Nghiên cứu khảo sát khả năng nhân giống dâu tây Nhật “Penihuble”. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng từ các ngó dâu tây đạt tỷ lệ sống 93,33%, hình thành mô sẹo 60%, phôi sinh dưỡng (5,33 phôi/mẫu) trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l NAA, 0,5 mg/l BA.
Trang 1NHÂN GI ỐNG CÂY DÂU TÂY NHẬT (FRAGARIA ANANASSA “PENIHUBLE”)
T Ừ NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG
Trần Thị Ngọc Lan1
1 Trường Cao đẳng Kinh tế Kỹ thuật Lâm đồng
Thông tin chung:
Ngày nh ận bài: 18/01/2018
Ngày nhận kết quả bình duyệt:
18/02/2018
Ngày chấp nhận đăng: 04/2018
Title:
The process of
micropropagation of Fragaria
ananassa “Penihuble” through
apical meristem culture
Keywords:
α-naphtaleneacetic acid (NAA),
6-benzyladenine (BA), Apical
meristem, Fragaria ananassa
“Penihuble”, somatic embryos
Từ khóa:
α-naphtaleneacetic acid
(NAA), 6-benzyladenine
(BA), cây dâu tây, đỉnh sinh
trưởng, Fragaria ananassa
“Penihuble”, phôi sinh
dưỡng
ABSTRACT
A regeneration system was carried out to examine the competence of micropropagation from apical meristem culture of strawberry Fragaria ananassa “Penihuble” The results showed that calli and somatic embryos were formed from apical meristem culture of runner tips on the MS medium supplemented with 30 g/l sucrose, 7 g/l agar, 0.2 mg/l NAA, 0.5 mg/l BA (with the highest survival rate of 93.33%, the best induction callus rate of 60%, 5.33 somatic embryos/sample) Calli which was multiplied with 8.56 - fold fresh mass, formed somatic embryos with 15.78 embryos/initial callus when they were subcultured on the MS medium supplemented with 30 g/l sucrose, 7 g/l agar, 0.5 mg/l BA These embryos converted into normal plants on the ½ MS medium with the best regeneration rate of 100% without plant growth regulators Histological observation showed that these calli contained embryogenic cells In the ex-vitro culture, the highest survival rate was observed with mixture of Tribat substrate and rice husk ash in the ratio of 1:1 (72.33%) and no morphological variations were observed in these plantlets
TÓM T ẮT
Nghiên c ứu khảo sát khả năng nhân giống dâu tây Nhật “Penihuble” Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng từ các ngó dâu tây đạt tỷ lệ sống 93,33%, hình thành mô sẹo 60%, phôi sinh dưỡng (5,33 phôi/mẫu) trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l NAA, 0,5 mg/l BA Mô sẹo được tiếp tục nhân lên đạt tỷ lệ tăng trưởng 8,56 lần, hình thành phôi sinh dưỡng (15,78 phôi/mẫu) trên môi trường MS bổ sung 30 g/l sucrose, 7 g/l agar, 0,5 mg/l BA Môi trường ½ MS là phù hợp cho phôi sinh dưỡng phát triển thành cây với tỷ lệ 100% mà không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật Quan sát mô học mô sẹo cho thấy có nhiều tế bào có tiềm năng phát sinh phôi Cây con trồng trong tự nhiên với giá thể thích hợp là hỗn hợp đất sạch Tribat và trấu hun (tỷ lệ 1:1), tỷ lệ sống 72,33% Không có các sai hình nào được ghi nhận từ những cây này sau 30 ngày nuôi trồng
1 GI ỚI THIỆU
