Bài viết trình bày việc đánh giá độc tính cấp (xác định LD50 hoặc Dmax) và độc tính bán trường diễn của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng.
Trang 1ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƯỜNG DIỄN
CỦA CỐM BỤP GIẤM TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG
Lê Thị Lan Phương*, Nguyễn Phương Dung *
TÓM TẮT
Mở đầu: Cốm Bụp giấm là một loại chế phẩm dạng hạt hòa tan, bào chế từ nguồn nguyên liệu là bột sấy
phun đài hoa Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L Malvaceae) phối hợp với một số tá dược Trong các nghiên cứu trước, cốm Bụp giấm đã được xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và được chứng minh có hiệu quả điều trị rối loạn lipid máu trên thực nghiệm Đánh giá độc tính của chế phẩm trên động vật thử nghiệm là một trong những bước nghiên cứu quan trọng để tìm hiểu độc tính có thể có của chế phẩm, từ đó đưa ra khuyến cáo trước khi tiến hành những thử nghiệm kế tiếp trên lâm sàng, góp phần đưa chế phẩm vào sử dụng cho bệnh nhân
Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá độc tính cấp (xác định LD 50 hoặc D max ) và độc tính bán trường diễn của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Chế phẩm cốm Bụp giấm (BSP Bụp giấm, manitol, aspartam,
nước cất) được đóng gói kín, tránh ẩm và ánh sáng, khối lượng 2 g (± 5%), chứa 0,123% delphinidin-3-O-sambubiosid và 0,034% cyanidin-3-O-delphinidin-3-O-sambubiosid Nghiên cứu được thực hiện trên chuột nhắt trắng, cả giống đực và giống cái, chủng Swiss albino Trong nghiên cứu độc tính cấp, chuột thử nghiệm sử dụng chế phẩm với liều duy nhất, đường uống, tiến hành qua giai đoạn sơ khởi và giai đoạn xác định Trong nghiên cứu độc tính bán trường diễn, chuột thử nghiệm sử dụng cốm Bụp giấm đường uống, liều 0,4 g/kg (liều tối ưu có tác dụng), 0,8 g/kg và 4 g/kg trong 12 tuần liên tục, mỗi lô 20 chuột Đánh giá độc tính trên các biểu hiện hành vi, mức độ ăn, uống, cân nặng, chỉ số sinh hóa (AST, ALT, cholesterol toàn phần, triglycerid máu, creatinin huyết, acid uric, glucose), chỉ số huyết học (số lượng hồng cầu, hematocrit, hemoglobin, số lượng hemoglobin trung bình, nồng độ hemoglobin trung bình, thể tích trung bình của hồng cầu, số lượng bạch cầu, số lượng tiểu cầu), chỉ số trọng lượng gan, thận, lách và vi thể gan, thận chuột
Kết quả: Liều tối đa của cốm Bụp giấm có thể cho động vật thử nghiệm uống mà không có động vật nào chết
(D max ) là 15 g/kg chuột Cốm Bụp giấm khi sử dụng 12 tuần liên tục ở cả 3 mức liều 0,4 g/kg, 0,8 g/kg và 4 g/kg đều làm giảm cân nặng chuột ở tuần thứ 5 và từ tuần thứ 8 đến tuần thứ 12 Lô chuột sử dụng cốm Bụp giấm liều 0,4 g/kg có chỉ số glucose giảm 14% (p < 0,05) sau 6 tuần và 13% (p < 0,01) sau 12 tuần, chỉ số MCH (số lượng hemoglobin trung bình) giảm có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) sau 12 tuần Lô chuột sử dụng cốm Bụp giấm liều 4 g/kg có vi phẫu thận , 8/10 mẫu mức độ nhẹ, 2/10 mẫu mức độ trung bình so với lô chứng uống nước cất sau 12 tuần Các biểu hiện và chỉ số khác của các lô sử dụng cốm Bụp giấm khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng uống nước cất
Kết luận: Cốm Bụp giấm có độ an toàn khá cao Tuy nhiên, khi sử dụng cốm Bụp giấm trong thời gian dài
có thể làm ảnh hưởng đến một số thông số như giảm cân nặng, giảm glucose máu và MCH Khi sử dụng cốm Bụp giấm liều cao (4 g/kg chuột) trong 12 tuần gây viêm mô kẽ thận mức độ nhẹ so với lô chứng uống nước cất
Từ khóa: Cốm Bụp giấm, Hibiscus sabdariffa L Malvaceae, D max , LD 50
