Đề tài: Các phương pháp nhân giống in vitro lan Hồ Điệp

Lịch sử và thành tựu của nuôi cấy mô, các phương pháp nhân giống invitro, tìm hiểu về nhân giống lan Hồ Điệp, nhân giống invitro lan Hồ Điệp,... là những nội dung chính của đề tài Các phương pháp nhân giống in vitro lan Hồ Điệp. Mời các bạn cùng tham khảo.

Ph n I: M  Đ u ầ ở ầ

Cu c s ng ngày càng phát tri n, nhu c u t o m t g c vộ ố ể ầ ạ ộ ố ườn nh  mang màuỏ  xanh cây lá thiên nhiên vào trong nhà c a ngủ ười dân ngày càng cao.V n nhi u h ,ố ề ọ  nhi u ch ng lo i, màu s c phong phú l i t n ít di n tích nên vi c ch n tr ng và t oề ủ ạ ắ ạ ố ệ ệ ọ ồ ạ  

m t vộ ườn lan nh  trong khuôn viên nhà là s  l a ch n c a nhi u cá nhân, nhi u hỏ ự ự ọ ủ ề ề ộ gia đình.Trong s  nh ng lo i phong lan đố ữ ạ ược nuôi tr ng   nồ ở ước ta hi n nay, bênệ  

c nh nh ng loài tạ ữ ương đ i d  tr ng nh  Mokaro, Dendro, lan Vũ N …thì v n cóố ễ ồ ư ữ ẫ  

nh ng loài lan thích h p v i m t s  khu v c đ a lý nh t đ nh, c  th  là Đ a Lan –ữ ợ ớ ộ ố ự ị ấ ị ụ ể ị  loài hoa ch  có th  nuôi tr ng trong đi u ki n lí tỉ ể ồ ề ệ ưởng c a Đà L t .[4]ủ ạ

Không quá kén ch n và h n ch  n i tr ng nh  Đ a Lan song H  Đi p cũng làọ ạ ế ơ ồ ư ị ồ ệ  

m t trong nh ng gi ng lan quý l i khó tr ng. Do đó, đòi h i ngộ ữ ố ạ ồ ỏ ười tr ng ph i cóồ ả  đôi chút am hi u v  loài hoa này.Thích h p v i đi u ki n trong nhà l i là m t trongể ề ợ ớ ề ệ ạ ộ  

nh ng gi ng lan đữ ố ược yêu thích không ch  v  màu s c, ki u dáng mà còn mang m tỉ ề ắ ể ộ  nét đ p r t sang tr ng, trang nhã. Chính vì v y, H  Đi p đã nhanh ch ng tr  thànhẹ ấ ọ ậ ồ ệ ố ở  

s n ph m tr ng tr t đả ẩ ồ ọ ược nhi u ngề ườ ưi  a chu ng và mang l i hi u qu  kinh t  caoộ ạ ệ ả ế  không ch    Vi t Nam mà còn   nhi u nỉ ở ệ ở ề ước trên th  gi i nh :Đài Loan, Hàn Qu c,ế ớ ư ố  

Nh t B n, M …Bên c nh đó, hoa H  Đi p r t lâu tàn, đ  b n bông cao, giàu s cậ ả ỹ ạ ồ ệ ấ ộ ề ứ  quy n rũ nên nó đã đế ượ ực l a ch n làm v t trang trí, t o c nh quan trong các ngàyọ ậ ạ ả  

l , t t.V n là m t loài r t khó nhân gi ng b i H  Đi p thễ ế ố ộ ấ ố ở ồ ệ ường cho h  s  nhân r tệ ố ấ  

th p trong đi u ki n vấ ề ệ ườ ươn  m. Đ  có để ượ ố ược s  l ng l n cây gi ng đ ng đ u vàớ ố ồ ề  

s ch b nh đáp  ng nhu c u th  trạ ệ ứ ầ ị ường là m t v n đ  th t nan giãi. Do đó, vi c nhânộ ấ ề ậ ệ  

gi ng b ng k  thu t nuôi c y mô ra đ i t o ra hàng lo t cây con  n đ nh v  m t diố ằ ỷ ậ ấ ờ ạ ạ ổ ị ề ặ  truy n, s ch b nh, giá c  l i ph i chăng là r t h u ích. ề ạ ệ ả ạ ả ấ ữ

 Xu t phát t  th c ti n này c ng v i s  đam mê c a chính b n thân mình, tôiấ ừ ự ễ ộ ớ ự ủ ả  

đã ti n hành tìm ki m s u t p t  đó đ a ra đ  tài: “ế ế ư ậ ừ ư ề Các ph ươ ng pháp nhân gi ng in ố   vitro lan H  Đi p”.  ồ ệ

v t m i đậ ớ ược nuơi c y.ấ

 Năm 1934 White đã thành cơng trong vi c phát hi n ra s  s ng vơ h n c aệ ệ ự ố ạ ủ  

vi c nuơi c y t  bào r  cà chua.ệ ấ ế ễ

 Năm 1964 Ball là ngườ ầi đ u tiên tìm ra m m r  t  nuơi c y ch i ng n. Ơngầ ễ ừ ấ ồ ọ  

đã thành cơng  trơng vi c chuy n cây con c a cây sen c n và cây White Lupin tệ ể ủ ạ ừ mơi trường nuơi c y t i thi u, tuy nhiên vi c nhân gi ng v n ch a hồn ch nh. Sauấ ố ể ệ ố ẫ ư ỉ  

đĩ, nhi u nhà nghiên c u đã khám phá nh ng thành ph n dinh dề ứ ữ ầ ưỡng qua tr ng c nọ ầ  thi t cho s  phát tri n c a t  bào đế ự ể ủ ế ược nuơi c y (White (1951),Gauthere (1939),Vanấ  Overbeck (1941), Steward và Caplin (1951))

 Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hi n ra các h p ch t cĩ th  đi u khi nệ ợ ấ ể ề ể  

s  n y ch i.ự ả ồ

 Năm 1962, Murashige và Skoog  đã c i ti n mơi trả ế ường nuơi c y đánh d uấ ấ  

m t bộ ước ti n  trong k  thu t nuơi c y mơ. Mơi trế ỷ ậ ấ ường c a h  dùng làm c  s   choủ ọ ơ ở  

vi c nuơi c y nhi u lo i cây và v n cịn s  d ng r ng r i cho đ n ngày nay.ệ ấ ề ạ ẫ ử ụ ộ ả ế

 Năm 1960­1964, Morel cho r ng cĩ th  nhân gi ng vơ tính lan b ng nuơi c yằ ể ố ằ ấ  

đ nh sinh trỉ ưởng.T  k t qu  đĩ, lan đừ ế ả ược xem là cây nuơi c y mơ đ u tiên đấ ầ ượ  c

thương m i hố. T  đĩ đ n nay, cơng ngh  nuơi c y mơ t  bào th c v t đã đạ ừ ế ệ ấ ế ự ậ ượ  cphát tri n v i t c đ  nhanh trên nhi u cây khác (Haramaki(1971), Murashige(1972),ể ớ ố ộ ề  Miller và Murashige (1976)) và đượ ức  ng d ng thụ ương m i hĩa.ạ

