TCTT) 61

Hình 3.23 Kết quả ARMS PCR của bệnh nhânmã số WBbT090304 phát hiện

kiểu gen CD41/42(-TCTT) 61

Hình 3.24 Kết quả ARMS PCR của bệnh nhânmã số WBbT090304 phát hiện

kiểu gen HbE (GAG-AAG)-CD26 62

Hình 3.25 Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT090304 với

với đột biến dị hợp tử HbE (GAG-AAG)-CD26 63

Hình 3.26 Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbTS150926 với

Hình 3.30 Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ máu ngoại vi của các

đối tượng nghiên cứu 68

Hình 3.31 Kết quả điện di bước 1 sàng lọc 4 đột biến CD41/42(-TCTT),

CD17(AAG-TAG), IVS1-1(G-T), -28 (A-G) của cặp bố mẹ có mã

số WBbT090803 và WBbT090804 71

Hình 3.32 Kết quả điện di bước 2 sàng lọc 4 đột biến IVS2-654(C-T),

CD71/72(+A), IVS1-5(G-C), CD95 (+A) của cặp bố mẹ có mã số WBbT090803 và WBbT090804 72

Hình 3.33 Kết quả điện di bước 3 sàng lọc đột biến HbE (CD26) của cặp bố

Hình 3 37 Kết quả giải trình tự tìm đột biến điểm hiếm gặpcủa bệnh nhân mã

số WBbTS150926 77

Hình 3.38 Kết quả điện di phát hiện đột biến mất đoạn lớn ở người bố.

Hình 3.39 Kiểu gen kết hợp đột biến gen β globin và α globin của 3 gia đình

có các con vừa bị Beta thalassemia thể nặng và phù thai di Alpha thalassemia thể nặng 81

Hình 3.40 Quy trình chẩn đoán trước sinh cho bệnh Beta thalassemia 82 Hình 3.41 Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đình bệnh nhân sản phụmã số

AFbT120605, Nguyễn Thị Th 85

Hình 3.42 Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đìnhbệnh nhân sản phụ mã số

AFbT110705, Hà Thị V 86

Hình 3.43 Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đìnhbệnh nhân sản phụ mã số

AFbT121061 Nguyễn Phương D 86

Hình 3.44 Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đình sản phụ mã số

AFbT150302, Lò Thị Bích Th 87

ĐẶT VẤN ĐỀ

Beta thalassemia (β Thalassemia) là một bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, gây thiếu máu tan máu phổ biến ở Việt Nam, gây ra bởi đột biến gen Beta globin ( globin) nằm trên nhiễm sắc thể (NST) 11 (NC Khanh 1985) Tần suất mang gen bệnh khác nhau giữa các dân tộc Kinh là 1,49%, Mường 20,6%, Tày

11% (Saovaros Svasti, Hieu et al 2002) Bệnh nhân là những người mang 2 đột

biến gen  thalassemia (đồng hợp tử) hoặc  thalassemia kết hợp với HbE Biểu hiện lâm sàng là da xanh, niêm mạc nhợt, biến dạng xương, gan lách to, xạm da

do hồng cầu của bệnh nhân dễ bị phá hủy và tăng tạo máu ngoài tủy (BV Viên 2001)

Việc quản lý bệnh nhân β Thalassemia bao gồm vấn đề về phòng ngừa các trường hợp bệnh mới, điều trị các bệnh nhân Thalassemia thể nặng bằng truyền máu thường xuyên và tầm soát, phát hiện người mang gen Điều trị bệnh β thalassemia chủ yếu bằng truyền máu, thải sắt suốt đời hoặc chữa trị bằng ghép tế bào gốc, liệu pháp gen đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao và phải có nguồn tế bào gốc phù hợp Việc này gây ra gánh nặng về kinh tế và tâm lý cho các gia đình có người nhà bị bệnh β Thalassemia, cũng như cho toàn xã hội Vì vậy việc phòng bệnh được xem là chiến lược trong việc giải quyết vấn đề Thalassemia trong cộng đồng Biện pháp phòng ngừa bệnh β Thalassemia hữu hiệu nhất hiện nay là chẩn đoán trước sinh, nhằm phát hiện các thai nhi bị bệnh đối với những cặp vợ chồng đã có con bị bệnh muốn sinh con trong các lần tiếp sau hoặc những cặp vợ chồng trước hoặc sau khi kết hôn đều đã được chẩn đoán là người mang gen bệnh Đột biến trên gen β globin phần lớn là đột biến điểm Mỗi chủng tộc hoặc dân tộc khác nhau lại mang đột biến và tần suất khác nhau Bệnh β Thalasemia được chẩn đoán xác định dựa vào đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm huyết học Tuy nhiên, các xét nghiệm di truyền phân tử

xác định các đột biến trên gen β globin là điều kiện thiết yếu để thực hiện chẩn đoán

trước sinh bệnh β thalassemia

Phân tích kiểu gen không chỉ giúp khẳng định chẩn đoán trong một số trường hợp xét nghiệm thành phần Hb không điển hình mà còn giúp chẩn đoán thể bệnh nặng và trung gian, là cơ sở để lên kế hoạch điều trị tốt hơn cho bệnh nhân Phân tích kiểu gen là cơ sở thiết yếu cho thực hành tư vấn tiền hôn nhân, tư vấn di truyền cho các cặp vợ chồng là người mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh β Thalassemia, giúp giảm tỷ lệ ca bệnh mới ra cộng đồng Đây được xem là biện pháp phòng bệnh hiệu quả nhất và cần thiết để ngăn ngừa và giảm bớt nguy cơ sinh ra các em bé mắc thể bệnh nặng Phân tích kiểu đột biến gen còn giúp nghiên cứu về kiểu đột biến gen bệnh khác nhau giữa các dân tộc (Weatherall 2007)

Ở các quốc gia khác trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về tần suất đột biến gen và nghiên cứu lâm sàng ở các dân tộc khác nhau như ở người Thái Lan,