* Khoa Y học cổ truyền - Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: ThS.DS Lê Thị Lan Phương ĐT: 0907748591 Email: ltlphuong@ump.edu.vn
Trang 2ABSTRACT
STUDYING ACUTE TOXICITY AND SEMI-CHRONIC TOXICITY OF BUP GIAM GRANULES
IN MICE
Le Thi Lan Phương, Nguyen Phuong Dung
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 22 - No 5- 2018: 25 – 33
Background: Bup giam granules are dissolving granules, made from dry powder of Bup giam (Hibiscus
sabdariffa L Malvaceae) calyx and some adjuvants In previous studies, quality standard of Bup giam granules was formulated and the efficacy in the treatment dyslipidemia of Bup giam granules in mice was proved Evaluating the toxicity of drug in animals is one of the important stages to investigate the possible toxicity of drug, thereby recommending precautions prior to conducting further clinical studies as well as contributing to the preparation of a new drug utilized in patients
Objectives: The study was undertaken to evaluate the acute toxicity (determine LD 50 or D max ) and semi-chronic toxicity of Bup giam granules in mice
Methods: Bup giam granules are prepared from dry powder of Bup giam calyx, manitol, aspartame and
distilled water The composition is sealed in a package in order to avoid moisture and light Each package weights 2 g (± 5%) and contains 0.123% delphinidin-3-O-sambubiosid and 0.034% cyanidin-3-O-sambubiosid This study was performed in white mice, both male and female, Swiss albino strain In the acute toxicity study, mice administered a single oral dose This research proceeded through the initial and definitive stages In the semi-chronic toxicity study, mice were given Bup giam granules at dose level of 0.4 g/kg (effective dose), 0.8 g/kg and 4 g/kg during 12 weeks, 20 mice each group Toxicity was measured through activities, eating and drinking capacity of mice, weight, biochemical tests (AST, ALT, total cholesterol, triglyceride, creatinine, uric acid, glucose) and hematology tests (hematocrit, hemoglobin, mean hemoglobin, mean hemoglobin concentration, average red cell volume, white blood cell count, platelet count), weight of liver, weight of kidney, weight of spleen, liver and kidney microscope
Results: The maximum recommended dose of Bup giam granules which were given to mice without any
death (D max ) was 15 g/kg Bup giam granules were used for 12 weeks at 3 doses of 0.4 g/kg, 0.8 g/kg and 4 g/kg all reduced the weight of mice after 5 th weeks and from 8 th weeks to 12 th weeks The mice received 0.4 g/kg of Bup giam granules had lower glucose level by 14% (p < 0.05) after 6 weeks and by 13% (p < 0.01) after 12 weeks MCH (mean number of hemoglobin) decreased significantly (p < 0.05) after 12 weeks The group used Bup giam granules at the dose of 4 g/kg showed indication of mild kidney inflammation after 12 weeks Other results were not statistically different compared to the control group
Conclusions: Bup giam granules are relatively safe However, using Bup giam granules in long-term may
cause some abnormal affects such as weight loss, reduction blood glucose level and reduction the number of MCH There was mild kidney inflammation in mice using Bup giam granules with high dose (4 g/kg mouse weight) during 12 weeks
Keywords: Bup giam granules, Hibiscus sabdariffa L Malvaceae, D max , LD 50
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L Malvaceae) là
một loại dược thảo đang được sử dụng rộng rãi
không chỉ ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới
như một dạng thực phẩm bổ sung và hướng đến