1.1.2 Ở Vi t Namệ

Nuơi c y mơ t  bào th c v t đã đấ ế ự ậ ược phát tri n   Vi t Nam sau chi n tranhể ở ệ ế  

th  gi i k t thúc (1975). Phịng thí nghi m nuơi c y mơ và t  bào đ u tiên đế ớ ế ệ ấ ế ầ ược xây 

d ng đ u tiên   vi n sinh h c, vi n khoa h c Vi t Nam(KHVN) do ti n sĩ Lê Thự ầ ở ệ ọ ệ ọ ệ ế ị 

Mu i đ ng đ u. Bộ ứ ầ ước đ u t p trung nghiên c u nh ng v n đ  c  b n nh  nuơiầ ậ ứ ữ ấ ề ơ ả ư  

c y bao ph n, nuơi c y mơ s o và protoplast. Các k t qu  đ u tiên v  nuơi c yấ ấ ấ ẹ ế ả ầ ề ấ  thành cơng bao ph n lúa và thu c lá đấ ố ược cơng b  năm 1978 ố (Lê Thị Muội và cs,, 

1978; Lê Thị Xuân và cs,, 1978). Ti p đĩ là thành cơng v  protoplast   thu c lá vàế ề ở ố  khoai tây (Lê Th  Mu i và Nguy n Đ c Thành(1978),Nguy n Đ c Thành và Lê Thị ộ ễ ứ ễ ứ ị 

Mu i 1980,1981).Trong cùng th i gian t i phân vi n KHVN t i Tp.HCM, mu i h nộ ờ ạ ệ ạ ộ ơ  

n a là t i Đ i h c Nơng ử ạ ạ ọ

Nghi p I (ĐHNNI) Hà N i và Vi n Khoa H c K  Thu t Nơng Nghi p Vi t Namệ ộ ệ ọ ỹ ậ ệ ệ  (KHKTNNVN) và các phịng thí nghi m nuơi c y mơ và  t  bào cũng đệ ấ ế ược thành 

l p ch  y u t p trung vào vi nhân gi ng khoai tây . Hi n nay, chúng ta cĩ r t nhi uậ ủ ế ậ ố ệ ấ ề  phịng thí nghi m nuơi c y mơ  khơng nh ng   các trệ ấ ữ ở ường đ i h c các vi n nghiênạ ọ ệ  

c u (vi n Di Truy n Nơng Nghi p(DTNN), vi n Rau Qu  Trung ứ ệ ề ệ ệ ả ương(RQT )) màƯ  

 c  m t s  t nh và c  s  s n xu t(Yên Bái ,H ng Yên, Thanh Hĩa….). Gi a

nh ng năm 1980 tr  l i đây, các hữ ở ạ ướng nghiên c u  ng d ng  nuơi c y mơ và tứ ứ ụ ấ ế bào th c v t phát tri n m nh. Nh ng k t qu  khích l  đã đ t đự ậ ể ạ ữ ế ả ệ ạ ược trong lĩnh v c viự  nhân   gi ng   khoai   tây(vi n   Cơng   Ngh   Sinh   H c   (CNSH),   ĐHNNI,   vi nố ệ ệ ọ ệ  KHKTNNVN), d a, chu i,  mía (vi n  CNSH,  ĐHNNI,  vi n KHKTNNVN,  vi nứ ố ệ ệ ệ  RQT ) m t s  cây hoa   phong lan (phân vi n CNSH thành ph  H  Chí Minh),Ư ộ ố ệ ố ồ  

H ng, Cúc, C m Chồ ẩ ướng(vi n CNSH, vi n DTNN) và cây cơng nghi p nh  b chệ ệ ệ ư ạ  đàn (vi n DTNN, vi n Lâm Nghi p). M t s  k t qu  bệ ệ ệ ộ ố ế ả ước đ u đã ghi nh n trongầ ậ  

l nh v c ch n dịng t  bào nh  ch n dịng t  bào kháng b nh (Lê Bích Th y và cs,,ỉ ự ọ ế ư ọ ế ệ ủ  1994), ch n dịng ch u mu i ,ch u m t nọ ị ố ị ấ ước (Nghuy n Tễ ường Vân và cs ,,1994; Đinh Th  Phịng và cs,, 1994). Các k t qu  v  dung h p cây lai t  bào ch t vàị ế ả ề ợ ế ấ  chuy n gen l c l p c ng thu để ụ ạ ủ ược k t qu  lý thú (Nguy n Đ c Thành và cs,, 1988;ế ả ễ ứ  Nguy n Đ c Thành và cs,, 1993, 1997) nuơi c y bao ph n đ  t o dịng thu n đãễ ứ ấ ấ ể ạ ầ  

đượ ức  ng d ng nhi u   vi n CNSH và DTNN. Nuơi c y các dụ ề ở ệ ấ ược li u quý  đ  b oệ ể ả  

t n ngu n gen và t o các t  bào cĩ hàm lồ ồ ạ ế ượng các ch t sinh h c quan tr ng caoấ ọ ọ  cũng đã và đang phát tri n.ể

1.2 Các giai đo n nhân gi ng invitro [5]ạ ố

Cho t i nay vi c nhân gi ng  invitro  đã áp d ng cho nhi u lo i cây (350 lồi,ớ ệ ố ụ ề ạ  Murashige (1974) chia  quy trình nhân gi ng ra làm 4 giai đo n :ố ạ

 Nuơi c y kh i đ u, tái sinh ch i, c m ch i.ấ ở ầ ồ ụ ồ

 Nhân nhanh ch i, c m ch i trong đi u ki n invitro.ồ ụ ồ ề ệ

 T o cây con hồn ch nh, hu n luy n cây con.ạ ỉ ấ ệ

 Ph c h i, chuy n cây ra tr ng trong đi u ki n  t  nhiên.ụ ồ ể ồ ề ệ ự

1.3 Các phương pháp nhân gi ng invitro [5]ố

1.3.1 Nuơi c y đ nh sinh trấ ỉ ưởng

M t phộ ương th c d  dàng nh t đ t đứ ễ ấ ạ ược m c tiêu trong nuôi c y mô t  bàoụ ấ ế  

th c v t là nuôi c y đ nh sinh trự ậ ấ ỉ ưởng (bao g m nuôi c y ch i đ nh và nuôi c y ch iồ ấ ồ ỉ ấ ồ  bên). Sau khi vô trùng, m u s  đẫ ẽ ược nuôi c y trên môi trấ ường thích h p ch a đ yợ ứ ầ  

đ  các ch t dinh dủ ấ ưỡng khoáng vô c  và h u c  ho c môi trơ ữ ơ ặ ường khoáng có bổ sung ch t kích thích sinh trấ ưởng  thích h p. T  m t đ nh sinh trợ ừ ộ ỉ ưởng, sau m t th iộ ờ  gian nuôi c y nh t đ nh m u s  phát tri n thành m t ch i hay nhi u ch i. Ch i ti pấ ấ ị ẫ ẽ ể ộ ồ ề ồ ồ ế  

t c phát tri n thân, ra lá và r  đ  thành m t cây hoàn ch nh. Cây con đụ ể ể ể ộ ỉ ược chuy nể  

d n ra đ t và thích nghi bình thầ ấ ường

1.3.2 Nuôi c y mô s oấ ẹ

Mô s o là m t kh i t  bào phát tri n vô t  ch c, hình thành do s  phân hóaẹ ộ ố ế ể ổ ứ ự  

c a các t  bào đã đủ ế ược phân hóa. Mô s o s  phát tri n nhanh khi môi trẹ ẽ ể ường có sự 

hi n di n c a auxin. Kh i mô s o có kh  năng phát tri n thành cây con hoàn ch nhệ ệ ủ ố ẹ ả ể ỉ  trong đi u ki n môi trề ệ ường không có ch t  kích thích t o mô s o. Nuôi c y mô s oấ ạ ẹ ấ ẹ  