Cây dâu tây (Fragaria ananassa) thuộc họ Hoa
hồng (Rosaceae) là loại cây cho quả ngon, màu
sắc và hương thơm quyến rũ, được sử dụng làm
thực phẩm với nhiều món ăn ngon, đa dạng Quả
của cây dâu tây giàu chất khoáng, các hợp chất nhóm flavonoid chống oxi hóa, giàu các loại vitamin nhóm B và đặc biệt là lượng vitamin C khá cao, cao hơn cả cam, dưa hấu Đây là đặc điểm ưu việt của quả dâu tây, giúp tăng sức đề
Trang 2kháng, chống nhiễm trùng, nhiễm độc, cảm cúm,
tốt cho tim mạch và chống stress Quả dâu tây
cũng chứa nhiều acid ellagic, được xem là chất
2005) Vì vậy, đây là loại quả có tiềm năng kinh
tế lớn Trong các giống dây tây, giống dâu tây
Nhật nhập nội cho quả to, màu sắc đỏ, đẹp, đặc
biệt có độ ngọt và mùi hương hấp dẫn Tuy nhiên,
trong nhân giống dâu tây, phương pháp nhân
giống sinh dưỡng từ ngó dâu thường dễ nhiễm
bệnh và thoái hóa giống, phương pháp gieo hạt
thường cho cây biến dị, quả nhỏ
Trên thế giới đã có các công bố về vi nhân giống
dâu tây Wang, Wergin và Zimmerman (1984),
nuôi cấy các phôi chưa trưởng thành của quả dâu
tây để tạo phôi sinh dưỡng Hassan và cs (2010),
nhân giống các mắt đốt dâu tây Fragaria x
ananassa Duch trên môi trường MS bổ sung 1
mg/l BA và 0,1 mg/l NAA để nhân chồi, ra rễ trên
môi trường MS bổ sung 0,1 mg/l IAA và cho
thấy sử dụng GA3 hay nước dừa không ảnh hưởng
đáng kể đến quá trình nhân chồi của dâu tây Mir
và cs (2010), nhân chồi từ các mắt đốt dâu tây
trên môi trường MS bổ sung 2 mg/l BA và 0,5
mg/l NAA Moradi, Otroshy và Azimi (2011),
nhân giống các mắt đốt của cây dâu tây gieo hạt in
vitro trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA và
0,2 mg/l kinetin để nhân chồi, ra rễ trên môi trường MS bổ sung 0,1 mg/l BA và 0,2 mg/l IBA Ashrafuzzaman và cs (2013) đã nhân giống chồi
từ các ngó dâu tây trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA, ra rễ trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l IBA Husaini và cs (2008) đã có công
bố về sự hình thành phôi sinh dưỡng từ mô sẹo dâu tây được hình thành từ những mẫu lá trên môi trường MS bổ sung 4 mg/l TDZ Tuy nhiên, phương pháp tạo phôi sinh dưỡng từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thì chưa được đề cập Đây cũng
là phương pháp hữu hiệu trong nhân giống và gia tăng tỷ lệ không nhiễm virus Vì vậy, trong nghiên cứu này, mục tiêu mà chúng tôi hướng đến là nhân giống hàng loạt cây con từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng qua con đường phát sinh phôi sinh dưỡng với giống dâu tây Nhật nhập nội có giá trị kinh tế cao
2 V ẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
C ỨU 2.1 V ật liệu
Đối tượng nghiên cứu: các ngó của giống dâu tây
(Fragaria ananassa “Penihuble”), có xuất xứ từ Nhật, là các giống dâu cho trái to, ngọt và đẹp được nhập nội (Hình 1a, 1b) Trên thị trường tại
Đà lạt, 1 kg dâu tây loại này có giá khoảng
400000 Việt Nam đồng
Hình 1 Cây dâu tây (Fragaria ananassa “Penihuble”)
a Cây mang qu ả b Một đoạn ngó dâu tây
Trang 3Môi trường nuôi cấy cơ bản: MS (Murashige,
Skoog, 1962), pH được điều chỉnh 5,7, hấp vô
