Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số hợp chất từ nấm biển phân lập tại miền trung việt nam

Một số lượng lớn các công trình nghiên cứu cũng đã công nhận vi nấm biển là nguồn tiềm năng cung cấp các hợp chất với cấu trúc mới và hoạt tính sinh học cógiá trị trong y học bao gồm hoạ

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ

- - - -

NGHIÊN CỨU HÓA HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ VI NẤM BIỂN PHÂN LẬP TẠI MIỀN TRUNG VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2019

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-PHAN THỊ HOÀI TRINH

NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ VI NẤM BIỂN PHÂN LẬP TẠI MIỀN TRUNG

VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9.42.02.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS.TS Phí Quyết Tiến

2. PGS.TS Trần Thị Thanh Vân

Hà Nội – 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác vớimột số cộng sự khác

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đãđược công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành và được sự đồng ý sử dụng sốliệu của các đồng tác giả

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Nghiên cứu sinh

Phan Thị Hoài Trinh

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và trân trọng nhất của mình đến PGS.TS Phí Quyết Tiến, Viện Công nghệ sinh học và PGS.TS Trần Thị Thanh Vân, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang – những người Thầy đã luôn tận tình giúp đỡ, hướng dẫn khoa học và định hướng nghiên cứu trong suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn cố PGS.TS Bùi Minh Lý, người đã truyền niềm đam mê nghiên cứu khoa học, luôn quan tâm và tạo động lực cho tôi từ những ngày đầu thực hiện luận án.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các Thầy, Cô ở Viện Công nghệ sinh học đã giảng dạy, cung cấp các kiến thức mới để tôi hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong chương trình đào tạo.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành các nội dung trong chương trình đào tạo.

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào tạo ở Viện Công nghệ sinh học và Chuyên viên Nguyễn Thị Minh Tâm ở Học viện Khoa học và Công nghệ đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành các hồ sơ trong quá trình học tập.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện NC&UDCN Nha Trang cùng các đồng nghiệp đã luôn ủng hộ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi tập trung nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn Hợp phần nhánh số 3 thuộc Dự án điều tra cơ bản và Dự án hợp tác nghiên cứu khoa học giữa Viện NC&UDCN Nha Trang và Viện KH&CN Hải dương Hàn Quốc đã hỗ trợ kinh phí thực hiện đề tài.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm,

hỗ trợ và động viên trong suốt thời gian qua để tôi có thể hoàn thành tốt nhiệm vụ học tập và công tác chuyên môn.

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Nghiên cứu sinh

Phan Thị Hoài Trinh

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vii

Danh mục các bảng x

Danh mục các hình xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Giới thiệu chung về hoạt tính sinh học từ vi nấm biển 4

1.1.1 Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học từ vi nấm biển 4

1.1.1.1 Chất kháng sinh 4

1.1.1.2 Chất gây độc tế bào ung thư 8

1.1.1.3 Chất chống oxy hóa 10

1.1.1.4 Chất bảo vệ tế bào thần kinh 11

1.1.1.5 Một số chất có hoạt tính sinh học khác 12

1.1.2 Đa dạng sinh học vi nấm biển 12

1.1.3 Một số đặc tính sinh học của vi nấm biển 14

1.1.4 Nghiên cứu sàng lọc vi nấm biển sinh tổng hợp hoạt chất sinh học 16

1.2 Môi trường lên men và ảnh hưởng của điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của vi nấm biển 17

1.2.1 Đặc điểm của quá trình lên men sinh chất kháng sinh 17

1.2.2 Môi trường lên men vi nấm sinh kháng sinh 19

1.2.2.1 Lên men rắn 19

1.2.2.2 Lên men chìm 20

1.2.3 Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của vi nấm biển 22

1.2.3.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men 22

1.2.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối 24

1.2.3.3 Ảnh hưởng của pH 26

1.2.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 27

1.2.3.5 Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitơ 28

1.3 Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hóa học chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển 29

1.3.1 Phân lập chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển 29

1.3.2 Xác định cấu trúc hóa học chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển 31

1.4 Xu hướng nghiên cứu các hoạt chất sinh học từ vi nấm biển trên thế giới và ở Việt Nam 32

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Vật liệu và môi trường nghiên cứu 37

2.2 Phương pháp nghiên cứu 39

2.2.1 Phân lập vi nấm biển 39

2.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng VSV kiểm định của các chủng vi nấm biển 39

2.2.3 Phân tích cặn chiết của các chủng vi nấm có hoạt tính kháng sinh cao 39

2.2.4 Xác định đặc điểm hình thái và phân loại vi nấm biển 40

2.2.5 Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của vi nấm biển 42

2.2.6 Phân tách các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển 42

2.2.6.1 Phân tách các hợp chất từ chủng vi nấm A flocculosus 01NT.1.1.5 43

2.2.6.2 Phân tách các hợp chất từ chủng vi nấm Aspergillus sp 01NT.1.12.3 43

2.2.6.3 Phân tách các hợp chất từ chủng vi nấm P chrysogenum 045-357-2 44

2.2.7 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển 44

2.2.8 Xác định hoạt tính sinh học của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển 45

2.2.8.1 Xác định hoạt tính kháng VSV kiểm định 45

2.2.8.2 Xác định hoạt tính gây độc tế bào 45

2.2.8.3 Xác định hoạt tính chống oxy hóa 46

2.2.8.4 Xác định hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh 47

2.2.9 Xử lý số liệu nghiên cứu 47

2.2.10 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát trong luận án 48

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 49

3.1 Phân lập và sàng lọc hoạt tính kháng VSV kiểm định của vi nấm biển 49

3.1.1 Số lượng chủng vi nấm biển thu nhận theo địa điểm và nguồn phân lập 49

3.1.2 Đặc điểm hình thái của vi nấm biển 50

3.1.3 Hoạt tính kháng VSV kiểm định của vi nấm biển 58

3.2 Phân tích cặn chiết thô và xác định đặc điểm phân loại của 08 chủng vi nấm biển tuyển chọn 62

3.2.1 Phân tích cặn chiết thô của 08 chủng vi nấm biển tuyển chọn 62

3.2.2 Xác định đặc điểm hình thái và phân loại 08 chủng vi nấm biển tuyển chọn.64 3.3 Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của 03 chủng vi nấm biển tuyển chọn 71

3.3.1 Khảo sát thời gian lên men 71

3.3.2 Khảo sát nồng độ muối biển 73

3.3.3 Khảo sát pH ban đầu 76

3.4 Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ chủng vi nấm biển tuyển chọn 78

3.4.1 Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất từ chủng vi nấm A flocculosus 01NT.1.1.5 78

3.4.2 Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất từ chủng vi nấm Aspergillus sp 01NT.1.12.3 89

3.4.3 Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất từ chủng vi nấm P chrysogenum 045-357-2 94

3.5 Xác định hoạt tính sinh học của 14 hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ 03 chủng vi nấm biển tuyển chọn 97

3.5.1 Xác định hoạt tính kháng VSV kiểm định 97

3.5.2 Xác định hoạt tính gây độc tế bào 100

3.5.3 Xác định hoạt tính chống oxy hóa 100

3.5.4 Xác định hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh 102

CHƯƠNG 4 THẢO LUẬN KẾT QUẢ 103

4.1 Hình thái và hoạt tính kháng VSV kiểm định của vi nấm biển miền Trung Việt Nam 103

4.2 Đặc tính của các chủng vi nấm biển có tiềm năng sinh tổng hợp các hoạt

chất sinh học 105

4.3 Điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của vi nấm biển 107

4.4 Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ 03 chủng vi nấm biển tuyển chọn 110 4.5 Hoạt tính sinh học của 14 hợp chất thu nhận từ 03 chủng vi nấm biển tuyển chọn 115

4.5.1 Hoạt tính kháng VSV kiểm định 115

4.5.2 Hoạt tính gây độc tế bào, chống oxy hóa và bảo vệ tế bào thần kinh 116

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 119

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 121

TÀI LIỆU THAM KHẢO 123

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC 150

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

tắt

ACHN Renal carcinoma cells Tế bào ung thư biểu mô thậnA-549 Adenocarcinomic human alveolar Tế bào ung thư phổi

basal epithelial cells

ATCC American Type Culture Collection Bảo tàng giống chuẩn Hoa KỳBGCs Biosynthetic gene clusters Nhóm gen sinh tổng hợpBGC-823 Gastric adenocarcinoma cell line Tế bào ung thư dạ dày

CLSI The Clinical & Laboratory Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và