được th c hi n đ i v i các lo i th c v t không  có kh  năng nhân gi ng thông quaự ệ ố ớ ạ ự ậ ả ố  nuôi c y đ nh sinh trấ ỉ ưởng. Cây tái sinh t  mô s o có đ c tính gi ng nh  cây m  Từ ẹ ặ ố ư ẹ ừ 

m t c m t  bào mô s o có th  tái sinh cùng m t lúc nhi u ch i h n là nuôi c yộ ụ ế ẹ ể ộ ề ồ ơ ấ  

đ nh sinh trỉ ưởng, tuy nhiên m c đ  bi n d  t  bào soma l i cao h n.ứ ộ ế ị ế ạ ơ

1.3.3 Nuôi c y t  bào đ nấ ế ơ

Kh i mô s o đố ẹ ược nuôi c y trong môi trấ ường l ng và đỏ ược đ t trên máy l cạ ắ  

có t c đ  đi u ch nh thích h p s  tách ra thành nhi u t  bào riêng l  g i là t  bàoố ộ ề ỉ ợ ẽ ề ế ẽ ọ ế  

đ n.T  bào đ n đơ ế ơ ượ ọc l c và nuôi c y trên môi trấ ường đ c bi t đ  tăng sinh kh i.ặ ệ ể ố  

V i các ch t thích h p đớ ấ ợ ược b  sung vào môi trổ ường, t  bào có kh  năng s n xu tế ả ả ấ  các ch t có ho t tính sinh h c. Sau m t th i gian nuôi c y  kéo dài trong môi trấ ạ ọ ộ ờ ấ ườ  ng

l ng t  bào đ n đỏ ế ơ ược tách ra và tr i trên môi trả ường th ch.ạ

    +  Khi môi trường th ch có b  sung auxin, t  bào đ n phát tri n thành t ngạ ổ ế ơ ể ừ  

c m có mô s o.ụ ẹ

    +  Khi môi trường th ch có t  l  cytokinine/auxin thích h p, t  bào đ n cóạ ỷ ệ ợ ế ơ  

kh  năng tái sinh  thành cây con hoàn ch nh.ả ỉ

1.3.4 Nuôi c y protoplast­chuy n genấ ể

Protoplast (t  bào tr n) là t  bào đ n đế ầ ế ơ ược tách b i v  cellullose, có s c s ngở ỏ ứ ố  

và duy trì đ y đ  các ch c năng s n có.ầ ủ ứ ẵ

Trong đi u ki n nuôi c y thích h p, protoplast có kh  năng tái sinh  màng tề ệ ấ ợ ả ế bào, ti p t c phân chia và tái sinh cây hoàn ch nh (tính toàn th    th c v t). Khi tế ụ ỉ ể ở ự ậ ế bào ch t m t vách và ti n hành dung h p, hai protoplast có kh  năng dung h p v iấ ấ ế ợ ả ợ ớ  

nhau t o t  bào lai, đ c tính này cho phép c i thi n gi ng cây tr ng. Quá trình dungạ ế ặ ả ệ ố ồ  

h p protoplast có th  th c hi n trên hai đ i tợ ể ự ệ ố ượng cùng loài hay khác loài

1.3.5 Nuôi c y h t ph n đ n b iấ ạ ấ ơ ộ

H t ph n   th c v t đạ ấ ở ự ậ ược nuôi c y trên nh ng môi trấ ữ ường  thích h p t o môợ ạ  

s o. Mô s o này đẹ ẹ ược tái sinh thành cây hoàn ch nh là cây đ n b i.  ỉ ơ ộ

II.2 Tìm hi u v  nhân gi ng lan H  Đi pể ề ố ồ ệ

2.1 Ngu n g c và đ c đi m c a lan H  Đi p [4]ồ ố ặ ể ủ ồ ệ

Hà Lan đ nh danh l i là Phalaenopsis. ị ạ

 Loài hoa này có xu t x    mi n B c Australia,  n Đ  và các nấ ứ ở ề ắ Ấ ộ ước Đông Nam Á nh  Philippine, Inđônêsia, bán đ o Đông Dư ả ương. Quê hương c a lan Hồủ  

Đi p là các nệ ướ ủc c a vùng Đông Nam Á, r ng Vi t Nam không có loài Phalaenopsisừ ệ  amabilis, ch  có 5 loài tỉ ương t  đự ược bi t là Phaenopsis mannii, Phalaeopsis gibbosa,ế  Phalaenopsis lobbi, Phalaenopsis fuscata và Phalaenopsis cornu­cervi. Lan H  Đi pồ ệ  

được tr ng   m i n i trên th  gi i, h u h t là   Đ c, Nh t b n, Ph n Lan, Đàiồ ở ọ ơ ế ớ ầ ế ở ứ ậ ả ầ  Loan, Thái Lan và M  Cây con đỹ ược nuôi c y mô nhi u   các nấ ề ở ước Ph n Lan, Tháiầ  Lan, Đài Loan…Hi n nay gi ng H  Đi p có trên 70 loài và càng ngày càng lai t o raệ ố ồ ệ ạ  

r t nhi u.ấ ề

2.1.2 Đ c đi mặ ể

 Lan H  Đi p là cây đ n thân, ng n, lá to, dày, m c sát vào nhau. Hoa n  luânồ ệ ơ ắ ọ ở  phiên h t cái này đ n cái khác, th i kì n  hoa thay đ i theo loài và thế ế ờ ở ổ ường n  trongở  vài tháng. Phát hoa m c t  nách lá, dài, chùm hoa n  t ng cái, 3 đài to tròn, hai cánhọ ừ ở ừ  xoè r ng kín, s c đ p. Môi hoa cong d p có hai râu dài nên c  đóa hoa trong gi ngộ ắ ẹ ẹ ả ố  

nh  con bư ươm bướm. Hai hàng hoa x p đ u đ n 2 bên cành, kh  đong đ a nh  đànế ề ặ ẽ ư ư  

bướm xinh x n đang bay lắ ượn ch p ch n. Tr  có hình bán nguy t v i hai phân kh iậ ờ ụ ệ ớ ố  

u lên, ch a đ y ph n hoa. S  hoa trên cành bi u th  s c s ng c a cây. S  lứ ầ ấ ố ể ị ứ ố ủ ố ượ  ng

càng nhi u thì cây càng sung s c. Riêng đ c tính phân nhành hoa l i tùy thu c nhi uề ứ ặ ạ ộ ề  vào t ng lo i gi ng.ừ ạ ố

 Lan H  Đi p có màu s c phong phú, không thua kém b t c  gi ng lan nàoồ ệ ắ ấ ứ ố  khác t  tr ng, h ng, đ , vàng, tím đ n các lo i H  Đi p có s c n m ngang ho cừ ắ ồ ỏ ế ạ ồ ệ ọ ằ ặ  

th ng đ ng, ho c có đ m to hay nh …Lan H  Đi p sinh trẳ ứ ặ ố ỏ ồ ệ ưởng ch m, kho ng 40ậ ả  ngày v i đi u ki n chăm sóc t t m i m c thêm m t lá hoàn ch nh. Khi cây có trên 4ớ ề ệ ố ớ ọ ộ ỉ  

lá m i có th  phân hoá m m hoa. Loài lan này có đ  b n bông cao trong đi u ki nớ ể ầ ộ ề ề ệ  thích h p, r t thích h p đ  tr ng trong nhà, d  ra hoa. Nh ng nó v n v n là loài hoaợ ấ ợ ể ồ ễ ư ố ẫ  khó tính

