NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HOẠTTÍNH SINH HỌC CỦA DỊCH CHIẾT FLAVONOID TỪ CÂY DIẾP CÁ HOUTTUYNIA CORDATA THUNBERG THU HÁI TẠI HÀ NỘI Hoàng Văn Tuấn* 1 , Phạm Hương Sơn 1 ,
Trang 1NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HOẠT
TÍNH SINH HỌC CỦA DỊCH CHIẾT FLAVONOID TỪ CÂY DIẾP
CÁ
(HOUTTUYNIA CORDATA THUNBERG) THU HÁI TẠI HÀ
NỘI
Hoàng Văn Tuấn* 1 , Phạm Hương Sơn 1 , Nguyễn Thị Hiền 1 ,
Nguyễn Đình Luyện 2 , Nguyễn Thanh Hảo 3
1Viện Ứng dụng Công nghệ, *vantuan197@gmail.com
2Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm KH & CN
Việt Nam
3Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội
TÓM TẮT: Cây Diếp cá, một loại thực vật truyền thống ở Việt
Nam, có nhiều hoạt tính sinh học như chống viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn và tăng cường hiệu quả miễn dịch, các thành phần có hoạt tính sinh học trong diếp cá chủ yếu là flavonoid Trong nghiên cứu này, dịch chiết diếp cá được thu nhận bằng cách trích
ly sử dụng 2 dung môi là nước và etanol, sau đó xác định hàm lượng tổng flavonoid, định lượng flavonoid, xác định hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa của dịch chiết Kết quả thu được cho thấy, tổng flavonoid thu được trong dịch chiết etanol cao hơn trong dịch chiết nước, lần lượt là 2,19% và 0,83% Hàm lượng rutin và quercetin trong dịch chiết etanol xác định được là 0,14%
và 0,01% Ngoài ra, dịch chiết etanol có khả năng kháng được 4
chủng vi sinh vật kiểm định gồm: Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus Khả năng
chống oxy hóa của dịch chiết etanol đạt được là 61,23%, giá trị
SC50 là 19,56 g/ml
Từ khóa: Diếp cá, flavonoid, kháng khuẩn, chống oxy hóa,
quercetin
Trang 2MỞ ĐẦU
Diếp cá (Houttuynia cordata
Thunb.) hay còn gọi là giấp cá
hoặc ngư tinh thảo, là một loại
thực vật truyền thống được trồng
rất phổ biến ở Việt Nam và một
số nước châu Á Trong đông y,
diếp cá được sử dụng trong các
bài thuốc để trị bệnh trĩ, mụn
nhọt, lên sởi, đau mắt [4] Diếp
cá là đối tượng nghiên cứu của
nhiều tác giả khác nhau và đã
được báo cáo là có khả năng
kháng khuẩn, kháng viêm, tăng
cường đáp ứng miễn dịch do
chứa nhiều thành phần có hoạt
tính sinh học cao, đặc biệt là các
hợp chất thuộc nhóm flavonoid
như rutin, quercetin [3]
Tại Việt Nam, Trần Thanh
Lương và nnk., (2007) [6] đã xác
định được thành phần của 2 loại
flavonoid có trong Diếp cá thu
hái tại thành phố Hồ Chí Minh là
quercetin (cao dầu hỏa) và rutin
(cao butanol) Hoạt tính kháng
khuẩn của dịch chiết cũng đã
được xác định trong nghiên cứu
này Trần Thị Việt Hoa và nnk
(2008) [5] đã phân lập và xác
định được cấu trúc của 3 thành
phần có trong cây diếp cá là
sesamin, β-sitosterol và quercitrin từ cao ete dầu hỏa và etyl acetat
Trong nghiên cứu này, trên nguồn diếp cá
Trang 3được thu hái tại Hà Nội, chúng
tôi nghiên cứu tách chiết và xác
định một số hoạt tính sinh học
(kháng khuẩn, chống oxy hóa)
của cây diếp cá và dịch chiết của
nó nhằm tạo cơ sở cho việc khai
thác và ứng dụng cây diếp cá cho
1 số ngành như y học, thực phẩm
chức năng và là cơ sở để so sánh
với các nguồn diếp cá khác
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Cây Diếp cá được thu hái tại
Xuân Đỉnh, Từ Liêm, Hà Nội
Cây Diếp cá được cắt gốc, rửa
sạch (cành và lá) và sấy khô đến
độ ẩm <13%, bảo quản ở nhiệt
độ phòng sử dụng cho nghiên
cứu
Phương pháp
Phương pháp tách chiết
Mẫu được xay nhỏ sau đó
ngâm trong etanol 70% và nước
ở nhiệt độ 60 oC trong 3 giờ [9]
Dịch chiết thô sau đó được lọc
và cô loại dung môi trên thiết bị