COSY Correlation spectroscopy Phổ tương tác hai chiều đồng

hạt nhânDPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

DU-145 Prostatic carcinoma cell line Tế bào ung thư tuyến tiền liệtESI-MS Electron spray ionzation mass Phổ khối lượng phun mù điện

13

C -NMR 13C-Nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

H1N1 Influenza A virus subtype H1N1 Virus cúm A H1N1

H3N2 Influenza A virus subtype H3N2 Virus cúm A H3N2

HCT-15 Human colon cancer cell line Tế bào ung thư đại tràngHCT-116 Human colon cancer cell line Tế bào ung thư đại tràngHL-60 Human leukemic cell line Tế bào ung thư bạch cầuHMBC Heteronuclear multiple bond Phổ tương tác đa liên kết hai

Chữ viết Tiếng Anh Tiếng Việt

tắt

HT-29 Colorectal adenocarcinoma cell Tế bào ung thư đại trực tràng

line

ITS Internal transcribed spacer Vùng được phiên mã nội bộK-562 Human leukemic cell line Tế bào ung thư bạch cầu

M-CSF Macrophage colony stimulating Nhân tố kích thích đại thực

MCF-7 Human breast carcinoma cell line Tế bào ung thư vú

MDA-MB- Human breast carcinoma cell line Tế bào ung thư biểu mô tuyến

MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

NCI-H23 Human lung cancer cell line Tế bào ung thư biểu mô phổiNCI-H460 Human lung cancer cell line Tế bào ung thư phổi

spectroscopyNMR Nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân

NUGC-3 Gastric adenocarcinoma cell line Tế bào ung thư biểu mô dạ dàyOSMAC One-Strain-Many-Compounds Một chủng – Nhiều hợp chấtPC-3 Prostatic carcinoma cell line Tế bào ung thư tuyến tiền liệtRAW264.7 Leukemia cell line Tế bào ung thư bạch cầu

RI detector Refractive Index detector Đầu dò khúc xạ

ROESY Rotating frame nuclear overhauser Phổ ROESY

effect spectroscopy

RYE Rice yeast extract medium Môi trường gạo và dịch chiết

nấm men

Chữ viết Tiếng Anh Tiếng Việt

tắt

proton và carbon

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.3 Số liệu thống kê hoạt tính kháng VSV kiểm định của 273 chủng vi nấm

biển 60

Bảng 3.5 Đặc điểm hình thái của 08 chủng vi nấm biển tuyển chọn được quan

sát dưới kính hiển vi66

Bảng 3.6 Phân loại 08 chủng vi nấm biển dựa trên phân tích trình tự gen vùng

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất cephalosporin C và gliotoxin 4

Hình 1.2 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng tạo sinh khối và sinh tổng hợp chất penicilazaphilone C (PAC) của chủng vi nấm biển Penicillium sclerotiorum M – 22 23 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất pestalone 34

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát trong luận án 48

Hình 3.1 Số lượng các chủng vi nấm biển được phân lập từ Ninh Thuận, Nha Trang và Đà Nẵng 49 Hình 3.2 Thống kê hình dạng khuẩn lạc của 273 chủng vi nấm biển 50

Hình 3.3 Thống kê đặc điểm bề mặt khuẩn lạc của 273 chủng vi nấm biển 51

Hình 3.4 Thống kê đặc điểm độ dày khuẩn lạc của 273 chủng vi nấm biển 52

Hình 3.5 Thống kê đặc điểm viền khuẩn lạc của 273 chủng vi nấm biển 52

Hình 3.6 Thống kê màu sắc bề mặt khuẩn lạc của 273 chủng vi nấm biển 53

Hình 3.7 Hoạt tính kháng VSV kiểm định của một số chủng vi nấm biển đại diện 61 Hình 3.8 Hoạt tính kháng VSV kiểm định của 08 chủng vi nấm biển tuyển chọn 61 Hình 3.9 Phân tích cặn chiết thô của 08 chủng vi nấm tuyển chọn trên TLC 62

01NT.1.12.3, 045-357-2, 168ST.16.1 và 01NT.1.5.4 63

Hình 3.11 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt tính kháng VSV kiểm định

và hàm lượng cặn chiết thô từ chủng vi nấm A flocculosus 01NT.1.1.5 (A), Aspergillus sp 01NT.1.12.3 (B), và P chrysogenum 045-357-2 (C)

73

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nồng độ muối biển đến hoạt tính kháng VSV kiểm định

và hàm lượng cặn chiết thô từ chủng vi nấm A flocculosus 01NT.1.1.5 (A), Aspergillus sp 01NT.1.12.3 (B), và P chrysogenum 045-357-2 (C)

75

Hình 3.13 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt tính kháng VSV kiểm định và hàm

lượng cặn chiết thô từ chủng vi nấm A flocculosus 01NT.1.1.5 (A),

Aspergillus sp 01NT.1.12.3 (B), và P chrysogenum 045-357-2 (C) 78 Hình 3.14 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ chủng vi nấm A flocculosus

01NT.1.1.5 79

Hình 3.16 Một số tương tác trên phổ COSY và HMBC của hợp chất

Hình 3.23 Một số tương tác trên phổ COSY, HMBC và ROESY của hợp chất

Hình 3.27 Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất

MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với công cuộc phát triển kinh tế xã hội thì việc chăm sóc vàbảo vệ sức khỏe cộng đồng luôn là mối quan tâm đặc biệt của mọi quốc gia trên thếgiới Mặc dù nền y học của con người đã đạt đến trình độ tiến bộ nhất định nhưngcác bệnh truyền nhiễm và bệnh nan y vẫn đang diễn biến khá phức tạp và là mối đedoạ lớn đối với sức khoẻ cộng đồng Tình trạng dịch bệnh xảy ra phổ biến ở cácnước đang phát triển do sự thiếu thuốc và sự xuất hiện lan rộng của các chủng visinh vật gây bệnh kháng kháng sinh [1] Vì vậy, việc nghiên cứu phát hiện các hợpchất tự nhiên có hoạt tính sinh học, đặc biệt là các hợp chất có nguồn gốc từ vi sinhvật biển đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trong nước vàtrên thế giới [2]

Các nhà khoa học đã chứng minh vi sinh vật biển có vai trò rất quan trọngtrong quá trình trao đổi chất và phát triển của các sinh vật trong đại dương Chính sự

đa dạng của hệ sinh thái biển cùng sự khắc nghiệt của môi trường sống đã tạo nêncác hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ vi sinh vật biển đa dạng về cấu trúc cũng nhưcác hoạt tính sinh học [3] Do đó, trong những năm gần đây, nhiều nhà khoa họctrên thế giới đã tập trung nghiên cứu và thu nhận các sản phẩm tự nhiên từ vi sinhvật biển với mục đích phát triển chúng thành các nguồn dược liệu mới

Một số lượng lớn các công trình nghiên cứu cũng đã công nhận vi nấm biển

là nguồn tiềm năng cung cấp các hợp chất với cấu trúc mới và hoạt tính sinh học cógiá trị trong y học bao gồm hoạt tính kháng sinh, kháng viêm, kháng ung thư vàchống oxy hoá [4] Cụ thể, giữa năm 2000 và 2005, khoảng 100 hợp chất từ vi nấmbiển được mô tả [5], đến giữa năm 2006 và 2010, có tổng số 690 hợp chất tự nhiênphân lập từ vi nấm biển được công bố [6] Những hợp chất mới này được tạo ra chủ

yếu từ các loài nấm thuộc chi Penicillium, Aspergillus và một số loài nấm thuộc các chi ít phổ biến hơn như Acremonium, Emericella, Epicoccum, Exophiala,

Paraphaeospaeria, Phomosis và Halarosellinia [7].