2.2 Đi u ki n sinh thái [5]ề ệ

2. 2.1 Nhi t đ  [3]ệ ộ

Lan H  Đi p có ngu n g c t  mi n nhi t đ i, do đó nhi t đ  thích h p đồ ệ ồ ố ừ ề ệ ớ ệ ộ ợ ể 

tr ng Lan H  Đi p tồ ồ ệ ương đ i cao, nhi t đ  thích h p đ  tr ng ban ngày là t  25­ố ệ ộ ợ ể ồ ừ

280C, ban đêm là 18­200Cgiai đo n ạ ươm cây non thì c n nhi t đ  ban đêm kho ngầ ệ ộ ả  

230C . N u nhi t đ  nhà trông nh  h n 15ế ệ ộ ỏ ơ 0C r  cây ng ng hút ch t dinh dễ ừ ấ ưỡng, quá trình sinh trưởng ng ng l i, th m chí b  l nh h i làm r ng hoa ho c làm cho cánhừ ạ ậ ị ạ ạ ụ ặ  hoa xu t hi n các đ m nh   nh hấ ệ ố ỏ ả ưởng đ n v  đ p c a hoa, giai đo n ph n hoa đòiế ẽ ẹ ủ ạ ấ  

h i ph i có s  ỏ ả ự

cách bi t khá cao v  đ  lêch nhi t đ  ngày /đêm, nhi t đ  ban ngày thích h p nh tệ ề ộ ệ ộ ệ ộ ợ ấ  

là 25 0C, ban đêm 10­200C, kéo dài 3­6 tu n r t có l i cho s  phân hóa hoa.  ầ ấ ợ ự

2. 2.2 Nướ ước t i 

H  Đi p là loài đ n thân, không có gi  hành nên không d  tr  nồ ệ ơ ả ự ữ ước, h n n aơ ữ  

di n tích b c h i c a b n lá khá l n và chúng không có mùa ngh  vì th  ph i cungệ ố ơ ủ ả ớ ỉ ế ả  

c p cho không m t lấ ộ ượng nước đ y đ  và thầ ủ ường xuyên trong su t năm. Trong mùaố  

m a m i ngày ph i tư ỗ ả ưới cho chúng 2 l n, tr  nh ng ngày có m a, m t l n vào 9ầ ừ ữ ư ộ ầ  

gi  sáng, m t l n vào 3 gi  chi u. Tờ ộ ầ ờ ề ưới nh  v y s  đ m b o cây khô ráo khi tr iư ậ ẽ ả ả ờ  

t i vì đ ng nố ọ ướ ởc   nách lá su t đêm có th  gây ra s  th i r a. Vào mùa n ng, nênố ể ự ố ữ ắ  

tưới cho chúng 1 ngày 3 l n. ầ

Đi u ki n thoát nề ệ ước là tương đ i quan tr ng, H  Đi p không th  ch u đố ọ ồ ệ ể ị ượ  c

m t đ   m l ng đ ng (nh t là ban đêm), vì r t đ  t o đi u ki n cho b nh th i r aộ ộ ẩ ắ ọ ấ ấ ễ ạ ề ệ ệ ố ữ  phát tri n. T t nh t c  ba ngày ta nên pha Dithane M45, Maneb, Captan vào trongể ố ấ ứ  

nướ ướ ớ ồc t i v i n ng đ  1/400 đ  ng a ch ng b nh nói trên. Nên nh , H  Đi p làộ ể ừ ứ ệ ớ ồ ệ  loài lan thích h p v i giá th  và nợ ớ ể ướ ước t i có pH khá th p (pH=5,2) vì th  ph iấ ế ả  dùng axít phôtphoric đ  gi m pH c a nể ả ủ ước. 

 n c ta, vào mùa m a H  Đi p tăng tr ng m nh h n, nh ng nh ng gi t

m a n ng h t cũng không kém ph n nguy hi m vì th  đa s  các lo i H  Đi p bư ặ ạ ầ ể ế ố ạ ồ ệ ị 

ch t do nh ng c n m a đ u mùa. Đây cũng là m t hình th c tế ữ ơ ư ầ ộ ứ ướ ủi c a thiên nhiên 

mà ta không ki m soát để ược. Do đó đ  ng a tình tr ng trên, mái giàn che H  Đi pể ừ ạ ồ ệ  nên dùng nh ng t m tôn nh a xanh, nh  v y s  lo i tr  nh ng tr n m a không c nữ ấ ự ư ậ ẽ ạ ừ ữ ậ ư ầ  thi t và t o đế ạ ược nh ng tia sáng khu ch tán r t lý tữ ế ấ ưởng

Vào mùa khô, ta v n duy trì m c đ  tẫ ứ ộ ướ ềi đ u đ n nh  trong mùa m a, vì lúcặ ư ư  này  m đ  trong không khí gi m xu ng rõ r t. Do đó, s  tăng s  l n tẩ ộ ả ố ệ ự ố ầ ưới nh mằ  

m c đích t o cho ụ ạ

cây tăng trưởng liên t c. N u cây có tr ng thái thi u nụ ế ạ ế ướ ủc,   rũ b n nên chuy n câyạ ể  sang v  trí khác ho c tăng s  l n tị ặ ố ầ ưới lên. M t l n tộ ầ ướ ổi b  sung vào gi a tr a trongữ ư  mùa khô r t thích h p cho s  phát tri n c a H  Đi p.ấ ợ ự ể ủ ồ ệ

2. 2.3 Ánh sáng [3]

Lan H  Đi p r t k  ánh sáng chi u th ng tr c ti p, do đó ph i có bi n phápồ ệ ấ ỵ ế ẳ ự ế ả ệ  che sáng đ ng th i tùy thu c vào cây l n nh  mà có bi n pháp đi u ch nh ánh sángồ ờ ộ ớ ỏ ệ ề ỉ  cho thích h p. Th i k  ợ ờ ỳ ươm cây non  nhu c u v  ánh sáng có cầ ề ường đ  10.000­ộ12.000 lux, giai đo n cây bánh t  là 12.000­20.000 lux, giai đo n thúc ra hoa 20.000­ạ ẻ ạ30.000 lux. Trong đi u ki n tr ng trong nhà lề ệ ồ ưới, mùa hè và mùa thu ph i che đi 75­ả85% ánh sáng, c n ph i có hai l p che sáng đ t ch ng lên nhau, mùa đông xuân thìầ ả ớ ặ ồ  ánh sáng y u h n ch  c n che 40­50% là đ  ế ơ ỉ ầ ủ

2. 2.4 Đ  thông thoángộ

R t c n thi t vì  H  Đi p hay b  b nh th i nhũn lá (phõng lá), s  thông thoángấ ầ ế ồ ệ ị ệ ố ự  giúp lá cây mau khô sau khi tưới và b  r  không b  úng nộ ễ ị ước nên h n ch  b nh r tạ ế ệ ấ  nhi u.   nề Ở ước ta vào mùa m a H  Đi p tăng trư ồ ệ ưởng m nh nh ng gi t m a  n ngạ ữ ọ ư ặ  

h t có th  làm th i đ t. Do đó đ  ngăn ng a tình tr ng trên nên dùng nh ng t m tônạ ể ố ọ ể ừ ạ ữ ấ  

nh a xanh đ  che. Có m t s  trự ể ộ ố ường h p tr ng H  Đi p trên cao (sân thợ ồ ồ ệ ượng) có 

hi u qu  h n. Tuy nhiên gió nhi u và m nh d  làm cây m t nệ ả ơ ề ạ ễ ấ ước nhanh n u taế  không cung c p đ  lá cây s  héo rũ, nhăn.  ấ ủ ẽ

