TÌNH TRẠNG lây NHIỄM VIRUS VIÊM GAN c và các BIỆN PHÁP đề PHÒNG lây CHÉO tại KHOA THẬN NHÂN tạo BỆNH VIỆN BẠCH MAI 2001 – 2006

Do vậy,việc giám sát dịch tễ, nghiên cứu các yếu tố nguy cơ lây truyền và các biệnpháp đề phòng lây nhiễm là rất cần thiết, nhất là trong lĩnh vực thận nhân tạo.Ngay từ những ngày đầu lọ

Đặt vấn đề

Virus viêm gan C lây qua đờng máu, gây ra bệnh có hậu quả nghiêmtrọng nh viêm gan mạn, xơ gan và ung th gan nguyên phát [27] [61] [161][162] [170] Theo ớc tính của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) năm 1999 cókhoảng 3% dân số thế giới bị nhiễm HCV [187] Davis G.L dự tính vào năm

2008 ở Mỹ xơ gan và ung th gan do HCV sẽ tăng 61–68% Tỷ lệ chết doviêm gan C tăng 223% nếu không đợc điều trị [72] Một nghiên cứu khác ởPháp dự đoán tỷ lệ ung th gan do Virus viêm gan C sẽ tăng từ 150–200% vàonăm 2020 [77] Cho đến nay, mặc dù có sự tiến bộ rất lớn trong kỹ thuật pháthiện Virus viêm gan C, bằng phản ứng huyết thanh và kỹ thuật sinh học phân

tử, có độ nhạy và độ đặc hiệu ngày càng cao [2] [4] [24] [46] [73] [74] [91] ,nhng còn rất nhiều hạn chế trong công tác điều trị, đặc biệt trong công tác dựphòng rất khó khăn vì cha có vacxin [5] [33] [45] [87] [104] [140] Do vậy,việc giám sát dịch tễ, nghiên cứu các yếu tố nguy cơ lây truyền và các biệnpháp đề phòng lây nhiễm là rất cần thiết, nhất là trong lĩnh vực thận nhân tạo.Ngay từ những ngày đầu lọc máu, ngời ta đã chứng minh rõ ràng kỹ thuật này

có một nguy cơ lây nhiễm rất cao với Virus viêm gan truyền qua đờng máu,

đặc biệt là Virus viêm gan C [28] [29] [36] [40] [53] [54] Thập kỷ 90 trở vềtrớc, bệnh nhân suy thận mạn, lọc máu chu kỳ tất cả phải truyền máu vì cha cóthuốc tăng hồng cầu, hơn nữa lúc đó các xét nghiệm sàng lọc máu, loại trừHCV có độ nhạy và độ đặc hiệu cha cao nên tỷ lệ lây nhiễm HCV ở bệnhnhân lọc máu là rất trầm trọng Theo Dussol B và CS (1995) tỷ lệ nhiễm HCV

ở bệnh nhân lọc máu chu kỳ tăng theo thời gian lọc máu Mỗi năm tăng 10%[86] Bệnh nhân truyền máu càng nhiều, tỷ lệ nhiễm HCV càng cao [9] [12][86] Một số nghiên cứu khác cho thấy kết quả lại không hẳn nh vậy Năm

1995 Cendroglo N.B [59] thấy có 5–25% các bệnh nhân lọc máu chu kỳkhông truyền máu cũng bị nhiềm HCV Cũng nh tác giả Nhật Bản đã báo cáo

có 5–20% các bệnh nhân lọc máu chu kỳ không truyền máu bao giờ cũng bịnhiễm HCV [96] Nguyên nhân lây truyền ở những trờng hợp này là lây chéogiữa các bệnh nhân trong cùng đơn vị lọc máu bởi dụng cụ tiêm truyền, vậtliệu dùng chung hay nhân viên y tế không thay găng khi tiếp xúc với bệnhnhân mới [58] [59] [60] Chính điều này đã giải thích tại sao các bệnh nhânlọc màng bụng và lọc máu tại nhà có tỷ lệ nhiễm HCV thấp hơn rất nhiều lần

so với các bệnh nhân lọc máu tại các trung tâm [86] [110] [111] [139] Trênthế giới, các trung tâm lọc máu có tỷ lệ nhiễm HCV rất khác nhau: cao nhất ởChâu Phi, Châu á, và Đông Âu từ 30–90%, ở Mỹ, Pháp và các nớc Tây Âu5–30% Các nớc có tỷ lệ nhiễm HCV thấp nh Anh, úc, Phần Lan dới 5%[76] [77] [78] [129] Các đơn vị lọc máu ở Việt Nam có tỷ lệ nhiễm HCV rấtcao Tại khoa Thận nhân tạo Bệnh viện Bạch Mai năm 2002 có Anti-HCV (+)

là 57% [10] Khoa đã áp dụng các biện pháp theo khuyến cáo của Tổ chức Y

tế thế giới nhằm giảm tỷ lệ lây nhiễm Virus viêm gan C trong đơn vị lọc máu:Thay truyền máu bằng tiêm thuốc tăng hồng cầu Erythropoetine, dùng kim lọcmáu một lần, sử dụng núm lọc khí, kim thông khí riêng từng bệnh nhân Thaygăng mới trớc khi tiêm truyền, làm thủ thuật Rửa máy, sát khuẩn máy saumỗi ca lọc máu, vệ sinh môi trờng phòng lọc máu và sử dụng lại quả lọc theo

đúng quy trình, đồng thời triển khai “Phòng lọc máu cách ly” Để góp phần

đánh giá tình trạng lây nhiễm Virus viêm gan C và hiệu quả của các biện pháp

đề phòng lây chéo tại đơn vị lọc máu, chúng tôi nghiên cứu đề tài với 3 mụctiêu sau:

1 Xác định tỷ lệ nhiễm HCV ở bệnh nhân lọc máu lần đầu tại khoa Thận nhân tạo Bệnh viện Bạch Mai.

2 Xác định tỷ lệ nhiễm HCV ở bệnh nhân lọc máu chu kỳ có truyền máu và không truyền máu.

3 Đánh giá hiệu quả đề phòng lây chéo Virus viêm gan C ở bệnh nhân lọc máu chu kỳ.

Chơng 1 Tổng quan1.1 Virus viêm gan C (Hepatitis C Virus: HCV)

1.1.1 Lịch sử phát hiện virus viêm gan C.

Sau khi phát hiện virus viêm gan A (HAV) và virus viêm gan B (HBV),rất nhiều trờng hợp viêm gan sau truyền máu vẫn xuất hiện nhng không phải

là viêm gan A và B Ngời ta gọi là viêm gan Non–A Non–B (NANB) [26].Virus này cũng gây viêm gan cấp và mạn tính Hơn một thập kỷ sau, đến năm

1989, nhóm nghiên cứu của Houghton và cộng sự, hợp tác với Bradley D.W ởTrung tâm kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ (C.D.C) đã phát hiện loại virus này nhờ

kỹ thuật sinh học phân tử Sau khi vợn Chimpanzee đợc gây nhiễm bằng huyết

thanh bệnh nhân viêm gan NANB, ngời ta siêu ly tâm huyết tơng và tìm đợccác hạt virus (Virion), rồi tách chiết lấy acid nhân từ các hạt này Sau đó thựchiện quá trình phản ứng chuỗi (Polymerase Chain Reaction) và quá trìnhphiên mã nhờ enzym phiên mã ngợc (Reverse Transcriptase), ký hiệu là RT– PCR Đó là một trong những thành tựu rất lớn của lĩnh vực công nghệsinh học phân tử, đã xác định một loại virus có nhân ARN gây viêm gan(không phải A, không phải B) sau truyền máu và đặt tên là virus viêm gan

C, ký hiệu là HCV [25] [26] [64] Viêm gan C có nguy cơ dẫn đến xơ ganhoặc ung th gan Tỷ lệ hiện nhiễm HCV chủ yếu gặp ở các nhóm nguy cơnhng số lợng và tỷ lệ thay đổi tuy theo từng nớc [188] Khu vực có tỷ lệnhiễm HCV cao là ở Châu Phi, miền Đông Địa Trung Hải, Đông Nam á vàTây Thái Bình Dơng Các nớc có tỷ lệ nhiễm ít phổ biến hơn là Bắc Mỹ vàChâu Âu Tính trên toàn cầu, các nớc thuộc vơng quốc Anh có tỷ lệ nhiễmHCV thấp nhất, khoảng 0,5% trong quần thể chung [78] [79]

1.1.2 Hình thái cấu trúc và đặc tính của virus viêm gan C (HCV)

1.1.2.1 Hình thái cấu trúc

HCV là virus có dạng hình cầu vỏ lipoprotein bao bọc một capsid 20mặt, đờng kính 55- 65nm, thuộc họ Flaviviridae: họ này gồm pestiviruses,Flaviviruser và Hepaciviruses tức HCV Hệ gen của HCV có cấu trúc ARNchuỗi đơn, có khoảng 9.600 nucleotit [64] Hệ gen của HCV mã hoá cho quátrình tổng hợp một polyprotein tiền chất khoảng 3011 - 3033 a.amin, sau đópolyprotein này sẽ đợc cắt thành các protein cấu trúc và không cấu trúc [64][65] Hệ gen của HCV gồm 2 vùng:

 Vùng cấu trúc (structural region) nằm ở đầu 5' phần không sao mã (5'untranslated region: 5' UTR) gồm các gen: C, E1, E2, P7 là các gen mãhoá cho các protein cấu trúc của virus Gen C mã hoá cho P19, chúng đ-

ợc gắn với ARN hình thành nên nucleocapsid (lõi) Gen E1 và E2 mã hoácho glycoprotein gp 33 và gp 72 để tạo nên vỏ của virus, gen P7 cha

vµo qu¸ tr×nh sao chÐp virus vµ c¾t ®o¹n polyprotein [27] [54] [64][75] [85].

RNA - polymerase

Protein xuyªn mµng

Đặc tính quan trọng nhất về cấu trúc hệ gen của HCV là tính đa dạng vềgen Hệ gen của HCV có những vùng tơng đối ổn định nh đầu 5'UTR và gen C(capsid), ngợc lại vùng hay thay đổi nhất là đầu 5' của gen E2 gọi là vùng siêubiến 1 (HVR - 1: The first hypervariable region) Vùng này có khoảng 90nucleotit HVR - 1 là gen mã hoá trung hoà chủ yếu của HCV, có vai trò quantrọng về tính kháng nguyên của các chủng HCV và hay thay đổi dới áp lựccủa hệ thống miễn dịch dịch thể của vật chủ Dựa trên cơ sở tính đa dạng về

hệ gen, các chủng HCV đợc phân thành các nhóm chính gọi là type hoặcgenotype Các typ HCV đợc phân thành nhiều phân type hay dới typ gọi theovần a, b, c Hiện nay đã xác lập đợc 12 genotype khác nhau của HCV, trong

đó có 6 genotype đã đợc nghiên cứu và xếp vào các type I, II, III, IV, V, VI,

và hơn 50 phân type [126] [127] [151] Tuy nhiên các phân type mới đợc tiếptục khám phá Các nghiên cứu ở Đông Nam á (Việt Nam và Thái Lan) đãphân lập đợc một số chủng đợc coi là những genotype mới (7-8-9-10-11) vàcác tác giả đã đề nghị có 11 genotype và trên 70 phân type [94] Nhng một sốtác giả khác lại cho rằng genotype 7-8-9,11 cũng thuộc genotype 6, còngenotype 10 thuộc genotype 3 [135] [163] Các genotype HCV có sự khácnhau về dịch tễ học, độc lực, khả năng gây bệnh và khả năng đáp ứng điều trịbằng interfeon [94] [127]

Các nhóm cũng đợc phân bố theo khu vực địa lý khác nhau

Nhóm 1, 2, 3 và các phân typ phân bố toàn cầu Nhóm 1b lu hành chủyếu ở Nam Âu, Đông Âu, Nhật Bản Nhóm 3a lu hành phổ biến ở ngời trẻ tuổitrong các nớc phơng Tây, đặc biệt ở ngời nghiện chích ma tuý Nhóm 4 chủyếu ở Jaire, Hy Lạp và Gabon Nhóm 5a tập trung ở Nam Phi Nhóm 6 chủyếu ở Hồng Kông Nhóm 7, 8, 9, 10, 11 (6 và 3) đang lu hành ở khu vực ĐôngNam á Nhóm 7, 8, 9 (6) đang lu hành ở Việt Nam [94] [163]

Các nhóm (genotype) HCV cũng liên quan tới đáp ứng điều trị đã đợcnhiều công trình nghiên cứu đề cập tới Theo Davis G.L [71], trong 15 côngtrình nghiên cứu ở Mỹ và Châu Âu điều trị viêm gan C bằng Interferon, tỷ lệ

đáp ứng tốt ở bệnh nhân viêm gan mạn do HCV ở nhóm 1 thấp hơn các nhómkhác (18,1% so với 54,9%) Ngày nay ngời ta phải kết hợp thuốc đã mang lạihiệu quả gấp đôi so với dùng Interferon đơn thuần

Tính đa dạng gen của HCV làm cho virus có khả năng né tránh đáp ứngmiễn dịch của vật chủ dẫn đến tỷ lệ nhiễm HCV mạn tính cao (>80%) [151]

sau khi khỏi bệnh cơ thể không có miễn dịch bảo vệ và vẫn có nguy cơ bịnhiễm [151] do vậy việc nghiên cứu sản xuất vacxin cho đến nay còn đanggặp nhiều khó khăn vì HCV đột biến gen tạo ra những chủng virus mới nên cơthể không có tác dụng bảo vệ khi bị tái nhiễm [151] [161] Các nghiên cứuvacxin viêm gan C còn đang trong giai đoạn thực nghiệm trên động vật.