Philippin, Malaysia, Trung Quốc, Hàn Quốc (Kazazian, Dowling et al 1986, Park, Lee et al 2002, Peng, Liu et al 2003, Tan, George et al 2004, Viprakasit, Tanphaichitr et al 2004) Đã có một số nghiên cứu về mối liên quan giữa kiểu gen

là kiểu hình trên bệnh nhân  thalassemia (Galanello, Ruggeri et al 1983, Galanello, Barella et al 2002, Gabbianelli, Morsilli et al 2008, Sripichai, Munkongdee et al 2008, Sharma and Saxena 2009, Viprakasit, Lee-Lee et al 2009, Nuinoon, Makarasara et al 2010) Thái Lan là một trong những nước làm tốt tư vấn

di truyền và chẩn đoán trước sinh với hơn 10 trung tâm (Dhamcharee, Romyanan et

để đưa ra con số tỷ lệ đột biến đặc trưng của người Việt Nam nói chung và của

người miền Bắc nói riêng Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương” được

thực hiện nhằm mục tiêu nghiên cứu sau:

1 Phát hiện đặc điểm đột biến gen β globin trên bệnh nhân β thalassemia và người mang đột biến dị hợp tử bằng các kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR, ARMS-PCR và giải trình tự gen Sanger

2 Chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia bằng kỹ thuật sinh học phần

tử từ tế bào ối

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CẤU TRÚC VÀ CÁC DẠNG PHÂN TỬ HEMOGLOBIN

1.1.1 Cấu trúc phân tử Hb ở người bình thường

Thalassemia là rối loạn di truyền do bất thường trong quá trình tổng hợp hemoglobin mà nguyên nhân là sự thay đổi tỷ lệ tổng hợp các chuỗi globin Bình thường 2 loại chuỗi α globin và “không α” globin cặp đôi với nhau theo tỷ lệ 1:1, đột biến gen làm giảm hoặc ngừng sản xuất một loại chuỗi globin nhất định hoặc một vài chuỗi (α, β, γ, δ) sẽ gây ra sự mất cân bằng giữa các chuỗi globin Loại chuỗi globin được tổng hợp bình thường trở nên dư thừa vì không được cặp đôi, sẽ tích tụ trong tế bào hồng cầu và gây phá hủy hồng cầu Thông thường người ta chia bệnh thalassemia ra làm 2 loại, nếu giảm hoặc không tổng hợp chuỗi α globin sẽ gây bệnh α thalassemia và rối loạn tổng hợp chuỗi β globin sẽ gây thể bệnh β thalassemia

Hình 1.1 Thành phần globin của các Hb bình thường

(Nguồn: http://www.tutorialpoint.org/ProvaBiswas/HB_page1.html)

Hemoglobin (Hb), hay còn gọi là huyết sắc tố, là chất chứa trong các tế bào hồng cầu, có nhiệm vụ vận chuyển oxy từ phế nang đến tổ chức và vận chuyển chuyển hóa của tổ chức là H+ và CO2 đến thận và phổi để đào thải Cấu trúc phân tử

Hb gồm hai phần: phần Globin và phần HEM Phần Globin có bản chất protein, đặc trưng cho từng loài Ở người, phần globin được cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide, giống và gắn với nhau từng đôi một Mỗi chuỗi polypeptide gắn với 1 HEM Vì vậy, mỗi phân tử Hb có 2 đôi chuỗi polypeptide và 4 HEM, có khả năng vận chuyển

4 phân tử oxy

1.1.2 Các dạng phân tử hemoglobin

Trong quá trình phát triển của cá thể ở người, các loại chuỗi polypeptide có

sự chuyển đổi, loại chuỗi này thay thế chuỗi kia ở từng giai đoạn của cuộc sống Phân tích cấu trúc của các loại Hb khác nhau ở người, các tác giả Igram, Schoeden

và Brautnixer, Koemberg và Hill chia chuỗi polypeptide ra các loại sau đây: Chuỗi alpha (α), chuỗi beta (β), chuỗi gamma (), chuỗi delta (δ), chuỗi epsilon (ε ), chuỗi theta (ζ)

Các chuỗi (ζ) và chuỗi (ε) chỉ tồn tại ở những tuần đầu của thời kỳ bào thai, sau đó nhanh chóng được thay thế bằng chuỗi (α), (β), (), (δ) Các chuỗi này tồn tại suốt cuộc đời ở các mức độ khác nhau Ở người trưởng thành gặp chủ yếu là chuỗi (α), (β) một số ít chuỗi (δ) và rất ít chuỗi () Các loại chuỗi (β), (), (δ) đều kết hợp từng cặp với chuỗi (α) nên các loại chuỗi đó còn gọi chung là các chuỗi

“không α”

Bảng 1.1 Thành phần globin của các Hb bình thường

globin

Thời kỳ xuất hiện

Bình thường mỗi phân tử Hb có 2 cặp chuỗi polypeptide ở phần globin Các loại Hb khác nhau có các thành phần chuỗi polypeptide khác nhau Gen α globin hoạt động tương đối sớm, ngay từ cuối tháng đầu của thời kỳ bào thai và tồn tại

trong suốt quá trình phát triển của cá thể Trong khi đó, tổ hợp gen β globin hoạt

động thay đổi theo từng giai đoạn phát triển và có sự thay thế một cách trình tự chuỗi này bằng chuỗi khác

1.2 BỆNH  THALASSEMIA

1.2.1 Khái niệm

Thalassemia là nhóm bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, đặc trưng bởi sự suy giảm hoặc thiếu hụt tổng hợp chuỗi α hoặc β globin trong phân tử Hemoglobin (Cao and Galanello 2010) Tùy theo sự thiếu hụt xảy ra ở chuỗi α hay

β globin mà được gọi là bệnh α hay β Thalassemia Đây là một trong các bệnh di truyền phổ biến nhất trên thế giới và là nguyên nhân gây thiếu máu, tan máu hàng đầu ở trẻ em

1.2.2 Dịch tễ học bệnh  thalassemia

Theo ước tính của hiệp hội Thalassemia quốc tế (TIF), thế giới hiện nay có khoảng 1,5% dân số thế giới là người lành mang gen bệnh β Thalassemia, và có khoảng 100.000 trẻ sơ sinh với bệnh thiếu máu β thalassemia được sinh ra mỗi

năm (Colah, Gorakshakar et al 2010) Bệnh thiếu máu β Thalassemia xảy ra phổ

biến nhất ở các nước Địa Trung Hải, Bắc Phi, Trung Đông, Ấn Độ, Trung Á và Đông Nam Á, tập trung chủ yếu tại châu Phi, Ấn Độ và Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam

1.2.3 Cơ chế bệnh sinh

Trong hội chứng Thalassemia có một hiện tượng chung nhất là sự thiếu hụt một loại chuỗi polypeptit của phần globin, gây ra dư thừa tương đối loại chuỗi kia