điều trị một số bệnh lý, trong đó có rối loạn lipid máu Dịch chiết đài hoa Bụp giấm khô ở liều 500
và 1,000 mg/kg được cho cùng với chế độ ăn giàu cholesterol trên chuột cống trong 6 tuần cho kết quả giảm đáng kể mức cholesterol huyết
Trang 3thanh(5), dịch chiết nước từ đài hoa Bụp giấm cho
tác dụng chống oxy hoá trong quá trình oxy hoá
LDL và tác dụng giảm lipid máu(7,4) Hiện nay,
rối loạn lipid máu vẫn được xác định là một
trong những yếu tố nguy cơ hàng đầu của bệnh
mạch vành, có tỷ lệ gây tử vong cao ở cả nam và
nữ(2) Chính vì những lý do trên, chúng tôi đã
tiến hành nghiên cứu bào chế cốm Bụp giấm, có
thành phần chính là bột sấy phun từ đài hoa Bụp
giấm và xây dựng tiêu chuẩn của chế phẩm
này(6) Liều tối ưu có tác dụng điều trị rối loạn
lipid máu của chế phẩm được xác định ở mức 0,4
g/kg chuột, tương đương 2 g (1 gói cốm) trên
người trưởng thành (nghiên cứu đã được báo
cáo giám định năm 2017 - Sở khoa học công nghệ
Thành phố Hồ Chí Minh)
Nhằm tạo cơ sở tiếp tục phát triển và nghiên
cứu chế phẩm cốm Bụp giấm trên lâm sàng,
đồng thời đưa ra những khuyến cáo về độc tính
của chế phẩm, trong nghiên cứu này, chúng tôi
tiến hành nghiên cứu đánh giá độc tính cấp và
bán trường diễn của cốm Bụp giấm trên chuột
nhắt trắng
PHƯƠNG TIỆN-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, trang thiết bị
Cốm Bụp giấm
Chế phẩm cốm Bụp giấm (cốm BG) có thành
phần gồm cao khô Bụp giấm, manitol, aspartam,
nước cất Chế phẩm được đóng gói kín, tránh ẩm
và ánh sáng, mỗi gói 2 g ± 5% Mỗi gói cốm chứa
0,123% delphinidin-3-O-sambubiosid và 0,034%
cyanidin-3-O-sambubiosid, đạt tiêu chuẩn về độ
ẩm, độ hòa tan, độ đồng đều khối lượng của
thuốc cốm theo Dược điển Việt Nam IV
Động vật thử nghiệm
Chuột nhắt trắng cả 2 giống đực và cái,
trưởng thành (5 – 6 tuần tuổi), chủng Swiss abino,
nặng 18 – 22 g được cung cấp bởi viện Pasteur,
Tp Hồ Chí Minh Chuột được nuôi ở nhiệt độ
phòng với chu kỳ 12 giờ sáng/tối, mỗi lồng 8 – 10
chuột, sử dụng thức ăn là cám viên với thành
phần bột gạo, bột bắp, carbohydrat và vitamin trong suốt thử nghiệm
Hóa chất, trang thiết bị
Thuốc thử định lượng sinh hóa, huyết học máu: Chema Diagnostica - Ý Hóa chất formol, ethanol, loại tinh khiết do công ty Xilong Chemicals, Trung Quốc sản xuất Trang thiết bị: Máy sinh hóa DIRUI DR- 7000 - Trung Quốc, lồng chuyển hóa, cân phân tích Sartorius, kính hiển vi soi nổi, dụng cụ phẫu thuật và một số dụng cụ thí nghiệm khác
Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế thực nghiệm
Đánh giá độc tính cấp của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng (4,10)
Nghiên cứu độc tính cấp trên động vật thí nghiệm, chủ yếu là xác định liều chết trung bình nếu có (liều làm chết 50% số con vật thí nghiệm, gọi là LD50: lethal dose 50%) trong những điều kiện nhất định Chuột nhắt chia thành các lô tương tự, những chuột ở cùng một lô sẽ nhận cùng một liều chất khảo sát Sự đánh giá dựa vào phản ứng toàn ứng hay bất ứng (sống hay chết) nhận thấy ở mỗi chuột trong nhóm sau 72 giờ Chuột được tiếp tục theo dõi sau 14 ngày uống
để ghi nhận những triệu chứng bất thường (nếu có) Trong trường hợp sau khi cho chuột uống mẫu thử, số chuột trong lô thử nghiệm vẫn bảo toàn, ta có thể xác định liều cao nhất có thể bơm qua kim mà không làm chết chuột (Dmax)và liều tương đối an toàn dùng trong các thực nghiệm dược lý có thể bằng 1/5 Dmax hoặc lớn hơn
Thử nghiệm được tiến hành qua 2 giai đoạn: Giai đoạn 1 (sơ khởi), sử dụng 6 chuột (50% đực, 50% cái ở mỗi liều), giai đoạn 2 (xác định), trong trường hợp tìm LD50, số lượng chuột mỗi lô là 10 chuột và 12 – 20 chuột ở liều gần LD50, trong trường hợp xác định Dmax, số lượng chuột là 20 con (50% đực, 50% cái)