trùng ở 121 οC, 1 atm
2.2 Phương pháp
2.2.1 Kh ảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa
sinh trưởng thực vật lên quá trình nuôi
c ấy đỉnh sinh trưởng cây dâu tây
X ử lý nhiệt chồi dâu tây
Các ngó dâu tây được bỏ các lá ngoài, có chiều
dài từ 1 cm – 1,25 cm, rửa sạch dưới vòi nước
đang chảy, rửa lại bằng nước rửa chén Sunlight,
rửa lại dưới vòi nước đang chảy, khử trùng trong
tủ cấy bằng ethanol 900, rửa nước đã hấp vô trùng,
khử trùng tiếp bằng HgCl2 0,1% trong 6 phút, bỏ
bớt các lá ngoài, chỉ còn lại các chồi mang từ 4 - 5
lá non, rửa nước đã hấp vô trùng 3 lần Nuôi cấy
các chồi này trong môi trường MS bổ sung 30 g/l
sucrose, 7 g/l agar, cường độ ánh sáng 2000 lux
và độ ẩm không khí 70%, ủ trong điều kiện chiếu
sáng 16/24 giờ ở 37 οC trong 7 ngày nhằm tiêu
diệt virus (nếu có) Nuôi cấy 1 mẫu/bình có thể
tích 250 ml với 20 ml môi trường nuôi cấy
Nuôi c ấy đỉnh sinh trưởng
Các chồi đã được nuôi in vitro như trên được tách
tiếp các lá bao chồi, rửa nước đã hấp vô trùng 3
lần, dùng dao và kẹp tách lấy đỉnh sinh trưởng
mang từ 2 - 3 lá sơ khởi (thao tác được thực hiện
dưới kính lúp, Hình 2a1.) và cấy vào môi trường
MS bổ sung BA (0, 0,5 hoặc 1 mg/l), có kết hợp
hay không kết hợp NAA (0, 0,2 mg/l), 30 g/l
sucrose và 7 g/l agar Mỗi nghiệm thức gồm 5
mẫu Nuôi cấy 1 mẫu/bình có thể tích 250 ml với
20 ml môi trường nuôi cấy Theo dõi sự sống sót,
sự phát sinh mô sẹo, phôi sinh dưỡng hay chồi
của mẫu cấy sau 15 ngày và 30 ngày nuôi cấy
2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên
sự tăng trưởng của mô sẹo và hình thành
phôi sinh dưỡng dâu tây có nguồn gốc từ
nuôi c ấy đỉnh sinh trưởng
Các mô sẹo dâu tây hình thành từ nuôi cấy đỉnh
sinh trưởng (50 mg/mẫu) được nuôi cấy tiếp tục
trên môi trường MS bổ sung 30 g/l sucrose, 7 g/l
agar và các nồng độ khác nhau của BA (0, 0,5 mg/l) và NAA (0, 0,2 mg/l) Nuôi cấy 5 mẫu có khối lượng 50 mg/bình, thể tích 250 ml với 40 ml môi trường nuôi cấy Mỗi nghiệm thức gồm 5 bình Quan sát và thu nhận số liệu về tỷ lệ tăng trưởng (khối lượng mô sẹo sau nuôi cấy/khối lượng mô sẹo trước nuôi cấy), số phôi sinh dưỡng trung bình hình thành sau 30 ngày nuôi cấy
2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ môi trường MS lên sự sinh trưởng của phôi sinh dưỡng cây dâu tây
Các phôi sinh dưỡng thu nhận từ các thí nghiệm trên được nuôi cấy trên 3 loại môi trường: MS ¾
MS và ½ MS bổ sung 20 g/l sucrose, 1 g/l than
hoạt tính (AC) và 7 g/l agar để khảo sát sự sinh trưởng, hình thành cây và phát triển của các phôi này Nuôi cấy 20 mẫu/bình có thể tích 500 ml với
70 ml môi trường nuôi cấy Quan sát và thu nhận
số liệu về tỷ lệ hình thành cây con (số phôi hình thành cây con trên số phôi nuôi cấy *100), chiều cao, màu sắc của cây, số lá, số rễ và chiều dài rễ trung bình/cây sau 30 ngày nuôi cấy
2.2.4 Kh ảo sát ảnh hưởng của giá thể môi trường lên khả năng sống sót và sinh trưởng của cây dâu tây sau 30 ngày nuôi trồng trong điều kiện ex vitro
Cây con từ nuôi cấy in vitro được giữ nguyên