Hệ sinh thái biển ở vùng nhiệt đới được các nhà khoa học đánh giá là rất đadạng, đặc biệt là hệ sinh thái rạn san hô ở vùng ven biển Trong đó, Việt Nam đượcbiết đến là một quốc gia có chiều dài bờ biển hơn 3.200 km và sở hữu một nguồn tài

nguyên sinh vật phong phú và đa dạng Đây chính là cơ sở cho các nghiên cứu điều tra

về đa dạng sinh học cũng như tiềm năng các hoạt chất sinh học từ nguồn vi nấm biển.Với mục tiêu tìm kiếm các chủng vi nấm biển có khả năng sinh các chất chuyển hoáthứ cấp có hoạt tính sinh học nhằm phát hiện nguồn dược liệu mới đóng góp một phần

hóa học và hoạt tính sinh học của một số hợp chất từ vi nấm biển phân lập tại miền Trung Việt Nam ”.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài:

Mục tiêu nghiên cứu:

Thu nhận các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển phân lập ở vùngbiển miền Trung và xác định một số hoạt tính sinh học (kháng sinh, gây độc tế bào,chống oxy hóa, bảo vệ tế bào thần kinh) của các hợp chất sạch thu được

Nội dung nghiên cứu:

1. Phân lập, đánh giá hoạt tính kháng sinh và tuyển chọn các chủng vi nấm biển cho nghiên cứu tiếp theo

2. Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thô của chủng vi nấm biển tuyển chọn

3. Phân tách, tinh sạch và xác định cấu trúc của các hợp chất chuyển hóa thứcấp từ cặn chiết lên men chủng vi nấm tuyển chọn

4. Xác định hoạt tính sinh học của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp tinh sạch được thu nhận trong nghiên cứu

Những đóng góp mới của luận án:

- Luận án là nghiên cứu mới có hệ thống về phân lập và đánh giá hoạt tính kháng sinhcủa các chủng vi nấm phân lập từ vùng biển miền Trung Việt Nam

- Tinh sạch và đánh giá được hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào ung thư,chống oxy hóa, bảo vệ tế bào thần kinh của 14 hợp chất chuyển hóa thứ cấp thu

nhận được từ 3 chủng vi nấm biển Aspergillus flocculosus 01NT.1.1.5, Aspergillus

sp 01NT.1.12.3 và Penicillium chrysogenum 045-357-2, gồm: phomaligol A2 (1),

wasabidienone E (2), aspertetranone D (3), mactanamide (4), cycloechinulin (5),

asteltoxin (6), ochraceopone F (7), asterriquinone C1 (8), dihydroaspyrone (9) và aspilactonol F (10), 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin (11), 6β,9α,14- trihydroxycinnamolide (12), andrastin A (13) và citreohybridonol (14).

- Xác định được 4 hợp chất mới gồm phomaligol A2 (1), ochraceopone F (7),

6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin (11), và 6β,9α,14-trihydroxycinnamolide (12).

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về

hoạt tính sinh học từ vi nấm biển

1.1.1 Các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học từ vi nấm biển

1.1.1.1 Chất kháng sinh

Vào thập niên 50 của thế kỷ trước, nhóm nghiên cứu của Abraham đã phát hiệnđược hợp chất cephalosporin C có hoạt tính kháng sinh cao từ loài vi nấm

Cephalosporium spp (ngày nay là Acremonium spp.) có nguồn gốc từ vùng biển

thuộc nhóm β-lactam lần đầu tiên được phân lập từ vi nấm biển Khám phá này đãnhanh chóng giúp cho các nhà khoa học mở ra định hướng nghiên cứu mới về các chấtkháng sinh có nguồn gốc từ môi trường biển, đặc biệt là từ vi nấm biển Đến cuối

những năm 1970, hợp chất gliotoxin mới được phát hiện từ chủng vi nấm Aspergillus

sp MO-10 phân lập ở vùng biển Seto (Hình 1.1) Đây là một loại kháng sinh

diketopiperazine lần đầu tiên thu được từ một loại vi nấm có nguồn gốc từ trầm tích

được phân lập và mô tả, chủ yếu là từ các chi Penicillium, Aspergillus, Fusarium và

Cladosporium [11] Phần lớn các chất kháng sinh (khoảng 50%) thuộc nhóm

điều kiện sống khắc nghiệt của môi trường biển như độ mặn cao, dinh dưỡng thấp,

áp suất cao, biến đổi nhiệt độ đồng thời cạnh tranh với vi khuẩn, virus và các loạinấm khác đã tạo điều kiện để các vi sinh vật biển sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp

có hoạt tính sinh học mới, ưu việt so với vi sinh vật trên cạn [14] Các công bố cũngcho thấy có từ 38% đến 59% các hợp chất chiết xuất từ vi nấm biển thể hiện hoạttính kháng sinh [15, 16]

Các hợp chất tự nhiên từ vi nấm biển rất đa dạng về lớp cấu trúc và kết hợpvới một loạt các nhóm thế dẫn đến hoạt tính sinh học vô cùng phong phú Dưới đây

là một số hợp chất kháng sinh mới từ các chủng vi nấm biển được công bố từ năm

2011 đến nay (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Các chất kháng sinh mới được phân lập từ vi nấm biển

(MIC 0,37 μM)

Các hợp chất Piperazine/Diketopiperazine và Pyrimidine/Pyrimidinone

terreus PT06-2 μM)

Dẫn xuất aroyl uridine Aspergillus S epidermidis (MIC 12,5 [26]

Các hợp chất steroid và terpenoid

1,6 μM)

similanensis sp. (MRSA)nov KUFA 0013

commune 518 (MIC lần lượt 4,1 μM và

16,4 μM)

(MIC 50 µg/mL)_

flavipes AIL8 (MIC lần lượt 8,0 và 0,25

μg/mL)

Aflatoxin B2b A flavus 092008 E coli, B subtilis và E. [42]

aerogenes (MIC lần lượt

22,5; 1,7 và 1,1 µM)

robillardoides Trichophyton rubrum (MIC

Từ những công bố trên có thể thấy được tiềm năng sinh tổng hợp chất khángsinh của nguồn vi nấm biển và khả năng phát triển các hợp chất tự nhiên thành cácthuốc kháng sinh mới ứng dụng trong điều trị [46] Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằnghầu hết các hợp chất kháng sinh mới được phát hiện chủ yếu từ các loài vi nấm

thuộc chi Aspergillus và Penicillium.

Trong số các loài thuộc chi Aspergillus, A flocculosus là loài vi nấm tương đối

mới trong tự nhiên và được mô tả vào năm 2004 bởi nhóm nghiên cứu của Frisvad và

trình nghiên cứu về các hợp chất tự nhiên từ loài này vẫn còn hạn chế Ở công bố đầu

tiên, Zheng và các cộng sự (2013) đã phân lập được 2 hợp chất mới gồm epoxy-3β,11α,14β,16β-tetrahydroxyergosta-5,7-dien-12-one và 6-(1H-pyrrol-2- yl)hexa-1,3,5-trienyl-4-methoxy-2H-pyran-2-one từ chủng vi nấm biển A flocculosus PT05-1 thể hiện hoạt tính kháng sinh đối với chủng vi khuẩn Enterobacter aerogenes

phân lập được 9 hợp chất pyrrolidine alkaloid mới từ chủng vi nấm biển

hợp chất tự nhiên mới với hoạt tính sinh học có giá trị

Thông qua các nghiên cứu cũng cho thấy các loài vi nấm thuộc chi Penicillium

được nghiên cứu khá chi tiết trong nhiều năm qua từ cả nguồn trên cạn và dưới biển

Trong đó loài P chrysogenum được xem là nguồn sinh tổng hợp chính các kháng

sinh thuộc nhóm β-lactam ứng dụng trong quy mô công nghiệp Loài vi nấm nàyhiện diện trong các nhiều môi trường sống khác nhau bao gồm thực vật, hải miên,rong biển, trầm tích biển và rừng ngập mặn [49] Điều thú vị là trong thời gian gần

đây số lượng các hợp chất mới vẫn tiếp tục được phát hiện từ loài P chrysogenum,

đặc biệt là các chủng vi nấm có nguồn gốc từ môi trường biển Cụ thể ở nghiên cứucủa Chen và cộng sự (2016), ba hợp chất chrysamide A-C mới đã được thu nhận từ

chủng vi nấm P chrysogenum SCSIO41001 có nguồn gốc từ trầm tích biển sâu ở

Ấn Độ Dương [50] Vào năm 2018, Zhen và cộng sự đã phát hiện ba hợp chất

chrysoxanthone A-C mới cùng với 17 hợp chất đã biết từ chủng vi nấm P.

chrysogenum HLS111 cộng sinh với hải miên Gelliodes carnosa Cả ba hợp chất

mới chrysoxanthone A-C đều thể hiện hoạt tính kháng sinh hiệu quả đối với vi khuẩn B subtilis, Staphylococcus epidermidis và S aureus với MIC 5-80 µg/mL

sinh vật biển, đặc biệt là vi nấm biển trong nghiên cứu các hoạt chất sinh học

1.1.1.2 Chất gây độc tế bào ung thư

Các nghiên cứu đã chứng minh rằng một số nhóm thuốc kháng sinh có nguồngốc từ vi sinh vật đã được sử dụng thành công trong điều trị các bệnh ung thư bao gồmanthracycline, actinomycin và bleomycin Trong đó, nhiều hợp chất thuộc nhómanthracycline đóng vai trò quan trọng trong điều trị lâm sàng các bệnh ung thư máu,

nghiên cứu của Wang và cộng sự (2013), hợp chất kháng sinh anthraquinone SZ-685Cthuộc nhóm anthracycline được phân lập từ chủng vi nấm rừng ngập mặn