1.1.3 Các phơng thức lây truyền của HCV

Cho đến nay, nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam

đã xác định các phơng thức lây truyền HCV và các yếu tố nguy cơ nhiễmHCV 60-70% nguy cơ lây nhiễm liên quan đến truyền máu, sản phẩm máu,nghiện chích ma tuý, mại dâm, chạy thận nhân tạo, ghép phủ tạng… và còn có và còn cónhững trờng hợp không rõ đờng lây còn tiếp tục đợc nghiên cứu [29] [37][128] [131]

* Tiêm chích ma tuý

Nhiễm HCV có liên quan nhiều đến tiêm chích ma tuý và sử dụngchung bơm kim tiêm Ví dụ, ở Mỹ số lợng viêm gan C do tiêm chích ma tuý

có xu hớng tăng Một nghiên cứu theo dõi dọc ở Maryland từ năm 1988 đến

1996 trên những ngời sử dụng ma tuý bằng đờng tiêm chích thấy 30,3% đối ợng nghiên cứu có kháng thể HCV [184] ở hai thành phố Antwerp vàLimburg của Bỉ có các tỷ lệ phát hiện tơng ứng là 71% và 46% [131]

t-ở Châu Âu HCV có tỷ lệ hiện nhiễm đợc báo cáo là 80% trong nhóm tiêmchích ma tuý [176] ở khu vực Buner của Pakistan, một nghiên cứu phát hiệnthấy tất cả 751 bệnh nhân viêm gan C có tiền sử tiêm chích ma tuý [137] 90%những ngời tiêm chích ma tuý ở Chang Mai Thái Lan có dơng tính với xétnghiệm kháng thể HCV [43] ở Sydney Australia, tỷ lệ dơng tính với HCV là36,6% trong nhóm tiêm chích ma tuý; ở Melbourne là 74% [52], [129] Mộtnghiên cứu gần đây ở Luân Đôn, Anh Quốc tỷ lệ nhiễm là 44% so với HIVchỉ có 4% Điều này tơng ứng với một tỷ lệ nhiễm mới là 41,8 trờng hợp trong

100 ngời/năm [114] Vai trò quan trọng của tiêm chích ma tuý trong cơ chếlây truyền HCV nhiều khi không đợc chú ý hoặc quan tâm nhiều Tỷ lệ nhiễmHCV trong số ngời nhiễm HIV do tiêm chích ma tuý đạt đến tỷ lệ báo độngvới 90% [168] Sự đồng nhiễm cả hai loại virus này sẽ làm cho việc điều trị trởnên khó khăn hơn Đa số những nớc trên thế giới có quần thể trẻ tuổi nhiễmHCV nên coi tiêm chích ma tuý là nguyên nhân hàng đầu trong lây lan loại

virus này Rất nhiều ngời trong số nhóm tiêm chích ma tuý không biết về tìnhtrạng nhiễm HCV của họ Việc sàng lọc HCV kết hợp với điều trị cai nghiệngặp nhiều khó khăn nhng có vai trò quan trọng để phòng nguy cơ lây nhiễmcủa họ.

Hiện nay, ngời ta quan tâm nhất đến đối tợng nghiện chích ma tuý đờngtĩnh mạch vì tỷ lệ nhiễm HCV rất cao trong nhóm này: 78,9% ở Đức; 72% ởPháp; 60% ở Mỹ [93] Sự lây truyền HCV qua đờng tiêm chích ma tuý là rấtkhó kiểm soát vì ngời nghiện thờng né tránh sự kiểm soát của y tế Thời giannghiện càng lâu, tỷ lệ nhiễm HCV càng cao 32% Anti-HCV (+) trong 6 tháng

đầu, 62% Anti-HCV(+) sau 1 năm Sở dĩ có tốc độ tăng nhanh tỷ lệ nhiễmHCV nh vậy là do ngời nghiện dùng chung kim tiêm và giao hợp giữa nhữngngời nghiện, những ngời tuổi cao, nam giới cũng có tỷ lệ lây nhiễm HCV caohơn [93]

* Truyền máu

Truyền máu cũng là nguyên nhân hàng đầu trong lây nhiễm HCV Tuynhiên, do quy trình sàng lọc đợc cải thiện, loại cơ chế lây nhiễm này đanggiảm ở hầu hết các nớc phát triển ở Nhật Bản, tỷ lệ lây nhiễm mới sau truyềnmáu đối với viêm gan siêu vi non-A non-B giảm từ 4,9% trong năm 1988 -

1989 đến còn 1,9% những năm 1990 sau khi hệ thống và kỹ thuật sàng lọc

đầu tiên đợc áp dụng ở Mỹ, nguy cơ nhiễm sau truyền máu của viêm gan Ccũng giảm từ 3,84% xuống 0,57% kể từ khi ứng dụng kỹ thuật sàng lọc HCVnăm 1990 [83] ở Anh Quốc, tần suất nhiễm HCV do truyền máu cũng giảm

từ 1/520,000 (1993-1998) xuống còn 1/30 triệu (1999-2001) khi tất cả cácmẫu máu cho đợc xét nghiệm kiểm tra HCV RNA [164]

• Những bệnh nhân đợc truyền máu có nguy cơ lây nhiễm cao: nhữngbệnh nhân mắc bệnh a chảy máu (Hemophilia) có tỷ lệ nhiễm HCV rất cao:87% Anti-HCV(+) Cacopardo, B ở ý nghiên cứu trên 1000 bệnh nhânThalassemies thấy 80% bệnh nhân này có Anti-HCV(+) Trong 3 loại sảnphẩm ổn định của máu (các yếu tố đông máu, globulin miễn dịch và albumin)chỉ có albumin là không có nguy cơ truyền HCV, do albumin đã đợc xử lýbằng nhiệt độ > 600C [29] [56] [80]

Các yếu tố kháng chảy máu (yếu tố VIII, IX) và những thành phần đôngmáu khác không đợc xử lý bất hoạt bằng dung môi nên có nguy cơ cao truyền

HCV Do đó, ngời ta thấy trên 90% bệnh nhân Hemophilia đợc truyền các yếu

tố kháng chảy máu có Anti-HCV(+) [29] [56] [80]

Từ năm 1990 khi áp dụng chơng trình sàng lọc Anti-HCV ở ngời chomáu bằng kỹ thuật ELISA đã giảm tỷ lệ nhiễm HCV đáng kể Cho đến nay,nguy cơ nhiễm HCV sau truyền máu còn rất nhỏ 0,01 - 0,001% trong một đơn

vị máu truyền [35] [37] [38] [83] [88] [119] [164]

Tuy vậy, tỷ lệ mới mắc viêm gan có liên quan đến truyền máu vẫn cònphổ biến ở nhiều khu vực trên thế giới Ví dụ ở Chile, nguy cơ lây nhiễm HCVcao nhất là do truyền máu (54% so với 5% do tiêm chích ma tuý) [166].Nghiên cứu ở Brazil cho thấy có sự giảm đáng kể về nguy cơ nhiễm HCV dotruyền máu, tuy vậy nguy cơ với tần suất 1/13721 dù là rất thấp, nhng vẫn caogấp 10 lần so với các nớc phát triển [119] Mặc dù việc sàng lọc chọn ngờicho máu đợc cải thiện, nhng nhu cầu sàng lọc bằng các xét nghiệm HCVtrong labô vẫn rất cần thiết

* Lọc máu chu kỳ (chạy thận nhân tạo)

Bằng chứng lây nhiễm HCV trên những bệnh nhân chạy thận nhân tạo

là rõ ràng Nhiều tài liệu ghi nhận vai trò lây nhiễm qua đờng này với tỷ lệnhiễm HCV cao Rất nhiều nớc trên thế giới đã báo cáo tỷ lệ nhiễm HCV caotrong nhóm bệnh nhân chạy thận nhân tạo (từ 10-50%) [28] [86] Trớc đây, ởChâu Âu tỷ lệ này là 20-30% [176] và gần đây ở ả Rập Xê út là 9,24% so với0,30% ở nhóm cho máu [152] Tại một bệnh viện chăm sóc cấp III ở thànhphố Mexico, các thống kê cho thấy tỉ lệ nhiễm HCV là 6,7% so với khoảng1,2% ở quần thể chung ở Mexico [132] Tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh trongnhóm bệnh nhân chạy thận nhân tạo không có các yếu tố nguy cơ khác đợcbáo cáo là 1,38-1,9%/năm [121] [127] Dựa vào các nghiên cứu này, ngời ta đã đi

đến kết luận rằng lây nhiễm HCV ở những ngời chạy thận nhân tạo thờng phụthuộc theo tính chất của các yếu tố nguy cơ nh sử dụng dụng cụ không sát khuẩngiữa các bệnh nhân, dùng chung bơm kim tiêm hoặc dụng cụ truyền dịch, kỹ thuậtvô trùng kém, sử dụng máy chạy thận nhân tạo không đợc sát trùng kỹ, và khoảngcách giữa các ghế chạy thận không thích hợp (quá gần) [191]

Bệnh nhân lọc máu chu kỳ có nguy cơ bị nhiễm HCV từ 5 - 94% từngvùng, khu vực [28] [86] [176] Tỷ lệ nhiễm HCV tăng dần theo thời gian, theo

số lần lọc máu và không phụ thuộc vào truyền máu Lọc máu ở nhà, lọc màngbụng nhiễm HCV thấp hơn so với lọc máu ở trung tâm trong bệnh viện, do đó

có sự lây chéo HCV giữa các bệnh nhân với nhau hay các dụng cụ, thủ thuậtmáy, nhân viên y tế [86] [191] Vấn đề này vẫn đang đợc tiếp tục nghiên cứu

và chúng tôi trình bày ở phần bệnh nhân lọc máu

* Quan hệ tình dục

Vai trò của quan hệ tình dục trong lây nhiễm HCV vẫn cha rõ ràng.Nhìn chung nguy cơ lây nhiễm viêm gan C qua đờng tình dục là rất thấp [31].Tuy vậy, các nghiên cứu ở Mỹ cho thấy số bạn tình (OR=2,54 cho 2-49 bạntình) có mối tơng quan mạnh với lây nhiễm HCV týp 1b, và điều này cũng đợckhẳng định trong các nghiên cứu khác [41] [147] ở một nghiên cứu tạiphòng khám lâm sàng các bệnh lây nhiễm qua đờng tình dục ở Mỹ, ngời tathấy có HCV dơng tính là 9,7% trong số 1257 ngời bệnh không có tiêm chích

ma tuý Một giả thuyết cho rằng có rất nhiều bệnh nhân bị nhiễm HCV có thểvừa có nhiều bạn tình vừa tiêm chích ma tuý Trong một nghiên cứu khác ngời

ta thấy 15% phụ nữ không có tiêm chích ma tuý nhng có bạn tình tiêm chích

ma tuý bị nhiễm HCV Gần đây, một nghiên cứu dọc tiến cứu (theo dõi hớngtới tơng lai) trong thời gian 10 năm trên 8060 bệnh nhân cho thấy không cóbằng chứng của lây nhiễm qua đờng quan hệ tình dục đối với các cặp vợchồng đơn thê ở ý [80] Tuy nhiên, ở Hy Lạp theo ớc tính lây nhiễm từ vợsang chồng chiếm 34% và 10% ở những phụ nữ có và không có HCV RNA đ-