Trang 4Đánh giá độc tính bán trường diễn của cốm
Bụp giấm trên chuột nhắt trắng (9,10)
Chuột thử nghiệm được nuôi ổn định 1 tuần,
cân trọng lượng, xét nghiệm các thông số sinh
hóa và huyết học ban đầu, chia ngẫu nhiên
thành 4 lô, mỗi lô 20 con (10 đực, 10 cái):
Lô chứng: Uống nước cất
Lô thử 1: Uống cốm Bụp giấm (BG) 0,4 g/kg
(liều tối ưu có tác dụng điều trị)
Lô thử 2: Uống cốm Bụp giấm (BG) 0,8 g/kg
(liều gấp 2 lần liều có tác dụng điều trị)
Lô thử 3: Uống cốm Bụp giấm (BG) 4,0 g/kg
(liều gấp 10 lần liều có tác dụng điều trị)
Các thông số đánh giá hàng tuần: Hành vi
(tăng đi lại, giảm đi lại, nằm im, run rẩy, co giật),
lông (mượt, rụng ), biểu hiện của các cơ quan;
cân nặng, tính chất phân, nước tiểu
Mức độ ăn, uống được đánh giá tại thời
điểm ban đầu, sau 6 tuần và sau 12 tuần bằng
cách nhốt riêng mỗi chuột vào lồng chuyển hóa,
cho chuột làm quen lồng trong ngày thứ nhất,
cân lượng cám và lượng nước uống đã sử dụng
trong 24 giờ tiếp theo
Sau 6 tuần thử nghiệm, tiến hành lấy máu
đuôi chuột và xét nghiệm các thông số: Sinh hóa
(AST, ALT, cholesterol toàn phần, triglycerid
máu, creatinin huyết, acid uric, glucose), huyết
học (số lượng hồng cầu - RBC, hematocrit - HCT,
hemoglobin - HGB, số lượng hemoglobin trung
bình - MCH, nồng độ hemoglobin trung bình -
MCHC, thể tích trung bình của hồng cầu - MCV,
số lượng bạch cầu - WBC, số lượng tiểu cầu -
PLT)
Sau 12 tuần thử nghiệm, tiến hành lấy máu
đuôi chuột và xét nghiệm các thông số: Sinh hóa
(AST, ALT, cholesterol toàn phần, triglycerid
máu, creatinin huyết, acid uric, glucose), huyết
học (số lượng hồng cầu - RBC, hematocrit - HCT,
hemoglobin - HGB, số lượng hemoglobin trung
bình - MCH, nồng độ hemoglobin trung bình -
MCHC, thể tích trung bình của hồng cầu - MCV,
số lượng bạch cầu - WBC, số lượng tiểu cầu -
PLT) Gây mê, mổ quan sát đại thể gan, thận, tim, lách, phổi, dạ dày, ruột Xét nghiệm vi thể gan, thận (lấy ngẫu nhiên 50% số động vật) Cân trọng lượng gan, thận, lách chuột xác định: Chỉ số trọng lượng gan = (trọng lượng gan / trọng lượng cơ thể chuột) x 100%
Chỉ số trọng lượng thận = (trọng lượng thận / trọng lượng cơ thể chuột) x 100%
Chỉ số trọng lượng lách = (trọng lượng lách / trọng lượng cơ thể chuột) x 100%
Phương pháp thống kê, xử lý số liệu
Tất cả dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn (M ± SD) Dùng phép kiểm t-test và Anova một chiều, một yếu tố với phần mềm Minitab 16.0 và Microsoft Excel 2017 để thống kê dữ liệu và vẽ đồ thị
KẾT QUẢ
Độc tính cấp của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng
Bảng 1 Kết quả thử nghiệm độc tính cấp của cốm
Bụp giấm
Thử nghiệm
Liều dùng (g/kg chuột)
Số chuột
Số chuột chết trong lô
Phân suất tử vong
Trong suốt thời gian 72 giờ đầu tiên và 2 tuần quan sát tiếp theo, không ghi nhận được bất
kỳ dấu hiệu bất thường nào xảy ra trên chuột thử nghiệm Tất cả các chuột đều ăn uống và hoạt động bình thường, không có chuột chết, cân nặng khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các lô Do đó, không tìm được LD50 vì lô chuột uống 15 g/kg là liều tối đa thuốc phân tán vào nước có thể qua đầu kim để cho uống được mà vẫn không có chuột chết
Quan sát đại thể: Sau 2 tuần theo dõi, mổ
chuột ở tất cả các lô để quan sát đại thể các phủ tạng của chuột Kết quả: Tất cả các chuột thực nghiệm không thấy bất kỳ thay đổi bệnh lý nào
Trang 5về hình thái đại thể của tim, gan, thận, bàng
quang và hệ thống tiêu hóa
Độc tính bán trường diễn của cốm Bụp giấm
trên chuột nhắt trắng
Trong suốt thời gian cho uống thuốc (12