Halorosellinia sp No 1403 thể hiện hoạt tính kháng đặc hiệu đối với cả hai dòng tế

năng ức chế hiệu quả sự gia tăng của sáu dòng tế bào ung thư ở người gồm ung thư vúkháng adriamycin, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thần kinh đệm và ung thư gan

[53]. Vì vậy, việc đánh giá khả năng kháng ung thư của các chủng vi nấm biển và đặcbiệt là các hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng sinh đang được các nhà khoa học

quan tâm nghiên cứu [54]

Bên cạnh đó, nhiều hợp chất kháng ung thư hiệu quả có các khung cấu trúckhác cũng đã được phát hiện từ nguồn vi nấm biển Cụ thể, hợp chất verrucarin A

được phân lập từ môi trường lên men của loài vi nấm biển Myrothecium roridum đã

thể hiện hoạt tính ức chế hiệu quả sự sản xuất interleukin-8 từ bạch cầu cấp tiền tủybào ở người (promyelocytic), bằng cơ chế liên quan đến sự ức chế hoạt hóa củamitogen kích hoạt kinases c-JUN và p38 [55]

Nhóm nghiên cứu của Garo và cộng sự (2003) đã có báo cáo về hợp chất

trichodermamide B được phân lập từ chủng vi nấm biển Trichoderma virens CNL910, có nguồn gốc từ loài hải tiêu Didemnum molle thể hiện hoạt tính gây độc

đối với tế bào ung thư đại tràng ở người [56] Chủng vi nấm Penicillium paxilli MaG thu được từ loài hải miên Mycale angulosa cũng có khả năng sản sinh các hợp chất

ức chế các dòng tế bào ung thư ở người gồm tế bào ung thư vú MDA-MB435, tế bàoung thư hệ thần kinh trung ương CNS-295 và tế bào ung thư bạch cầu HL-60 [57].Ngoài ra, Zhou và cộng sự (2013) còn phân lập được hợp chất cephalimysin A có

cấu trúc lõi 1-oxa-7-azaspiro non-2-ene-4,6-dione độc đáo từ chủng vi nấm biển A.

fumigatus OPUST106B-5 có hoạt tính gây độc tế bào đáng kể đối với dòng tế bào

ung thư bạch cầu P-388 và HL-60 ở người [58]

Các dẫn xuất indole phân lập từ vi nấm biển cũng được chứng minh là có khảnăng ức chế hiệu quả các dòng tế bào ung thư Cụ thể, các hợp chất leptosin M, M1

và N được sản sinh từ loài vi nấm Leptosphaeria sp OUPS-N80 phân lập từ rong biển Sargassum tortile biểu hiện khả năng chống ung thư hiệu quả đối với dòng tế

bào bạch cầu lympho P-388 [59] Một dẫn xuất chromone mới, 8-methoxy-3-methyl-4H-chromen-4-one được phân lập từ chủng vi nấm

(2-hydroxymethyl)-Penicillium sp EG-5 thể hiện hoạt tính kháng ung thư thông qua ức chế các enzym

chuyển hóa gây ung thư và bảo vệ khỏi tổn thương ADN [60]

Bên cạnh đó, vi nấm rừng ngập mặn cũng được xem là nguồn tiềm năng cho cáchợp chất có hoạt tính kháng u Điều này được ghi nhận ở một chủng vi nấm thuộc chi

Paecilomyces có khả năng sinh tổng hợp hai hợp chất có cấu trúc vòng thơm mới gồm

paeciloxocin A và B thể hiện hoạt tính gây độc tế bào hiệu quả đối với dòng tế bào ung

tổng hợp dựa trên khung cấu trúc của diketopiperazine halimide được phát hiện từ

chủng vi nấm Aspergillus sp CNC-139 đang trải qua các thử nghiệm lâm sàng giai

đoạn 3 mang đến hy vọng chữa trị bệnh ung thư phổi cho cộng đồng [12, 62]

A được thu nhận từ chủng vi nấm Eurotium sp SCSIO F452 thể hiện hoạt tính bắtgốc tự do DPPH với trị IC50 58,4 μM [65] Bên cạnh đó, một dẫn xuất chromonemới, arthone C từ chủng vi nấm biển sâu Arthrinium sp UJNMF0008 cũng có khảnăng bắt gốc tự do DPPH và ABTS với giá trị IC50 lần lượt 16,9 và 18,0 μM [66]

Các báo cáo cũng cho thấy nhiều hợp chất chống oxy hóa đã được thu nhận

từ các chủng vi nấm biển nội sinh Cụ thể, chủng vi nấm A wentii EN-48 nội sinh ở rong biển Sargassum spp có khả năng sinh tổng hợp 8 hợp chất thể hiện khả năng

bắt gốc tự do DPPH với giá trị IC50 từ 5,2 – 99,4 μg/mL gồm một dẫn xuấtanthraquinone mới (wentiquinone C), một dẫn xuất benzamide mới (methyl 4-(3,4-dihydroxybenzamido)butanoate) cùng với 6 hợp chất phenolic [67]

Các nghiên cứu đã chứng minh rằng chính sự tồn tại của các gốc tự do ởnồng độ cao trong cơ thể người đã gây nên các tổn thương cấu trúc màng sinh học,

tế bào, mô và các cơ quan đồng thời dẫn đến nhiều căn bệnh khác nhau [68] Vì vậy,các hợp chất chống oxy hóa được xem là liệu pháp hứa hẹn cho phòng ngừa và điềutrị các bệnh khác liên quan đến gốc tự do như bệnh tim mạch, xơ vữa động mạch,tăng huyết áp, tiểu đường, viêm khớp, ung thư và lão hóa [69]

1.1.1.4 Chất bảo vệ tế bào thần kinh

Nhiều hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển được phát hiện là có hiệu quảtrong điều trị các mô hình rối loạn thần kinh thực nghiệm và được nghiên cứu về tiềmnăng ứng dụng như một loại thuốc mới để điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh

ở người [70] Cụ thể, hợp chất neoechinulin A được phân lập từ hai loài nấm cộng

sinh với rong đỏ thuộc chi Microsporum và Aspergillus được ghi nhận có khả năng

cải thiện dị tật thần kinh trong các tế bào PC12 do các chất độc thần kinh gây ra bởibệnh Parkinson [71, 72] Chủng vi nấm Paecilomyces sp Tree 1-7 được phân lập từ

rừng ngập mặn có khả năng sinh tổng hợp chất alaterin có tác dụng bảo vệ thần kinh

khi thử nghiệm in vivo [73] Một nhóm nghiên cứu khác cũng phân lập được hợp

chất axit secalonic A từ loài vi nấm biển A ochraceus có khả năng chống lại sự tử

vong tế bào thần kinh gây ra bởi 1-metyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin(MPTP) đồng thời bảo vệ các tế bào SH-SY5Y chống lại độc tính thần kinh bắtnguồn từ MPP+ [74] Bên cạnh đó, Zhao và cộng sự (2009) cũng có báo cáo về hợp

chất xyloketal B được phân lập từ vi nấm rừng ngập mặn Xylaria sp No 2508 có

khả năng bắt gốc tự do DPPH [75] và bảo vệ tế bào thần kinh chống lại sự thoái hóathần kinh gây ra bởi 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) chủ yếu liên quan đếntính chất chống oxy hóa của nó [76]

Các nghiên cứu đã cho thấy chính sự tích tụ các gốc tự do trong các tế bàothần kinh gây nên các bệnh về rối loạn, thoái hóa thần kinh như Alzheimer vàParkinson [77, 78] Mặc dù sự hiểu biết của chúng ta về những rối loạn này đã đượccải thiện đáng kể trong những năm gần đây, nhưng hiện tại chỉ có một vài loại thuốcđược chứng minh là có khả năng làm chậm hoặc ngăn chặn sự tiến triển của bệnh.Hơn nữa, các loại thuốc được sử dụng cho việc điều trị các bệnh thoái hóa thần kinhchỉ làm giảm triệu chứng và có tác dụng nhất thời [79] Do đó, việc tìm kiếm cáchợp chất tự nhiên có hoạt tính chống oxy hóa cao sẽ mở ra hướng mới trong điều trị

và bảo vệ các tế bào thần kinh

1.1.1.5 Một số chất có hoạt tính sinh học khác

Bên cạnh các hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư, chống oxy hóa và bảo vệ tếbào thần kinh, vi nấm biển còn được xem là nguồn tiềm năng sản sinh các hợp chất

sinh học khác như kháng viêm, kháng lao, và giảm béo [80] Ngoài ra, vi nấm biểncòn sinh tổng hợp các chất có khả năng ức chế α-glucosidase nhằm ứng dụng trongđiều trị bệnh tiểu đường [81] Hiện nay, các hợp chất thu nhận từ vi nấm biển nhưmycosporine, carotenoid và scytonemin đang được ứng dụng trong sản xuất mỹphẩm nhờ các hoạt tính hấp thụ tia UV, chống lão hóa da và làm trắng da [82].