ợc phát hiện Trong khi đó, lây nhiễm từ chồng sang vợ chỉ là 3% Tínhchung, lây nhiễm HCV trong quan hệ vợ chồng là 6% [128] Cũng trong thờigian gần đây, ngời ta thấy thiếu các bằng chứng về lây nhiễm qua đờng quan

hệ tình dục đối với nhóm đồng tính luyến ái nam trong nghiên cứu thuần tập

t-ơng lai ở Mỹ (nghiên cứu trên 2653 ngời-năm theo dõi) [31] Tất cả các bằngchứng này đều cho thấy lây nhiễm HCV qua đờng tình dục là hiếm gặp, nhngvì một số lý do đặc biệt tỷ lệ nhiễm HCV có thể cao hơn ở những ngời cóhành vi tình dục nguy cơ (tình dục không bảo vệ hoặc có nhiều bạn tình)

* Quần thể đặc biệt khác

Nguy cơ lây nhiễm giữa các thành viên trong gia đình vẫn còn bị saonhãng Nguồn lây nhiễm từ mẹ sang con vẫn còn cha rõ ràng; một số tài liệucho rằng mức độ lây nhiễm khoảng 10% Nếu mẹ bị nhiễm HCV, thì xác suấtlây nhiễm cho con sẽ là 1/10 (hay 10%) Nguy cơ lây nhiễm HCV từ mẹ sangcon sẽ tăng lên nếu mẹ bị viêm gan C ở mức độ nặng và ngợc lại Mẹ bị viêmgan C nhẹ sẽ ít có nguy cơ lây sang con Các nguy cơ lây truyền qua sữa mẹ

cũng cha rõ ràng, do đó các nghiên cứu hiện tại đang đi sâu vào nghiên cứu vềvấn đề này [31].

Trong một số quần thể khác, tỷ lệ nhiễm HCV cũng khá cao ở bệnhnhân thận có ghép thận cũng có tỷ lệ nhiễm cao, nh ở ý tỷ lệ chung đến33,3% trong khi đó tỷ lệ này trớc năm 1990 là 50% so với sau năm 1990 là27% Điều dễ thấy là phần lớn các bệnh nhân đợc ghép thận cũng đều phải trảiqua chạy thận nhân tạo Trung tâm y tế của Hội Cựu chiến binh Mỹ cũngnghiên cứu thấy nhiễm HCV cao hơn rất nhiều (35%) trong nhóm bệnh nhânghép thận so với nhóm quần thể chung [62] Trong các nghiên cứu gần đâycủa 20 trung tâm y tế của Mỹ cho thấy tỷ lệ nhiễm HCV là 5,4% trong đó78% trong số họ có một yếu tố nguy cơ hoặc là truyền máu hoặc là tiêm chích

ma tuý Tỷ lệ dơng tính trong huyết thanh cũng phối hợp với hành vi xămmình và tình trạng bị tù [82] Tỷ lệ nhiễm HCV cũng tăng lên trong những ng-

ời cùng tù Ví dụ, ở một hệ thống nhà tù của Quận Riverside, 25% ngời lớn tù

đã mang virus HCV trong khi chỉ có 2% vị thành niên trong các trại tạm giammang HCV [93] Do đó, quần thể vị thành niên trong các trại giam sẽ là nhóm

đối tợng quan trọng trong nghiên cứu và can thiệp vì nhiều ngời trong số họ cóthể sẽ bị nhiễm virus HCV sớm trong những năm tiếp theo nếu không đợc canthiệp kịp thời

Tại các bệnh viện, sự lây truyền HCV từ bệnh nhân cho nhân viên y tế

là có nhng tỷ lệ lu hành HCV ở nhân viên y tế không cao (0 - 2%) Điều quantrọng là nhân viên y tế có biện pháp và ý thức bảo vệ phòng chống lây nhiễmhàng ngày [29] [34] [118] [133] Nguy cơ lây nhiễm trớc đây cao nhất làtruyền máu hay sản phẩm máu nhiễm HCV và nghiện chích ma tuý dùngchung bơm kim tiêm không đợc khử trùng Hiện nay, máu và các sản phẩmmáu đã đợc sàng lọc nên tỷ lệ nhiễm HCV đã giảm đi đáng kể, cho nên hiệnnay nghiện chích ma tuý đờng tĩnh mạch là một nguy cơ nhiễm virus viêmgan C hàng đầu thế giới cũng nh ở nớc ta [6] [7] [8] [12] [14] [15] [17] [18][39] [125]

1.2 Diễn biến và hậu quả của nhiễm virus viêm gan C

Bệnh cảnh lâm sàng của viêm gan C rất đa dạng, từ thể nhẹ không triệuchứng đến thể cấp tính, tối cấp và mạn tính Trong viêm gan cấp tính do HCV,thời gian ủ bệnh khoảng 7 tuần (3 - 20 tuần) Sau khi nhiễm HCV, phần lớncác trờng hợp (75%) không có triệu chứng lâm sàng, 25% có vàng da, rối loạn

tiêu hoá thất thờng không nổi bật nh viêm gan cấp do HBV [104] Hầu hết cácviêm gan cấp do HCV có tăng ALT mức độ vừa phải và đỉnh cao ALT gấp 10lần mức bình thờng ở 80% các trờng hợp [104] HCV - RNA xuất hiện sớm tr-

ớc khi có biểu hiện lâm sàng 1 - 2 tuần và nồng độ đạt đỉnh cao 106 - 108 bảnsao/ml

* Sự biến đổi huyết thanh muộn (Anti-HCV) trong nhiễm virus viêmgan C cấp có ảnh hởng rất lớn tới kết quả chẩn đoán huyết thanh Chỉ 30 -50% đợc phát hiện trong những tháng đầu, 80% đợc phát hiện sau 15 tuần Dovậy, rất nhiều trờng hợp nhiễm HCV không đợc phát hiện Ngoài ra, 20%nhiễm HCV không tạo kháng thể với HCV [38] [104]

• Sự biến đổi huyết thanh muộn rất khó khăn trong vấn đề theo dõi pháthiện viêm gan cấp do HCV

Biểu đồ 1.1: Diễn biến lâm sàng và biến đổi huyết thanh

của viêm gan cấp do HCV [104]

• Trong viêm gan tối cấp do HCV ít đợc phát hiện [104], do tử vong ờng xảy ra trớc khi có sự biến đổi huyết thanh Do đó việc tìm HCV- RNA làvô cùng quan trọng để chẩn đoán viêm gan tối cấp do HCV Trong trờng hợpnhiễm phối hợp 2 loại virus viêm gan C với B thì tỷ lệ tối cấp cao hơn [104]

th-Anti-HCV Triệu chứng

• Viêm gan mạn

Nhiễm HCV có xu hớng trở thành mạn tính Seeff, L B [162] nghiêncứu ở Mỹ thấy bệnh nhân bị viêm gan C sau truyền máu, 85% những ngời này

có thể tiến triển mạn tính hoặc diễn biến dai dẳng

Trong số viêm gan virus mạn, HCV là căn nguyên phổ biến nhất.Nhiễm HCV thờng kéo dài hàng chục năm, trong thời gian đó, men gan(ALT) tăng giảm không phụ thuộc vào triệu chứng lâm sàng [90], nhng nồng

độ HCV-RNA duy trì ổn định trong huyết thanh

Viêm gan mạn do HCV biểu hiện lâm sàng rất nghèo nàn, không đặchiệu, không thờng xuyên Triệu chứng lâm sàng chủ yếu là mệt mỏi, chán ăn,tức hạ sờn phải, tiểu tiện nớc tiểu vàng, vàng da có thể có đặc biệt ở nhữngbệnh nhân nặng Bệnh nhân diễn biến dai dẳng với ALT tăng và dao độngtrong phạm vi 2 - 10 lần mức bình thờng, nhng thờng tăng một cách gián

đoạn Sinh thiết gan ở những trờng hợp nhiễm HCV mạn tính có ALT bình ờng Hoofnagle J.H [104] nhận thấy phần lớn bệnh nhân này là viêm gan mạn:65% là viêm gan mạn tồn tại hoặc viêm gan không đặc hiệu, 22% viêm ganhoạt động, chỉ có 13% không có tổn thơng gan Do đó, không nên quan niệmnhững trờng hợp nhiễm HCV mạn tính có ALT bình thờng là ngời lành mangvirus

th-Anti-HCV Triệu chứng

Biểu đồ 1.2: Diễn biến lâm sàng và biến đổi huyết thanh của viêm gan mạn

do HCV [104]

• Diễn biến hậu quả của viêm gan C

Với đặc điểm nổi bật là có khả năng chuyển mạn tính cao

Theo Alberti A [32] và Seeff L.B [162], đã cho thấy 85% các trờnghợp nhiễm HCV chuyển thành mạn tính

Các yếu tố tham gia vào quá trình mạn tính của viêm gan C phụ thuộc vàonhiều yếu tố, trong đó yếu tố virus, đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ lànhững yếu tố chủ đạo [162] Đáp ứng kháng thể có thể tồn tại nhiều năm saukhi virus đã đợc loại trừ Còn HCV- RNA tồn tại trong máu của ngời nhiễmmạn với nồng độ thấp và có thể gián đoạn nhng hiếm khi tự mất Chỉ khoảng15% ngời nhiễm cấp có thể tự mất HCV-RNA trong máu sau 23 - 24 thángnhng Anti-HCV vẫn tồn tại nhiều năm Để kết luận nhiễm HCV chấm dứt cầnthiết phải mất HCV-RNA và có men gan ALT bình thờng Một số yếu tố kháccũng tham gia vào quá trình diễn biến mạn tính của HCV, đó là nghiện rợu,nghiện thuốc lá, chất độc môi trờng, nhiễm phối hợp HCV với các virus viêmgan khác [39] [162]

• Biến chứng chủ yếu của viêm gan C là xơ gan và ung th gan Trongnghiên cứu của Hội gan mật Châu Âu, trên 384 bệnh nhân xơ gan do HCV,thấy có 15 - 20% chuyển giai đoạn xơ gan mất bù, 10% chuyển thành ung thgan và 9% bị chết hoặc cần ghép gan [92]

1.3 Chuyển đổi huyết thanh của ngời bị nhiễm viêm gan C

Sau khi bị nhiễm HCV phần lớn bệnh nhân không có những biểu hiệnlâm sàng (95% các trờng hợp) Trong thời gian ủ bệnh, bệnh rất khó xác định,tuy nhiên do có sự huỷ hoại tế bào gan nên chức năng gan và men ALT(Alanine Amino Transferasa) thờng có những biến đổi sớm Do vậy tại một sốnớc tiên tiến để ngăn chặn việc lây nhiễm HCV qua đờng truyền máu ở giai

đoạn mới nhiễm đã đa xét nghiệm xác định men ALT vào sàng lọc cho ngờicho máu, bổ sung cho kỹ thuật phát hiện kháng thể HCV [124]

Kháng thể HCV có thể xuất hiện sớm nhng phải sau 7 - 10 tuần tuỳ

theo từng loại kít chẩn đoán (biểu đồ 1.3) Với kỹ thuật xác định kháng thể

HCV bằng kỹ thuật ELISA thì phải sau 54 - 192 ngày bị nhiễm mới có thể xác

định đợc Thời gian phát hiện đợc tuỳ thuộc từng kỹ thuật khác nhau với cácthế hệ kít khác nhau và tuỳ thuộc từng bệnh nhân [74] [109] [116]

Giai đoạn cửa sổ huyết thanh

Của kháng thể HCV ng ời nhiễm HCV

Độ nhạy thử nghiệm %

60

100 80

150 125

Thời gian sau nhiễm (ngày)

Biểu đồ 1.3: Giai đoạn cửa sổ huyết thanh của kháng thể kháng HCV ở ngời

nhiễm HCV [18] [19].