trong bình, chuyển ra ngoài vườn ươm trong 1 tuần để thích ứng Sau đó, cây con được lấy ra,
rửa sạch môi trường bám lên rễ, trồng trong các
loại giá thể: vỏ trấu hun, đất sạch (Tribat 10 kg/bao) hay hỗn hợp tro trấu hun và đất sạch (tỷ lệ 1:1), có độ ẩm 85% Cây được trồng trong các bầu
nhựa polyethylene, đường kính bầu 8 cm; tưới cây
2 lần/ngày Quan sát sự sống sót và sự sinh trưởng của cây dâu tây Số liệu được thu nhận sau 30 ngày nuôi trồng
2.2.5 Quan sát mô h ọc
Làm các loại tiêu bản về mô sẹo với việc cắt lát theo chiều ngang mẫu mô sẹo cần quan sát, ngâm trong dung dịch javel 10% trong 15 phút, rửa nước, ngâm trong dung dịch acid acetic 45% trong 15 phút, rửa nước, nhuộm màu bằng thuốc
Trang 4nhuộm hai màu đỏ carmin và xanh iod trong 15
phút, rửa nước và quan sát trên kính hiển vi quang
học Olympus, Nhật với độ phóng đại 40 - 400 lần
Quan sát đỉnh sinh trưởng cây dâu tây ở độ phóng
đại 100 lần
2.2.6 Điều kiện thí nghiệm
Tất cả các thí nghiệm nhân giống in vitro và ex
vitro được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại ba
lần Nhiệt độ phòng nuôi: 25 οC ± 1 οC, cường độ
ánh sáng 2000 lux và độ ẩm không khí 70% Chu
kỳ chiếu sáng trong ngày: 16 giờ sáng và 8 giờ
tối Trong thí nghiệm khảo sát sự thích nghi của
cây con trong điều kiện ex vitro thì sử dụng vườn
ươm (có lưới che 50% ánh sáng trong 15 ngày
đầu), có nhiệt độ dao động ngày đêm là 17 οC –
25 οC ± 1 οC, cường độ ánh sáng: 7000 lux và độ
ẩm không khí: 80%
2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn
toàn ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3
lần Các số liệu thu được là giá trị trung bình của
3 lần lặp lại Số liệu thu thập được xử lý trên phần
mềm Excel 2010 và được phân tích thống kê bằng
phép thử Duncan (sự khác biệt có ý nghĩa ở mức
xác suất P < 0,05) với phần mềm xử lý thống kê SPSS (Statistical Program Scientific System) 16.0
3 K ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng của NAA và BA lên quá trình nuôi c ấy đỉnh sinh trưởng cây dâu tây
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây dâu tây với việc bổ sung các nồng độ khác nhau của NAA và BA, kết quả nhận được thể hiện qua Bảng 1
Quan sát mẫu đỉnh sinh trưởng cây dâu tây trên kính hiển vi có hình vòm (Hình 2a1) Đây là nơi
chứa các tế bào mô phân sinh với những tế bào kích thước nhỏ, nhân to và có tiềm năng phân chia mạnh mẽ Có thể gọi đỉnh sinh trưởng là nơi chứa các tế bào gốc, nơi biệt hóa các cơ quan sau này Thông thường, các virus di chuyển dễ dàng trong
cơ thể thực vật thông qua hệ thống mạch dẫn, là cấu trúc mà ở đỉnh phân sinh không có Chính vì
vậy, mô phân sinh đỉnh thường khó nhiễm virus (Morel, 1960) Hơn nữa, hoạt tính trao đổi chất cao trong quá trình phân chia của các tế bào mô phân sinh cũng như nồng độ auxin nội sinh cao ở trong các đỉnh chồi có thể ức chế sự sinh sản, sao chép của virus
B ảng 1 Ảnh hưởng của NAA và BA lên quá trình nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây dâu tây sau 30 ngày nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy bổ
(%)
T ỷ lệ hình thành mô s ẹo (%)