Với các hoạt tính sinh học có giá trị đã thể hiện, các hợp chất chuyển hóa thứcấp từ vi nấm biển được xem là nguồn tiềm năng cho các sản phẩm y dược mới Do

đó, cần có những nghiên cứu chi tiết hơn về điều tra và thu nhận các hợp chất tựnhiên mới từ vi nấm biển nhằm đáp ứng được nhu cầu phát triển ở cả mức cơ bản vàứng dụng của các hoạt chất sinh học từ vi nấm biển [12]

1.1.2 Đa dạng sinh học vi nấm biển

Vi nấm biển là vi sinh vật nhân chuẩn, không quang hợp, có kích thước cực nhỏ

từ 2 đến 500 μm và được bao bọc bởi thành tế bào chitin Các loài vi nấm thường sinhtrưởng và phát triển bằng cách hấp thụ các chất dinh dưỡng từ môi trường sống xung

thích nghi cao, có thể phát triển trong phạm vi rộng của độ mặn trong các đại dương

Do đó, các định nghĩa ban đầu về vi nấm biển dựa trên khả năng chịu mặn dẫn đến mộtkhái niệm không rõ ràng và hẹp đã khuyến khích các nhà nghiên cứu nấm học đánh giá

cứu về sinh lý học biển trở nên tiến bộ hơn Định nghĩa hiện tại xác định rằng vi nấmbiển là vi nấm được thu nhận nhiều lần từ môi trường biển vì

(1) chúng có khả năng sinh trưởng và/hoặc sinh bào tử trong môi trường biển; (2)chúng hình thành các mối quan hệ cộng sinh với các sinh vật biển khác; hoặc (3) chúngđược chứng minh là thích ứng và tiến hóa ở cấp độ di truyền hoặc có hoạt động chuyểnhóa trong môi trường biển Định nghĩa này được xem là hoàn chỉnh nhất hiện nay vì nókết hợp khía cạnh di truyền và chức năng bằng cách đề cập đến vai trò hiện diện củachúng trong các mối quan hệ cộng sinh và hoại sinh, trong khi không dựa hoàn toànvào hệ thống phân loại vì sự hiểu biết của chúng ta về mối quan hệ tiến hóa

của nấm biển chưa đầy đủ Nhiều loài, chi và họ vi nấm mới vẫn được mô tả từ cácvùng biển chưa được khám phá [86].

Vi nấm biển có tầm quan trọng lớn trong hệ sinh thái đại dương [87] Nhiềunghiên cứu chỉ ra rằng vi nấm biển đóng vai trò quan trọng trong các chu trình dinhdưỡng gồm phân hủy các chất hữu cơ trong hệ sinh thái biển và tái tạo chất dinhdưỡng [88] Ngoài ra, vi nấm biển còn có các vai trò sinh thái khác nhau như kýsinh và cộng sinh với các sinh vật biển [89]; hoặc liên quan đến quá trình khử nitơtrong trầm tích biển [90] Vi nấm biển còn được xem là quần thể vi sinh vật thốngtrị và tham gia chính vào chu trình nitơ trong hệ sinh thái rạn san hô [91] Điều nàychứng tỏ sự cần thiết của vi nấm biển đối với hệ sinh thái biển cũng như sự tồn tạicủa nhiều nhóm sinh vật mà chúng kết hợp [92]

Theo các công bố, vi nấm biển rất đa dạng và hiện diện hầu hết trong các môitrường sống khác nhau của hệ sinh thái biển bao gồm nước biển [93], môi trườngthiếu oxy [90], nền gỗ trong đại dương [94], cộng sinh với hải miên, san hô và cácđộng vật không xương sống khác trên biển [89], hoặc cộng sinh với rong biển vàcác thực vật biển [95, 96] Các nhà khoa học ước tính rằng có đến 1500 loài vi nấmbiển tồn tại tuy nhiên tiềm năng sinh học của vi nấm biển chưa được điều tra đầy đủ

nấm biển được phát hiện và đang trong tiến trình nghiên cứu [98]

Hầu hết các loài vi nấm phân lập được từ môi trường biển thuộc các ngành nấmchính như Ascomycota, Basidiomycota, và Chytridiomycota Trong đó, các loài

Cho đến nay chỉ có một số ít trình tự gen vùng ITS và 28S rDNA của vi nấm biển thuộcngành Zygomycota được công bố, tuy nhiên chưa có ghi nhận nào về các chủng

vi nấm biển đại diện cho các ngành Glomeromycota, Blastocladiomycota, vàNeocallimastigomycota [100]

Nghiên cứu đã cho thấy rằng các môi trường biển khác nhau sẽ hình thành nêncác quần thể vi nấm có đặc tính sinh học riêng biệt Vi nấm có thể được tìm thấy từ đạidương sâu thẳm, vùng ven biển đến đầm lầy ngập mặn và cửa sông với độ mặn

thấp Theo một số công bố, môi trường sống đóng vai trò quan trọng trong việc xácđịnh thành phần quần thể vi nấm trong đại dương Ngoài ra, các nghiên cứu còn chothấy thành phần của quần thể nấm được điều khiển bởi vị trí địa lý, nhiệt độ và độmặn của nước biển [94] Bên cạnh đó, các yếu tố môi trường như áp suất thủy tĩnh,nồng độ oxy hòa tan và độ sâu của nước cũng được dự đoán là tác động mạnh mẽđến sự phân bố của vi nấm biển [92] Sự thích nghi của vi nấm biển trong điều kiệnmôi trường khắc nghiệt cho thấy rằng chúng là những nguồn đầy hứa hẹn để sànglọc các sản phẩm tự nhiên [101] Mặc dù vi nấm biển được phân bố rộng rãi, nhưnggần như chưa có tài liệu nào công bố chi tiết về cấu trúc địa lý sinh học, hoặc cácảnh hưởng của vị trí địa lý lên đặc điểm sinh học của chúng [92].

1.1.3 Một số đặc tính sinh học của vi nấm biển

Vi nấm biển thường phát triển mạnh trong môi trường giàu dinh dưỡng như cácsinh vật chủ, trầm tích và các mảnh vụn phân hủy từ xác động vật, thực vật Đây là nơicác vi nấm có thể bám dính vào chất nền, tiết ra enzyme, phá vỡ các polyme sinh họcphức tạp và thu nhận chất dinh dưỡng Với cấu trúc thành tế bào giàu chitin nên vi nấm

dễ dàng thu nhận các chất dinh dưỡng bằng cách thẩm thấu Đặc điểm này đã thúc đẩy

tỷ lệ trao đổi chất cao, tăng trưởng nhanh và hiệu quả ở vi nấm Các loài vi nấm biểncũng được đánh giá là không đa dạng ở tầng nước bề mặt do môi trường ở tầng nướcnày thường có ít chất dinh dưỡng cùng với sự khuếch tán nhanh nên các enzyme do vi

Theo nghiên cứu của Kalaiselvam (2015) cho thấy nhiệt độ môi trường đóng vaitrò quan trọng hàng đầu trong việc kiểm soát sự phân bố của vi nấm biển, tiếp theo làcác yếu tố khác như chất nền hoặc sinh vật chủ, độ mặn, áp suất và lượng oxy hòa tan

Sự khác biệt về nhiệt độ nước biển ở những vùng biển khác nhau là do ảnh hưởng bởicường độ của bức xạ mặt trời, sự bốc hơi, dòng chảy nước ngọt và dòng thủy triều từcác vùng ở khoảng giữa vùng duyên hải và thềm lục địa Nhìn chung, vi nấm biển

hợp, vi nấm yêu cầu nhiệt độ cao hơn như các chủng thuộc loài A niger, A terreus và