Gần đây một số hãng đã giới thiệu kít ELISA để phát hiện khángnguyên HCV, đây là một tiến bộ của y học vì với kỹ thuật này ngời ta cũng cóthể phát hiện đợc trực tiếp virus và độ nhậy của kỹ thuật này cũng tơng tự nh

kỹ thuật PCR mà việc thực hiện kỹ thuật lại dễ dàng hơn [97] [116] [156][158]

Hiện nay một số nớc tiên tiến đã đa kỹ thuật PCR phát hiện RNA-HCVvào sàng lọc cho ngời cho máu để rút ngắn giai đoạn cửa sổ của nhiễm HCV,

kỹ thuật PCR có thể phát hiện đợc RNA-HCV trong huyết thanh sau 10-14ngày bị nhiễm Nhờ áp dụng kỹ thuật này mà đã rút ngắn thời gian cửa sổ từ

82 ngày xuống 59 ngày và cũng nhờ áp dụng kỹ thuật này mà nguy cơ lâynhiễm HCV ở ngời cho máu đã giảm đi rõ rệt (Từ 1/103.000 với kỹ thuật

ELISA phát hiện kháng thể xuống 1/386.000 với kỹ thuật phát hiện HCV [157]

RNA-1.4 Quan hệ giữa hoạt độ ALT (Alanine Amino Transferasa) huyết thanh và tình trạng nhiễm HCV ở bệnh nhân suy thận mạn lọc máu chu kỳ

Hoạt độ ALT huyết thanh là yếu tố dự đoán nghèo nàn về tình trạngbệnh gan gây ra bởi HCV trong nhóm bệnh nhân lọc máu chu kỳ Trong thực

tế, trong nhóm bệnh nhân lọc máu chu kỳ, hoạt độ huyết thanh ALT chỉ giatăng trong 4% -67% trong số bệnh nhân có kháng thể kháng HCV, 12% đến31% trong nhóm bệnh nhân có HCV RNA (+) và chỉ duy nhất 1/3 trong số này

đợc khẳng định thông qua sinh thiết gan [146] Có rất nhiều lý do để giải thíchcho sự khác biệt giữa hoạt độ ALT và sự hiện diện của kháng thể kháng HCV:

1 Viêm gan siêu vi C mạn là một quá trình rất thay đổi với nhiều đỉnh vànhiều điểm đi xuống thấp của hoạt độ ALT huyết thanh và chính nó vẫnnằm trong khoảng giá trị bình thờng Chính điều này dẫn đến, bệnhnhân với kết quả hoạt độ ALT huyết thanh nằm trong khoảng bình th-ờng có thể có bệnh gan trớc đó và đã có tổn thơng gan về mặt mô học[146]

2 Tình trạng nhiễm HCV không phải luôn luôn gây ra tình trạng bệnh ganmạn tính Trong thực tế, trong số bệnh nhân hiến máu không có biểuhiện lâm sàng về gan và có mang kháng thể kháng HCV và đợc sinhthiết gan, chỉ có 69% có những bằng chứng về mô học cho tình trạngviêm gan mạn tính, tất cả những bệnh nhân này đều có RNA HCVtrong huyết thanh [32] Do đó, tình trạng ngời lành mang HCV vàkhông có triệu chứng của huỷ hoại gan có thể tồn tại Trong những tr-ờng hợp này, tình trạng nhân lên của virus có thể vẫn tồn tại tại vị trínào đó ngoài gan

3 Hoạt độ ALT cơ bản của bệnh nhân lọc máu thờng thấp Một điểm

đáng lu ý, tình trạng gia tăng hoạt độ ALT huyết thanh trong nhómbệnh nhân lọc máu và không mang kháng thể kháng HCV đã đợc quansát trong số 4%-23% [146]

Bệnh nhân cũng có thể là những ngời mang HCV và không xảy ra quátrình sản xuất ra kháng thể kháng HCV, hoặc bệnh gan có thể đợc gây ra bởivirus non-A, non-B hơn là HCV hoặc không phải nguyên nhân virus Từ

những khía cạnh trên, sinh thiết tế bào gan vẫn là phơng pháp đáng tin cậyduy nhất trong việc xác nhận và đánh giá mức độ nặng nhẹ của bệnh gan đốivới những bệnh nhân nhiễm HCV Điều này đặc biệt đúng cho những bệnhnhân đang đợc xem xét đến chỉ định ghép tạng, bởi vì nếu có biểu hiện môhọc tại gan trong giai đoạn đầu là một yếu tố dự đoán rất tốt cho kết quả ngaysau khi ghép và về lâu dài của ghép thận [159] Trong khoảng thời gian theodõi trung bình là 6 năm, tiến triển đến suy gan và tử vong là rất hiếm trong sốnhững bệnh nhân đợc ghép tạng và có bất thờng biểu hiện trên mô học ở mứctrung bình chẳng hạn nh: tình trạng nhiễm mỡ hoặc viêm gạn mạn tính trờngdiễn Ngợc lại, 35% trong số những bệnh nhân đợc ghép tạng với viêm ganmạn tính tiến triển sớm và 60% viêm gan mạn tính tiến triển trớc đó tiến tớisuy gan và tử vong [159].

Về mặt miễn dịch

Khi đã nhiễm HCV, cơ thể đáp ứng lại bằng cách sản xuất ra kháng thểnhắm thẳng vào nhiều vùng của hệ gen của HCV Phần lớn trong số nhữngkháng thể này là không có tác dụng trung hoà và do đó không có vai trò miễndịch bảo vệ Mặc dù kháng thể trung hoà sẽ bao phủ những vùng của HCVgần đây đã đợc chỉ rõ đặc điểm, vai trò của chúng trong hàng rào bảo vệ miễndịch vẫn cha đợc chứng minh Do đó, trong đa số trờng hợp nhiễm HCV, đápứng miễn dịch vẫn thất bại trong việc kiểm soát quá trình nhiễm HCV, dẫn

đến tình trạng tiến triển bệnh của những ngời mang HCV mạn tính [153]

1.5 Các kỹ thuật phát hiện HCV và ứng dụng trong chẩn đoán

Cho đến nay có nhiều biện pháp kỹ thuật để phát hiện HCV ngày càng

có độ nhạy và độ đặc hiệu cao Các phản ứng huyết thanh học phát hiện khángthể kháng virus viêm gan C (tức Anti-HCV) đầu tiên ta phải kể đến phản ứngmiễn dịch Enzym (EIA: Enzyme Immuno Assay) từ thế hệ 1 đến thế hệ 3 có

độ nhạy và độ đặc hiệu tăng dần từ 50% đến 99% [99] Nhng hiện nay hầu hếtcác labo đang sử dụng phản ứng miễn dịch enzyme cải tiến gọi là phản ứnghấp phụ miễn dịch gắn men (ELISA: Enzyme liked immuno sorbent assay) có

độ đặc hiệu và độ nhạy cao lại thích hợp với các phòng xét nghiệm [99], ngoài

ra còn có những phản ứng miễn dịch không đợc dùng rộng rãi vì trang bị phứctạp hoặc giá thành đắt nh các phản ứng miễn dịch thấm tái tổ hợp (RIBA:Recombinant immunoblot assay) và phản ứng miễn dịch phóng xạ (RIA:Radioimmunoassay) tuy vậy các phản ứng huyết thanh phát hiện kháng thể

còn những nhợc điểm là còn tỷ lệ dơng tính giả, thời gian cửa sổ dài và khôngphát hiện đợc ngay cả khi nhiều HCV đang hoạt động hoặc chỉ có kháng thể

mà không còn virus Chính vì lẽ đó, phản ứng sinh học phân tử chẩn đoánnhiễm HCV ra đời Bằng phản ứng sinh học (PCR: polymerase chain reaction)phát hiện đợc RNA-HCV trong huyết tơng [64] [115] Điều này cho thấy ph-

ơng pháp phân tử chẩn đoán virus chắc chắn hơn phơng pháp miễn dịch tìmAnti-HCV Từ PCR tiến tới kỹ thuật đếm số lợng bản sao virus (viral load) đã

đợc ứng dụng để đánh giá mức độ nhân lên của virus, khả năng lây truyền vàtiên lợng bệnh, tiếp theo đó là xác định typ và phân typ của HCV bằng phảnứng sinh học phân tử, giúp cho công tác điều trị và điều tra dịch tễ học củavirus viêm gan C ngày càng hoàn thiện hơn [117] [121]

1.5.1 Các phản ứng huyết thanh học phát hiện Anti - HCV

1.5.1.1 Phản ứng miễn dịch hấp phụ gắn men (ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)

Năm 1989 các nhà khoa học đã phân lập đợc virus viêm gan C (HCV),tiếp theo là kết quả về phân lập RNA - HCV trong huyết thanh và đã thànhcông lai tạo RNA virus C và E.coli, tạo đợc protein C-100.3 Protein này phảnứng đặc hiệu với anti-HCV và đợc coi nh một kháng nguyên của virus viêmgan C, kháng nguyên tổng hợp (Recombinant HCV anti gen)

Kỹ thuật ELISA đợc áp dụng trong sàng lọc, anti - HCV ở ngời cho máu

đã đợc triển khai áp dụng ở một số nớc Châu Âu từ năm 1990 đã đem lại hiệuquả vô cùng to lớn trong việc phát hiện HCV và đề phòng lây nhiễm trong cộng

đồng ELISA có 3 thế hệ đã nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu lên dần:

 ELISA thế hệ 1 (ELISA-1): dùng một kháng nguyên tái tổ hợp từ gen

NS4 gọi là C-100-3 Việc đa kỹ thuật ELISA-1 vào sàng lọc Anti-HCV ở ngờicho máu đã làm giảm đáng kể tỷ lệ viêm gan C sau truyền máu, nhng ELISA-

1 cha đạt đợc độ nhạy và độ đặc hiệu cao

Đồng thời kháng thể C100-3 xuất hiện sau 1-3 tháng hoặc lâu hơn kể từkhi nhiễm cấp [99] cho nên ELISA-1 chỉ phát hiện nhiễm HCV đã có trớc 1-3tháng [99] ở quần thể có nguy cơ lây nhiễm HCV cao ESISA-1 chỉ cho kếtquả dơng tính từ 70 - 85% số bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng và HCV-RNA (+) ở quần thể nguy cơ nhiễm thấp (ngời cho máu) Có tới 50% dơngtính giả với ELISA-1 Do độ đặc hiệu thấp trớc đây ngời ta cần bổ sung bằngRIBA [99] [121] [195]

 ELISA thế hệ thứ 2 (ELISA-2) sử dụng kháng nguyên từ vùng lõi, gen

NS3 và gen NS4 (C22-3; C33-C; C-100-3) vì thế ELISA-2 còn gọi là ELISA đakháng nguyên ELISA-2 có độ nhạy cao hơn ELISA-1 (92-95% so với 70-85%) [99] [121]; ELISA-2 cho kết quả sớm hơn từ thời kỳ cấp cho nên Anti-HCV (ELISA-2) là dấu ấn của cả mới và đã nhiễm Độ đặc hiệu của ELISA-2cũng cao hơn ELISA-1: 50-60% so với 30-50 ở quần thể nhiễm thấp, 70-85%

ở quần thể nhiễm cao [99] [121] ELISA-2 sử dụng kháng nguyên từ vùng lõi

và NS3 nên thời kỳ cửa sổ đợc rút ngắn (10 tuần so với 16 tuần nếu dùngELISA-1) [99]