2. 2.5 Dinh dưỡng 

H  Đi p c n dinh dồ ệ ầ ưỡng thường xuyên, quanh năm vì không có mùa ngh  . Khiỉ  

tưới phân không nên tướ ớ ồi v i n ng đ  cao càng đ ng tộ ừ ưới lên đ t, nh t là lúc lá nonọ ấ  

m i nhú ra t  đ nh sinh trớ ừ ỉ ưởng. H  Đi p c n phân bón tồ ệ ầ ướ ớ ồi v i n ng đ  loãng và cóộ  

th  tể ưới nhi u l n trong tu n. Có th  tề ầ ầ ể ưới thêm phân h u c  nh : bánh d u 15ữ ơ ư ầ  

      + Th i k  cây dờ ỳ ưới 12 tháng tu i c n dùng N, P, K v i t  l  cao 30­10­ổ ầ ớ ỷ ệ

10, sau đó dùng phân N, P, K v i t  l  20­20­20 ho c 18­18­18 cho đ n lúc ra hoa.ớ ỉ ệ ặ ế  Tuy nhiên vào mùa m a n u tư ế ưới phân 30­10­10 th y cây y u m m quá có th  tăngấ ế ề ể  

cường lượng lân và kali b ng cách xen k  phân 20­20­20 ho c 18­18­18 (dù là câyằ ẽ ặ  con), đ  cây để ượ ức c ng cáp, tăng cường s c đ  kháng sâu b nh.ứ ề ệ

+ Lúc cây trưởng thành (18­24 tháng tu i) vào th i đi m cu i năm, th iổ ờ ể ố ờ  

ti t l nh có th  kích thích cây ra hoa b ng cách tế ạ ể ằ ưới phân 10­30­30, đ n khi cây b tế ắ  

đ u nhú cành hoa r i ta tr  l i tầ ồ ở ạ ưới phân 20­20­20 cho đ n lúc hoa n  và tàn. Khôngế ở  nên đ  cành hoa lâu quá trên cây, khi n  hoa cu i cùng đã n  và có 1, 2 hoa b t đ uể ụ ố ở ắ ầ  héo, thì ta nên c t cành hoa b  đi đ  dắ ỏ ể ưỡng s c cho cây. Khi c t cành hoa càng s mứ ắ ớ  thì lá m i ra mau và cây sinh trớ ưởng t t h n đ  l n ra hoa sau s  m nh h n. ố ơ ể ầ ẽ ạ ơ

2.2.6 Sâu b nhệ

Đ i v i phong lan, vi c phòng b nh h t s c quan tr ng, vì khi cây đã  b  b nhố ớ ệ ệ ế ứ ọ ị ệ  

r t khó tr  và có th  làm ch t cây. Ngoài vi c chăm sóc lan k  lấ ị ể ế ệ ỹ ưỡng đ u đ n, tề ặ ướ  i

nưới và dinh dưỡng c n ph i tầ ả ưới thêm thu c tr  n m b nh nh m tăng s c đ  đố ừ ấ ệ ằ ứ ề ề kháng cho cây. Lan H  Đi p hay b  con b  trĩ chích t o v t thồ ệ ị ọ ạ ế ương trên lá t  đó viừ  khu n xâm nh p gây b nh th i nhũn trên lá. Có th  dùng m t s  lo i thu c đẩ ậ ệ ố ể ộ ố ạ ố ể phòng tr  nh  Malathion, lannat… đ  phòng tr ị ư ể ị

2.2.7 Ch u, giá th , cách tr ngậ ể ồ

Cách tr ng chung nh t cho các lo i H  Đi p là ch u th t thoáng, có nhi u lồ ấ ạ ồ ệ ậ ậ ề ỗ 

có th  s  d ng ch u đ t nung có nhi u l  hay ch u nh a cũng để ử ụ ậ ấ ề ỗ ậ ự ược. Ch u ph iậ ả  

th t s ch không có rêu bám trên thành ch u. Thông thậ ạ ậ ường các nhà vườn tr ng lanồ  

v i s  lớ ố ượng 

l n (vài ngàn cây) thớ ường dùng than, d , x  d a, mút… làm giá th  đ  tr ng lan Hớ ơ ừ ể ể ồ ồ 

Đi p. Có r t nhi u cách tr ng lan H  Đi p tu  theo t ng vùng. Nh ng có đi mệ ấ ề ồ ồ ệ ỳ ừ ư ể  chung là than, mút n m dằ ưới đáy ch u, còn x  d a hay d n s  n m trên mi ngậ ơ ừ ớ ẽ ằ ệ  

ch u cách tr ng này giúp cây thoát nậ ồ ướ ốc t t vào mùa m a, không b  th i r  và phátư ị ố ễ  tri n t t. Trong th i gian kho ng 2 năm ta thay ch u m t l n, n u cây l n quá mauể ố ờ ả ậ ộ ầ ế ớ  

có th  thay ch u s m h n. ể ậ ớ ơ

2.3 Tình hình s n xu t lan H  Đi p   Vi t Nam [5]ả ấ ồ ệ ở ệ

Hi n nay, t i TP.HCM cây lan H  Đi p đệ ạ ồ ệ ược xem là cây tr ng chi n lồ ế ượ  ttrong vi c chuy n đ i c  c u cây tr ng và v t nuôi. Đây là cây tr ng đem l i hi uệ ể ổ ơ ấ ồ ậ ồ ạ ệ  

qu  cao g p 2­3 l n so v i vi c tr ng lúa, hoa màu v.v  Trong xu th  đ t tr ngả ấ ầ ớ ệ ồ ế ấ ồ  ngày càng h p thì cây lan không chi m di n tích đ t nhi u nên là gi i pháp r t hi uẹ ế ệ ấ ề ả ấ ệ  

qu  Không ch  đ p v  màu s c, hình dáng, hoa lâu tàn… giá thành r  nên ngày càngả ỉ ẹ ề ắ ẻ  

đượ ưc  a chu ng và nuôi tr ng. T i TP.HCM và các t nh lân c n có r t nhi u vộ ồ ạ ỉ ậ ấ ề ườ  n

tr ng H  Đi p v i qui mô t  vài trăm đ n vài nghìn cây. Đi n hình là công ty Lâmồ ồ ệ ớ ừ ế ể  Thăng c a Đài Loan đ u t  và công ty Kim Ngân chuyên tr ng v  lan H  Đi p,ủ ầ ư ồ ề ồ ệ  hàng năm có th  cung  ng cho th  trể ứ ị ường t  vài ngàn đ m vài ch c ngàn cây, nh t làừ ế ụ ấ  vào d p T t Nguyên Đán. Tuy nhiên do không có s  liên k t gi a các nhà vị ế ự ế ữ ườn nên 

s n ph m  làm ra không tìm đả ẩ ược th  trị ường tiêu th , gi a cung và c u không h pụ ữ ầ ợ  lý