(Cousens, Gaff et al 2010) Hiện tượng này xảy ra ở các mức độ rất khác nhau phụ

thuộc vào từng thể bệnh, song hậu quả của nó gây ra:

- Giảm tổng hợp Hb do thiếu phần globin

- Mất cân bằng giữa các chuỗi α và “không α”

Người bình thường có hai gen β globinnằm trên 2 NST tương đồng số 11 (β/β) Nếu một trong hai gen này bị đột biến (dị hợp tử β+ thalassemia hoặc β0thalassemia), được gọi là người mang gen bệnh hay còn gọi là thể nhẹ Nếu đột biến xảy ra ở cả hai gen trên hai NST được gọi là thể trung gian hoặc thể nặng tùy thuộc vào mức độ gây giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi βglobin

Tỷ lệ mắc bệnh là như nhau ở cả hai giới nam và nữ Nếu bố và mẹ là mang gen dị hợp tử với một đột biến, nguy cơ trong một lần sinh thai nhi là người lành

mang gen bệnh là 50%, thai nhi là người hoàn toàn khỏe mạnh không mang gen bệnh là 25%, thai nhi mắc bệnh β thalassemia thể nặng là 25%

Hiện tượng thứ nhất: giảm tổng hợp Hb

Là hậu quả trực tiếp của việc thiếu hụt tổng hợp phần globin do thiếu một loại chuỗi polypeptit nào đó nên làm giảm tổng hợp Hb Biểu hiện là hồng cầu nhược sắc và tăng sinh các hồng cầu non trong tủy Ở các thể nhẹ, sự mất cân bằng giữa chuỗi α và chuỗi β không nặng nề nên biểu hiện sự giảm tổng hợp Hb là không

ra ngoài huyết tương Những tác hại trên của các hạt tủa làm hồng cầu bị vỡ sớm gây nên hiện tượng tan máu Còn ở tủy xương, các hạt tủa trên gắn lên nguyên sinh chất và màng của các hồng cầu non, làm cho hồng cầu bị chết trước khi trưởng thành, dẫn đến tăng sinh mạnh các hồng cầu non trong tủy, gây nên các biến dạng xương, tăng hấp thu sắt gây ra nhiễm sắt cho cơ thể

Hình 1.2 Sơ đồ cơ chế bệnh sinh trong Thalassemia

(Nguồn : Dương Bá Trực 1996)

Hiện tượng các hồng cầu non bị chết sớm không đến được giai đoạn trưởng thành như trên gọi là hiện tượng sinh hồng cầu không hiệu quả Đây là cơ chế chủ yếu gây ra những biến đổi về lâm sàng và huyết học ở những bệnh nhân β Thalassemia thể nặng

Việc đột biến gen dẫn đến không tổng hợp hoặc giảm tổng hợp chuỗi  globin, thay vào đó là tăng sự tổng hợp các chuỗi  và các chuỗi  để tạo ra thành HbF (22), tăng tổng hợp các chuỗi  và các chuỗi  để taọ thành HbA2 ( 22)

Vì vậy, người mang gen bệnh hoặc người bị bệnh  thalassemia sẽ có chỉ số HbF và HbA2 cao hơn bình thường Nếu cả hai gen  globin đều bị đột biến dần đến mất chức năng hoàn toàn, không sản xuất được chuỗi  globin, khi đó gọi là 0

thalassemia, người bệnh không có HbA1 Nếu một trong hai gen  globin bị đột biến nhưng vẫn sản xuất chuỗi  globin khi đó gọi là + thalassemia  thalassemia phối hợp với HbE tạo thành thể phối hợp thalassemia/HbE Thể này có hồng cầu F

1.2.4.2 Thể trung gian

Bệnh nhân  Thalassemia thể trung gian mang 2 đột biến gen  Thalassemia Biểu hiện lâm sàng: thiếu máu nhẹ hơn thể nặng nên thường phát hiện bệnh sau 2 tuổi Nhiều trường hợp không cần phải truyền máu định kỳ, chỉ truyền máu khi Hb

< 70g/L Xét nghiệm thường có Hb >7g/dl, HbF 20 - 100%, HbA2 < 7% Bệnh nhân cũng có thể biểu hiện bệnh rõ như lách to, gan to, biến dạng xương mặt, chậm phát triển nếu bệnh diễn biến lâu và không được truyền máu đủ Người có HbE/  Thalassemia thường cũng biểu hiện bệnh như thể trung gian Các trường hợp  Thalassemia thể trung gian là thể rất ít gặp, rất dễ bỏ sót vì các chỉ số dùng cho mục đích sàng lọc bệnh Thalassemia không đặc trưng

1.2.4.3 Thể nặng

 Thalassemia đồng hợp tử đa số là thể nặng, bệnh thường được phát hiện sớm dưới 2 tuổi, thiếu máu nặng rõ, đòi hỏi phải truyền máu định kỳ, thường 2 - 4 tuần/ 1 lần Xét nghiệm Hb thường < 7g/dl, HbA2 < 4; HbF >50% Nếu không được điều trị hoặc điều trị không đầy đủ sẽ biểu hiện rõ trên lâm sàng: bộ mặt huyết tán mạn tính với mũi tẹt, gò má cao, bướu trán, bướu đỉnh, gan lách to, xạm da Ở giai đoạn muộn còn có các biến chứng như: chậm dậy thì, đái tháo đường, loãng xương, suy tim Những bệnh nhân này thường có tuổi thọ nhỏ hơn 20 tuổi (Khanh.1985,

Old, Traeger-Synodinos et al 2005, Weatherall 2005) Một số trường hợp HbE/ 

Thalassemia biểu hiện như thể nặng

1.2.5 Đặc điểm cận lâm sàng bệnh  thalassemia

1.2.5.1 Xét nghiệm công thức máu

Xét nghiệm công thức máu là xét nghiệm cơ bản đầu tiên trong việc phát hiện người mang gen và bị bệnh Thalassemia nói chung và bệnh  thalassemia nói riêng Kết quả của xét nghiệm công thức máu đưa lại các chỉ số về thể tích trung bình hồng cầu (MCV), số lượng huyết sắc tố trung bình tìm thấy trong các tế bào hồng cầu của cơ thể (MCH), lượng huyết sắc tố trong một thể tích máu (Hb) Với người mang gen bệnh hoặc bị bệnh Thalassemia, các chỉ số này đều giảm, mức độ giảm phụ thuộc vào tùy từng dạng đột biến và số lượng đột biến xảy ra