S ố phôi/mẫu T ỷ lệ hình
thành ch ồi (%)
NAA(mg/l) BA(mg/l)
Chú thích: *: Các mẫu tự khác nhau (a,b, ) trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với P <0,05 bằng phép thử Duncan
Đỉnh sinh trưởng có thể hình thành phôi sinh
dưỡng với tiềm năng nhân phôi IAA được hình
thành từ đỉnh sinh trưởng làm cho môi trường
nuôi cấy nếu có bổ sung IAA sẽ làm giảm khả
năng nhân lên của phôi, vì vậy, nghiệm thức chỉ
bổ sung 0,2 mg/l NAA là không khả thi Ở nghiệm thức bổ sung 0,2 mg/l NAA và 0,5 mg/l
BA cho tỷ lệ sống sót cũng như tỷ lệ hình thành
mô sẹo và phôi sinh dưỡng là cao hơn cả (tương ứng lần lượt là 93,33% và 60% với số phôi trung
Trang 5bình đạt 5,33 phôi/mẫu) Mô sẹo phôi màu vàng
đã hình thành sau 15 ngày nuôi cấy (Hình 2a2)
Mô sẹo hình thành và các phôi phát triển độc lập
sau 30 ngày nuôi cấy (Hình 2b)
Các auxin như NAA cần kết hợp với IAA nội sinh
ở mô phân sinh đỉnh chồi, kích thích tế bào cảm
ứng thành phôi (Jiménez & Thomas, 2005) Đây
cũng có thể là yêu cầu chủ yếu trong quá trình
phát sinh phôi Sự kết hợp giữa NAA và BA làm
tế bào mô phân sinh dãn vách, tăng kích thước,
tăng khả năng phân chia, giúp tế bào sống sót và
biệt hóa khả năng tế bào gốc của mình để hình
thành phôi sinh dưỡng Sự tham gia tuy với nồng
độ thấp của NAA đã phối hợp với BA gia tăng
khả năng phân bào của các phôi sinh dưỡng Sự
kết hợp giữa NAA và BA trong nuôi cấy phôi
thường áp dụng trong nuôi cấy nhân phôi họ Lan
(Orchidaceae) hay nhân chồi từ các đoạn thân như
công bố của Mir và cs (2010) trên đối tượng dâu
tây Fragaria x ananassa
Sự hình thành phôi sinh dưỡng từ phôi non của cây dâu tây đã được báo cáo bởi Wang và cs (1984) Tuy nhiên, sự biệt hóa từ phôi non thường
có kiểu di truyền không giống với cây mẹ Nhân giống tạo phôi sinh dưỡng từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường cho thế hệ cây con tương đồng về
kiểu di truyền với cây mẹ Đây cũng là ưu thế của việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (Morel, 1964)
3.2 Ảnh hưởng của NAA và BA lên lên sự
tăng trưởng của mô sẹo, hình thành phôi sinh dưỡng có nguồn gốc từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng dâu tây
Các mẫu mô sẹo tiếp tục nuôi cấy sẽ tăng trưởng
và hình thành phôi sinh dưỡng (Hình 2c, 2e) Các
số liệu về sự tăng trưởng của mô sẹo và sự hình thành phôi sinh dưỡng dâu tây được trình bày qua Bảng 2
B ảng 2 Ảnh hưởng của NAA và BA lên quá trình nhân lên của phôi sinh dưỡng có nguồn gốc từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây dâu tây sau 30 ngày nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy bổ sung T ỷ lệ tăng trưởng của
Chú thích: *: Các m ẫu tự khác nhau (a, b, ) trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với P <0,05 bằng phép thử Duncan
Các nghiên cứu nhân giống dâu tây từ ngó của
Moradi và cs (2011) hoặc của Nayem và cs
(2011) cho thấy, ngoài 0,5 mg/l BA, cần bổ sung
vào môi trường nuôi cấy từ 0,2 mg/l – 2 mg/l
kinetin để nhân chồi nhưng trong nghiên cứu này
chỉ cần bổ sung 0,5 mg/l BA là đủ để mô sẹo phát