V  ngu n cây gi ng thì   nề ồ ố ở ước ta do không đ u t  nên cây gi ng không đ tầ ư ố ạ  

ch t lấ ượng t t, gi ng m i không nhi u nên các nhà vố ố ớ ề ườn thường nh p gi ng t  cácậ ố ừ  

nước nh  Thái Lan, Đài Loan…Ngoài ra hàng năm vi c nh p kh u hoa t  các nư ệ ậ ẩ ừ ướ  cnày ước tính tiêu t n hàng tri u USD. So v i các nố ệ ớ ước có ngành tr ng lan phát tri nồ ể  

nh  Đài Loan hay Thái Lan thì ngành tr ng   nư ồ ở ước ta c n ph i h c h i nhi u vàầ ả ọ ỏ ề  

c n ph i có chính sách phát tri n h p lý nh m đem l i hi u qu  kinh t  cao h n.ầ ả ể ợ ằ ạ ệ ả ế ơ2.4. Nhân gi ng invitro lan H  Đi pố ồ ệ

2.4.1 Nhân gi ng H  Đi p lai t  tr c phát hoa [14]ố ồ ệ ừ ụ

2.4.1.1. V t li u và phậ ệ ương pháp nuôi c yấ

Tr c phát hoa H  Đi p lai đụ ồ ệ ược c t khi các hoa g n tàn. Các m t đắ ầ ắ ược làm 

s ch và t y trùng b ng phạ ẩ ằ ương  th c c a Scuully, có 4 lo i ch i khác nhau trên cácứ ủ ạ ồ  khúc m t đắ ược dùng trong thí nghi m.ệ

 Ch i nguyên v n đồ ẹ ược dùng đ  ki m ch ng .ể ể ứ

 Ch i b  làm ch n thồ ị ấ ương b ng cách c t b  2/3 ch i theo m t c t song songằ ắ ỏ ồ ặ ắ  

v i tr c phát hoa và nh  th  m t c t  s  nghiêng v i hớ ụ ư ế ặ ắ ẽ ớ ướng m c m t g c  ọ ộ ố α

 Ch i b  làm ch n thồ ị ấ ương  b ng cách c t ch i làm hai m t c t theo tr c.ằ ắ ồ ặ ắ ụ

 Đâm d c ch i b ng m t kim nh n t  đ nh xu ng g c.ọ ồ ằ ộ ọ ừ ỉ ố ố

2.4.1.2  Đi u ki n nuôi c y  ề ệ ấ

 Môi trường  Murashige và Skoog( M+S)

 Môi trường Knudson C

 pH:5.8

 Ánh sáng: 5000 1m/m2

 Quang k  : 14 gi ỳ ờ

 Nhi t đ : 210ệ ộ 0C

 D ng c  ch a đ ng môi trụ ụ ứ ự ường  là l  thu c nh  ch a 10ml.ọ ố ỏ ứ

2.4.2 Gieo h t lan H  Đi p n y m m trong đi u ki n invitrro [3]ạ ồ ệ ả ầ ề ệ

Trong t  nhiên h t lan ít n y m m (ch  n y m m 1­2%) do h t lan không cóự ạ ả ầ ỉ ả ầ ạ  

ch a anbunin và m t phôi ch a phân hóa, có kích thứ ộ ư ước nh  nên khó ch a ch t dỏ ứ ấ ự 

tr  .Vì v y, trong t  nhiên h t lan H  Đi p n y m m đữ ậ ự ạ ồ ệ ả ầ ược nó ph i c ng sinh v iả ộ ớ  

n m Rhizoctonia mucoroides. N m s  cung c p đấ ấ ẽ ấ ường đ  nuôi cây, phân gi i cácể ả  

ch t h u c  khó h p thu. Bù l i cây s  cung c p nấ ữ ơ ấ ạ ẽ ấ ước cho n m, ch    và cácấ ỗ ở  khoáng ch t mà nó thu đấ ượ ừ ươc t  s ng. D a trên nguyên t c này, các phòng thíự ắ  nghi m nuôi c y mô đã t o môi trệ ấ ạ ường gieo h t lan H  Đi p trên môi trạ ồ ệ ường dinh 

dưỡng nhân t o v i t  l  r t cao.ạ ớ ỉ ệ ấ

D ch nghi n c a khoai tây, chu i , cà r t, nị ề ủ ố ố ước d a, pepton…ừ

2.4.3.  ng d ng h  th ng nuôi c y ng p chìm trong nhân gi ng H  Đi p laiỨ ụ ệ ố ấ ậ ố ồ ệ  [2]

 2.4.3.1. H  th ng nuôi c yệ ố ấ

H  th ng ng p chìm t m th i đệ ố ậ ạ ờ ượ ử ục s  d ng trong nghiên c u này là h  th ngứ ệ ố  bình nuôi c y Plantima do công ty A­tech Bioscientific c a Đài Loan s n xu t . Hấ ủ ả ấ ệ 

th ng này g m nh ng b  ph n ch  y u sau: B m hay máy nén khí t o áp l c đố ồ ữ ộ ậ ủ ế ơ ạ ự ể 

đ y môi trẩ ường t  ngăn ch a lên ngăn ch a m u c y và ngừ ứ ứ ẫ ấ ượ ạc l i, timer dùng để 

đi u khi n chu k  ng p, h  th ng  ng d n và van đi u khi n, các màng l c thoángề ể ỳ ậ ệ ố ố ẫ ề ể ọ  khí vô trùng, các bình Platima b ng nh a polycarbonate g m có 2 ngăn, ngăn dằ ự ồ ướ  i

ch a môi trứ ường l ng và ngăn trên ch a m u th c v t.ỏ ứ ẫ ự ậ

B ng cách đi u ch nh t  đ ng áp l c không khí thông qua m t máy b m, môiằ ề ỉ ự ộ ự ộ ơ  

trường l ng t  ngăn dỏ ừ ướ ẽ ượi s  đ c b m lên ngăn ch a m u c y và khi đ t đ n th iơ ứ ẫ ấ ạ ế ờ  gian ng p chìm t m th i dung d ch s  quay tr  l i ngăn dậ ạ ờ ị ẽ ở ạ ưới . Trong giai đo n dungạ  

d ch ng p m u có s  trao đ i không khí, m u đị ậ ẫ ự ổ ẫ ược xoay chuy n nh  và làm m iể ẹ ớ  không khí bên trong bình nuôi c y, dòng khí đi vào và thoát ra đấ ược kh  trùng nhử ờ cách l c vô trùng 0,45ọ µm . Th i gian ng p chìm và t n su t ng p chìm đờ ậ ầ ấ ậ ược đi uề  khi n b ng timer.ể ằ

        Hình 1:  H  th ng Plantima v i h  th ng đi u khi n chu k  ng p[11]ệ ố ớ ệ ố ề ể ỳ ậ  

2.4.3.2. M u c y lan H  Đi p ẫ ấ ồ ệ

Đ i tố ượng thí nghi m là m t loài lan H  Đi p lai có tên g i  ệ ộ ồ ệ ọ Doritaenopsis 

Taida Salu. M u c y g m có :ẫ ấ ồ

Protocorm – like bodies –PLBs c a gi ng ủ ố Dtps Taida Salu.