1.2.5.2 Điện di huyết sắc tố hemoglobin

Mục đích phương pháp điện di huyết sắc tố là tìm ra thành phần các hemoglobin, đặc biệt chỉ ra các thành phần hemoglobin bất thường Kết hợp với kết quả của xét nghiệm công thức máu, sẽ bước đầu định hướng được thể bệnh Thalassemia thường gặp Đối với việc chẩn đoán bệnh Beta thalassemia, người mang gen bệnh thường có chỉ số HbA2 ≥ 3,5%, chỉ số HbF tăng cao khi kiểu gen của bệnh nhân là kết hợp dị hợp tử hai đột biến hoặc đồng hợp tử cùng một đột biến nào đó Hiện nay, phương pháp điện di huyết sắc tố Cellulo acetat pH 6,8 được sử dụng rất phổ biến, cho phép xác định thành phần hemoglobin trong mẫu máu của bệnh nhân Tuy nhiên, đối với các trường hợp Beta thalassemia không điển hình, phương pháp này không chỉ ra được các hemoglobin bất thường chiếm tỉ lệ ít, dẫn đến việc có thể chỉ điểm cho các xét nghiệm chẩn đoán xác định không đúng hướng

Điện đi huyết sắc tố bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) là một phương pháp lý tưởng để khắc phục các nhược điểm trên, và cũng là phương pháp đã được nhiều nơi sử dụng trong các chương trình sàng lọc người mang gen trong cộng đồng cũng như sàng lọc sơ sinh

gan lách to, chậm lớn, bộ mặt thalassemia Có thể có tiền sử truyền máu hoặc chưa từng phải truyền máu

Xét nghiệm công thức máu và diện di Hb đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán bệnh ban đầu Tất cả các trường hợp mắc bệnh đều có biểu hiện thiếu máu ở các mức độ khác nhau: Hb 2,6-13,3g/dl; MCV<80fl, MCH<27pg Cụ thể được trình bày ở bảng 1.2

Trước đây, bệnh  thalassemia được chẩn đoán xác định dựa vào đánh giá chỉ số chuỗi α/β globin, khi chỉ số này tăng lớn hơn 1 Hiện nay chẩn đoán xác định bệnh  thalassemia được chủ yếu dựa vào xét nghiệm di truyền phân tử phát hiện đột biến gen β globin

Bảng 1.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh  thalassemia

+

hoặc β/ β0

1.3 ĐỘT BIẾN GEN  GLOBIN

1.3.1.Cấu trúc gen  globin

Bệnh β thalassemia là bệnh di truyền lặn theo nhiễm sắc thể thường Gen mã hóa cho chuỗi β globin nằm trên nhánh ngắn của NST số 11, vị trí 11p15.5, mỗi NST chứa một gen β globin Gen dài 1600 cặp base, mã hóa cho 146 acid amin

Cho đến nay có hơn 200 đột biến đã được tìm thấy trên gen β globin Dựa vào ảnh hưởng của đột biến đến việc tổng hợp chuỗi β globin, đột biến trên gen β globin được chia làm 2 nhóm: nhóm gây mất hoàn toàn số lưỡng chuỗi β globin, làm mất chức năng của gen β globin gọi là nhóm β0 globin và nhóm làm giảm số lượng chuỗi β globin được xếp vào nhóm đột biến gây β+globin Đột biến trên gen

β globin mang tính chủng tộc, có nghĩa là mỗi nhóm dân tộc, vùng địa lý khác nhau mang một nhóm đột biến khác nhau đặc trưng cho từng nhóm đó với tỷ lệ khác nhau

Cấu trúc gen β globin gồm các phần sau:

a Vùng promotor hay vùng 5’ (vùng điều khiển): có trình tự nhận biết và vị

trí gắn với enzym RNA polymerase và các yếu tố phiên mã, promotor có chức năng kiểm soát hoạt động của gen Người ta quy ước vị trí nucleotid đầu tiên được phiên

mã sang mRNA (thường là Adenin) là +1, các nucleotid của vùng mang thông tin di truyền mang dấu dương (về phía đầu 3’ hay downstream), các nucleotid vùng điều khiển mang dấu âm (về phía đầu 5’ hay upstream) Trong cấu trúc của gen β globin, vùng promotor kéo dài từ vị trí – 95 đến – 26 của gen Có các trình tự quan trọng là hộp TATA (ở vị trí -28 đến -31), hộp CCAAT (vị trí -72 đến -76) giúp các ribosom nhận biết đúng vị trí khởi đầu dịch mã trên mRNA trong quá trình dịch mã

b Điểm khởi đầu phiên mã: có trình tự nucleotid ACATTTG, đây là vị trí

gắn của phân tử 7 methylguanosin để tạo “mũ” ở đầu 5’ phân tử mRNA’ Mũ là yếu

tố cần thiết cho các ribosom nhận biết trong sự khởi đầu dịch mã và tránh cho mRNA không bị phân hủy bởi các enzym nuclease

c Bộ ba mở đầu: là ATG (sẽ phiên mã thành AUG ở mRNA), định vị sau

điểm khởi đầu phiên mã 50 cặp base Đoạn 50 cặp base xen giữa điểm khởi đầu phiên mã và bộ ba mở đầu là vùng không dịch mã, gọi là vùng 5’ UTR

d Exon thứ nhất: gồm 90 cặp base, mã hóa cho acid amin 1-30 của chuỗi β

globin

e Intron thứ nhất: gồm 130 cặp base, là đoạn không mang mã di truyền cho

β globin Cấu trúc của intron này rất quan trọng, giúp hoàn thiện phân tử tiền mRNA thành mRNA trưởng thành và đi ra bào tương để tổng hợp protein

f Exon thứ hai: gồm 222 cặp base, mã hóa cho acid amin 31-104

g Intron thứ hai: cấu tạo gồm 850 cặp base, không mã hóa cho cấu trúc của

phân tử β globin

h Exon thứ ba: gồm 126 cặp base, mã hóa cho acid amin 105-146 của chuỗi

β globin

i Bộ ba kết thúc: là TAA, bộ ba này được phiên mã thành UAA ở phân tử

mRNA Ribosom sẽ tách ra tại vị trí này và phân tử protein được giải phóng

j Vùng không dịch mã 3’ (3’ UTR): mặc dù được phiên mã nhưng không

được dịch mã trong cấu trúc của protein Có trình tự nucleotid là AATAAA, là vị trí gắn đuôi poly A (gồm khoảng 200 đến 300 phân tử adenyl) để hoàn thiện phân tử mRNA Quá trình này giúp mRNA di chuyển ra bào tương và tham gia tổng hợp protein