cô chân không Heidolph (Đức)
Hiệu quả tách chiết (Y,%) được
xác định dựa vào tỷ lệ % khối lượng giữa lượng dịch chiết thu được sau khi đã làm khô so với khối lượng mẫu sử dụng
Phương pháp xác định tổng flavonoid
Tổng flavonoid được xác định theo phương pháp so màu như miêu tả của Chang et al (2002) [1] dựa trên nguyên tắc: Flavonoid trong diếp cá tạo phức màu vàng với dung dịch AlCl3 Phản ứng này dùng để xác định hàm lượng flavonoid tổng có trong diếp cá Cường độ màu tỷ
lệ thuận với hàm lượng flavonoid được xác định ở bước sóng 415 nm
Lập phương trình đường chuẩn: lấy 10 mg Quercetin hòa tan trong ethanol 80% sau đó pha loãng ra các nồng độ 25, 50
và 100 µg/ml Hút 0,5 ml dung dịch sau khi pha loãng bổ sung 1,5 ml ethanol 95%, 0,1ml AlCl3, 0,1 ml CH3COOK và 2,8
ml nước cất Sau đó, hỗn hợp được lắc đều và để ổn định ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút, rồi tiến hành so màu ở bước sóng 415 nm trên máy UV-Vis V630 (Hoa Kỳ), mẫu trắng
sử dụng nước cất
Trang 4Lấy 0,5 mL dịch chiết diếp cá
và làm tương tự như các bước
lập phương trình đường chuẩn,
tổng flavonoid được xác định
theo công thức: F(%) =
(a×V/m)×n×10-6×100 Trong đó,
a là hàm lượng quercetin (µg/ml)
được xác định từ phương trình
đường chuẩn; V là tổng thể tích
dịch chiết (mL); m là khối lượng
mẫu (g); n là hệ số pha loãng
Phương pháp định lượng
flavonoid (Rutin và Quercetin)
Hàm lượng flavonoid (Rutin
và Quercetin) được định lượng
sử dụng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên
máy Shimadzu (Nhật Bản) với:
tốc độ dòng là 0,5 ml/phút;
detector UV là 255 nm; pha
động ACN-H3PO4 0,01%; thể
tích mẫu tiêm là 10 µl
Phương pháp xác định hoạt tính
kháng khuẩn
Hoạt tính kháng khuẩn (kháng
vi sinh vật kiểm định) được kiểm
tra sơ bộ bằng phương pháp đục
lỗ thạch, sau đó định lượng lại
trên các phiến vi lượng 96 giếng
(96-well microtiter plate) theo
phương pháp của Vander
Bergher et al (1991) [8] Các
chủng vi sinh vật kiểm định sử
dụng gồm: Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas
aeruginosa (ATCC 25923),
Bacillus subtillis (ATCC 27212), Staphylococcus aureus (ATCC
12222), Aspergillus niger (439),
Fusarium oxysporum (M42), Candida albicans (ATCC 7754)
và Saccharomyces cerevisiae
(SH 20)
Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa
Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu được xác định thông qua phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH) Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của Shela et al (2003) [7] Dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường
độ hấp thụ ánh sáng của các gốc
tự do DPPH Hoạt tính chống ôxy hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng
515 nm
Trang 5Các mẫu có biểu hiện hoạt
tính (SC ≥ 50%) sẽ được thử
nghiệm để tìm giá trị SC50 Giá
trị SC50 được xác định thông qua
nồng độ chất thử và % hoạt động
của chất thử mà ở đó 50% các
gốc tự do tạo bởi DPPH được
trung hòa bởi chất thử
Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý thống
kê trên phần mềm Graph Pad
Prism 5 và được trình bày dưới
dạng giá trị trung bình ± độ lệch
chuẩn (mean ± SD)
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Đánh giá hiệu quả tách chiết
Khi sử dụng các dung môi
khác nhau gồm nước và etanol
70% để tách chiết đã cho kết quả
khác biệt rõ rệt, lần lượt ở mức
13,7% và 19,21% (bảng 1); tổng flavonoid trong dịch chiết diếp