M u c y ch i đẫ ấ ồ ượ ấc l y trong thí nghi m tái sinh ch i t  PLBs trong các hệ ồ ừ ệ 

th ng khác nhau trên môi trố ường tái sinh ch i.ồ

2.4.3.3.  Phương pháp thí nghi m ệ

A.Kh o sát s  nhân nhanh PLBs trong các h  th ng nuôi c y khác nhauả ự ệ ố ấ

Thí nghi m kh o sát s  nhân nhanh PLBs trong các h  th ng nuôi c y khácệ ả ự ệ ố ấ  nhau được ti n hành trong nh m so sánh hi u qu  trong vi c nâng cao h  qu  nhânế ằ ệ ả ệ ệ ả  

và ch t lấ ượng c a PLBs trong h  th ng TIS so v i các h  th ng nhân gi ng trênủ ệ ố ớ ệ ố ố  môi trường th ch và trong h  th ng nuôi c y l ng l c. Đ ng th i kh o sát cácạ ệ ố ấ ỏ ắ ồ ờ ả  thông s  t i  u cho vi c nhân PLBs trên h  th ng TIS . M t đ  m u c y và t nố ố ư ệ ệ ố ậ ộ ẫ ấ ầ  

xu t ng p chìm.ấ ậ

Môi trường nuôi c y : Môi trấ ường MS b  sung BA và NAA, sucrose, glucose,ổ  

nước d a. Môi trừ ường đ i ch ng trên th ch có s  d ng than ho t tính và agar.ố ứ ạ ử ụ ạ

B.Kh o sát s  tái sinh ch i t  PLBs trong h  th ng TISả ự ồ ừ ệ ố

M u c y là nh ng PLBs thu đẫ ấ ữ ượ ừc t  quá trình nhân PLBs. Môi trường nuôi 

c y là môi trấ ường MS 1/2 có b  sung nổ ước d a, pepton, d ch chi t khoai tây,ừ ị ế  sucrose. Đ i ch ng là các m u đố ứ ẫ ượ ấc c y trên môi trường đ c.ặ

Kh o sát các thông s  t i  u cho vi c tái sinh ch i và nhân ch i trên h  th ngả ố ố ư ệ ồ ồ ệ ố  TIS. M t đ  m u c y và t n su t ng p chìm.ậ ộ ẫ ấ ầ ấ ậ

C.Kh o sát s  ra r  c a ch i H  Đi p tái sinh t  PLBs trong h  th ngả ự ễ ủ ồ ồ ệ ừ ệ ố  TIS

M u c y là nh ng ch i đẫ ấ ữ ồ ược tách ra t  quá trình tái sinh ch i, ch i lúc c y vàoừ ồ ồ ấ  

có chi u dài là kho ng 8­9 mm, chi u r ng là kho ng 3­4 mm, chi u cao thân làề ả ề ộ ả ề  kho ng 10mm, không có r  Môi trả ễ ường nuôi c y là môi trấ ường MS 1/2 có b  sungổ  

nước d a, pepton, d ch chi t khoai tây, sucrose, IBA. Đ i ch ng là m u nuôi c yừ ị ế ố ứ ẫ ấ  trên môi trường đ c .ặ

       Hình 2:  Cây sinh trưởng trong h  th ng nuôi c y ng p chìm [13]ệ ố ấ ậ

2.4.4.4. Đi u ki n thí nghi m ề ệ ệ

Các thí nghi m đệ ược th c hi n t i phòng Công Ngh  T  Bào Th c V tự ệ ạ ệ ế ự ậ  (Trung tâm Công Ngh  Sinh H c TP. HCM) trong đi u ki n nhi t đ  kho ng 25 ±ệ ọ ề ệ ệ ộ ả  

20C, đ   m 80­ 85 %, th i gian chi u sáng 10 gi  / ngày, cộ ẩ ờ ế ờ ường đ  chi u sáng 2500ộ ế  lux. 

2.4.4.   Nhân nhanh phôi và Protocorm – like body cây lan H  Đi p b ng hồ ệ ằ ệ 

th ng Bioreactor  [1]ố

2.4.4.1. V t li u và phậ ệ ương pháp

Đ i tố ượng nghiên c uứ

Gi ng lan H  Đi p có màu tr ng (ố ồ ệ ắ phalaenopsis amabilis ).

M u thí nghi m ẫ ệ

Ngu n m u lá phôi và PLB ( có màu xanh, đồ ẫ ường kính t  1­1,5 mm) thu nh nừ ậ  sau 2­ 3 tháng c y chuy n trên môi trấ ề ường MS có b  sung 2,0 mg/l BA, 0,5 mg/lổ  NAA, 20% 

nước d a và 30 g/l đừ ường . Ngu n m u này đồ ẫ ược dùng làm ngu n v t li u đ  làmồ ậ ệ ể  thí nghi m.ệ

Môi trường nuôi c y ấ

Môi trường MS c  b n có b  sung k t h p các thành ph n BA, NAA, và nơ ả ổ ế ợ ầ ướ  c

d a, sau đó b  sung 9g/l agar, 1g/l than ho t tính, pH môi trừ ổ ạ ường được đi u  ch nhề ỉ  

 Đ i v i h  th ng bioreactor ố ớ ệ ố

Bioreactor s  d ng trong nghiên c u có d ng hình c u, th  tích 3 lít (s n xu tử ụ ứ ạ ầ ể ả ấ  

t i Hàn Qu c). Ph n đáy có d ng hình tr  (đạ ố ầ ạ ụ ường kính ngoài 45 mm, cao 100 mm). 

Ph n trên có d ng hình c u  (đầ ạ ầ ường kính ngoài 170 mm). Đáy được n i v i máyố ớ  

s c khí, bên dụ ưới là m t mi ng ceramic (độ ế ường kính 20 mm, dày 2mm) có tác d ngụ  

t o b t khí m n. N p đ y làm b ng v t li u   silicone, hình nón c t, đạ ọ ị ắ ậ ằ ậ ệ ụ ường kính trung bình là 100 mm và có kh  năng ch u nhi t t t (không bi n d ng khi h p vôả ị ệ ố ế ạ ấ  trùng   121ở 0C, 1atm, trong 30 phút). Trên n p có  ng n i v i màng l c khí . Màngắ ố ố ớ ọ  

l c khí s  d ng là lo i ch u nhi t, đọ ử ụ ạ ị ệ ường kính l  màng l c là 0,2 Mm. H  th ngỗ ọ ệ ố  nuôi c y này s  d ng 2 màng l c, m t đ  l c khí vào và m t đ  l c khí ra. Các  ngấ ử ụ ọ ộ ể ọ ộ ể ọ ố  

d n khí đẫ ược làm t  silicone ch u nhi t, chia làm 2 lo i: Lo i đừ ị ệ ạ ạ ường kính 7 mm và 

lo i đạ ường kính 13 mm. S  d ng m t máy b m đ  cung c p khí cho bioreactor v iử ụ ộ ơ ể ấ ớ  

lượng khí kho ng 20 lít/ phút.ả

Đi u ki n nuôi c y ề ệ ấ

Th c hi n các quá trình nuôi c y   nhi t đ  25 ± 2ự ệ ấ ở ệ ộ 0C, cường đ  ánh sángộ  kho ng 2000lux, s  d ng ánh sáng tr ng t  đèn neon, th i gian chi u sáng là 10ả ử ụ ắ ừ ờ ế  

Bước 2 : Gói các b  ph n c a h  th ng bioreactor vào trong túi nilon ch uộ ậ ủ ệ ố ị  nhi t và đem h p kh  trùng   121 ệ ấ ử ở 0C, 1 atm trong 40 phút. Đ ng th i h p vô trùngồ ờ ấ  môi trường cùng m t lúc .ộ