tuần), động vật lô uống thuốc thử nghiệm liều 1
(0,4 g/kg) và liều 2 (0,8 g/kg) có mức ăn uống, đi
lại bình thường, tình trạng phân, lông và các biểu hiện bên ngoài bình thường so với lô chứng uống nước cất Động vật lô uống thuốc thử nghiệm liều 3 (4 g/kg) có biểu hiện đi phân mềm (phân ướt hơn so với phân của lô chứng và không định hình) từ tuần thứ 6 trở đi
Bảng 2 Kết quả theo dõi cân nặng của các lô trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn
Lô 1
(nước cất)
18,95
± 1,28
21,75
± 1,59
23,05
± 2,16
23,30
± 2,72
25,70
± 2,87
27,30
± 3,05
26,50
± 2,54
Lô 2
(BG 0,4 g/kg)
18,90
± 0,85
21,70
± 1,63
22,65
± 1,95
23,60
± 2,48
25,10
± 2,49
24,45**
± 2,74
26,10
± 3,13
Lô 3
(BG 0,8 g/kg)
18,70
± 0,92
20,90
± 2,00
22,90
± 1,92
22,80
± 1,88
24,85
± 2,25
24,40**
± 2,30
25,85
± 3,05
Lô 4
(BG 4 g/kg)
18,90
± 1,07
21,80
± 1,88
22,85
± 2,23
22,60
± 1,90
24,95
± 1,50
24,30***
± 1,84
26,60
±2,30
Lô 1
(nước cất)
27,15
± 2,72
30,20
± 3,07
30,30
± 3,10
31,05
± 2,61
31,35
± 2,35
31,40
± 2,35
Lô 2
(BG 0,4 g/kg)
26,00
± 4,03
27,10**
± 3,77
27,75*
± 4,25
27,85**
± 3,56
28,45**
± 3,89
28,55**
± 3,17
Lô 3
(BG 0,8 g/kg)
25,35
± 3,22
26,15***
± 3,05
26,15***
± 3,22
26,65***
± 2,98
27,05***
± 2,80
26,95***
± 2,93
Lô 4
(BG 4 g/kg)
26,30
± 2,20
26,30***
± 3,15
26,30***
± 3,25
25,50***
± 3,49
25,00***
± 3,21
24,30***
± 3,11
Cân nặng chuột của lô thử nghiệm uống cốm
BG 0,4 g/kg giảm ở tuần thứ 5 (p < 0,01), tuần thứ
8 (p < 0,01), tuần thứ 9 (p < 0,05), tuần thứ 10 (p <
0,01), tuần thứ 11 (p < 0,01) và tuần thứ 12 (p <
0,01) so với lô chứng uống nước cất
Cân nặng chuột của lô thử nghiệm uống cốm
BG 0,8 g/kg giảm ở tuần thứ 5 (p < 0,01), tuần thứ
8 (p < 0,001), tuần thứ 9 (p < 0,001), tuần thứ 10 (p
< 0,001), tuần thứ 11 (p < 0,001) và tuần thứ 12 (p
< 0,001) so với lô chứng uống nước cất
Cân nặng chuột của lô thử nghiệm uống cốm
BG 4 g/kg giảm ở tuần thứ 5 (p < 0,001), tuần thứ
8 (p < 0,001), tuần thứ 9 (p < 0,001), tuần thứ 10 (p
< 0,001), tuần thứ 11 (p < 0,001) và tuần thứ 12 (p
< 0,001) so với lô chứng uống nước cất
Hình 1 Lượng nước uống của các lô chuột trong thử
nghiệm độc tính bán trường diễn (ml)
Lượng nước và lượng thức ăn tiêu thụ của chuột giữa các lô khác biệt nhau không có ý nghĩa thống kê tại các thời điểm: Ban đầu, sau 6 tuần và sau 12 tuần thử nghiệm
Trang 6Hình 2 Lượng thức ăn của các lô chuột trong thử
nghiệm độc tính bán trường diễn (g)
Chỉ số xét nghiệm sinh hóa
Chỉ số sinh hóa của chuột giữa các lô trong
thử nghiệm khác biệt nhau không có ý nghĩa
thống kê tại thời điểm ban đầu
Sau 6 tuần thử nghiệm, so với lô chứng uống
nước cất: Lô uống cốm BG 0,4 g/kg có chỉ số acid
uric, creatinin, AST, ALT, cholesterol toàn phần,
triglycerid khác biệt không có ý nghĩa thống kê, glucose giảm 14% (p < 0,05) Lô uống cốm BG 0,8 g/kg và 4 g/kg có chỉ số acid uric, creatinin, glucose, AST, ALT, cholesterol toàn phần, triglycerid khác biệt không có ý nghĩa thống kê
(Bảng 3)
Sau 12 tuần thử nghiệm, so với lô chứng uống nước cất: Lô uống cốm BG 0,4 g/kg có chỉ
số acid uric, creatinin, AST, ALT, cholesterol toàn phần, triglycerid khác biệt không có ý nghĩa thống kê, glucose giảm 13% (p < 0,01) Lô uống cốm BG 0,8 g/kg và 4 g/kg có chỉ số acid uric, creatinin, glucose, AST, ALT, cholesterol toàn phần, triglycerid khác biệt không có ý nghĩa
thống kê (Bảng 4)
Bảng 3 Chỉ số xét nghiệm sinh hóa sau 6 tuần của các lô chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn
Lô
(n = 20)
Uric (mg/d)
Creatinin (mg/dL)
Glucose (mg/dL)
ALT (U/I)
AST (U/I)
Cholesterol
TP (mg/dl)
Triglycerid (mg/dl)