 ELISA thế hệ 3 (ELISA-3) có kháng nguyên từ vùng lõi, NS3, NS4 vàthêm NS5, độ nhạy cao trên 97% và giai đoạn cửa sổ giảm xuống còn 2-8 tuần[99] [183] Độ đặc hiệu trong sàng lọc ngời cho máu cũng cao hơn ELISA-2[42] ELISA 2 và 3 phát hiện Anti-HCV xuất hiện từ thời kỳ cấp - cả hai đều

là dấu ấn của nhiễm mới và nhiễm cũ [99] ở Việt Nam, Đỗ Tuấn Đạt,Nguyễn Thu Vân và cộng sự [4] đã sử dụng protein tái tổ hợp biểu thị ở E.colichế tạo bộ sinh phẩm miễn dịch gắn men thế hệ 3 phát hiện kháng thể củaHCV mang tên GST Anti-HCV EIA-3 Các bệnh nhân viêm gan mạn có Anti-HCV (ELISA-2 hoặc 3) (+), thông thờng trên 90% số bệnh nhân này đều đang

có nhiễm HCV [121] Sàng lọc kháng thể kháng HCV (Anti-HCV) ở ngời chomáu đã có tác dụng vô cùng to lớn ngăn ngừa sự lan truyền của HCV theo đ-ờng máu cho cộng đồng Tuy vậy còn có 1 tỷ lệ đáng kể Anti-HCV dơng tínhgiả đối với ELISA-1 50% và ELISA 2 và 3: 30% [99] Để khắc phục hiện tợngnày thờng phải làm 2 ELISA của 2 hãng khác nhau hoặc nếu có điều kiện xétnghiệm bổ sung RIBA (Recombinant Immunoblot Assay) là kỹ thuật miễndịch thấm tái tổ hợp có khả năng phát hiện và tách riêng lẻ các kháng thểkháng các kháng nguyên của HCV RIBA đợc coi là dơng tính khi phát hiện

đợc từ 2 kháng thể trở lên, âm tính khi không phát hiện đợc kháng thể nào vàRIBA không xác định khi chỉ phát hiện đợc 1 kháng thể [99] RIBA là xétnghiệm bổ xung giúp loại trừ các trờng hợp Anti-HCV (ELISA) dơng tính giả.RIBA thờng không cần thiết với quần thể lây nhiễm cao Vì nhóm này có tới93% số trờng hợp dơng tính với ELISA-2 cũng dơng tính với RIBA [121] Sự

có mặt của Anti-HCV trong huyết thanh là bằng chứng của nhiễm HCV.Trong trờng hợp nhiễm HCV chỉ có 30-50% đợc phát hiện trong những tháng

đầu, 80% đợc phát hiện sau 15 tuần Kết quả này cho thấy có rất nhiều trờng

hợp nhiễm HCV không đợc phát hiện trong thời kỳ cửa sổ bằng kỹ thuậtELISA [38] [149] Hơn nữa việc tìm thấy kháng thể không giúp phân biệt đợcnhiễm HCV ở giai đoạn cấp hay mãn hoặc hồi phục

1.5.1.2 Phản ứng miễn dịch thấm tái tổ hợp (RIBA: Recombinant Immunoblotassay)

Phản ứng này đợc gọi là phản ứng bổ xung (complementary assay) chokết quả EIA hoặc ELISA cùng thế hệ, kháng nguyên dùng làm phản ứngRIBA có 3 thế hệ RIBA-1, RIBA-2, RIBA-3 độ nhạy và độ đặc hiệu tăng dần[99], nhng giá thành rất đắt nên các nớc nghèo hầu nh không phát triển kỹthuật này kể cả Việt Nam

1.5.1.3 Phản ứng miễn dịch phóng xạ (RIA: Radioimmunoassay)

Nguyên lý của phản ứng tơng tự nh phản ứng miễn dịch gắn men, cáckháng nguyên đợc đánh dấu bằng chất đồng vị phóng xạ và các thế hệ phảnứng cũng ngày càng tăng độ nhạy và độ đặc hiệu Nhng phản ứng này không

đợc dùng rộng rãi vì trang bị phức tạp, thời gian bán huỷ của sinh phẩm ngắn

và phải bảo quản đặc biệt, giá thành cao cho nên hiện nay hầu hết các labo xétnghiệm phát hiện kháng thể kháng HCV đều sử dụng bằng kỹ thuật ELISA-3hoặc EIA-3 [67] [116]

1.5.2 Kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện virus viêm gan C (HCV)

Kỹ thuật sinh học phân tử hay còn gọi là các thử nghiệm axít nhân:Nucleic Acid Test (NAT) [97] [158] Các kỹ thuật này phát hiện trực tiếp một

đoạn gen đặc hiệu của HCV nên có tính đặc hiệu cao và cho biết sự có mặttrực tiếp của virus nếu phản ứng dơng tính, nếu định lợng cho phép suy ra số l-ợng virus trong mẫu thử Một đặc điểm của kỹ thuật sinh học phân tử để pháthiện HCV là hầu hết các trờng hợp nhiễm HCV mạn tính có số lợng virus tồntại rất thấp nên bắt buộc phải khuếch đại Căn cứ vào đối tợng nhằm khuếch

đại ngời ta chia kỹ thuật này làm 2 nhóm chính [19]:

- Khuếch đại mục tiêu (Target Amiplification)

- Khuếch đại tín hiệu (Signal Amiplification)

1.5.2.1 Nhóm kỹ thuật khuếch đại mục tiêu: Phản ứng chuỗi (Polymerase Chain Reaction- P.C.R)

Nguyên liệu di truyền của HCV là ARN nên muốn thực hiện PCR phải

có giai đoạn chuyển ARN sang cDNA nhờ men sao chép ngợc RT (ReverseTranscriptase) nên có ký hiệu là RT – PCR Sau khi có cDNA thì ta thực hiệnphản ứng trực tiếp PCR với đơn vị đặc hiệu của HCV Thông thờng nhất làkhuếch đại vùng không mã hoá ở đầu tận cùng 5’ (5’ NCR: 5’ NoncodingRegion hay còn gọi là 5’ UTR: untranslated Region) Để tăng độ khuếch đại ng-

ời ta sử dụng Nested PCR hay Heminested PCR Kỹ thuật RT – PCR dùng đểphát hiện RNA của HCV với độ nhạy cao cho kết quả dơng tính với 100 đến

1000 bản sao RNA/ml (Amplicor HCV – RT – PCR kit) [19] [24] [191]

Kỹ thuật NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplifications) Đặc

điểm của kỹ thuật này là khuếch đại trực tiếp RNA của HCV ở nhiệt độ thờng

Kỹ thuật này đối với HIV thì độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao nhng đối vớiHCV thì kết quả cha đợc nh mong muốn nh RT – PCR [158]

Kỹ thuật LCR (Ligase Chain Reaction) Kỹ thuật này cũng chuyểnRNA của HCV sang cDNA nh kỹ thuật RT – PCR nhng men để nhân DNAlên là DNA Ligase Nhng độ nhạy và độ đặc hiệu không bằng RT – PCR[19] [158]

1.5.2.2 Nhóm kỹ thuật khuếch đại tín hiệu:

Kỹ thuật DNA nhánh: bDNA (Branched DNA)

Phản ứng bDNA dựa trên khuyếch đại tín hiệu Đây cũng là một phơngpháp lựa chọn để đo lờng hàm lợng virus ở bệnh nhân viêm gan mạn tính (đây

là phơng pháp của hãng Bayer) Trong phơng pháp xét nghiệm này HCV-RNA

đợc bắt giữ ở một cái giếng, lai tạo bằng chất dò tổng hợp nucleotide bổ xungcho chuỗi hoạt động ở phút thứ 5 Trong vùng không mã hoá và lõi gen HCV.Các chất dò bổ xung sẽ bắt gắn chặt HCV-RNA với các phân tử bDNA đợckhuếch đại và đánh dấu bằng chất dò phát quang Xét nghiệm này đợc chuẩnhoá rất tốt, có độ chính xác cao và hoàn toàn có thể ứng dụng đợc giữa cáclabo, nhợc điểm chính của nó là độ nhạy tơng đối thấp với giới hạn thấp làkhoảng 200.000 HCV-RNA/ml huyết thanh Hiện nay phản ứng bDNA đang

đợc đánh giá để theo dõi ngời nhiễm HCV mạn tính trong và sau điều trị, đây

là phản ứng định lợng không dùng để phát hiện HCV [19] [24] [156] [158]

1.5.2.3 Phản ứng định typ và phân typ của HCV bằng phản ứng sinh học phân tử

Dựa trên các phơng pháp phân tích mảnh PCR của vùng (5' untranslated region) l vùng ổn định cao chứa nhiều kiểu gen đặc hiệu choà vùng ổn định cao chứa nhiều kiểu gen đặc hiệu chogenotyp Do vậy vùng 5'UTR thờng đợc dùng trong phản ứng định typ.Vùng nhân và vùng NS5B là hai vùng ổn định mức trung bình đ ợc dùng đểphân biệt các phân typ

• Phân tích hình thái đoạn gen (RFLT: Restrict fragment polyphormysm

analysis)

Đây là phơng pháp khuếch đại mảnh PCR của một vùng nhân hoặcvùng NS5B Các tác giả đã xác định phân typ 1a, 1b, 2a, 2b từ mảnh PCR củavùng NS5B có 340 đôi bazơ và sử dụng 5'UTR để phát hiện genotyp từ 1-6 đ-

ợc áp dụng rộng rãi [73]

• Phơng pháp khuếch đại đặc hiệu phân typ.

Khuếch đại vùng nhân đợc sử dụng để xác định các phân typ 1a, 1b, 2a,2b Năm 1997 Maetens G., Stuyver L đã khuếch đại vùng NS5B và xác định

đợc các phân typ 1a, 1b, 2a, 2b, 3b [126] Phơng pháp này gọi chung làkhuếch đại đặc hiệu phân typ

• Phản ứng thăm dò chuỗi bằng lai ngợc (Reverse hybridisation:

LIPA-line Probe Assay)

LIPA cho phép phát hiện các genotyp và các phân typ chung dựa trên sựphân biệt hình thái của vùng 5'UTR đặc hiệu cho các genotyp khác nhau [126]

• Phản ứng miễn dịch men lai ngợc.