Bước 3 : Ti n hành l n lế ầ ượt, đ  môi trổ ường nuôi  c y vào bình c u v i thấ ầ ớ ể tích nuôi c y là 1lít, c y m u phôi và PLB vào, đ y n p l i và sau đó g n các màngấ ấ ẫ ậ ắ ạ ắ  

l c khí. N p đ y đọ ắ ậ ược dán b ng keo dán  ng nằ ố ước. Sau cùng g n máy s c khí vàoắ ụ  

h  th ng đ  th c hi n quá trình nuôi c y.ệ ố ể ự ệ ấ

       Hình 3: Các thi t l p và v n hành h  th ng bioreactor.[1]ế ậ ậ ệ ố

Thi t k  thí nghi mế ế ệ

 T i  u hóa môi tr ng nuôi c y tăng sinh phôi và PLBố ư ườ ấ

Ti n hành kh o sát  nh hế ả ả ưởng c a n ng đ  các ch t đi u hòa sinh trủ ồ ộ ấ ề ưở  ng

th c v t (BA, NAA) và nự ậ ước d a phát sinh phôi vô tính và PLB c a lan H  Đi p.ừ ủ ồ ệ  Các thí nghi m đệ ược b  trí theo các b ng nh  sau.ố ả ư

Sau 8 tu n nuôi c y, thu nh n phôi và PLB, ti n hành l y k t qu  v i các chầ ấ ậ ế ấ ế ả ớ ỉ tiêu sau: Tr ng lọ ượng tươi, đường kính phôi, PLB và đánh giá thông qua quan sát 

th c t ự ế

B ng 1:  nh hả Ả ưởng c a BA lên s  tăng sinh c a phôi và PLB trong môi trủ ự ủ ường nuôi 

c y b  sung 0,5 mg /l NAA và 20 % nấ ổ ước d a.ừ

B ng 2: nh hả Ả ưởng c a NAA lên s  tăng sinh c a phôi và PLB trong môi trủ ự ủ ườ  ngnuôi c y b  sung 2,0 mg /l BA và 20% nấ ổ ước d a.ừ

B ng 3:  nh hả Ả ưởng c a nủ ước d a lên s  tăng sinh c a phôi và PLB trong môiừ ự ủ  

trường nuôi c y b  sung 2,0 mg /l BA và 0,5 mg /l NAA.ấ ổ

Kh o sát s  tăng sinh c a phôi và PLB trong h  th ng nuôi c y bioreactorả ự ủ ệ ố ấ

T  k t qu  đ t đừ ế ả ạ ượ ởc   thí nghi m t i  u môi trệ ố ư ường tăng sinh phôi nhóm nghiên c u xác đ nh đứ ị ược các thành ph n t i  u cho môi trầ ố ư ường nuôi c y trongấ  bioreactor là: Môi trường MS c  b n, th  tích nuôi c y 1lít b  sung 2,0 mg / l BA ,ơ ả ể ấ ổ  1,0 mg /l NAA và 20 % nước d a, ch nh pH v  5,8 trừ ỉ ề ước khi đem đi h p kh  trùngấ ử   121

ở 0C, 1 atm trong 40 phút. Các bước ti n hành nuôi c y trong h  th ng bioreactorế ấ ệ ố  

đã được trình 

bày   trên. Đ ng th i ti n hành nuôi c y trên môi trở ồ ờ ế ấ ường agar truy n th ng v i thề ố ớ ể tích bình và môi trường tượng t  nh  trong h  th ng bioreactor là 3 lít (th  tíchự ư ệ ố ể  bình)và 1 lít (th  tích môi trể ường) đ  làm m u đ i ch ng. T t c  các thí nghi mể ẫ ố ứ ấ ả ệ  

đ u đề ược theo dõi và ti n hành l y s  li u sau 6 tu n nuôi c y. K t qu  thu nh nế ấ ố ệ ầ ấ ế ả ậ  phôi và PLB thông qua các ch  s  sau: Tr ng lỉ ố ọ ượng tươi, h  s  tăng sinh, t  l  s ng,ệ ố ỉ ệ ố  

s  lố ượng, đường kính c a phôi và PLB đủ ược hình thành.  

X  lý s  li u ử ố ệ

M i nghi m th c đỗ ệ ứ ượ ặ ạc l p l i 3 l n, k t qu  thí nghi m đầ ế ả ệ ược phân tích b ngằ  Duncan, s test ( Ducan, 1995) v i   = 0,05 . ớ α

2.5  K t qu  các thí nghi m ế ả ệ

2.5.1.  Nhân gi ng H  Đi p lai t  tr c phát hoa [4]ố ồ ệ ừ ụ

Hai tu n sau, các ch i nguyên v n ph ng lên và phát tri n thành tầ ồ ẹ ồ ể ước, trong khi các ch i b  ch n thồ ị ấ ương đã phát tri n thành mô s o. T  6­8 tu n ngể ẹ ừ ầ ười ta có thể quan sát th y các ch i b t đ nh nh  màu xanh, trên mô s o. K t qu  th y r ng m tấ ồ ấ ị ỏ ẹ ế ả ấ ằ ặ  

c t nghiêng 2/3 ch i và đâm d c ch i đắ ồ ọ ồ ược coi là phương pháp t t nh t. M c dùố ấ ặ  

ph n l n ch i phát sinh b t đ nh t  mô s o, v n có m t ít phát sinh không b t đ nhầ ớ ồ ấ ị ừ ẹ ẫ ộ ấ ị  

t  các ch i bên còn l i trên m t ch n thừ ồ ạ ặ ấ ương

Sau 10 tu n l  các ch i b t đ nh v a đ  l n thì không l y ra đầ ễ ồ ấ ị ừ ủ ớ ấ ược, bi u hi nể ệ  lúc các lá hình thành ch i đ t đồ ạ ược chi u dài 5­10 mm và r  b t đ u xu t hi n .ề ễ ắ ầ ấ ệ  Cây con đượ ấc l y ra trong đi u ki n vô trùng, đề ệ ược tr ng trên môi trồ ường Knudson 

C và x  lý nh  cây con tr ng h t. Khi cây con đử ư ồ ạ ượ ấc l y ra, các ch i khác v n đồ ẫ ượ  chình thành và phát tri n.Tuy nhiên, n u đ  m t s  lể ế ể ộ ố ượng quá nhi u trên m t m t thìề ộ ắ  các ch i l n c n tr  s  phát tri n các ch i nh  Đ  đ m b o các ch i phát tri n liênồ ớ ả ở ự ể ồ ỏ ể ả ả ồ ể  

t c ta c y chuy n các khúc m t lúc đ u sang môi trụ ấ ề ắ ầ ường m i khi các ch i đớ ồ ựơ ấ  c l y

ra ho c khi môi trặ ường khô và c n ch t dinh dạ ấ ưỡng

       Hình 4: S  hình thành ch i sinh dự ồ ưỡng t  phát hoa.[6]ừ

2.5.2. Gieo h t lan H  Đi p n y m m trong đi u ki n invitrro [3]ạ ồ ệ ả ầ ề ệ

Các nhà khoa h c đã ti n hành thí nghi m trên m t s  gi ng lan H  Đi pọ ế ệ ộ ố ố ồ ệ  

nh m tìm đằ ược tu i qu  thích h p và lo i môi trổ ả ợ ạ ường nuôi c y t i  u cho vi cấ ố ư ệ  nhân gi ng b ng gieo h t. K t qu  nghiên c u đố ằ ạ ế ả ứ ược trình bày   b ng 4 và b ng 5ở ả ả