Bảng 4 Chỉ số xét nghiệm sinh hóa sau 12 tuần của các lô chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn
Lô
(n = 20)
Uric (mg/d)
Creatinin (mg/dL)
Glucose (mg/dL)
ALT (U/I)
AST (U/I)
Cholesterol
TP (mg/dl)
Triglycerid (mg/dl)
Lô 2 (BG 0,4 g/kg) 7,19 ± 1,46 0,37 ± 0,07 75,17 ± 10,67 42,00 ± 14,84 75,75 ± 16,97 80,88 ± 15,87 114,80 ± 28,71
Lô 3 (BG 0,8 g/kg) 7,39 ± 1,29 0,39 ± 0,11 85,64 ± 13,24 45,80 ± 12,65 78,20 ± 25,22 74,79 ± 13,18 120,56 ± 20,27
Chỉ số xét nghiệm huyết học
Chỉ số huyết học của chuột giữa các lô trong
thử nghiệm khác biệt nhau không có ý nghĩa
thống kê tại thời điểm ban đầu
Chỉ số huyết học của chuột giữa các lô trong
thử nghiệm khác biệt nhau không có ý nghĩa
thống kê sau 6 tuần Sau 12 tuần thử nghiệm, lô uống cốm Bụp giấm liều 0,4 g/kg có chỉ số MCH giảm có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với lô chứng uống nước cất Các chỉ số khác khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng uống
nước cất (Bảng 5, Bảng 6)
Bảng 5 Chỉ số xét nghiệm huyết học sau 6 tuần của các lô chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn
Lô 1
(nước cất)
6,24
± 1,85
5,56
± 0,57
12,41
± 1,21
32,90
± 6,21
59,67
± 3,95
23,05
± 3,85
37,08
± 1,17
903,45
± 191,10
Trang 7Lô (n = 20) WBC 10^9/L RBC 10^12/L HGB g/L HCT % MCV fL MCH pg MCHC g/L PLT 10^9/L
Lô 2
(BG 0,4 g/kg)
6,53
± 1,57
6,03
± 1,00
13,42
± 1,93
34,65
± 6,10
58,42
± 3,74
21,50
± 2,24
36,74
± 2,89
993,95
± 230,26
Lô 3
(BG 0,8 g/kg)
6,55
± 1,67
5,42
± 1,07
12,85
± 1,82
31,55
± 6,92
58,05
± 3,25
22,17
± 1,90
37,69
± 1,19
946,50
± 323,83
Lô 4
(BG 4 g/kg)
6,75
± 2,75
5,82
± 0,88
13,14
± 2,06
33,93
± 6,19
58,70
± 4,17
22,36
± 3,11
37,17
± 1,47
1007,95
± 226,90
Bảng 6 Chỉ số xét nghiệm huyết học sau 12 tuần của các lô chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn
Lô 1
(nước cất)
6,43
± 1,85
6,38
± 0,87
13,66
± 1,87
39,27
± 5,42
62,30
± 3,17
24,14
± 3,14
36,42
± 3,59
991,25
± 155,48
Lô 2
(BG 0,4 g/kg)
6,70
± 1,85
6,63
± 0,68
14,64
± 1,49
38,52
± 6,00
61,26
± 3,37
22,08 *
± 1,12
36,09
± 1,14
965,85
± 224,26
Lô 3
(BG 0,8 g/kg)
6,44
± 2,02
6,48
± 0,55
13,94
± 1,70
38,84
± 3,87
60,06
± 7,33
22,63
± 1,26
36,54
± 0,86
982,35
± 275,78
Lô 4
(BG 4 g/kg)
6,64
± 2,12
6,41
±0,82
14,16
± 1,64
39,37
± 4,98
60,03
± 9,23
22,68
± 3,62
36,24
± 1,15
941,90
± 243,62
Kết quả giải phẫu quan sát đại thể và vi thể
Sau 12 tuần uống thuốc, chuột được gây mê,
giải phẫu, quan sát tim, phổi, gan, thận, lách,
ruột, bàng quang Kết quả bình thường, không
khác biệt so với lô uống nước cất (Hình 3)
Chỉ số trọng lượng gan, thận, lách của chuột
giữa các lô trong thử nghiệm khác biệt nhau
không có ý nghĩa thống kê sau 12 tuần
Kết quả giải phẫu bệnh gan, thận được gửi
xét nghiệm tại bệnh viện Chợ Rẫy, Thành phố
Hồ Chí Minh, Việt Nam Sau 12 tuần thử
nghiệm, so với lô chứng uống nước cất: Lô uống
cốm Bụp giấm 0,4 g/kg và 0,8 g/kg 10/10 mẫu có
hình ảnh vi phẫu gan, thận không khác biệt
nhau Lô uống cốm Bụp giấm 4 g/kg có hình ảnh
vi phẫu gan không khác biệt, vi phẫu thận có
viêm mô kẽ thận, 8/10 mẫu mức độ nhẹ, 2/10
mẫu mức độ trung bình (Hình 4, Hình 5)
Hình 3 Chỉ số trọng lượng gan, thận, lách của các lô
chuột trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn (%) n=20 cho mỗi lô
Hình 4: Hình ảnh vi thể gan của các lô thử nghiệm độc tính bán trường diễn
Trang 8Hình 5: Hình ảnh vi thể thận của các lô thử nghiệm độc tính bán trường diễn
BÀN LUẬN
Độc tính cấp của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt
trắng
Cốm Bụp giấm không thể hiện độc tính cấp
đường uống với liều tối đa có thể bơm qua đầu
kim để cho chuột uống là 15 g/kg, tương đương