Cladosporium herabrum phân lập từ rừng ngập mặn Pichavaram Trong khi đó, một số

loài vi nấm biển được phân lập từ vùng biển Nam Cực như

Thraustochytrium antarticum, Leucosporidium anatartica, và Spathulospora

Độ mặn cũng là một yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến sự đa dạng và phân bố của

vi nấm trong môi trường biển Các nghiên cứu trước đây về sinh lý vi nấm biển đã

kết luận rằng chúng cần muối natri clorua ở nồng độ thích hợp trong nước biển cho sự

91,5% chủng phát triển tốt hơn trong môi trường chứa 3% NaCl so với môi trường

nồng độ muối cao gồm tích tụ polyol, glycerol và duy trì cân bằng ion nội mô Khi tiếpxúc với NaCl, các tế bào trải qua cả hai quá trình stress thẩm thấu và độc tính ion Để

Vi nấm biển còn có khả năng đồng hóa hầu hết các nguồn carbon và nitơ Tuynhiên, tùy từng chủng vi nấm mà có thể sử dụng các nguồn nitơ khác nhau như cácmuối amoni, các muối nitrat hay các nguồn nitơ hữu cơ như cao nấm men, pepton,trypton, bột đậu tương để thích hợp cho việc thu nhận các hoạt chất sinh học Nguồnnitơ hữu cơ có tác động khá mạnh đến khả năng sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứcấp của các chủng vi nấm biển do được cung cấp các nguồn axit amin quan trọng và dễdàng được hấp thụ để tạo thành sản phẩm Nghiên cứu cũng cho thấy vi nấm cần cungcấp các nguồn carbon thích hợp cho sự phát triển và sinh tổng hợp các hoạt chất sinhhọc bao gồm tinh bột, gạo và các loại đường như glucose, dextrose, sucrose , tùy

Trong một số trường hợp, vi nấm biển có sự thay đổi hình thái nhất định đểthích nghi với môi trường sống Cụ thể, các loài nấm thuộc lớp Hyphomycetes hiệndiện trong môi trường biển và rừng ngập mặn là do sự thích nghi của các bào tử củachúng với hệ sinh thái biển bằng cách sản xuất các phần phụ, giúp chúng nổi trongnước, có khả năng bám vào chất nền như gỗ trôi dạt hoặc các chất nền thực vật khác

ở rừng ngập mặn [102]

1.1.4 Nghiên cứu sàng lọc vi nấm biển sinh tổng hợp hoạt chất sinh học

Sàng lọc và tuyển chọn chủng vi nấm biển có khả năng sinh tổng hợp cáchoạt chất sinh học mới là một bước quan trọng được thực hiện dựa trên sự kết hợpgiữa các phương pháp sinh học và hóa học Việc đánh giá các hoạt tính sinh học nhưkháng VSV kiểm định, gây độc tế bào ung thư và chống oxy hóa được xem là cácphương pháp sàng lọc sinh học hữu hiệu để tuyển chọn được chủng vi nấm tiềmnăng cho các nghiên cứu tiếp theo [106] Bên cạnh đó, phân tích cặn chiết thô trênsắc ký bản mỏng (TLC) và phổ 1H NMR cũng được nhiều nhóm nghiên cứu sửdụng để đánh giá sự đa dạng chất đồng thời dự đoán về cấu trúc hóa học của cáchợp chất có vòng thơm chứa trong cặn chiết [107]

Theo nghiên cứu của Vita-Marques và cộng sự (2008), cặn chiết thô của 57chủng vi nấm biển đã được sàng lọc trên TLC silica gel với hệ dung môi n-hexane :

20 cặn chiết có chứa nitơ trong cấu trúc phân tử khi hiện màu bằng thuốc thử

Dragendorff đồng thời thể hiện sự đa dạng vệt chất trên sắc ký Đáng lưu ý là phần lớncác cặn chiết này đều thể hiện tín hiệu của các hợp chất có cấu trúc vòng thơm, cấu trúckhông bão hòa cũng như các nhóm chức có chứa oxy và/hoặc nitơ khi được phân tích

kiểm định và gây độc tế bào, hai chủng vi nấm AcSS8 và AcSS13 thuộc loài Beauveria

felina được lựa chọn để phân tách các hợp chất sinh học Tám hợp chất có cấu trúc

cyclodepsi-peptide đã được thu nhận từ cặn chiết lên men chủng AcSS8, trong đó có 2hợp chất mới pseudodestruxin C và β-Me-Pro destruxin E chlorohydrin cùng với 6 hợpchất đã biết gồm destruxin B, destruxin E chlorohydrin, roseotoxin B, roseocardin,isariin và isariin B Trong đó destruxin được báo cáo là các hợp chất có cấu trúc thuộcnhóm cyclodepsi-peptide thể hiện nhiều hoạt tính sinh học như gây độc tế bào, kháng

chủng vi nấm biển Leptosphaerulina sp 2012F7-1B có cặn chiết thô thể hiện các tín

hiệu proton tại vùng trường thấp (6-11 ppm) Chủng vi nấm được lên men và phân táchđược 6 hợp chất chứa cấu trúc vòng thơm gồm 5 dẫn xuất 6-methylpyridinone

và 1 dẫn xuất 6-methylpyranone, trong đó có 2 hợp chất mới [109] Bên cạnhphương pháp sàng lọc hóa học dựa trên TLC và NMR, nhiều nhóm nghiên cứu đã

sử dụng HPLC/UV/MS để dự đoán thành phần hóa học chứa trong cặn chiết của cácchủng có hoạt tính sinh học cao Kossuga và cộng sự (2012) đã đánh giá hoạt tínhkháng sinh và gây độc tế bào của 688 chủng vi nấm đồng thời phân tích cặn chiếtthô trên HPLC/UV/MS Dựa trên kết quả sàng lọc đã tuyển chọn được 5 chủng cóhoạt tính sinh học cao cùng phổ chất quan tâm, trong đó có 4 chủng thuộc chi

Penicillium Điều thú vị là cả 8 hợp chất thu nhận từ 5 chủng vi nấm tuyển chọn đều

có cấu trúc dạng vòng thơm, trong đó có hợp chất mới là pyrenocin J [110] Hoạttính kháng sinh và gây độc tế bào của các hợp chất thuộc nhóm pyrenocine đã đượckhẳng định bởi nhiều công bố khoa học [111]

Ngoài ra, phương pháp sàng lọc dựa trên sắc ký khí kết hợp khối phổ MS) cũng được đánh giá hiệu quả do có độ nhạy và tính chuẩn xác cao [112]

(GC-Salvatore và cộng sự (2018) đã phát hiện được nhiều hợp chất thuộc nhóm chấtvòng thơm gồm diketopiperazine, flavonoid, anthraquinone, sterol và chalcone từ

các chủng vi nấm thuộc chi Aspergillus khi phân tích cặn chiết trên GC-MS Kết

quả này một lần nữa khẳng định tiềm năng sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấpvới các đặc tính hóa học và sinh học có giá trị ứng dụng trong y học của các chủng

thuộc chi Aspergillus có nguồn gốc từ biển.

Các nghiên cứu đã cho thấy sàng lọc chủng vi nấm dựa trên phân tích hóahọc và sinh học là phương pháp hữu hiệu để tuyển chọn chủng vi nấm có khả năngsản sinh các hợp chất chuyển hóa thứ cấp với hoạt tính sinh học có giá trị Bên cạnh

đó, việc phân loại chủng vi nấm tuyển chọn cũng được các nhà khoa học quan tâm

vì đây là cơ sở để so sánh với các tài liệu công bố về các hợp chất tự nhiên mới từ vi

1.2 Môi trường lên men và ảnh hưởng của điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của vi nấm biển

1.2.1 Đặc điểm của quá trình lên men sinh chất kháng sinh

Thuốc kháng sinh là chất chuyển hóa thứ cấp được định nghĩa là các sản phẩmhữu cơ có trọng lượng phân tử thấp do vi sinh vật tạo ra và có khả năng kháng lại các

vi sinh vật khác ở nồng độ thấp [113] Phần lớn các vi sinh vật đều có điểm chung làbắt đầu phát triển và tạo sinh khối nhanh ở giai đoạn đầu trong quá trình lên men.Khi chất dinh dưỡng cạn kiệt ở giữa và cuối pha cân bằng cũng chính là thời điểmcác hợp chất chuyển hóa thứ cấp được sản sinh và tích tụ cao nhất trong môi trườngnuôi cấy [114, 115].

Doshida và cộng sự (1996) đã khảo sát thời gian lên men thích hợp cho sinh

tổng hợp chất kháng sinh của chủng vi nấm biển Exophiala pisciphila NI10102.

