Đề tài khảo sát đặc điểm thực vật và mã vạch ADN của cây An xoa (Helicteres hirsute L., Sterculiaceae) nhằm hỗ trợ cho việc định danh loài An xoa phân bố ở Bình Phước.
Trang 1KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ MÃ VẠCH ADN
CỦA CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTE L., STERCULIACEAE)
Ở BÌNH PHƯỚC, VIỆT NAM
Trương Thị Bảy * , Trương Thị Đẹp ** , Đỗ Thị Hồng Tươi **
TÓM TẮT
Mục tiêu: Đề tài khảo sát đặc điểm thực vật và mã vạch ADN của cây An xoa (Helicteres hirsute L.,
Sterculiaceae) nhằm hỗ trợ cho việc định danh loài An xoa phân bố ở Bình Phước
Phương pháp: Đề tài đã mô tả đặc điểm hình thái của mẫu An xoa thu thập trong tự nhiên ở huyện Lộc
Ninh, tỉnh Bình Phước Mẫu lá non được sử dụng để phân tích mã mạch ADN dựa trên vùng gen rbcL trong ADN lục lạp cloropast ADN (cpDNA) được khuyếch đại bằng phản ứng PCR từ ADN toàn phần tách chiết từ mẫu lá An xoa non Sản phẩm PCR được giải trình tự bằng phương pháp Sanger, dùng phần mềm BioEdit 7.0.5
So sánh với trình tự tương ứng công bố trên GenBank bằng phương pháp BLAST để định danh loài dựa trên mã vạch ADN
Kết quả: Quan sát và mô tả đặc điểm thực vật, đặc điểm vi phẫu, bột dược liệu của thân và lá An xoa Giải
trình tự đoạn rbcL của mẫu lá An xoa non thu hái ở tỉnh Bình Phước cho thấy mẫu có độ tương đồng 100% so với trình tự ADN của mẫu đối chứng Helicteres hirsuta L được công bố trên Genbank
Kết luận: Kết quả của nghiên cứu cung cấp thông tin về đặc điểm thực vật và mã vạch ADN của loài An
xoa ở tỉnh Bình Phước góp phần trong công tác định danh loài làm nguyên liệu cho các nghiên cứu về hóa thực vật hoặc tác dụng sinh học của dược liệu này
Từ khóa: An xoa, đặc điểm thực vật, mã vạch ADN, rbcL
ABSTRACT
STUDY ON BOTANICAL CHARACTERISTICS AND DNA BARCODES OF
HELICTERES HIRSUTE L., STERCULIACEAE IN BINH PHUOC PROVINCE, VIETNAM
Truong Thi Bay, Truong Thi Dep, Do Thi Hong Tuoi
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 670 – 679
Objectives: This work studied on botanical characteristics and DNA barcodes of Helicteres hirsute L., Sterculiaceae to help identification of this plant in Binh Phuoc province
Methods: This study described morphological characteristics of H hirsute L collected naturally in Loc Ninh
district, Binh Phuoc province Fresh leaf was used to analyze DNA barcodes based on rbcL region of chloroplast DNA Total DNA from leaf were amplified by PCR using rbcL primers DNA products were identified the sequences by Sanger method, using BioEdit 7.0.5 software Comparison to rbcL sequences of control published in GenBank by BLAST will help to identify H hirsuta
Results: The study observed, described botanical and microscopic characteristics of H hirsute steam and leaf
Results of rbcL sequences of H hirsute leaf collected in Binh Phuoc province showed that its similarity in
comparison with H hirsute control published in Genbank is 100%
Conclusion: Results of this study provided information about botanical characteristics and DNA barcodes of
*Khoa Dược, Trường Cao đẳng Y tế Bình Phước