(DEIA: Reverse hybridisation - bDNA enzyme immuno assay)

Ngời ta đã sử dụng phơng pháp hình thái trong vùng E1 để phân biệtphân typ 1a và 1b Ngời ta còn sử dụng bộ thăm đặc hiệu phân typ để laingợc các mảnh từ vùng nhân và xác định đợc các phân typ 1a, 1b, 2b, 3a[151]

1.5.3 Kỹ thuật các xét nghiệm trong chẩn đoán

1.5.3.1 Chẩn đoán HCV cấp tính

Chẩn đoán HCV cấp tính khá khó khăn Chỉ có gần một nửa các bệnhnhân viêm gan C cấp tính có biểu hiện hoàng đản, trong khi đó rất nhiều bệnhnhân chỉ có rất ít các triệu chứng của viêm gan C Mặc dù các kháng thể đặchiệu IgM rất hữu ích trong chẩn đoán HBV và HCV cấp tính, nhng mức tin

cậy của nó cũng cha đợc khẳng định trong chẩn đoán HCV cấp tính Nhữngkhó khăn trong chẩn đoán này cũng bị cản trở bởi thời gian kéo dài đáng kểgiữa thời điểm nhiễm HCV và phát hiện kháng thể đối với virus trong huyếtthanh bệnh nhân Ví dụ nh xét nghiệm miễn dịch men kháng HCV thế hệ thứnhất (EIA-1) mất 16 tuần kể từ lúc nhiễm HCV và biểu hiện biến đổi huyếtthanh Khoảng thời gian kéo dài này đợc rút ngắn dần qua mỗi thế hệ xétnghiệm EIA Thật vậy, EIA-2 là 10 tuần, EIA-3 là 7-8 tuần Tuy nhiên, HCV-RNA thờng có thể phát hiện đợc trong huyết thanh bệnh nhân là từ 10-14ngày sau khi nhiễm Do đó, trong trờng hợp nghi ngờ bệnh nhân nhiễm HCV cấptính trên lâm sàng, nh nghiện chích ma tuý hoặc có tăng hàm lợng menaminotransferase nhng không phát hiện thấy kháng thể kháng HCV, thì ta có thể

sử dụng xét nghiệm HCV-RNA để khẳng định cho chẩn đoán [121] [127] [156]

1.5.3.2 Chẩn đoán HCV mạn tính

Theo ớc tính có 85% cá thể phơi nhiễm với HCV sẽ có biểu hiện rụngtóc kéo dài ảnh hởng đến chất lợng cuộc sống Tuy nhiên, nhiều bệnh nhân cóHCV mạn tính có rất ít các triệu chứng trừ giai đoạn muộn của bệnh Hậu quả,hầu hết các bệnh nhân HCV mạn tính đã không biết tình trạng bệnh của họ.Biện pháp hiệu quả nhất để sàng lọc bệnh nhân có biểu hiện nghi ngờ HCVtrên lâm sàng là sử dụng xét nghiệm miễn dịch gắn men kháng HCV hoặcELISA 3 Trong trờng hợp này, việc sử dụng xét nghiệm miễn dịch tái kết hợp(RIBA) để khẳng định là không cần thiết bởi vì HCV-RNA có thể phát hiện ởtrên 90% huyết thanh có dơng tính với kháng thể kháng HCV Nhng xétnghiệm HCV-RNA định tính sẽ rất hữu dụng để phân biệt các cá thể bị nhiễmHCV trớc nhng đã hết virus (khỏi) và những cá thể vẫn còn nhiễm HCV Tuynhiên, bởi vì một số bệnh nhân bị nhiễm HCV mãn tính có thể chỉ có biểuhiện rụng tóc thoáng qua, việc sử dụng xét nghiệm định tính HCV-RNA bằngphơng pháp PCR sẽ là cần thiết để phân biệt đợc các trờng hợp viêm nhiễmliên tục [156]

• Xét nghiệm HCV trớc, trong và sau điều trị:

Công tác điều trị thành công các bệnh nhân HCV mạn tính đã cải thiệngấp 4 lần trong thập kỷ qua Interferon vẫn là phơng pháp điều trị chính, nhngcác phác đồ điều trị tăng cờng và việc bổ sung ribavirin đã cải thiện đáng kểcơ hội đáp ứng kéo dài với điều trị

a) Xét nghiệm HCV trớc điều trị:

Việc đánh giá kiểu gen và hàm lợng HCV-RNA trong máu sẽ giúp íchnhiều trong t vấn và xác định thời gian điều trị ở những bệnh nhân bị HCVmạn tính [196] Trong trờng hợp này, việc đo lờng hàm lợng HCV-RNA rấtquan trọng bởi vì 90 - 97% các mẫu là có (+) hoặc bằng phơng pháp xétnghiệm PCR hoặc bằng bDNA [156]

b) Xét nghiệm HCV trong và sau điều trị:

Chuẩn vàng về virus học để xác định là điều trị thành công đợc địnhnghĩa bằng chỉ số virus duy trì (Sustained virologic response) là không cònHCV-RNA liên tục trong ít nhất 6 tháng sau điều trị kháng virus đợc thể hiệnbằng chỉ số xét nghiệm có dới 100 phiên bản virus/ml huyết thanh Do độnhạy của xét nghiệm không cao, nên các xét nghiệm định lợng HCV-RNA làcách đo lờng cha đầy đủ ở giai đoạn kết thúc điều trị hoặc để đo lờng hàm l-ợng virus kéo dài ở những bệnh nhân bị HCV mãn tính Việc tiến hành cácnghiên cứu dọc ở những cá thể có đáp ứng virus kéo dài đối với điều trịinterferon là cần thiết Trong suốt 5-10 năm tiếp theo, khi theo dõi dọc các bệnhnhân HCV, ngời ta thấy HCV-RNA vẫn còn tồn tại trong máu ở hơn 10% cácbệnh nhân đã đợc điều trị nh rất nhiều các nghiên cứu đã chỉ ra [156]

Việc đo lờng hàm lợng HCV-RNA ở giai đoạn cuối của điều trị khángvirus cũng rất hữu ích để tiên đoán đáp ứng điều trị ở các giai đoạn điều trịtiếp theo Chẳng hạn nh, những bệnh nhân không phát hiện thấy HCV-RNA ởgiai đoạn kết thúc thời gian điều trị đầu tiên với interferon có tỷ lệ đáp ứngduy trì >50% với điều trị tăng cờng interferon hoặc điều trị kết hợp vớiinterferon và ribavirin Thế nhng, ở những bệnh nhân có phát hiện thấy HCV-RNA ở giai đoạn kết thúc thời gian điều trị đầu tiên với interferon có tỷ lệ đápứng duy trì <15% với điều trị lại [156]

1.5.4 Chiến lợc sử dụng các xét nghiệm chẩn đoán HCV

Năm 1997 Hội nghị chuyên đề về quản lý bệnh nhân viêm gan C đợc tổchức tại Mỹ Căn cứ vào độ nhạy, độ đặc hiệu và những u khuyết điểm của kỹthuật ELISA thế hệ 2 và 3 phát hiện Anti-HCV và kỹ thuật RT-PCR phát hiệnHCV-RNA đã quyết nghị: Chẩn đoán nhiễm HCV chủ yếu dựa vào phát hiệnAnti-HCV bằng kỹ thuật ELISA thế hệ 2 hoặc 3 [67] [121] [140]

 Đối với những ngời cho máu hoặc ngời khoẻ mạnh mà viêm gan(ALT) không tăng:

a- 1 ELISA (+) làm thêm Test phân tích RIBA

b- 1 ELISA (-) làm tiếp ELISA

c- 2 ELISA sau đó 1 Test phân tích RIBA

Phơng án b thờng đợc thực hiện là 2 Test ELISA đỡ tốn kém hơn [42]

 Đối với bệnh nhân viêm gan: Trớc tiên dùng xét nghiệm ELISA-2hoặc 3 [121]

+ Nếu có Anti-HCV (+) và men gan (ALT) tăng: đủ xác định chẩn

đoán, không cần chỉ định các xét nghiệm bổ xung xác chẩn RIBA hoặc PCR [121]

RT-Nếu có Anti-HCV (+) nhng men gan (ALT) bình thờng và Bilirubin bìnhthờng: Cần bổ xung xét nghiệm RIBA và RT-PCR để xác định [121]

 Đối với bệnh nhân viêm gan mạn có Anti-HCV (+) bởi ELISA 2 hoặc

3 và men gan (ALT) tăng:

- Trên 95% số bệnh nhân này có HCV-RNA (+) [81]

- Không cần thiết làm thêm RIBA hoặc RT-PCR [121]

Các kỹ thuật phát hiện HCV ngày càng đợc cải tiến để có độ nhạy và độ

đặc hiệu cao giúp cho việc sàng lọc, chẩn đoán và điều trị ngày càng tốt hơn

1.6 Tình hình nhiễm HCV trên thế giới và Việt Nam hiện nay

1.6.1 Tình hình nhiễm HCV trên thế giới hiện nay

HCV hiện nay vẫn còn rất phổ biến, là một trong những gánh nặngbệnh tật chính đối với các nớc trên thế giới Năm 1999, theo ớc tính của Tổchức Y tế Thế giới, tỷ lệ hiện nhiễm HCV toàn cầu là khoảng 3% tơng ứng với

khoảng 170 triệu ngời trên thế giới [187] (bảng 1.1) Nhìn chung, phần lớn

các nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm HCV thờng báo cáo tỷ lệ nhiễm HCV ở ngờicho máu dựa vào kháng thể HCV, nhng lại cha làm đợc xét nghiệm theo dõiHCV ở các giai đoạn tiếp theo Tuy nhiên, việc sử dụng nhóm cho máu đểthống kê hoặc nghiên cứu tỷ lệ nhiễm HCV có thể gặp phải một vấn đề về ớctính thiếu tỷ lệ hiện nhiễm HCV thực bởi vì ngời cho máu thờng là quần thể đ-

ợc lựa chọn nhiều trong các nghiên cứu về HCV [27]

Theo kết quả điều tra về y tế và dinh dỡng quốc gia của Mỹ, từ năm

1988 đến 1994 cho thấy số lợng nhiễm HCV là 3,9 triệu ngời trong đó 2,7triệu ngời ở Mỹ mắc HCV mạn tính (tìm thấy HCV RNA dơng tính tronghuyết thanh) Có sự liên quan giữa quan hệ tình dục không bảo vệ với nhiễmHCV Tuy nhiên đa số ngời bệnh có HCV dơng tính có độ tuổi dới 50 [41] ởvùng Trung và Nam Mỹ, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ nhiễm HCV năm

2001-2002 là 6,3% [147] ở Mexico, tỷ lệ này là khoảng 1,2% [177] ở nhómcho máu ở Chile và Brazil, quần thể này bị nhiễm HCV týp ab thấp tơng ứng ởmức 0,3% và 1, 14% [138] [182] ở Châu Âu, tỷ lệ hiện mắc chung HCV là1%, nhng khác nhau tuỳ theo từng nớc [176] Tỷ lệ kháng thể HCV là 0,87%

ở Bỉ [179] ở Anh Quốc, ít nhất 200.000 ngời mang virus [79] Miền Bắc nớcItalia có tỷ lệ HCV týp ab là 3,2% [51] Ví dụ, ba nghiên cứu ở Trung và Nam

ý đã cho thấy là nhiễm HCV là cao (8,4%-22,4%), đặc biệt ở nhóm những

ng-ời già [130] [154] Trong số các bệnh nhân đợc khám tại Lyon, Pháp thấy tỷ lệHCV ớc tính là 1,3%, tơng tự nh quần thể chung ở Pháp Nhiễm HCV trongnhóm ngời phục vụ quân đội ở Nga là 1,5% và ngời cho máu ở Bắc Caucasus,khu vực Viễn Đông và Siberia là (3,1-3,8%) so với khu vực Transbaikal(0,7%) [143] Tỷ lệ thấp thấy đợc ở Bunar Hungary (0,73%) trong số 15.864ngời hiến máu [47]

Bảng 1.1: Phân bố tỷ lệ và số lợng viêm gan C ớc tính theo khu vực của Tổ

chức Y tế Thế giới

Vùng

Tổng số dân ( Triệu )

Tỷ lệ % nhiễm HCV

Số dân bị nhiễm ( Triệu )

Số nớc không có dữ liệu

Châu á có tỷ lệ nhiễm HCV ở mức độ trung bình [107] Các điều tra tạiNhật Bản thời kỳ 1995-2000 cho thấy nhiễm HCV trong số 3.485.648 ngờicho máu là 0,5% [171], trong khi đó tỷ lệ này năm 1992 là gần 1% trong số

10.905.489 ngời cho máu [190] ở Trung Quốc cũng có tỷ lệ nhiễm HCV thấpkhoảng 1% ở nhóm cho máu tự nguyện [185] [194] Tuy nhiên, ở một số vùng

có tỷ lệ cao nh tỉnh Hà Bắc của Trung Quốc (30,13%) và Mông Cổ (31,86%)[172] Các nớc khác thuộc khu vực Châu á có tỷ lệ thấp nh Malaysia (~1.6%)

và Singapore (0,54%) [84] [120]; Thái Lan (3,2-5,6%) [43] [165]; Nepal có tỷ

lệ rất thấp [63]; ấn Độ 1,85% trong nhóm cho máu ở Châu Phi có ít cácnghiên cứu hơn, nhng số liệu có sẵn cho thấy Châu Phi 1,6% ở những ngờicho máu nh ở Ethiopia và 0,9% ở Kenya [95] [108] Tỷ lệ hiện mắc ớc tính tạiAustralia là 2,3% với số lợng 210,000 ngời năm 2001, trong đó nhóm tuổi 20-