Mặc dù, chủng vi nấm này đạt đến pha cân bằng sau 5 ngày lên men nhưng hợp chấtkháng sinh chỉ bắt đầu được sinh tổng hợp từ ngày lên men thứ 6 Kết quả nghiêncứu cho thấy thời gian thích hợp nhất để thu nhận hợp chất kháng sinh là sau 10ngày lên men, tại thời điểm cuối pha cân bằng [116] Ở một nghiên cứu khác, chủng

vi nấm biển P citrinum S36 bắt đầu tăng trưởng nhanh từ ngày thứ 5 của chu trình lên men khi được nuôi cấy trên môi trường rắn chứa cơ chất chính là cám lúa mì.

Tuy nhiên, hàm lượng chất kháng sinh thu được cao nhất ở thời điểm đạt pha cânbằng sau 7 ngày lên men [117]

Nghiên cứu của Xiong và cộng sự (2009) cho thấy chủng vi nấm biển

Cladosporium sp F14 phát triển chậm sau 5 ngày lên men trên môi trường canh có

chứa 10 g/L glucose, 5 g/L tryptone, và 5 g/L dịch chiết nấm men Chủng vi nấm bắtđầu phát triển nhanh sau 6 ngày lên men và đạt đến cuối pha cân bằng sau 10 – 11ngày lên men Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy hàm lượng chất kháng sinh bắtđầu được sinh tổng hợp mạnh sau 9 ngày lên men [118] Tương tự, chủng vi nấm

biển A niger KC 582297 cũng sản sinh chất kháng sinh đạt tối đa vào giữa pha cân bằng, sau 6 ngày lên men trên môi trường Sabouraud Dextrose [119]

Một trong những hạn chế của quá trình thu nhận các chất chuyển hóa thứ cấp từ

và xác định hoạt tính sinh học Điều này được các nhà khoa học lí giải là do các

chất chuyển hóa thứ cấp chỉ được sản sinh trong điều kiện lên men thích hợp đồng thờiquá trình sinh tổng hợp này luôn luôn phải cạnh tranh với các quá trình trao đổi chấtthiết yếu của vi sinh vật Do đó, việc thay đổi hàm lượng dinh dưỡng hoặc các điều

1.2.2 Môi trường lên men vi nấm sinh kháng sinh

Môi trường lên men là một yếu tố đặc biệt quan trọng tác động trực tiếp đến sựtăng trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh của vi nấm vì nó cung cấp chất dinh

về môi trường và điều kiện lên men có thể thay đổi cấu trúc cũng như hàm lượng của

phương pháp lên men được sử dụng phổ biến hiện nay là lên men rắn (Solid StateFermentation – SSF) và lên men chìm (Submerged Fermentation - SmF)

1.2.2.1 Lên men rắn

Lên men SSF là phương pháp lên men các vi sinh vật trên các chất nền rắn

ẩm, hoặc trên các chất mang trơ và được ứng dụng hiệu quả trong suốt thế kỷ quatrong nhiều ngành công nghệ thực phẩm và y dược [121] Gần đây, phương pháp lênmen này đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất các hợp chất vi sinh vìnhững lợi ích kinh tế mà chúng mang lại như năng suất lên men và nồng độ sảnphẩm cuối cùng cao, ức chế dị hóa thấp đồng thời yêu cầu điều kiện vô trùng thấphơn so với phương pháp lên men lỏng [122] Đặc biệt, lên men SSF đang là mốiquan tâm đối với các nước có nhiều sản lượng nông nghiệp vì có thể tận dụng đượcnguồn nguyên liệu giá rẻ [123] Nhiều cơ chất khác nhau đã được sử dụng trong quátrình sản xuất các loại kháng sinh bao gồm cám lúa mì cho kháng sinh cephamycin

cephalosporin C [127], cám lúa mì và vỏ cam cho sản sinh lovastatin từ chủng

Nhiều báo cáo đã cho thấy hiệu quả của quá trình sản sinh các hợp chất kháng

biển P citrinum S36 phân lập từ mẫu trầm tích thuộc vùng biển Ai Cập sản sinh chất

kháng sinh hiệu quả trong môi trường chứa cơ chất chính là cám lúa mì đồng thời bổsung 1% amoni sunfate và nước biển để đạt được độ ẩm sau khi cấy nấm là 60% (w/v)

[130] Tương tự, chủng vi nấm A chrysogenum ATCC 48272 cũng sinh tổng hợp

cephalosporin C với hàm lượng cao khi lên men trong môi trường chứa 10

g cám lúa mì và nhiều loại muối khoáng gồm 0,5 g K2HPO4, 0,5 g MgSO4.7H2O,

0,01 g FeSO4.7H2O và 0,5 g NaCl [131].

Trong nghiên cứu của Gao và cộng sự (2011), chủng vi nấm biển P.

chrysogenum QEN-24S được phân lập từ rong đỏ Laurencia sp., sinh tổng hợp được

hợp chất penicisteroid A mới có hoạt tính kháng nấm cao khi lên men trong môitrường gạo ở nhiệt độ phòng [132] Nhóm nghiên cứu của Kanoh cũng đã thu nhậnđược hợp chất kháng sinh mới sulfoalkylresorcinol từ chủng vi nấm biển

Zygosporium sp KNC52 khi nuôi cấy trong môi trường rắn gồm các thành phần

0,5% glucose, 2,0% glycerol, 0,2% dịch chiết nấm men, 0,25% NaCl và 1,5% agar.

Hợp chất này đã thể hiện hoạt tính kháng sinh đặc hiệu với các chủng vi sinh vật

kháng kháng sinh bao gồm Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB), M bovis BCG,

Phương pháp lên men SSF còn được chứng minh tạo ra lượng sản phẩm ổnđịnh hơn, yêu cầu cung cấp năng lượng ít hơn và đặc biệt là thu hồi sản phẩm đơngiản, dễ dàng hơn [134] Điều này được các nhà khoa học lí giải rằng khi lên mentrên môi trường rắn, các sợi nấm phát triển kết hợp với nhau tạo thành hệ sợi bámtrên chất nền nên thuận lợi cho việc sản sinh các chất chuyển hóa [135] Nếu quátrình lên men vi nấm được thực hiện trong môi trường lỏng có thể xảy ra một số bấtlợi cho việc hình thành các sản phẩm chuyển hóa do độ nhớt môi trường cao ảnhhưởng đến việc vận chuyển oxy Đồng thời, các chủng vi nấm tiết ra các chấtchuyển hóa sẽ làm tăng thêm độ nhớt của môi trường lỏng và cản trở quá trình hìnhthành các chất chuyển hóa thứ cấp [136] Vì vậy, lên men SSF được xem là kỹ thuậtphù hợp cho các vi sinh vật yêu cầu độ ẩm thấp như vi nấm [137] Trong khuôn khổ luận án này, phương pháp lên men rắn trên môi trường gạo được sử dụng để nghiên cứu thu nhận các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học từ vi nấm biển 1.2.2.2 Lên men chìm

Hiện nay, bên cạnh lên men SSF, phương pháp lên men SmF đang được sử dụngkhá phổ biến để nghiên cứu các hợp chất kháng sinh cũng như các chất chuyển hóa cóhoạt tính sinh học khác Một điểm cần lưu ý trong quá trình lên men lỏng là các chấtdinh dưỡng được vi sinh vật sử dụng khá nhanh, do đó cần có khảo sát cụ thể để bổsung các thành phần dinh dưỡng với tỉ lệ phù hợp vào môi trường nuôi cấy

Kỹ thuật lên men này được đánh giá là phù hợp cho lên men các chủng vi sinh vậtyêu cầu độ ẩm cao, đặc biệt là vi khuẩn [137].