Trang 2H hirsute in Binh Phuoc province This could be useful for identify this medicinal plant to research its chemical components as well as biological effects
Key words: Helicteres hirsute L., botanical characteristics, DNA barcodes, rbcL
ĐẶT VẤN ĐỀ
An xoa (Helicteres hirsuta L.) có nguồn gốc từ
Campuchia được sử dụng trong dân gian để
điều trị các bệnh về gan Ở Việt Nam, An xoa
được tìm thấy ở khắp các tỉnh từ Bắc vào Nam
An xoa còn được gọi là Dó lông, dùng làm
thuốc chữa ung nhọt; rễ làm thuốc giảm đau,
tiêu độc, kiết lị, cảm cúm, đậu, sởi, sốt rét và rắn
độc cắn; vỏ thân dùng dệt bao tải(8) Gần đây, An
xoa được người Việt Nam truyền miệng như
“thần dược” đối các bệnh gan, đặc biệt là ung
thư gan nhờ khả năng ức chế sự phân chia của tế
bào ung thư gan Vì vậy, An xoa đang bị khai
thác ráo riết làm cho nguồn dược liệu này trong
tự nhiên ngày càng cạn kiệt Việc định danh An
xoa có thể gặp khó khăn do có sự tương đồng
cao về đặc điểm hình thái của thân, lá với các
loài thuộc chi Helicteres như H angustifolia, H
hirsuta, H viscida, H glabriuscula, H lanceolata, H
isora Để khắc phục nhược điểm của việc định
danh dựa trên đặc điểm hình thái, phương pháp
định danh dựa trên đặc điểm di truyền được
nghiên cứu và phát triển Trên thực vật, mã vạch
ADN là phương pháp phổ biến nhất dựa trên
những đoạn ADN ngắn, kém được bảo tồn, thay
đổi nhiều trong tiến hóa, thường là trình tự
thuộc hệ gen lục lạp như matK, rbcL, rpoC1,
Hiện nay, ở Việt Nam chưa có công trình nào
nghiên cứu đặc điểm mã vạch ADN của cây An
xoa Do đó, đề tài này tiến hành khảo sát đặc
điểm thực vật và mã vạch ADN của cây An xoa
phân bố ở tỉnh Bình Phước nhằm hỗ trợ định
danh loài dược liệu này
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Vật liệu khảo sát đặc điểm thực vật là mẫu
cây An xoa được thu thập trong tự nhiên tại
huyện Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước vào tháng
9-10/2017 Tiêu bản mẫu được lưu tại Bộ môn
Thực vật, Khoa Dược, Đại học Y dược Tp Hồ Chí Minh Vật liệu phân tích mã vạch ADN là mẫu lá non, tươi thu thập từ cây An xoa trong tự nhiên ở tỉnh Bình Phước
Hóa chất
Đệm CTAB (CTAB 2%, Tris-HCl 100
mM pH 8,0, EDTA 20 mM pH 8,0, NaCl 1,4 M),
β-mercaptoethanol, cloroform : isoamyl alcohol (24:1), enzym Rnase và agarose từ Bio Basic, Canada; isopropanol, ethanol 70%, PCR Mix do NEXpro, Korea; thuốc nhuộm GelRed, đệm TAE 1X, loading dye 6x, Ladder 1 kb plus, TE pH 8,0, nước cất 2 lần vô trùng
Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát đặc điểm hình thái
Mô tả phân tích đặc điểm hình thái của thân,
lá, hoa, quả
Khảo sát đặc điểm vi phẫu
Cắt thân, lá thành các mảnh mỏng, nhuộm
và làm tiêu bản vi phẫu Quan sát, mô tả và chụp ảnh các đặc điểm vi phẫu qua kính hiển vi
Khảo sát đặc điểm vi học
Thân, lá được phơi khô, nghiền mịn và làm tiêu bản bột Quan sát, mô tả và chụp ảnh các đặc điểm qua kính hiển vi
Khảo sát đặc điểm mã vạch ADN
Thực hiện phản ứng PCR khuyếch đại vùng
trình tự rbcL trong ADN lục lạp cloropast ADN
(cpDNA) của mẫu An xoa