24 có tỷ lệ nhiễm cao nhất và quần thể trên 50 tuồi ít gặp hơn [42]

1.6.2 Tình hình nhiễm HCV ở Việt Nam

Tình hình nhiễm HCV ở Việt Nam cho đến nay tuy đã có nhiều côngtrình nghiên cứu điều tra dịch tễ học nhng còn nhỏ lẻ, tập trung chủ yếu ở một

số thành phố lớn và một số vùng dân c Từ những năm 1994 - 1995 các tác giảTrơng Xuân Liên, Lã Thị Nhẫn ở Thành phố Hồ Chí Minh đã công bố tỷ lệnhiễm HCV ở Thành phố Hồ Chí Minh là 2,55%, 4,3%; ở thị xã Bến Tre là9,72% [8] [15]; dân c ở Hà Nội tác giả Đỗ Trung Phấn (1995) là 0,4% [17].Sinh viên Hà Nội (1997) tác giả Bùi Mai An là 1,35% [1] Dân c ở QuảngNinh của tác giả Tuyết Mai, Thái Quý là 1,2% [11], năm 2003 tác giả Hoàng

Đăng Minh: dân c Hải Phòng là 1,7% ở nội thành, 0,78% ở nông thôn, 0,87%

ở ven biển [13] Đỗ Tuấn Đạt: dân c ở Thanh Hoá là 0,38% [3] Năm 2002 tácgiả Nguyễn Đăng Mạnh nghiên cứu trong quân đội tân binh là 0,35%, sỹ quan

là 0,77% [12] Còn ở phía Nam tác giả Châu Hữu Hậu nghiên cứu ở An Giang

là 4,1% và tác giả Võ Trọng Hải nghiên cứu ở Cà Mau là 2,15% [24]

Tỷ lệ nhiễm HCV ở những ngời cho máu cũng rất khác nhau, từ nhữngnăm 1995 ngời cho máu ở Hà Nội có Anti-HCV(+) là 3,4% [6] [17]; ở Huế7,14% [14] và ở Thành phố Hồ Chí Minh là 15% [7] [8]

Tỷ lệ nhiễm HCV cao ở bệnh nhân phải truyền máu hoặc các sản phẩm củamáu nhiều lần: 70,5 % ở bệnh nhân truyền máu nhiều lần [8] [11] [17]; 50% ởbệnh nhân Hemophilia [6] Đặc biệt tỷ lệ nhiễm HCV ở bệnh nhân nghiện chích

ma tuý là rất cao: 31 % ở Hà Nội; 87 - 96 % ở thành phố Hồ Chí Minh [8]

Theo Tổ chức Y tế thế giới năm 1997 [188] đánh giá nhiễm HCV theo 4 mức độ:

Mức độ nhiễm thấp  0,5%.

Mức độ nhiễm trung bình > 0,5 - 1%

Mức độ nhiễm tơng đối cao > 1%

Nh vậy ở Việt Nam đánh giá chung mức độ nhiễm HCV ở mức cao

Đánh giá trên toàn cầu ngời ta thấy nhiễm HCV liên quan rõ rệt tới điềukiện sống và mức độ giàu nghèo

1.7 Các phơng thức lây nhiễm HCV trong đơn vị lọc máu

và các biện pháp đề phòng lây nhiễm

1.7.1.Tình hình nhiễm HCV ở bệnh nhân chạy thận nhân tạo (lọc máu)

Những bệnh nhân suy thận mạn ngay cả trớc khi bắt đầu chạy thận đã làmột quần thể có nguy cơ cao nhiễm HCV do phải điều trị bảo tồn dài ngày,phải truyền máu, tiêm truyền và một số kỹ thuật can thiệp Bệnh nhân khivào chơng trình lọc máu chu kỳ phải phẫu thuật tạo lỗ thông động - tĩnhmạch - phải thiết lập vòng tuần hoàn ngoài cơ thể khi lọc máu, dùng chungmáy, dùng lại quả lọc, dây máu với môi trờng lây nhiễm cao, do vậy tỷ lệlây nhiễm HCV cũng khác nhau rất lớn do điều kiện kinh tế, kỹ thuật đềphòng lây nhiễm khác nhau Ví dụ ở Bồ Đào Nha trớc năm 1995 tỷ lệ anti-HCV(+) thay đổi từ 0 - 75,5% ở các trung tâm khác nhau, thấp nhất ở trungtâm miền Nam và cao ở miền Bắc ở Saudi Arabia tỷ lệ anti-HCV(+) thay đổi

từ 15,4% đến 94,7% Tuỳ theo các trung tâm lọc máu [86]

Theo B Dussol; P Bethezene; P Brunet và cộng sự 1995 thì tỷ lệ nhiễmHCV ở các bệnh nhân lọc máu chu kỳ tăng theo thời gian lọc máu 10% mỗinăm [86]

9% ở bệnh nhân lọc máu chu kỳ dới 3 năm

20% ở bệnh nhân lọc máu 4 - 6 năm

57% ở bệnh nhân lọc máu trên 10 năm

Ngày nay nhờ các kỹ thuật phát hiện anti-HCV ở các sản phẩm máu mànguy cơ nhiễm HCV trong truyền máu đã giảm đi rất đáng kể vì tỷ lệ thấp hơn1/103.000 truyền các sản phẩm máu [162] Tuy nhiên các tác giả Nhật Bản vàItalia đã báo cáo có 5 - 20% các trờng hợp bệnh nhân lọc máu chu kỳ khôngtruyền máu bao giờ cũng bị nhiễm HCV, nh vậy có sự lây chéo giữa các bệnh

nhân với nhau khi lọc máu chu kỳ Chính điều này đã giải thích tại sao cácbệnh nhân lọc màng bụng và lọc máu tại nhà có tỷ lệ HCV thấp hơn rất nhiềulần so với các bệnh nhân lọc máu tại các trung tâm [86] [110] [139] [145].Trên thế giới các trung tâm lọc máu có tỷ lệ nhiễm HCV rất khác nhau:Cao nhất ở Châu Phi, Châu á, Đông Âu: 30 - 90%; Mỹ, Pháp và các nớcTây Âu: 5 - 30%, các nớc có tỷ lệ nhiễm HCV rất thấp ở các nớc Anh, úc,Phần Lan: dới 5% [29] [66] [105] Tỷ lệ nhiễm HCV tăng dần theo số lầnlọc máu, không phụ thuộc vào truyền máu [59] [66] [105] Lọc máu ở nhànhiễm HCV thấp hơn so với lọc máu ở bệnh viện: 8% so với 25% [86]; 0%

so với 18,5% [113]

Alander T [36] đã phân tích đoạn nucleotit của HCV ở 5 bệnh nhân bịnhiễm HCV trong cùng một đơn vị lọc máu, nhận thấy cả 5 bệnh nhân đónhiễm cùng một genotype, điều đó rõ ràng có sự lây chéo Theo C.D.C [58]các biện pháp khử khuẩn dụng cụ máy móc đợc tiến hành sau mỗi ca lọc máu

đã làm giảm nguy cơ lây truyền HCV ở các trung tâm chạy thận mặc dù trớc

đây ngời ta cho rằng máy thận không có khả năng lây truyền HCV vì HCVkhông chui qua đợc màng lọc trừ khi có rách màng lọc Những căn cứ trên lànhững bằng chứng nói lên khả năng lây nhiễm trong đơn vị lọc máu liên quan

đến thiết bị lọc máu và môi trờng lọc máu, tuy nhiên sự lây chéo HCV giữacác bệnh nhân với nhau trong cùng đơn vị lọc máu diễn ra ở khâu nào, ở quảlọc dùng lại, ở hệ thống dây máu, kim chọc hay do nhân viên y tế, do các biệnpháp can thiệp dụng cụ y tế khác vẫn đang đợc tiếp tục nghiên cứu để chứngminh sự lây nhiễm HCV trong trung tâm lọc máu ở khâu nào Nhiều tài liệu

đã chứng minh việc sử dụng lại quả lọc thận không làm tăng lên tỷ lệ nhiễmHCV M.Jadoul và cộng sự ở Bỉ [110] đã nghiên cứu trên 15 trung tâm lọcmáu, thấy các bệnh nhân sử dụng quả lọc 1 lần và các bệnh nhân sử dụng lạiquả lọc nhiều lần có tỷ lệ nhiễm HCV tơng tự nhau ở Mỹ tỷ lệ nhiễm HCV ởcác trung tâm sử dụng lại quả lọc là 10,3%, trong khi tỷ lệ này ở các trung tâmkhông sử dụng lại quả lọc là 11,4% [139] [174] bởi lẽ khi sử dụng lại quả lọcngời ta đã dùng các dung dịch tiệt khuẩn diệt virus để bảo quản >24h giữa 2

kỳ lọc máu

1.7.2 Các hình thức lây nhiễm HCV tại đơn vị lọc máu

Các kết quả nghiên cứu cho thấy có rất nhiều cách lây nhiễm khác nhautại các đơn vị lọc máu cũng nh có nhiều biện pháp đề phòng lây nhiễm đôi khi

còn có quan điểm khác nhau do điều kiện kinh tế và môi trờng ở những nớcgiàu khác với những nớc nghèo và đang phát triển [186] Tuy nhiên những kếtquả nghiên cứu ở bất cứ công trình nào ở mọi nơi trên thế giới đều thấy rằng

tỷ lệ lây nhiễm HCV ở các trung tâm lọc máu bao giờ cũng cao hơn lọc máutại nhà hay lọc màng bụng [110] [145], lọc máu càng lâu năm tỷ lệ nhiễmHCV càng cao [86] [139] Tính đồng nhất tơng đối của các chủng HCV ởbệnh nhân lọc máu tại cùng đơn vị cho thấy rõ rệt việc lây nhiễm giữa cácbệnh nhân trong cùng đơn vị lọc máu là bằng chứng rõ ràng cho sự lây chéoHCV trong các đơn vị lọc máu [36] Kỹ thuật sinh học phân tử hiện nay chothấy bằng chứng của việc lây nhiễm HCV tại đơn vị lọc máu rất rõ ràng [50].Tại Bỉ khi sử dụng kỹ thuật PCR xác định gen HCV và sắp xếp chuỗinucleotid của 23 trờng hợp âm tính chuyển sang dơng tính cho thấy 20 ngời

đã bị nhiễm cùng một loại 00HCV [167] Tơng tự ở hai nghiên cứu khác, dùngphơng pháp phân tích giải trình tự gen ở vùng siêu biến 1 cho thấy tồn tại việclây nhiễm tại đơn vị lọc máu do lây chéo giữa các bệnh nhân [101] [102] Sosánh thứ tự gen virus tại vùng E1 cũng cho bằng chứng dịch tễ học về nhiễmkhuẩn tại đơn vị lọc máu ở phía nam nớc Pháp và xác định phơng thức lây lancủa một loại HCV nhất định

Một số nhà nghiên cứu khác cũng sử dụng phơng pháp sinh học phân tử

để tìm ra các gen liên quan với HCV trong các bệnh nhân lọc máu đã nhiễmHCV tại các đơn vị lọc máu tại cùng một khu vực địa lý và các kỹ thuật này làtiêu chuẩn vàng để giúp xác định nguyên nhân lây nhiễm HCV trong đơn vịlọc máu [169] Ngợc lại, một nghiên cứu khác cũng sử dụng kỹ thuật sinh họcphân tử cho thấy lây nhiễm HCV giữa các bệnh nhân là không phổ biến trongcùng đơn vị lọc máu [194] Đó cũng là một thực tế vì nhiễm HCV có thời giancửa sổ bệnh nhân đợc điều trị bảo tồn từ nhiều đơn vị điều trị khác nhau, sau

đó mới vào đơn vị lọc máu chu kỳ hoặc phải truyền máu, truyền dịch trớc đóv.v

1.7.2.1 Lây nhiễm HCV qua máy thận thân tạo

Một số nghiên cứu cho thấy lây chéo do máy thận nhân tạo cũng lànguyên nhân gây nhiễm HCV tại đơn vị lọc máu [53] [76] [134] Trong máythận nhân tạo có nhiều bộ phận liên quan đến nguy cơ lây nhiễm virus lây qua

đờng máu Một trong những con đờng dễ lây nhiễm nhất đó là bộ phận chuyển

tiếp lọc khí, giữa dây đo áp lực động - tĩnh mạch nối trực tiếp vào máy thận códính máu mà không đợc tiệt khuẩn [76] [192] Cũng ở một nghiên cứu kháctại Iran năm 1999 cho thấy tỷ lệ nhiễm HCV cao ở các trung tâm bệnh nhândùng chung máy thờng xuyên [155].