Một trong những ưu điểm nổi bật khi sử dụng môi trường lên men chìm làkhả năng kiểm soát hiệu quả các thông số của môi trường (pH, nhiệt độ, nồng độoxy hòa tan) trong suốt quá trình lên men để thu được lượng chất chuyển hóa nhưmong muốn Khi chủng vi sinh vật được cấy vào môi trường lỏng sẽ được phân tánđều và tiếp xúc với các chất dinh dưỡng nên sự tăng trưởng diễn ra nhanh hơn sovới lên men rắn Ngoài ra, kỹ thuật lên men SmF còn có ưu điểm là dễ dàng triểnkhai cơ khí hóa và tự động hóa trên các thiết bị ứng dụng nên được ứng dụng phổbiến trong các quy mô công nghiệp [131]

Môi trường lỏng thường được sử dụng trong nghiên cứu chất kháng sinh từ vinấm biển là canh khoai tây dextrose PDB (Potato Dextrose Broth) Cụ thể, Devi vàcộng sự (2009) đã sử dụng môi trường PDB chứa 200 g tinh bột khoai tây, 20 gđường dextrose hòa trong 500 mL nước cất và 500 mL nước biển để khảo sát khả

năng sinh tổng hợp citrinin từ chủng vi nấm biển P chrysogenum MTCC 5108

mặn Avicennia marina cũng sinh tổng hợp được 5 hợp chất penicibrocazine A–E mới khi được lên men trên môi trường canh khoai tây – dextrose (1000 mL nước

biển, 20 g glucose, 5 g peptone, 3 g yeast extract, và 200 g dịch chiết khoai tây, pH6,5–7,0, thể tích môi trường/bình 300 mL) trong 30 ngày ở nhiệt độ phòng Các hợp

chất này ức chế sự phát triển của các chủng vi sinh vật Aeromonas hydrophilia, E.

coli, Micrococcus luteus, S aureus, Vibrio harveyi, V parahaemolyticus, Alternaria brassicae, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium graminearum, và

trường PDB này cũng được dùng để khảo sát hoạt tính kháng sinh của các chủng vi

nấm biển phân lập từ rừng ngập mặn ở Malaysia [140] và vi nấm biển từ đảoPohnpei và Palau, Liên bang Micronesia [141]

Chủng vi nấm Stagonosporopsis cucurbitacearum YM-215343 đã sản sinh bốn

hợp chất didymellamide A-D mới khi lên men trên môi trường canh chứa lúa mì (150g/bình Roux 500 mL) và nước biển (50 mL/bình Roux 500 mL) ở 25°C Trong

đó, hợp chất didymellamide A thể hiện hoạt tính kháng sinh đặc hiệu đối với các vi

sinh vật thử nghiệm gồm C albicans, C glabrata, và Cryptococcus neoformans với

các giá trị MIC từ 1,6 đến 3,1 μg/mL [142]

Để thấy được vai trò quan trọng của môi trường lên men, Liu và cộng sự (2015)

đã tiến hành lên men đồng thời chủng vi nấm biển Penicillium adametzioides AS-53

trên hai kiểu môi trường khác nhau gồm môi trường lỏng (canh khoai tây – dextrose) vàmôi trường rắn (môi trường gạo) Kết quả cho thấy hai hợp chất mới gồm acoranesesquiterpene và dimethyl-N-(phenylacetyl)-glutamate được thu nhận từ dịch chiết môitrường lên men gạo Điều đặc biệt là hai hợp chất mới này không được sinh tổng hợp

khác cũng cho thấy sự thay đổi đáng kể quá trình chuyển hóa khi chủng vi nấm biển

Penicillium sp F23-2 được chuyển từ lên men lỏng sang lên men rắn trên môi trường

gạo Chủng vi nấm này sản sinh năm dẫn xuất axit ambuic mới (penicyclones

các loại môi trường lên men được ứng dụng trong điều tra chất kháng sinh từ vi nấmbiển Vì vậy, cần có những nghiên cứu chi tiết để lựa chọn được môi trường lên menthích hợp hướng đến phát hiện và thu nhận các chất kháng sinh có hàm lượng vàhoạt tính cao từ nguồn vi nấm biển [145]

1.2.3 Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của vi nấm biển

Quá trình lên men thu nhận chất kháng sinh từ vi nấm biển chịu sự tác độngcủa nhiều yếu tố bao gồm thời gian, pH môi trường, nhiệt độ, độ mặn và nguồncarbon, nitơ [146]

1.2.3.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men

Xác định chu trình lên men thích hợp đối với từng chủng vi sinh vật là rất cầnthiết để thu nhận tối đa các sản phẩm chuyển hóa vì mỗi chủng có giai đoạn pháttriển và sản sinh chất chuyển hóa khác nhau Hầu hết các chủng vi sinh vật đều cóđiểm chung là sản sinh các hợp chất chuyển hóa thứ cấp vào giữa và cuối pha cânbằng của chu trình lên men [147]

Trong nghiên cứu của Smitha và Philip (2014), chủng vi nấm biển P citrinum

S36 sinh tổng hợp chất kháng sinh tối đa vào giữa pha cân bằng, sau 7 ngày lên men

[130]. Trong khi chủng vi nấm A chrysogenum ATCC 48272 đạt đến pha cân bằng

chỉ sau 4 ngày lên men và tạo ra lượng kháng sinh cephalosporin C đạt cao nhất vàongày thứ 5 của chu trình lên men [131] Tương tự, chủng vi nấm biển A terreus var.

africanus được phân lập từ vùng biển Alexandria, Ai Cập có thời gian lên men tối

ưu cho sinh tổng hợp chất kháng khuẩn cũng vào cuối pha cân bằng, sau 6 ngày lên

F2 được phân lập tại vùng biển Hồng Kông sản xuất kháng sinh tối đa chỉ sau 4ngày lên men [149]

Zhao và cộng sự (2018) cũng đã tiến hành khảo sát chu trình lên men sinhtổng hợp chất penicilazaphilone C có hoạt tính kháng khuẩn và gây độc tế bào từ

chủng vi nấm biển P sclerotiorum M – 22 Kết quả cho thấy sinh khối chủng vi nấm

bắt đầu được tạo ra nhanh sau 10 ngày lên men và đạt đến pha cân bằng vào ngàythứ 15 của chu trình Trong khi đó, hợp chất penicilazaphilone C được tạo ra vớilượng tương đối vào giữa pha cân bằng và đạt cao nhất vào thời điểm gần cuối phacân bằng, sau 25 ngày lên men (Hình 1.2) [150]

Hình 1.2 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng tạo sinh khối

và sinh tổng hợp chất penicilazaphilone C (PAC) của chủng vi nấm biển

Một số chủng vi nấm lại cần có thời gian lên men kéo dài hơn để đạt đến phacân bằng và thu được lượng kháng sinh tối đa Đối với trường hợp nấm nội sinh

Fusarium sp DF2, chủng này được ghi nhận sản xuất lượng kháng sinh cao nhất khi

đạt đến pha ổn định sau 10 ngày lên men và giữ gần như không đổi đến 15 ngày

cửa sông Loire (Pháp) có khả năng sinh tổng hợp griseofulvin cao nhất sau 14 ngàyvào cuối pha cân bằng khi lên men trên môi trường rắn [152] Chủng vi nấm P.

chrysogenum MTCC 5108 được phân lập từ lá cây Porteresia coarctata ở vùng

rừng ngập mặn ở Ấn Độ sản xuất cinitrin với hàm lượng cao nhất sau 15 ngày lênmen Hàm lượng citrin tạo ra gần như cạn kiệt hoàn toàn khi tiếp tục kéo dài thờigian lên men đến 30 ngày [138] Các nghiên cứu đã chứng tỏ thời gian tối ưu đểsinh tổng hợp chất kháng sinh là khác nhau tùy thuộc vào đặc tính sinh học của từngchủng và điều kiện lên men Nghiên cứu cũng cho thấy các chủng vi nấm được lênmen trong môi trường lỏng có thời gian sản sinh chất kháng sinh đạt tối đa trongthời gian ngắn hơn so với môi trường rắn

1.2.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối

Thống kê kết quả nghiên cứu từ năm 2010 đến 2015 cho thấy có đến 700 hợpchất được thu nhận từ vi nấm biển, trong đó có 285 hợp chất thể hiện hoạt tính khángsinh và 116 hợp chất kháng sinh có xác định cấu trúc mới Kết quả này cho thấy vi nấmbiển thực sự là nguồn tiềm năng các hợp chất tự nhiên mới Nhiều nghiên cứu cho rằngchính độ mặn của môi trường biển đã tác động đến khả năng sinh tổng hợp các hoạtchất sinh học tiềm năng của vi nấm biển Vì vậy, các nhà khoa học khẳng định sự cầnthiết của các nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn môi trường nuôi cấy đến quá trình phát

Huang và cộng sự (2011) đã có những nghiên cứu chi tiết về ảnh hưởng củanồng độ muối đối với sự phát triển, trao đổi chất thứ cấp và hoạt tính kháng sinh của

47 chủng vi nấm biển được phân lập từ eo biển phía Tây của Đài Loan Nghiên cứucho thấy NaCl có thể thúc đẩy sự phát triển và sản sinh chất kháng sinh của hầu hết

biển có khả năng phát triển nhanh hơn trong môi trường chứa 4% NaCl trong khi các