với 75 g/người 60 kg (bảng quy đổi liều(9)), gấp
32,5 lần liều dự kiến sử dụng hàng ngày là 2 g
cốm Như vậy, cốm Bụp giấm sử dụng trong thử
nghiệm có độ an toàn khá cao và có Dmax = 15
g/kg Kết quả của các nghiên cứu đã công bố trên
thế giới về độc tính cấp của Bụp giấm cũng cho
thấy độ an toàn cao của Bụp giấm khi sử dụng
đường uống Liều LD50 trên chuột nhắt (trọng
lượng 30 g) được báo cáo là khoảng 0,4 - 0,6 ml
(tiêm phúc mô, i.p.) nước sắc Bụp giấm 30%
(Bụp giấm được ngâm trong nước cất 30 phút,
lấy dịch chiết)(7)
Độc tính bán trường diễn của cốm Bụp giấm
trên chuột nhắt trắng
Cốm Bụp giấm sử dụng trong nghiên cứu
không làm ảnh hưởng đến lượng thức ăn, nước
uống tiêu thụ ở chuột và các biểu hiện hành vi
khi sử dụng dài ngày Tuy nhiên, theo công bố
của Iyare năm 2008 và 2010, dịch chiết nước Bụp
giấm làm giảm lượng thức ăn, nước uống tiêu
thụ ở chuột cống cái và tác dụng này phụ thuộc
liều Tác giả giải thích sự giảm lượng thức ăn và
nước uống tiêu thụ ở chuột có thể là do chúng
không thích mùi vị của Bụp giấm(3) Như vậy, có
thể do cốm Bụp giấm đã cải thiện được mùi, vị
của dược liệu nhờ bổ sung thêm mannitol và
aspartam nên không làm ảnh hưởng đến các chỉ
số này
Kết quả nghiên cứu còn cho thấy có sự giảm trọng lượng chuột ở lô uống cốm Bụp giấm so với lô chuột uống nước cất ở tuần thứ 5, 8, 9, 10,
11 và 12 trong khi lượng thức ăn và nước uống
sử dụng không khác biệt Những nghiên cứu được tổng hợp đến năm 2014 đều không cho thấy sự giảm trọng lượng đáng kể gây ra bởi Bụp giấm trên động vật bình thường(3) Do đó, tác động đối với trọng lượng cần được đánh giá thêm trong những nghiên cứu tiếp theo để làm
rõ hơn về lợi ích và nguy cơ
Nồng độ glusose trong máu của lô uống cốm Bụp giấm (0,4 g/kg) giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng uống nước cất sau 6 tuần và sau 12 tuần thử nghiệm Tuy nhiên, ảnh hưởng này lại không xuất hiện ở lô sử dụng liều cao hơn (0,8 g/kg và 4 g/kg) Như vậy, tác động trên glucose máu của cốm Bụp giấm phụ thuộc liều sử dụng
Về tác động trên đường huyết, Bụp giấm cho hiệu quả ức chế α-amylase tụy(1); ở liều 200 mg/kg, Bụp giấm chống đề kháng insulin, làm giảm sự tăng đường huyết và sự tăng insulin trong máu trên chuột cống(8) Do đó, trong các nghiên cứu tiếp theo, cần đánh giá thêm khả năng gây giảm đường huyết trên đối tượng bình thường
Lô uống cốm Bụp giấm liều 0,4 g/kg có chỉ
số MCH giảm so với lô chứng uống nước cất sau 12 tuần thử nghiệm Tuy nhiên, tác động này lại không xảy ra khi sử dụng cốm Bụp giấm ở liều cao (0,8 g/kg và 4 g/kg) Chỉ số MCH thấp có thể do lượng sắt thấp trong
Trang 9máu Cơ thể sử dụng sắt để tạo ra huyết sắc tố,
nếu như cơ thể hết chất sắt, thiếu máu do
thiếu sắt gây ra có thể làm giảm MCH Trong
nghiên cứu sơ bộ về việc sử dụng nước sắc
Bụp giấm như là một nguồn thay thế sắt trong
điều trị thiếu máu và một số bệnh khác do
thiếu hụt chất khoáng, kết quả cho thấy đài
hoa khô Bụp giấm thúc đẩy khả năng sử dụng
chất khoáng(3) Như vậy, có thể do khả năng
tăng cường sử dụng chất khoáng trong thời
gian dài đã dẫn đến sự thiếu hụt sắt trên chuột
thí nghiệm với khẩu phần ăn tiêu chuẩn Sự
giảm MCH không gặp phải khi sử dụng Bụp
giấm ở liều cao có thể do sự bù đắp chính từ
Bụp giấm vì trong thành phần của nó có chứa
khoáng chất
Lô uống cốm Bụp giấm 4 g/kg có dấu hiệu đi
phân mềm từ tuần thứ 6 trở đi có thể do ảnh
hưởng của lượng acid ascorbic và một số acid
hữu cơ cao trong Bụp giấm Hiện tượng viêm
mô kẽ thận ở lô này sau 12 tuần thử nghiệm cần
được đánh giá thêm về nguyên nhân và mức độ