triển với tỷ lệ tăng trưởng gấp 8,56 lần so với khối
lượng ban đầu và số phôi hình thành/mẫu đạt cao
nhất trong các nghiệm thức (15,78 phôi/mẫu)
Điều này cho thấy, tiềm năng phát sinh phôi khi
nuôi cấy đỉnh sinh trưởng dâu tây, chỉ cần 1 lượng
vừa đủ chất điều hòa sinh trưởng thực vật
(CĐHSTTV) là đủ để chúng phát sinh phôi và biệt hóa thành cây Trong nghiên cứu sự hình thành phôi sinh dưỡng, sự giảm nồng độ auxin và bổ sung hàm lượng citokinin thường kích thích các
mô sẹo hình thành phôi Sự bổ sung chỉ BA trong nghiên cứu này một lần nữa đã khẳng định điều này Sự quan trọng của BA trong việc nhân chồi dâu tây cũng đã được trình bày ở một số nghiên cứu (Adel & Sawy, 2007; Biswas & cs., 2007; Hasan, Nigar, Rabby, Mizan & Rahman, 2010)
Trang 63.3 Ảnh hưởng của nồng độ môi trường MS
lên s ự sinh trưởng của phôi sinh dưỡng
dâu tây
Nồng độ các chất dinh dưỡng ảnh hưởng đến khả
năng biệt hóa và phát triển thành cây của phôi
sinh dưỡng dâu tây với các kết quả nhận được, thể
hiện qua Bảng 3
Tỷ lệ hình thành cây con đạt cao nhất trên môi
trường ½ MS (100%) Tỷ lệ hình thành cây con
trên hai môi trường còn lại có thấp hơn do một
phần số phôi tiếp tục nhân lên (Hình 2f) Điều này
cho thấy, bản chất nhân phôi của các phôi sinh
dưỡng dâu tây trên môi trường đủ dinh dưỡng
mặc dù không bổ sung CĐHSTTV Trên môi
trường MS, phôi phát triển thành cây con nhưng
cây cao, lá mọng, xanh không đậm Trên môi
trường ½ MS tuy chiều cao cây có thấp hơn hai môi trường còn lại nhưng cây cho lá xanh đậm, cứng cáp với số rễ và chiều dài rễ đạt tương đương với hai môi trường trên (Bảng 3, Hình 2g) Các nghiên cứu của Adel và Sawy (2007) hay Ashrafuzzaman và cs (2013) đã sử dụng IBA để kích thích ra rễ các chồi dâu tây in vitro, trong nghiên cứu của chúng tôi đã không sử dụng CĐHSTTV nhưng các phôi dâu vẫn phát triển, hình thành cây con hoàn chỉnh, minh chứng cho
bản chất tự lập của phôi sinh dưỡng dâu tây
Việc sử dụng than hoạt tính nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của rễ nhờ hấp phụ các chất thải có tính ức chế do cây tiết ra; đồng thời làm giảm cường độ ánh sáng đến môi trường vùng
rễ
nuôi c ấy
Môi trường
nuôi c ấy
T ỷ lệ hình thành cây con (%)
Chi ều cao cây
r ễ (cm)
Chú thích: *: Các m ẫu tự khác nhau (a, b, ) trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với P <0,05 bằng phép thử Duncan
3.4 Ảnh hưởng của giá thể môi trường lên
kh ả năng sống sót và sinh trưởng của cây
dâu tây sau 30 ngày nuôi tr ồng
Nuôi cấy cây con dâu tây trong điều kiện ex vitro
thường khó, tỷ lệ chết rất cao do cây mọng nước,
dễ nhiễm khuẩn Chính vì vậy, giá thể nuôi trồng
là yếu tố quan trọng trong sự sống sót và phát triển của cây trong điều kiện ex vitro
B ảng 4 Ảnh hưởng của giá thể môi trường lên khả năng sống sót và sinh trưởng của cây dâu tây sau 30 ngày nuôi
tr ồng
Giá th ể môi trường T ỷ lệ cây sống
sót (%)
cây (cm)
m ới/cây Hình thái c ủa cây
không đậm, rễ phát triển kém
Cây có chiều cao vừa phải, lá
cứng cáp, xanh đậm, rễ phát triển
Trang 7Giá th ể môi trường T ỷ lệ cây sống
sót (%)
cây (cm)