Hình 1.3 Cấu trúc và quá trình tổng hợp chuỗi β globin

Khác với đột biến trên gen  globin chủ yếu là đột biến mất đoạn lớn, đột biến trên gen  globin chủ yếu là đột biến điểm Các đột biến này phân bố ở các vùng khác nhau của gen như:

- Đột biến điểm tại vùng promotor

- Đột biến tại vùng cắt nối

- Đột biến trong các exon

Độ và Pakistan (Spritz, Orkin 1982) Các đôt biến mất đoạn lớn hiếm gặp khác thông thường sẽ mất toàn bộ cả vùng 5’ promoter sẽ có chỉ số HbA2 và HbF tăng

Cả hai thể mất đoạn lớn tồn dư huyết sắc tố (HPFH) và  đều do đột biến mất đoạn

cả hai gen  và  globin

Đến nay, có hơn 200 đột biến đã được công bố Mỗi nhóm dân tộc mang 1 nhóm đột biến đặc trưng cho từng nhóm dân tộc ấy Bên cạnh đó, theo ước tính vẫn

có khoảng 1% đột biến gen globin vẫn chưa xác định được (Thein 1998)

1.3.2.2 Một vài cơ chế đột biến trong tổng hợp chuỗi  globin (Kazazian 1990)

- Đột biến ảnh hưởng đến quá trình sao mã: các đột biến này có thể là các thay đổi bộ ba mã hoá amino axit thành bộ ba kết thúc làm quá trình tổng hợp mARN bị dừng lại gây 0 globin Nếu đột biến này thuộc dạng thêm hoặc bớt vài nucleotide ở vùng mã hoá sẽ gây lệch khung đọc mã hoá cho mARN Nếu đột biến này nằm trong bộ ba mã hoá mở đầu thì cũng sẽ gây ra ảnh hưởng tương tự Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng vị trí của đột biến vô nghĩa và đột biến gây lệch khung đọc sẽ dẫn đến các biểu hiện lâm sàng Ví dụ, kiểu gen dị hợp tử của đột biến xảy ra

ở vùng trình tự trước (exon 1 và 2) sẽ gần như không có biểu hiện lâm sàng, tuy

nhiên nếu đột biến với đột biến xảy ra ở vùng sau (late), tình trạng thiếu máu sẽ có biểu hiện nặng hơn (Thein 1998)

- Đột biến ảnh hưởng đến quá trình dịch mã: các đột biến này có thể làm mất

đi vị trí cắt nối thông thường, hoặc tạo ra vị trí cắt nối mới hình thành chuỗi mARN bất thường gây dừng sản xuất chuỗi  globin Các đột biến thuộc nhóm này có thể ở

vị trí khác như intron, exon gây ra việc giảm tổng hợp chuỗi  globin gây +thalassemia

+ Đột biến IVS1-1 (G-T) : xảy ra ở vùng intron 1, tại vùng cắt nối gây 0globin Đột biến là một trong các đột biến thường gặp ở Pakistani (Khateeb,

1.3.3 Tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình

Tương quan kiểu gen tạo ra kiểu hình rất đa dạng Trước hết kiểu hình nặng hay nhẹ phụ thuộc vào kiểu đột biến  Thalassemia Thông thường đồng hợp tử 2 đột biến 0 là nặng nhất, còn nhẹ nhất là ++/++ Tuy vậy, kiểu hình còn bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác như kết hợp với gen  Thalassemia, hoặc bị ảnh hưởng các gen khác QTLs-Xmn1-G site, HbS1L- MB, BCL11A Các yếu tố này làm cho

bệnh  Thalassemia bớt nặng hơn (Galanello, Ruggeri et al 1983, Galanello, Barella et al 2002, Gabbianelli, Morsilli et al 2008, Giordano, Bakker-Verwij et al

2009, Nuntakarn, Fucharoen et al 2009, Viprakasit, Lee-Lee et al 2009) Một số yếu tố làm bệnh nặng hơn như SNPs (Nuinoon, Makarasara et al 2010) Kiểu gen

0/0 thường có kiểu hình thể nặng, kiểu gen ++/++ thường có kiểu hình thể trung

gian (Taher, Musallam et al 2010) Mức độ biểu hiện nặng của bệnh có thể bị thay

đổi do kiểu gen mang đột biến kết biến  thalassemia, dẫn đến tăng số lượng chuỗi

 globin (Weatherall, Wainscoat et al 1985).

Bảng 1.3 Kiểu hình, kiểu gen bệnh  thalassemia

(Nguồn: Musallam, Rivella et al 2013)

- 0/0, +/+, 0/+ và xóa đoạn hoặc không xóa đoạn 

thalassemia

- 0/0, +/+, 0/+ và có khả năng tăng tổng hợp chuỗi 

thalassemia và tồn tại huyết sắc tố bào thai

hợp chuỗi 

- Biểu hiện lâm sàng muộn

- Thiếu máu nhẹ, trung bình

- Không phụ thuộc truyền máu

- Độ nặng lâm sàng thay đổi từ nhẹ đến nặng

Nặng  0  0 ,  +  + ,  0 / +

- Biểu hiện lâm sàng sớm

- Thiếu máu nặng

- Phụ thuộc truyền máu

1.3.4 Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định các đột biến gen β globin

Với sự phát triển của sinh học phân tử, hiện nay có nhiều phương pháp giúp xác định các đột biến gây bệnh β thalassemia như phương pháp giải trình tự gen, lai các đoạn nucleotid đặc hiệu alen (allele-specific oligonucleotide hybridization- ASO), hệ thống khuếch đại đột biến (amplification refractory mutation system- ARMS), phản ứng khuếch đại chuỗi đặc hiệu allele (allele-specific PCR), kỹ thuật

đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (restriction fragment length polymorphism- RFLP), kỹ thuật kéo dài chuỗi đơn (single bp extension-SBE), kỹ thuật đa hình hình dạng các đoạn đơn (single-strDNA conformation polymorphism- SSCP), kỹ thuật

điện di trên gel theo gradient biến tính (denaturing gradient gel electrophoresis- DGGE), kỹ thuật điện di trên gel phụ thuộc nhiệt độ và thời gian (temporal temperature gel electrophoresis- TTGE),

Bảng 1.4 Các kĩ thuật sinh học phân tử được áp dụng trong phát hiện

đột biến gen gây bệnh  thalassemia

ĐỘT BIẾN ĐÃ BIẾT

2010)