Tách chiết ADN toàn phần
ADN toàn phần từ mô lá được tách chiết theo phương pháp của Doyle và Doyle (1990)(1)
tómtắt như sau: Nghiền lá non, phá màng tế bào trong đệm CTAB 2X, ủ ở 65 oC 15 phút Bổ sung CTAB, trộn đều, ly tâm 13000 rpm 10 phút, loại cắn tế bào Chiết ADN bằng β-mercaptoethanol
ở 65 oC 60 phút, thêm 500 µl cloroform, trộn đều,
Trang 3ly tâm 13000 rpm 10 phút Rửa ADN bằng
cloroform (2 lần, ly tâm 13000 rpm 10 phút/lần)
Hút lấy 350 µl lớp dịch bên trên, thêm 5 µl
RNase, lắc đều, ủ 37 oC 2 giờ Sau đó, thêm
CTAB 2X và 500 µl cloroform, ly tâm 13000 rpm
10 phút Hút 400 µl lớp dịch, thêm 400 µl
isopropanol, trộn đều, ủ ở -20 oC 30 phút, ly tâm
13000 rpm 10 phút Thu tủa ADN, rửa 2 lần bằng
ethanol 70%, làm khô trong 1 giờ, hòa tan trong
30 µl TE và bảo quản ở -20 oC
Kiểm tra ADN
Bằng cách điện di trên gel agarose 1% trong
TAE 1X Trộn mẫu với 1 µl loading dye 6X, 1 µl
ADN, 1 µl GelRed, 3 µl nước cất, bơm mẫu vào
giếng, chạy điện di ở 85V 30 phút Sau đó, chụp
ảnh với máy đọc gel bằng UV
Khuếch đại AND
Sử dụng PCR Kit (NEXproTM Diagnostics)
gồm 10X e-Taq Buffer, 10 mM dNTP, e-Taq
DNA polymerase, thêm nước cất, cặp mồi rbcL
và ADN để có thể tích 50 µl Trộn đều, cho vào
máy GeneAmp PCR System 2700, thực hiện PCR
với chu trình nhiệt như sau: 5 phút - 95 oC; (30
giây - 95 oC, 30 giây - 60 oC, 30 giây - 72 oC) x 35
chu kỳ; 5 phút - 72 oC, sau đó giữ ở 10 oC 20 phút
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel
agarose 1%
Bảng 1: Trình tự cặp mồi rbcL sử dụng trong phản
ứng PCR
Tên
mồi
( o C) Tác giả
rbcL.F ATGTCACCACAAACAGAGACT
AAAGC
60
Levin et al.,
2003(5)
Fazekas et
al., 2008(2) rbcL.R GTAAAATCAAGTCCACCRCG
Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự
đoạn AND
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit
Wizard SV Gel và PCR Clean-up System
(Promega), xác định trình tự bằng phường pháp
Sanger (Sanger et al., 1977) tại Công ty Phù Sa
Biochem, TP Vĩnh Long, tỉnh Vĩnh Long(6)
Phân tích số liệu
Trọng lượng phân tử được tính toán bằng phần mềm GelAnalyzer(4) Kết quả giải trình tự được lưu trữ ở dạng FASTA và phân tích bằng phần mềm BioEdit phiên bản 7.0.5(3) Trình tự được so sánh với trình tự tương ứng đã được công bố trên GenBank bằng phương pháp BLAST, từ đó kết luận mã vạch phân tử để định
danh loài
KẾT QUẢ
Đặc điểm hình thái
Cây bụi cao 1-3 m, nhánh hình trụ, có
lông Lá: Lá hình trái xoan, dài 5 - 17 cm,
rộng 2,5 - 7,5 cm Gốc cụt hay hình tim, đầu thon thành mũi nhọn Mép có răng không đều Mặt dưới màu trắng, cả hai măt phủ đầy lông hình sao; gân gốc 5, cuống lá dài 0,8 - 4 cm, lá kèm
hình dải, có lông, dễ rụng Hoa: Cụm hoa là
những bông ngắn, đơn hay xếp đôi ở nách lá Hoa màu hồng hay đỏ, cuống hoa có khớp và có
lá bắc dễ rụng, đài hình ống phủ lông hình sao, màu đo đỏ, chia 5 răng Cánh hoa 5, cuống bộ nhị có vân đỏ, nhị 10, nhị lép bằng chỉ nhị, bầu
có nhiều gợn, chứa 25-30 màu trong mỗi lá noãn
Quả: Quả nang hình trụ nhọn đầy lông xám, hạt
nhiều, hình lăng trụ
Đặc điểm vi phẫu
Đặc điểm vi phẫu của thân
Mặt cắt ngang gần như tròn, biểu bì là 1 lớp