m ới/cây Hình thái c ủa cây
Hỗn hợp đất sạch
Tribat và trấu hun (tỷ
lệ 1:1)
xanh đậm, rễ phát triển
Chú thích: *: Các mẫu tự khác nhau (a, b, ) trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với P <0,05 bằng phép
th ử Duncan
Giai đoạn đầu (15 ngày), khi mới đưa ra vườn
ươm, cây rất dễ mất nước nên cây được trồng
trong điều kiện che sáng 50% Sau đó, cây được
trồng trong vườn ươm có giàn che polyethylene
Các kết quả khảo sát nhận được thể hiện qua Bảng
4
Từ Bảng 4 cho thấy, việc sử dụng giá thể đất sạch
Tribat hay hỗn hợp đất sạch Tribat và trấu hun
đều cho tỷ lệ sống sót khá cao (tương ứng lần lượt
70,33% và 72,33%), cây cho lá xanh đậm, hình
thành rễ mới, phát triển tốt sau 30 ngày nuôi trồng
(Hình 2h) Tuy nhiên, sử dụng hỗn hợp đất sạch
Tribat và trấu hun sẽ có giá thành thấp hơn so với
việc sử dụng giá thể đất sạch Tribat
Các nghiên cứu về trồng cây dâu vi nhân giống
trong điều kiện ex vitro trong và ngoài nước hầu
hết đều sử dụng giá thể là đất sạch đóng gói sẵn
hay hỗn hợp than bùn và vermiculite (Moradi &
cs., 2011) Vì vậy, việc sử dụng bổ sung trấu hun
(một vật liệu dễ kiếm và rẻ tiền) trong trồng cây
dâu con có lẽ là hữu hiệu và khả thi
3.5 Quan sát mô h ọc
Quan sát các tiêu bản vi phẫu mô sẹo cho thấy có
sự phân chia vô tổ chức của các tế bào mô sẹo,
tồn tại các tế bào đẳng kính, nhân to là những tế
bào có khả năng hình thành phôi (Hình 2d) Nuôi
cấy tiếp tục các mô sẹo này trên môi trường
không bổ sung CĐHSTTV, chúng sẽ biệt hóa
thành các phôi sinh dưỡng Các phôi tiếp tục phát
triển và hình thành cây con, phát triển độc lập mà không liên kết với mẫu mô mẹ (Hình 2b, 2e) Vì vậy, nhân giống dâu tây qua con đường phát sinh phôi sinh dưỡng có nguồn gốc từ đỉnh sinh trưởng
là biện pháp hữu hiệu và khả thi
4 K ẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 4.1 K ết luận
Qua con đường vi nhân giống cây dâu tây cho thấy, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây dâu tây đã hình thành mô sẹo (tỷ lệ đạt 60%) trên môi trường
MS bổ sung 0,2 mg/l NAA, 0,5 mg/l BA Các mô
sẹo này được nhân lên với tỷ lệ tăng trưởng đạt 8,56 lần, hình thành phôi sinh dưỡng với số phôi trung bình là 15,78 phôi/mẫu trên môi trường MS
bổ sung 0,5 mg/l BA Môi trường ½ MS là phù
hợp cho các phôi dâu tây phát triển thành cây con với tỷ lệ hình thành cây con đạt 100% mà không cần bổ sung CĐHSTTV Trong nuôi trồng ex
vitro, hỗn hợp đất sạch Tribat và trấu hun (tỷ lệ 1:1) là giá thể thích hợp để trồng cây trong điều kiện tự nhiên, tỷ lệ sống sót đạt 72,33%
4.2 Khuy ến nghị
Cần có các khảo sát về sự sinh trưởng và phát triển của những cây dâu con này để có thể áp dụng trong nhân giống đại trà giống cây có giá trị này (Thực tế, những cây dâu trong ống nghiệm này đã được bán cho bà con nông dân đường Đa Phú, phường 7, thành phố Đà lạt Đến nay, cây đã cho quả đạt chất lượng)
Trang 8Hình 2 Nhân gi ống cây dâu tây (Fragaria ananassa “Penihuble”) qua con đường nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