ARMS (amplification refractory mutation system) (Bartlett 2003)

MS-PCR (multiplexing mutagenically separated

RFLP (restriction fragment length polymorphism

A-RFLP (artificial-restriction fragment length

ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN ĐÃ BIẾT

2010)

ĐỘT BIẾN CHƯA BIẾT

MLPA (multiplex ligation-dependent probe

DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis) (Gorakshakar, Pawar et al 1999)

Có rất nhiều labo trên thế giới đã ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc phát hiện các đột biến gây β thalassemia và việc chẩn đoán trước sinh đã được tiến hành rộng rãi Việc lựa chọn phương pháp nào tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu, ứng dụng và điều kiện của từng labo và quốc gia đó

Từ 2010, việc ra đời của máy giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation Sequecing) đã tạo ra một cuộc cách mạng trong việc giải trình tự gen, nâng cao năng suất phân giải, tìm đột biến và cho cái nhìn toàn diện về tỷ lệ đột biến cho bất

cứ bệnh di truyền nào (Aziz, Ahmed et al 2017), (Chaudhary, Dhawan et al 2017), (He, Song et al 2017)

1.3.4.1 Amplification refractory mutation system (ARMS-PCR)

Kỹ thuật ARMS-PCR sử dụng để phát hiện sự có mặt của alen mang đột biến điểm đã biết Mỗi phản ứng sử dụng các mồi đặc hiệu có trình tự đầu 3’ bổ sung với alen đột biến và một mồi chung ngược chiều với mồi đặc hiệu alen Như vậy, trong mỗi phản ứng cho một đột biến điểm đã biết sẽ bao gồm hai phản ứng khuếch đại,

sử dụng cùng một khuôn DNA Trong đó, một sản phẩm sẽ được khuếch đại từ mồi đặc hiệu có trình tự đầu 3’ bổ sung với alen đột biến (mồi đột biến) hoặc alen bình thường (bình thường), và sản phẩm còn lại được khuếch đại từ một mồi chung ngược chiều với mồi đặc hiệu allen Sự hiện diện của các alen đột biến được biểu hiện bằng sản phẩm DNA khuếch đại với các kích thước khác nhau đã biết trước

Hình 1.4 Nguyên lý kĩ thuật ARMS-PCR

1.3.4.2 Restriction enzym (RE-PCR)

Đây là một phương pháp hay được sử dụng để phát hiện đột biến trên gen β

globin vì phần lớn đột biến trên gen này là đột biến điểm (Chang, Chen et al 1992)

Sản phẩm PCR được cắt bằng enzym giới hạn có thể bị cắt hoặc không bị cắt tùy vào tại vị trí đó có xuất hiện đột biến hay không Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là chỉ phát hiện được từng đột biến riêng lẻ, không tiến hành xác định được nhiều đột biến trong cùng 1 phản ứng Hơn nữa giá thành của enzyme cắt khá cao nên thời gian thực hiện sẽ bị kéo dài hơn, giá thành cao hơn

1.3.4.3 GAP-PCR

Kỹ thuật sử dụng hai mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch xuôi và mạch ngược trong vùng DNA chứa đoạn gen bị mất Với các đột biến mất đoạn có kích thước nhỏ hơn 1 kb, cặp mồi sẽ tạo ra hai sản phẩm, đoạn nhỏ hơn là sản phẩm từ

allen bị mất đoạn Với những đột biến mất đoạn lớn, khoảng cách giữa hai mồi quá lớn để có thể khuyếch đại được alen bình thường, mà chỉ có thể khuyếch đại sản phẩm từ alen mang đột biến mất đoạn Trong trường hợp này alen bình thường sẽ được khuyếch đại thông qua một điểm đứt gãy của đột biến, sử dụng một mồi theo nguyên tắc bổ sung với trình tự bị mất và một mồi khác theo nguyên tắc bổ sung với đoạn DNA còn lại Với alen bình thường, khoảng cách giữa hai mồi quá lớn nên không tạo ra được sản phẩm PCR Với alen có đột biến, khoảng cách này đủ ngắn

để tạo nên sản phẩm PCR đặc hiệu cho đột biến mất đoạn ấy

Kỹ thuật GAP-PCR, hay còn gọi là PCR khoảng cách được sử dụng để phát hiện lớn, hiếm gặp trên gen β globin, thường là các đột biến mất đoạn toàn bộ gen β

globin và các vùng gen bên cạnh (Craig, Barnetson et al 1994, Xu, Li et al 2000), Bartlett 2003, Harteveld, Voskamp et al 2005) Đây là kỹ thuật nhanh, đơn giản,

tuy nhiên hạn chế của kỹ thuật này là cần phải biết được điểm đứt gãy mới thiết kế

được cặp mồi tương ứng

1.3.4.4 Giải trình tự gen Sanger

Nguyên tắc của phương pháp Sanger là tạo ra các đoạn DNA sợi đơn, hơn kém nhau 1 nucleotide, được kết thúc bằng các ddNTPs đã được đánh dấu huỳnh quang Chuỗi được liên tục kéo dài do sự kết hợp ngẫu nhiên của các ddNTP, kèm theo

sự có mặt của DNA polymersase và mồi là các chuỗi oligonucleotid dài khoảng 20bp được thiết kế theo nguyên tắc bổ sung với vùng DNA đích cần quan tâm Thông thường các ddNTP được đánh dấu 4 màu huỳnh quang khác nhau Đối với phương pháp này, hệ thống điện di thường sử dụng là điện di mao quản Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, từ đó máy sẽ nhận diện được các nucleotid, từ đó biết được trình tự của DNA đích Phương pháp này cho phép xác định hầu hết các đột biến điểm, đột biến mất đoạn nhỏ hoặc lặp đoạn của gen Các phân tử này sẽ được tách nhau ra trong quá trình điện di mao quản Mục đích của phương pháp này là để phát hiện các đột biến điểm Đây được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán các bệnh lý di

truyền Thein, Hesketh et al (1989)

Trong quy trình chẩn đoán bệnh  thalassemia, vì phần lớn các đột biến trên gen β globin là đột biến điểm nên phương pháp giải trình tự gen Sanger được áp

dụng

Phương pháp này có ưu điểm là có thể phát hiện toàn bộ đột biến trên gen β globin trong cùng 1 phản ứng, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao

1.3.4.5 Kỹ thuật Hybrdization StripAssay

Kỹ thuật lai phân tử StripAssay là phương pháp kết hợp của kỹ thuật Multiplex PCR và lai DNA ngược Trên thanh lai Strip có đính nhiều đầu dò để phát hiện đồng thời nhiều đột biến và xác định kiểu gen đồng hợp/dị hợp của đột

biến (Winichagoon, Saechan et al 1999) Các đầu dò đặc hiệu cho alen đột biến và

alen bình thường được gắn cố định trên các dải nitrocenlullose có màng nilon Sản phẩm DNA được đánh dấu bằng biotin-16-dUTP trong các phản ứng khuếch đại Các sản phẩm này được lai với các đầu dò đặc hiệu alen đột biến và alen bình thường Sau khi rửa, sản phẩm lai đặc hiệu ở trên băng vạch của thanh lai được phát

hiện bằng mắt thường (Conner, Reyes et al 1983)

1.3.4.6 Kỹ thuật ASO (allele specific oligonucleotide)

Kỹ thuật dot blot (DB) hoặc reserve dot blot (RDB) lần lượt được (Saiki,

Walsh et al 1989), sử dụng một mạch đơn trong phân tử DNA của trình tự đã được

xác định (oligoprobe) để lai với phân tử DNA thứ hai chứa trình tự đích theo nguyên tắc bổ sung (target) với mức độ ổn định tùy thuộc vào chiều dài của các cặp base tham gia vào phản ứng Cả hai phương pháp DB và RDB có điểm chung là đều cần khuếch đại đặc hiệu một đoạn DNA, là đoạn cần được lai với ASO probe đã được cố định sẵn trên màng (RDB) hoặc probe đã được đánh dấu phóng xạ được cố định trên màng dạng dot blots có sẵn (DB) Tuy nhiên hai phương pháp này có những điểm khác nhau Đối với DB, mỗi một probe trong một phản ứng cần được lai và rửa trong một điều kiện khác nhau, và có thể phát hiện một loại đột biến của nhiều mẫu trên cùng một màng Ngược lại đối với RDB sử dụng probe không đánh dấu phóng xạ, thì các đột biến khác nhau chỉ cần lai và rửa tại cùng một điều kiện,

và cho phép phát hiện nhiều đột biến của cùng một mẫu trên cùng một màng

1.3.4.7 Kỹ thuật Real time PCR

Phản ứng tổng hợp chuỗi thời gian thực (Real time PCR) hay còn được gọi là phản ứng tổng hợp chuỗi định lượng là một kĩ thuật về sinh học phân tử được sử dụng trong phòng thí nghiệm dựa trên phản ứng tổng hợp chuỗi (Polymerase chain reaction-PCR), kĩ thuật này được sử dụng nhằm khuếch đại và cùng lúc xác định được số lượng của phân tử DNA đích

Quy trình thí nghiệm theo nguyên tắc thông thường của phản ứng tổng hợp chuỗi, trong đó đặc điểm chính là đoạn DNA được nhân lên sẽ được phát hiện trong thời gian thực (real time) Đây là phương pháp tiếp cận mới so với phản ứng PCR thông thường khi mà sản phẩm chỉ được xác định khi phản ứng đã kết thúc Hai phương pháp phổ biến để xác định được sản phẩm trong PCR định lượng đó là: (1) các dye phát huỳnh quang không đặc hiệu gắn vào bất kỳ đoạn DNA mạch đôi nào

đó, và (2) các đầu dò DNA đặc hiệu có chứa các đoạn oligonucleotide đã được đánh dấu với chất báo cáo phát huỳnh quang, từ đó cho phép phát hiện chỉ khi có sự lai giữa đầu dò với một trình tự bổ sung với nó, nhằm định lượng được RNA thông tin (mRNA) và các RNA không mã hóa trong các tế bào cũng như các mô

1.3.4.8 Kỹ thuật Micoarray

DNA microarray (thông thường được biết đến với tên gọi DNA chip hay chip sinh học) là một tập hợp các điểm DNA siêu nhỏ được gắn trên một giá thể rắn Các nhà khoa học sử dụng DNA microarray để đo một cách đồng thời mức độ biểu hiện của lượng lớn gen hoặc các vùng đa gen của hệ gen Mỗi điểm DNA chứa hàng picomoles (10-12 moles) của một trình tự gen đặc hiệu, được biết đến như các mẫu dò (probes hoặc reporters hay oligos) Chúng có thể là một đoạn ngắn của một gen hoặc một yếu tố DNA khác, được sử dụng để lai với một DNA hoặc RNac (hay RNA anti-sense) (được gọi là đích) dưới điều kiện nghiêm ngặt Sự lai mẫu dò – đích thường được phát hiện và định lượng bởi các chất đánh dấu huỳnh quang (fluorophore-labeled), bạc (silver-labeled) hoặc sự phát quang bằng phản ứng hóa học (chemiluminescence-labeled) để xác định mức độ lặp lại của các trình tự acid nucleic trong đích

Nguyên lý hoạt động mấu chốt của microarray là sự lai giữa hai chuỗi DNA, đặc tính của trình tự acid nucleic là bắt cặp bổ sung một cách đặc hiệu với chuỗi còn lại do hình thành liên kết hydro giữa các cặp bazơ nitơ bổ sung Sau khi rửa các trình tự gắn không đặc hiệu, chỉ có những chuỗi bắt cặp mạnh mẽ sẽ được giữ lại Các trình tự đích được đánh dấu huỳnh quang gắn với đầu dò cho tín hiệu phụ thuộc vào điều kiện lai (ví dụ như nhiệt độ) và điều kiện rửa sau lai

Độ mạnh của tín hiệu tại một điểm phụ thuộc vào lượng mẫu đích gắn với đầu

dò Microarray sử dụng định lượng tương đối khi mà cường độ của một điểm đặc trưng được so sánh với điểm giống như vậy ở trong điều kiện khác nhau

(Tritipsombut, Sanchaisuriya et al 2012)

Kĩ thuật này hiện nay đang rất thu hút được rất nhiều sự quan tâm, ứng dụng của các nhà sinh học Tuy nhiên vì giá thành cao, đồng thời yêu cầu thiết bị máy móc đắt nên chưa được phổ biến rộng rãi

1.3.5 Phát hiện người lành mang gen bệnh

Mục tiêu của sàng lọc là phát hiện người mang gen β globin bị đột biến hay còn gọi là người mang gen bệnh, từ đó biết nguy cơ sinh con bị bệnh của các cặp vợ chồng nếu đồng thời là người mang gen bệnh Các cặp vợ chồng này sẽ được tư vấn di truyền, nguy cơ sinh con bị bệnh của mỗi lần sinh là 25%