tế bào có nhiều lông che chở đa bào, phân 3 - 4 nhánh Biểu bì lồi chỗ chân lông, có nhiều lông che chở đa bào hình sao, lông tiết chân đơn bào, đầu đa bào Bần ở thân già 3 - 4 lớp tế bào hình chữ nhật, bên dưới là lục bì gồm 2 - 3 lớp tế bào xếp xuyên tâm Bên dưới biểu bì là 4 – 5 lớp mô dày góc liên tục, tế bào hình đa giác Mô mềm vỏ đạo, 5 – 6 lớp tế bào mô mềm hình bầu dục, nằm ngang, kích thước không đều, chứa nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai Trụ bì có 5 - 7 lớp tế bào hóa mô cứng rải rác thành cụm Libe 1 xếp thành từng cụm bên dưới trụ bì, chứa nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai Sợi libe kết thành 2 tầng gồm 1 - 2 lớp tế bào hóa mô cứng không
Trang 4liên tục Libe 2 gồm 2 - 3 lớp tế bào hình chữ
nhật, rải rác có các tinh thể calci oxalat hình cầu
gai Gỗ 2 liên tục gồm 15 - 18 lớp tế bào mô mềm
gỗ xếp xuyên tâm Mạch gỗ 2 to, rải rác, hình
tròn hoặc đa giác Gỗ 1 bên dưới gỗ 2 xếp thành
từng cụm 3 - 4 bó, phân hóa ly tâm, mô mềm gỗ
1 là những tế bào hình đa giác Mô mềm tủy đặc, hình đa giác, rải rác tinh thể calci oxalat hình cầu gai và túi tiết Thân già mô mềm tủy chứa nhiều tinh bột
Hình 1: Cây An xoa
Hình 2: Vi phẫu thân non (trái) và thân già (phải)
Trang 5Hình 3 : Đặc thể vi phẫu của thân An xoa
Đặc điểm vi phẫu của cuống lá
Mặt cắt ngang hình trứng Biểu bì mang
nhiều lông che chở phân nhánh như thân non và
nhiều lông tiết chân đơn bào, đầu đa bào Bên
dưới biểu bì là mô dày góc liên tục gồm 4 - 5 lớp
tế bào, nhiều hơn ở phần lồi của cuống lá Mô
mềm vỏ là mô mềm đạo, tế bào hình đa giác, gần tròn, kích thước không đều, có nhiều túi tiết và tinh thể calci oxalat hình cầu gai Trụ bì hóa mô cứng thành từng cụm 4 - 5 lớp tế bào Libe 1 tập trung bên dưới đám trụ bì Gỗ 1 hình vòng tròn Bên trong là mô mềm tủy có nhiều khuyết
Hình 4: Vi phẫu cuống lá An xoa
Lông che chở
đa bàohình sao
Mô dày góc
Tinh thể calci oxalat hình cầu gai
Mô mềm vỏ
Trang 6Đặc điểm vi phẫu của lá
Gân giữa lồi ở cả hai mặt Biểu bì trên và
biểu bì dưới mang lông che chở phân nhánh và
lông tiết Bên dưới biểu bì là mô dày góc, phần
biểu bì trên mô dày nhiều lớp tế bào hơn biểu bì
dưới Mô mềm đạo, nhiều túi tiết và tinh thể
calci oxalat hình cầu gai Trụ bì hóa mô cứng thành từng cụm 3-4 lớp tế bào Hệ thống mô dẫn gồm libe 1 ở ngoài, gỗ 1 ở trong xếp thành vòng bán nguyệt Mạch gỗ xếp xuyên tâm, mạch to ở ngoài, mạch nhỏ ở trong Bên trong cùng là mô mềm tủy
Hình 5: Vi phẫu phiến lá An xoa
Hình 6: Đặc điểm vi phẫu của lá An xoa
Đặc điểm vi phẫu của hoa
Hoa tự bông ở nách lá, mọc thành cụm 2 -
3 bông, mỗi bông có 6 – 12 hoa mọc thành 2
dãy trên trục mang hoa Cuống hoa hình trụ,
dài 3 - 4 mm, đường kính khoảng 1 mm, màu
tím nhạt, có nhiều lông Lá bắc hình vảy nhỏ,
dài khoảng 3 - 4 mm, màu xanh hơi tím, có
nhiều lông, rụng sớm Lá bắc con giống lá
bắc, mọc phía đối diện lá bắc
Định hướng: Cánh hoa giữa ở phía trước,
lá đài giữa ở phía sau
Đài hoa: 5 lá đài dính thành ống đài hình
ống, trên chia 5 thùy hình tam giác dài