cá bằng nước là 0,83%, trong dịch chiết bằng etanol là 2,19% Kết quả chứng tỏ thành phần flavonoid có trong cây Diếp cá được trích ly tốt hơn khi sử dụng dung môi là etanol so với nước Tác giả Phan Văn Cư (2010) [4] cũng đã sử dụng etanol làm dung môi tách chiết flavonoid trong nghiên cứu về cây diếp cá ở tỉnh Thừa Thiên Huế, hàm lượng flavonoid được đưa ra trong nghiên cứu này là 2,73%; trong nghiên cứu của Zhang et al (2008) [9], tác giả đã thu được hàm lượng flavonoid tổng là 3,152% khi sử dụng phương pháp chiết động ở áp suất cao với dung môi là etanol
Bảng 1 Hiệu quả tách chiết và tổng flavonoid trong dịch chiết diếp
cá
Dịch chiết diếp cá Hiệu quả tách chiết (Y,
%) Tổng flavonoid (F,%) Dịch chiết bằng
Dịch chiết bằng
Định lượng rutin và quercetin
Rutin và quercetin là 2 thành
phần phổ biến thuộc nhóm
flavonoid tồn tại trong cây Diếp
cá và đã được chứng minh sự tồn tại trong nhiều nghiên cứu khác
Trang 6nhau [6, 9] Hàm lượng rutin và
quercetin có trong dịch chiết
giàu flavonoid thu được trong
nghiên cứu này của chúng tôi
được định lượng theo phương pháp HPLC với kết quả thu được lần lượt là 0,14% rutin và 0,01% quercein (hình 1)
Hình 1 Sắc ký đồ HPLC của mẫu bột diếp cá
1 Mẫu bột diếp cá; 2 Mẫu rutin đối chiếu; 3 Mẫu quercetin đối
chiếu
Kết quả xác định hoạt tính
kháng khuẩn
Nhiều nghiên cứu đã khẳng
định, dịch chiết Diếp cá và các
thành phần trong đó, đặc biệt là
flavonoid có tác dụng ức chế và
tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn khác
nhau như: S aureus, E coli, Asp.
niger, F oxysporum, C albicans
và
S typhimurium [2, 6] Trong
nghiên cứu này, hoạt tính kháng
khuẩn của dịch chiết diếp cá giàu
flavonoid từ mẫu thu hái đã được xác định Kết quả cho thấy, trong
8 chủng vi sinh vật kiểm định sử dụng, dịch chiết có khả năng kháng 4 chủng với kết quả định tính và định lượng được trình bày trong bảng 2 và hình 2 Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu được đưa ra trong nghiên cứu của Choi
et al (2010) [2] trên đối tượng là
chủng S aureus là 50 µg/ml, còn
trong nghiên cứu của Trần Thanh Lương và nnk (2007) [6], giá trị
Trang 7trên được đưa ra với chủng E.
coli là 200 µg/ml.
Bảng 2 Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết diếp cá giàu flavonoid
Chủng vi sinh vật kiểm
định
Nồng độ ức chế tối
thiểu (MIC: µg/ml)
Đường kính vòng phân giải (ΔD, mm)D, mm)
Hình 2 Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết diếp cá giàu flavonoid
Kết quả xác định hoạt tính
chống oxy hóa
Ngoài hoạt tính kháng khuẩn,
hoạt tính chống oxy hóa cũng là
1 đặc trưng của Diếp cá và dịch
chiết của nó Khả năng bắt gốc tự
do của flavonoid có trong diếp cá
đã được chứng minh trong nhiều
nghiên cứu về tác dụng sinh học
của các thành phần có trong cây
diếp cá [3]
Chúng tôi đã tiến hành kiểm
tra hoạt tính
chống oxy hóa của dịch chiết diếp cá giàu flavonoid Kết quả cho thấy, khả năng bao vây gốc
tự do của dịch chiết diếp cá khá cao, giá trị SC50 đạt 19,56 g/ml khi so sánh với đối chứng (vitamin C) là 25,37 g/ml (bảng 3) Giá trị SC50 được đưa ra trong nghiên cứu của Chou et al (2009) [3] ở các nồng độ mẫu khác nhau nằm trong khoảng từ
Trang 831-63 M với đối chứng là
vitamin E
Bảng 3 Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết diếp cá giàu
flavonoid
ST
T Kí hiệu mẫu
Nồng độ mẫu (g/ml) SC%
SC50
(g/ml) Kết quả
1 Đối chứng
(+) 50 68,7 0,1 25,37 Dương tính
2 Đối chứng
(-) - 0,0 0,0 - Âm tính
0,5 19,56 Dương tính HC: Dịch chiết Diếp cá; Đối chứng (+): Vitamin C; Đối chứng (-): DPPH
KẾT LUẬN
Các kết quả nghiên cứu đã chỉ
ra rằng, sử dụng etanol làm dung
môi tách chiết cho hiệu quả chiết
cao hơn chiết bằng nước, hàm
lượng tổng flavonoid trong dịch