Người mang gen bệnh  thalassemia hay còn gọi là người lành mang gen bệnh (carrier) là những người chỉ mang một đột biến dị hợp tử trên gen β globin Nguy cơ mắc bệnh của các anh chị em ruột của bệnh nhân bị  thalassemia thể nặng

là 25%, do đó các thành viên trong của gia đình có bệnh nhân β thalassemia nên

được tiến hành xét nghiệm di truyền để sàng lọc đột biến gen β globin Những thành

viên này không những nên làm sàng lọc các đột biến đã được chỉ điểm trên bệnh nhân thể nặng trong gia đình, mà còn phải sàng lọc các đột biến khác trong số các đột biến thường gặp của vùng miền đó để tránh bỏ qua các đột biến gây + Các đột biến này có thể tạo kiểu hình là thể trung gian ở biểu hiện lâm sàng, rất khó phân biệt với thể nhẹ của người mang gen chỉ bị 1 đột biến trên gen β globin

Có hai phương pháp sàng lọc: sàng lọc quần thể và sàng lọc đích Sàng lọc quần thể được áp dụng cho quần thể lớn bằng các kĩ thuật sàng lọc đơn giản, thuận tiện Đối

tượng cho sàng lọc quần thể thường là các cặp vợ chồng chuẩn bị cưới, phụ nữ có thai hoặc trẻ em ở các trường mẫu giáo, trung học Sàng lọc đích chỉ nên thực hiện trên các đối tượng bệnh nhân đã qua sàng lọc quần thể, là người có nguy cơ bị bệnh hoặc là người mang gen bệnh Việc đưa ra 1 tập hợp các đột biến hay gặp trong 1 quần thể nhất định và kỹ thuật thực hiện sàng lọc đột biến ở mức độ sinh học phân

tử rất quan trọng để có tính khả thi khi thực hiện trên số lượng quần thể lớn

(Mitchell, Capua et al 1996, Lau, Chan et al 1997, Ma, Chan et al 2001)

1.4 CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH  THALASSEMIA

Hiện nay chưa có biện pháp điều trị đặc hiệu bệnh  thalassemia Các bệnh nhân bị  thalassemia thể nặng cần được truyền máu và thải sắt thường xuyên,

ảnh hưởng đến sự phát triển thể chất lâu dài (NC Khanh, Thu et al 1990, BDTrực

1996, Wonke 2001, HV Ngọc 2007, Viprakasit, Lee-Lee et al 2009, Cao and Galanello 2010, Colah, Gorakshakar et al 2010, Weatherall 2010, Surapon

2011, Sivalingam, Looi et al 2012) Việc điều trị này rất tốn kém gây gánh nặng

cho gia đình bệnh nhân và xã hội

Bệnh  thalassemia hoàn toàn có thể dự phòng được bằng cách sàng lọc và chẩn đoán xác định những người mang gen bệnh để được tư vấn di truyền trước hôn nhân và chẩn đoán trước sinh Với cặp vợ chồng nếu phát hiện thấy là người mang gen bệnh sẽ có nguy cơ sinh em bé bị bệnh thể nặng Chẩn đoán trước sinh cho thai nhi có nguy cơ cao mắc β thalassemia thể nặng chỉ đã biết các thông tin về đột biến của bố mẹ và sàng lọc trên các đột biến đã được chỉ điểm Chẩn đoán trước sinh cho thai nhi có nguy cơ mắc các bệnh di truyền đều thực hiện dựa trên phân tích DNA của thai nhi Nguồn DNA phổ biến được sử dụng trong chẩn đoán trước sinh được tách chiết từ mẫu dịch ối sau nuôi cấy Có hai phương pháp lấy mẫu để thực hiện xét nghiệm chẩn đoán trước sinh là phương pháp có can thiệp và phương pháp không can thiệp thai Phương pháp có can thiệp là sử dụng mẫu bệnh phẩm là dịch nước ối và mẫu gai rau của sản phụ Phương pháp không can thiệp là phương pháp

sử dụng các kĩ thuật siêu âm, xác định đột biến thai nhi từ mẫu máu của mẹ nhờ các DNA tự do của thai

1.4.1 Dịch nước ối

Từ những năm 1960, kỹ thuật chọc hút dịch ối đã được áp dụng cho chẩn đoán trước sinh khi thai ở ba tháng giữa của thai kỳ (15-19 tuần) Hiện nay vẫn đang là kỹ thuật có xâm lấn phổ biến nhất được sử dụng để chẩn đoán trước sinh các thai nhi có nguy cơ mắc bệnh di truyền Kỹ thuật này nhanh chóng được nhân rộng trên toàn thế giới với tính an toàn được cải thiện rõ rệt khi kết hợp dưới hướng dẫn của siêu âm Chọc hút dịch ối trở thành thủ thuật được thực hiện thường quy bắt đầu từ tuần thai thứ 16 Khoảng 16-20ml được hút ra từ buồng ối bao xung quanh thai nhi, thông qua một kim nhỏ xuyên qua thành bụng dưới hướng dẫn của siêu âm

Tỷ lệ tai biến do thủ thuật chọc ối ở tuần thai thứ 16 được thông báo vào

khoảng 0,5-1% (Tongsong, Wanapirak et al 1998), nhưng trên thực tế tỷ lệ này có

thể thấp hơn nhiều ở các trung tâm lớn với nhiều kinh nghiệm Chọc ối ở ba tháng đầu của thai kỳ được coi là có nguy cơ sảy thai cao hơn so với chọc ối ở ba tháng giữa Bất lợi chính của thủ thuật chọc ối là thời điểm chẩn đoán muộn Số lượng dịch ối đôi khi không đủ lượng DNA cần thiết cho chẩn đoán, cần phải nuôi cấy tế bào cho đến khi đủ lượng tế bào cần thiết, làm chậm thêm thời gian trả kết quả

(Tabor, Philip et al 1986)

Hình 1.5 Thủ thuật chọc ối trong chẩn đoán trước sinh

(Nguồn: http://sangloctruocsinh.vn)

1.4.2 Mẫu gai rau

Mục tiêu của sinh thiết gai rau (CVS) là để thu được một mẫu bệnh phẩm nhỏ từ bánh rau đang phát triển, nơi mang cùng một bản chất di truyền với thai nhi