khoảng 3 mm Ống đài dài khoảng 1,5 cm,
màu tím, có nhiều lông che chở hình sao
Tiền khai đài van
Cánh hoa: 5 cánh hoa rời, không đều 2 cánh trên to, rộng khoảng 3 mm, có phiến màu tím, phần gân phớt màu vàng, có ít lông, hơi quặp lại phía sau, 3 cánh hoa dưới nhỏ hơn, rộng khoảng 1,5 - 2 cm, phần gần phiến chia 2 thùy màu trắng Tiền khai hoa vặn
Bộ nhị có hùng thư đài dài 1,5 cm, màu trắng, mang 10 nhị rời, chỉ nhị trắng, dài 2
mm Bao phấn 2 ô, hình bầu dục, nứt dọc, hướng ngoại Hạt phấn màu trắng, rời, hình khối tam giác
Bộ nhụy: Bầu thượng, 5 lá noãn, bầu 5 ô, mỗi ô 1 noãn, đính noãn trung trụ Bầu hình bầu dục, hơi nhọn phần đỉnh, màu xanh, mang nhiều lông màu hồng 1 vòi nhụy màu trắng đính ở đỉnh bầu, dài khoảng 1,5 mm, 1 đầu nhụy trắng, trên cùng chia 5 gờ nhỏ Có đĩa mật ở đế hoa
Trang 7Hùng thư đài Hạt phấn
Hình 7: Cánh, bộ nhị và bộ nhụy của hoa An xoa
Đặc điểm bột dược liệu
Bột lá
Bột màu xanh, nhiều xơ, không mùi, vị hơi
đắng Thành phần gồm mảnh biểu bì dưới, tế
bào hình đa giác, vách uốn lượn, mang
nhiều lỗ khí kiểu dị bào Mô mềm giậu hình
ngang, tế bào hình đa giác chứa tinh bột và
tinh thể calci oxalat hình cầu gai Mảnh mô mềm có túi tiết Lông che chở đơn bào hoặc
đa bào hình sao Lông tiết chân đơn bào, đầu đa bào Sợi xếp thành bó Tinh thể calci oxalat cầu gai đường kính 8-30 µm Mảnh mạch xoắn, mạch mạng
Lông che chở đa
bào hình sao
Lông che chở đơn bào
Lông tiết Mô mềm chứa calci oxalat
hình cầu gai
Mạch điểm
Biểu bì diệp lục
hình giậu
Lỗ khí nhiều ở biểu bì dưới
(nhìn từ trên xuống)
Mạch vòng
Hình 8: Đặc điểm của bột lá An xoa
Bột thân
Bột thân màu nâu, nhiều xơ, không mùi
Thành phần gồm lông che chở đa bào hình
sao, mô mềm chứa tinh thể calci oxalat hình
cầu gai, sợi mang tinh thể calci oxalat hình cầu gai, mảnh bần, mạch vòng, mạch xoắn, mạch điểm, mạch vạch
Trang 8Lông che chở đa bào
hình sao
Mô mềm chứa tinh thể calci oxalat hình cầu gai
Sợi Sợi mang tinh thể calci oxalat
hình cầu gai
Hình 9: Đặc điểm của bột thân An xoa
Đặc điểm mã vạch ADN
Hình ảnh điện di cho thấy ADN của lá
An xoa non nguyên vẹn, không bị đứt gãy,
đạt yêu cầu cho thí nghiệm tiếp theo Cặp
mồi rbcL sử dụng được thiết kế dựa trên
trình tự báo cáo trước đây giúp khuếch đại
thành công đoạn rbcL, sản phẩm PCR có
kích thước 600 bp (Hình 10)
Trình tự đoạn rbcL của mẫu An xoa được xử
lý bằng phần mềm BioEdit 7.0.5 So với trình tự
đoạn rbcL của loài Helicteres hirsuta L được công
bố trên Genbank (https:// www.ncbi.nlm.-nih.gov/nuccore/AB925611.1) mẫu đối chứng, kết quả trình bày ở Hình 11
Mức độ tương đồng khi so sánh trình tự
đoạn rbcL của mẫu lá An xoa ở Bình Phước với mẫu đối chứng Helicteres hirsuta L [mã
số AB925611.1 – tác giả Toyama et al.,
2015(7)] công bố trên Genbank bằng phương pháp BLAST là 100%
Hình 10: Kết quả điện di ADN của mẫu lá non (trái) và sản phẩm PCR đoạn rbcL (phải)
Trang 9Hình 11: Kết quả so sánh trình tự giữa mẫu lá An xoa (Query) và mẫu đối chứng (Sbjct)
BÀN LUẬN
Việc định danh đúng nguyên liệu làm thuốc
là yêu cầu đầu tiên đóng vai trò quan trọng
trong các nghiên cứu về dược liệu Kiểm nghiệm