cũng như sự liên quan đến liều sử dụng trong
các nghiên cứu tiếp theo để làm sáng tỏ hơn
Từ những kết quả thu được trong nghiên
cứu này, chúng tôi đưa ra khuyến cáo cho các
nghiên cứu sau cần chú ý theo dõi cân nặng,
đánh giá lợi ích và nguy cơ; các thông số đường
huyết (tình trạng giảm đường huyết ở đối tượng
bình thường), MCH (tình trạng thiếu máu liên
quan đến liều) và nên đánh giá chức năng thận
khi sử dụng chế phẩm dài ngày với liều cao
KẾT LUẬN
Cốm Bụp giấm có Dmax = 15 g/kg, thể hiện độ
an toàn cao khi sử dụng Tuy nhiên, cốm Bụp
giấm sử dụng ở cả ba mức liều 0,4 g/kg, 0,8 g/kg
và 4 g/kg đều làm giảm trọng lượng chuột ở tuần
thứ 5 và từ tuần thứ 8 đến tuần thứ 12 Chuột
nhắt được cho uống cốm Bụp giấm ở liều tối ưu
có tác dụng điều trị (0,4 g/kg), không bị thay đổi
hầu hết các chỉ số sinh học, nhưng có giảm
glucose 14% sau 6 tuần và 13% sau 12 tuần, giảm
MCH 8,5% sau 12 tuần Chuột nhắt uống cốm
Bụp giấm liều gấp đôi liều tối ưu có tác dụng điều trị (0,8 g/kg), không bị thay đổi các chỉ số sinh học Chuột nhắt sử dụng cốm Bụp giấm liều gấp 10 lần liều tối ưu có tác dụng điều trị (4 g/kg) không bị thay đổi hầu hết các chỉ số sinh học nhưng có biểu hiện đi phân mềm từ tuần thứ 6 trở đi và có biểu hiện viêm mô kẽ thận mức độ nhẹ trên vi phẫu
Lời cảm ơn : Nhóm nghiên cứu xin cảm ơn sự hỗ trợ của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Adisakwattana S et al (2012) “In vitro inhibitory effects of
plant-based foods and their combinations on intestinal inverted question mark-glucosidase and pancreatic inveerted question
mark amylase” BMC Complementary and Alternative Medicine;
12(1): 110
2 Benjamin EJ et al (2017) "Heart Disease and Stroke Statistics -
2017 Update: A Report from the American Heart Association"
Circulation; 135(10): e146-e603
3 Da-costa-Rocha I et al (2014) “Hibiscus sabdariffa L - A
phytochemical and pharmacological review” Food Chemistry;
165: 424 - 443
4 Đỗ Trung Đàm (1996) Phương pháp xác định độc tính của
thuốc Nhà xuất bản Y học, tr 7 - 24, 50 - 57
5 Hainida E et al (2008) “Effects of defatted dried roselle (Hibiscus
sabdariffa L.) seed powder on lipid profiles of
hypercholesterolemia rats” Journal of the Science of Food and
Agriculture; 88:1043-1050
6 Lê Thị Lan Phương, Huỳnh Trần Quốc Dũng, Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Phương Dung (2017) “Xây dựng quy trình định
lượng đồng thời delphinidin-3-O-sambubiosid và
cyanidin-3-O-sambubiosid trong cốm Bụp giấm bằng phương pháp HPLC”
Tạp chí Y học TP.Hồ Chí Minh; 21(6): 81 - 86
7 Ochani PC and D’Mello P (2009) “Antioxidant and
antihyperlipidemic activity of Hibiscus sabdariffa Linn leaves and calyces extracts in rats” Indian Journal of Experimental Biology; 47:
276 - 282
8 Peng CH et al (2011) “Hibiscus sabdariffa polyphenolic extract
inhibits hyperglycemia, hyperlipidemia, and glycation-oxidative
stress while improving insulin resistance” Journal of Agricultural
and Food Chemistry; 59(18): 9901 - 9909
9 Sharaf A (1962) “The pharmacological characteristics of Hibiscus
sabdariffa L.” Planta Medica; 10: 48 - 52
10 Viện Dược liệu (2006) Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược
lý của thuốc từ dược thảo Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr
311 - 313
11 Yang MY et al (2010) “The Hypolipidemic Effect of Hibiscus
sabdariffa Polyphenols via Inhibiting Lipogenesis and Promoting
Hepatic Lipid Clearance” Journal of Agricultural and Food
Chemistry; 58: 850 - 859
Ngày nhận bài báo: 25/04/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/06/2018 Ngày bài báo được đăng: 20/09/2018