chiết etanol và dịch chiết nước
lần lượt là 2,19% và 0,83%
Hàm lượng rutin và quercetin
trong dịch chiết etanol được định
lượng theo phương pháp HPLC
cho kết quả lần lượt là 0,14% và
0,01% Dịch chiết giàu flavonoid
thu được có khả năng kháng 4
chủng vi sinh vật kiểm định
P aerugninosa, B subtillis và S aureus Khả năng chống oxy hóa
của dịch chiết biểu thị qua giá trị SC50 đạt 19,56 g/ml
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Chang C C., Yang M H., Chern J C., 2002 Estimation
of total flavonoid content
Trang 9in Propolis by two
complementary colorimetric
methods Journal of Food and
Drug Analysis, 10(3): 178-182
2 Choi J Y., Lee J A., Yun S
J., Lee S C., 2010
Anti-Inflammatory Activity of
Houttuynia cordata against
Lipoteichoic Acid-Induced
Inflammation in Human
Dermal Fibroblasts Chonnam
Medical Journal, 46: 140-147
3 Chou S C., Su S R., Ku Y
C., Wu T S., 2009 The
constituents and their
bioactivities of Houttuynia
cordata Chem Pharm Bull.,
57(11): 1227-1230
4 Phan Văn Cư, 2010 Phân lập
flavonoid từ cao butanol trong
cây Diếp cá (Houttuynia
cordata Thunb.) ở tỉnh Thừa
Thiên - Huế Tạp chí Khoa
học, Đại học Huế, 63: 27-32
5 Trần Thị Việt Hoa, Lê Thị
Kim Oanh, 2008 Phân lập và
xác định cấu trúc một số hợp
chất từ cây diếp cá
(Houttuynia cordata Thunb)
của Việt Nam Tạp chí phát
triển Khoa học và Công nghệ, 11(7): 73-77
6 Trần Thanh Lương, Lê Thị
Út, Phạm Nguyên Đông Yên, Nguyễn Thị Mai Hương, Nguyễn Thị Thanh Thủy,
2007 Nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của cây diếp cá thu hái tại thành phố Hồ Chí Minh Hội nghị khoa học và công nghệ hóa học hữu cơ toàn quốc lần thứ IV, 430-434
7 Shela G., Olga M B., Elena K., Antonin L., Nuria G.M, Ratiporn H., Yong-Seo P., Soon-Teck J., Simon T., 2003 Comparison of the contents of the main biochemical compounds and antioxidant activity of some Spanish olive oils as determined by four different radical scavenging tests The Journal of Nutritional Biochemistry, 14(3): 154-159
8 Vanden Berghe D A., Vlietinck A J., 1991 Methods in plant Biochemistry: Screening Methods for Antibacterial and Antiviral Agents from Higher Plants Academic Press,
Trang 10London In: Dey, P Mp.
Harbone, J B (Eds): 47-69
9 Zhang Y., Li S.F., Wu X.W.,
2008 Pressurized liquid
extraction of flavonoid from Houttuynia cordata Thunb Separation and Purification Technology, 58: 305-310
A STUDY ON EXTRACTION AND DETERMINATION SOME BIOACTIVITIES OF FLAVONOID EXTRACT FROM
HOUTTUYNIA CORDATA THUNBERG CULTIVATING IN
HANOI CITY
Hoang Van Tuan 1 , Pham Huong Son 1 , Nguyen Thi Hien 1 ,
Nguyen Dinh Luyen 2 , Nguyen Thanh Hao 3
1National Center for Technological Progress
2Institute of Natural Products Chemistry, VAST
3Hanoi University of Agriculture
SUMMARY
Houttuynia cordata Thunb is a medicinal plant in Vietnam, has
many biological activities including anti-inflammatory, anti-oxidant, anti-microbial and immunological effects The active components in
H cordata are flavonoids In this study, the H cordata extract was
obtained by water and alcohol Then, total flavonoids, anti-microbial
and anti-oxidant effects of H cordata extract were determined The
H cordata ethanolic extract had total flavonoids content more than
H cordata water extract, 2.19% and 0.83%, respectively Rutin and
quercetin content in ethanolic extract was 0.14% and 0.01% (g/g dried
H cordata extract) Moreover, H cordata ethanolic extract could
inhibit four bacterial strains including
E coli, P aerugninosa, B subtillis and S aureus Anti-oxidant