dược liệu làm thuốc, tránh sai sót và nhầm lẫn
nguồn nguyên liệu sử dụng góp phần quan
trọng ngăn ngừa sự pha trộn dược liệu giả trong
các thuốc từ dược liệu Hiện nay, việc định danh
dược liệu dựa trên đặc điểm thực vật gặp nhiều
khó khăn, nhất là đối với những loài có sự tương
đồng cao về đặc điểm hình thái Vì vậy, phương
pháp phân tích đặc điểm di truyền dựa trên mã
vạch ADN càng ngày càng được quan tâm
nghiên cứu, ứng dụng trong định danh thực vật
nói chung và dược liệu nói riêng
Đối với An xoa, được sử dụng đầu tiên bởi
người dân huyện Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước trị
các bệnh về gan, kể cả ung thư gan, đề tài này sử
dụng đoạn rbcL khuếch đại với cặp đoạn mồi có
trình tự được thiết kế dựa trên trình tự tham khảo từ các báo cáo trước đây(2,5) Kết quả giải
trình tự đoạn rbcL từ mẫu lá An xoa non thu hái
tại tỉnh Bình Phước cho thấy dược liệu khảo sát
có độ tương đồng là 100% so với trình tự đoạn
rbcL của mẫu đối chứng Helicteres hirsuta L đã
được nhóm tác giả Toyama và cộng sự công bố trên GenBank năm 2015(7) Từ đó gợi ý kết quả
phân tích mã vạch ADN của đoạn gen rbcL có
thể sử dụng để phân biệt loài An xoa với các loài
khác thuộc chi Helicteres phân bố nhiều ở các
tỉnh của Việt Nam
KẾT LUẬN
Đề tài đã quan sát và mô tả đặc điểm thực vật, đặc điểm vi phẫu, bột dược liệu của thân và
lá An xoa Giải trình tự đoạn rbcL của mẫu lá An
xoa non thu hái ở tỉnh Bình Phước cho thấy mẫu
có độ tương đồng 100% so với trình tự ADN của
mẫu đối chứng Helicteres hirsuta L được công bố
Trang 10trên Genbank Kết quả thu được góp phần trong
công tác định danh loài làm nguyên liệu cho các
nghiên cứu về hóa thực vật hoặc tác dụng sinh
học của cây An xoa
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Doyle JJ, Doyle JL (1990) Isolation of plant DNA from fresh
tissue Focus, 12: pp.13-15
2 Fazekas AJ, Burgess KS, Kesanakurti PR, et al (2008) Multiple
multilocus DNA barcodes from the plastid genome
discriminate plant species equally well PLOS One, 7: pp.e2802
3 Hall TA (1999) BioEdit: a user-friendly biological sequence
alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT
Nucl Acids Symp Ser., 41: pp.95-98
4 Istvan L (2010) GelAnalyzer version 2010, available at:
http://www.gelanalyzer.com
5 Levin RA, Wagner WL, Hoch PC, et al (2003) Family-level
relationships of onagraceae based on chloroplast rbcL and
ndhF data American Journal of Botany, 90: pp.107-115
6 Sanger S, Nicklen S, Coulson AR (1977) DNA sequencing with
chain-terminating inhibitors Proc Natl Acad Sci USA, 74(12):
pp.5463–5467
7 Toyama H, Kajisa T, Tagane S, Mase K, Chhang P, Samreth V,
Ma V, Sokh H, Ichihashi R, Onoda Y, Mizoue N, Yahara T (2015) Effects of logging and recruitment on community phylogenetic structure in 32 permanent forest plots of
Kampong Thom, Cambodia Philos Trans R Soc Lond., B, Biol
Sci., 370 (1662)
8 Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, 2, Nhà xuất bản Y học, tr 1011-1013
Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019