a 1 Đỉnh sinh trưởng; a 2 Mô sẹo hình thành từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (mũi tên) sau 15 ngày nuôi cấy; b Sự hình thành phôi sinh dưỡng (mũi tên liền), mô sẹo mang phôi (mũi tên ngắt quãng) và cây con sau 30 ngày nuôi cấy; c Sự nhân lên của mô sẹo; d Tiêu bản nhuộm màu mẫu mô sẹo có khả năng phát sinh phôi; e Sự hình thành cây con từ phôi sinh dưỡng;
f Phát sinh cây con từ mô sẹo cây dâu tây; g Các cây con dâu tây hình thành và phát triển từ phôi sinh dưỡng; h Trồng
cây con trong điều kiện vườn ươm
L ỜI CẢM ƠN
Tác giả trân trọng cảm ơn Trường Cao đẳng Kinh
tế Kỹ thuật Lâm Đồng đã tạo điều kiện vật chất
cho nghiên cứu này
TÀI LI ỆU THAM KHẢO
Adel, E.L & Sawy, M (2007) Somaclonal
variation in micro-propagated strawberry
detected at the molecular level International
Journal of Agricultural Biology, 9, 720 - 725
Ashrafuzzaman, M., Faisal, S., Yadav, M.,
Khanam, D & Raihan, F (2013)
Micropropagation of strawberry (Fragaria
ananassa) through runner culture Bangladesh Journal of Agricultural, 38(3), 467 - 472
Biswas, M.K., Hossain, M., Ahmed, M.B., Roy, U.K., Karim, R., Razvy, M.A., Salahin M & Islam, R (2007) Multiple shoots regeneration
of strawberry under various colour
illuminations American-European Journal of
Science Res, 2, 133 -135
Hasan, M.N., Nigar, N., Rabbi, M.A.K., Mizan,
Micropropagation of strawberry (Fragaria x
Trang 9ananassa Duch.) Int Journal Sustain Crop
Pro, 5(4), 36 - 41
Husaini, C.A., Samina, A., Mukhtar, B.,
Tabassum, Q & Malik, Z.A (2008) A high
efficiency direct somatic embryogenesis
system for strawberry (Fragaria x ananassa
Duch.) cultivar Journal Crop Science
Biotechnology, 11 (2), 100 - 107
ICAR News (2005) Indian council of agriculture
research, 11(4) New Delhi, India
Jiménez, V.M & Thomas, C (2005)
Participation of plant hormones in
determination and progression of somatic
embryogenesis In: Somatic embryogenesis,
Mujib, A., Šamaj, J (eds.) Plant Cell Monogr,
Springer-Verlag Berlin Heidelberg,103 - 118
Mir, J.I., Ahmed, N., Rizwan, R., Shabir H.,
Hidayatullah, M & Sheikh, M.A (2010)
Micropropagation of strawberry (Fragaria x
ananassa) Crop Improvement, 37 (2), 153
-156
Moradi, K., Otroshy, M & Azimi, M.R (2011)
Micropropagation of strawberry by multiple
shoots regeneration tissue cultures Journal
Agricultural Technology, 7(6), 1755 - 1763
Morel, G.M (1960) Producing virus-free
Cymbidium Am Orchid Society Bull, 29, 495 -
497
Morel, G.M (1964) Tissue culture − A new means of clonal propagation of orchids
American Orchid Society Bull, 33, 473 - 478
Murashige, T & Skoog, F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobaco tissue culture Physiology Plant, 15,
473 - 497
Nayem, Z., Shamsul, H., Saif, U., Fazle, A & Ashrafuzzaman, M (2011) Study
of shoot multiplication of strawberry
(Fragaria ananassa) Int J Agri Res Innov
Tech, 1 (1 & 2), 69 - 72
Wang, D.Y., Wergin, W.P & Zimmerman, R.H (1984) Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryo of
strawberry Horticulture Science, 19, 71 - 72
Website (2004)
http://www.dricolls.com/strawberries/nutrition html