Điều này đợc chứng thực hơn bởi nghiên cứu của Hội thận học Bồ ĐàoNha tại các đơn vị lọc máu năm 1995 - 1996 cho thấy việc sử dụng máy riêng

và khu vực cách ly cho bệnh nhân có anti-HCV dơng tính cùng với các biệnpháp ngăn ngừa lây nhiễm cho kết quả giảm rõ rệt bệnh nhân âm tính chuyểnsang dơng tính ở các đơn vị lọc máu [146] Tuy nhiên giá trị của một số biệnpháp đề phòng lây chéo vẫn còn tiếp tục bàn cãi bởi vì nơi này áp dụng cóhiệu quả, nơi khác áp dụng lại cha hiệu quả Ví dụ, ở một nghiên cứu sử dụngmáy riêng cho bệnh nhân dơng tính anti-HCV không ngăn ngừa đợc lâynhiễm HCV tại đơn vị lọc máu Ngợc lại, tỷ lệ lây nhiễm HCV lại thấp hơn ở

đơn vị lọc máu chỉ điều trị bệnh nhân âm tính với anti-HCV so với những đơn

vị lọc máu mà cả bệnh nhân âm tính và dơng tính điều trị chung Do đó, táchbiệt bệnh nhân âm tính và dơng tính với anti-HCV đợc coi là hiệu quả và rất

đợc đề cao [173]

Trong một nghiên cứu về lây lan HCV tại các trung tâm lọc máu ởItalia, việc sử dụng máy dành riêng cho bệnh nhân có anti-HCV dơng tính đợcxem nh hiệu quả trong phòng ngừa lây nhiễm HCV tại đơn vị lọc máu và do

đó đợc đề xuất áp dụng mạnh mẽ, ít nhất là cho những trung tâm có tỷ lệnhiễm HCV cao Nhng một số ý kiến lại cho rằng việc cách ly bệnh nhân d-

ơng tính anti-HCV, mặc dù đợc thực hiện bởi 25% số trung tâm đợc hỏi chothấy không đem lại hiệu quả chắc chắn và phải đi liền với chi phí cao Do đó

đợc coi là không mang lại hiệu quả [123]

Một nghiên cứu khác cũng cùng quan điểm cho thấy tỷ lệ nhiễm HCV ở

đơn vị lọc máu giảm mặc dù không cách ly bệnh nhân có anti-HCV dơng tínhnhng thực hiện nghiêm ngặt các biện pháp chuẩn phòng ngừa và kiểm soátnhiễm khuẩn [178] Hơn nữa một nghiên cứu tại nhiều trung tâm ở Bỉ khôngphát hiện bất kỳ trờng hợp lây nhiễm HCV nào trong thời gian 54 thángnghiên cứu, mặc dù không một trung tâm nào dùng máy riêng cho bệnh nhân

có anti-HCV dơng tính và hơn 70% bệnh nhân đợc lọc máu tại đơn vị mà máythận không đợc tiệt khuẩn sau khi lọc [111] Tuy vậy một ý kiến khác lại chorằng "không tính đến những ý kiến trái ngợc về vai trò của máy lọc thận nhântạo trong việc lây nhiễm HCV tại đơn vị lọc máu, việc tiệt khuẩn hệ thống

máy lọc đợc xem nh đơn giản và hiệu quả trong việc phòng ngừa lây nhiễmHCV" [44] Trong một nghiên cứu xử lý bằng nhiệt vòng tuần hoàn dịch lọc ởmáy thận nhân tạo đã loại bỏ đợc HCV [48] Do đó việc tiệt khuẩn hệ thốngtuần hoàn dịch bằng nhiệt tuy đơn giản nhng là phơng pháp có giá trị trongviệc kiểm soát lây nhiễm HCV trong đơn vị lọc máu và theo một số tác giảviệc áp dụng nó phải là bắt buộc [44] [48] Chính vì vậy các máy thế hệ saunày hầu nh có chơng trình rửa và khử khuẩn bằng nhiệt, kết hợp với hoá chấtkhông những tiệt khuẩn tốt mà còn giữ cho đờng dẫn dịch lọc luôn sạch vàkhông bị tắc Nếu áp dụng phơng pháp khử khuẩn bằng nhiệt cùng với việctuân thủ chặt chẽ biện pháp phòng ngừa chuẩn thì việc sử dụng máy riêng chobệnh nhân có anti-HCV dơng tính là xem nh không cần thiết Một số tác giả đãnghiên cứu nhiều năm trong lĩnh vực thận nhân tạo nh Murthy, Brian J.G Pereiracho rằng các dữ liệu hiện tại cha đủ để cho thấy bất kỳ vai trò rõ rệt nào của máylọc trong việc lây nhiễm HCV ở đơn vị lọc máu Do đó việc lây nhiễm HCV ởmáy lọc chủ yếu do môi trờng ô nhiễm và theo chiều ngang từ bệnh nhân truyềnsang cho bệnh nhân [34] [146]

1.7.2.2 Nhiễm HCV qua màng quả lọc và dịch lọc

Trên lý thuyết, việc đi qua màng quả lọc nguyên vẹn của HCV là khôngthể xảy ra vì virus HCV có đờng kính 55nm – 65nm lớn hơn rất nhiều so với

lỗ màng kể cả màng dễ qua nhất [192] Tuy nhiên bất kỳ sự thay đổi nào của

lỗ màng hoặc màng bị rách thì khi đó virus vào phần dịch lọc đợc [112]

Một vài nghiên cứu cho thấy cả quả lọc có hệ số siêu lọc thấp và hệ sốsiêu lọc cao của các loại màng tự nhiên hay tổng hợp đều có thể làm nhiễmHCV-RNA vào đờng dịch lọc [57] [106] Một nghiên cứu khác tơng tự khi sửdụng màng polysulfone có hệ số siêu lọc cao với áp lực xuyên màng thấpkhông phát hiện đợc HCV-RNA trong dịch lọc nhng lại thấy số lợng HCV-RNA trong huyết thanh giảm đáng kể sau lọc so với trớc khi lọc nên tác giảgợi ý rằng việc sử dụng áp lực xuyên màng thấp đối với các tr ờng hợp bệnhnhân có anti-HCV dơng tính để giảm nguy cơ lây nhiễm HCV do việc lâyHCV từ máu sang dịch lọc [142] Nhiều thí nghiệm trong cả in vitro và invivo HCV-RNA giảm đi rõ rệt trong huyết thanh sau khi lọc máu, nhất là ởmàng polysulfone nhng không phát hiện HCV-RNA ở dịch lọc Điều đóchứng tỏ rằng HCV-RNA ở huyết thanh bám vào màng lọc trong quá trình lọcmáu chứ không phải virus qua màng vào dịch lọc [136] Dựa vào tính chấtbám vào màng của HCV, ở Nhật đã dùng lọc máu để giảm số lợng virus trong

máu, kết hợp với thuốc kháng virus đã mang lại hiệu quả tốt hơn khi điều trịthuốc kháng virus đơn thuần Một số nghiên cứu khác bằng kỹ thuật PCR đãphát hiện đợc HCV-RNA ở dịch lọc khi màng vẫn nguyên vẹn [122] Việcphát hiện HCV-RNA bằng PCR ở dịch lọc có thể do mảng vỡ của ARN viruschứ không phải bản thân virus, do đó không dẫn đến lây nhiễm Hiện nay tỷ lệanti-HCV dơng cao ở bệnh nhân lọc máu cha liên quan đến bất kỳ loại màngnào [146]

Chơng 2

Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu

2.1 Đối tợng nghiên cứu

2.1.1 Bệnh nhân lọc máu lần đầu

Bệnh nhân suy thận cấp và suy thận mạn, lọc máu lần đầu tại khoa thậnnhân tạo Bệnh viện Bạch Mai từ tháng 5/2002 đến tháng 10/2002 Nhữngbệnh nhân này đợc thu thập thông tin từ bệnh án và khám trực tiếp ngời bệnh:tuổi, giới, nguyên nhân lọc máu, có truyền máu và không truyền máu Tất cả

đợc xét nghiệm Anti-HCV bằng kỹ thuật ELISA và phát hiện HCV-RNAbằng kỹ thuật RT-PCR

2.1.2 Bệnh nhân lọc máu chu kỳ tại khoa thận nhân tạo bệnh viện Bạch Mai

bệnh nhân có anti-HCV (-) không truyền máu, đều tiêm thuốc tănghồng cầu (E.P.O) Theo dõi tiến cứu, 6 tháng xét nghiệm anti-HCV mộtlần, sau 12 tháng so sánh với bệnh nhân có anti-HCV (-) lọc máu ởphòng lọc máu chung cùng với bệnh nhân có anti-HCV (+).

 Tất cả các bệnh nhân điều trị tại phòng lọc máu chung cũng nh bệnhnhân của phòng lọc máu cách ly đều đợc áp dụng các biện pháp đềphòng lây chéo theo khuyến cáo của tổ chức y tế thế giới (WHO) và cơquan kiểm soát và phòng bệnh Hoa Kỳ (C.D.C)

 Bác sỹ, y tá thay găng tay mỗi khi tiếp xúc bệnh nhân

 Rửa máy, lau sạch bề mặt máy sau mỗi ca lọc máu

 Kim dẫn máu dùng một lần

 Núm lọc khí và kim thông khí dùng riêng cho từng bệnh nhân

 Dụng cụ, catheter dùng lại phải đợc tiệt trùng theo quy trình tiêuchuẩn

 Quả lọc, dây máu dùng lại, bảo quản bằng formal dehgt 2%

 Khoảng cách các giờng bệnh không dới 60cm

 Đánh giá hiệu quả của biện pháp can thiệp tại phòng lọc máu chung vàphòng lọc máu cách ly thông qua kết quả xét nghiệm Anti-HCV, bằng ph-

ơng pháp ELISA thế hệ thứ 3, 06 tháng xét nghiệm 1 lần, kết thúc tháng9/2006

2.2 Phơng pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu theo phơng pháp mô tả điều tra cắt ngang

Cỡ mẫu cho bệnh nhân lọc máu lần đầu vào lọc máu chu kỳ

2001 – 2006 Theo công thức điều tra cắt ngang của WHO [16] [21](Sample size determination in health study)

n = z2 1-α/2 x

để đợc cỡ mẫu lớn nhất -> n = 96

n = 1,962 0,5 0,5 = 96

0,01

Cỡ mẫu nghiên cứu: n = 100

Cỡ mẫu bệnh nhân có Anti-HCV(+) xét nghiệp PCR để xác định RNA Theo tác giả Lok A và cs năm 1997 [121], hơn 90% Anti-HCV(+) cóHCV-RNA (+)

2 2 2 1 1 1 1

2 1

) (

} ) 1 ( ) 1 ( )

1 ( 2 {

P P

P P P P Z P P Z

n n

α:10%

β :20%, lực mẫu:80%

n1=n2=54

Thực tế n1=54 v nà vùng ổn định cao chứa nhiều kiểu gen đặc hiệu cho 2=59

2.2.3 Thu thập mẫu máu và bảo quản mẫu

 Các mẫu máu đợc lấy ở bệnh nhân tại khoa Thận nhân tạo bệnh việnBạch Mai

 Xét nghiệm anti- HCV, làm tại khoa Vi sinh bệnh viện Bạch Mai:

( ELISA3)

 Xét nghiệm HCV – RNA bằng phơng pháp RT - PCR tại phòng miễndịch virus Viện Huyết học Truyền máu TW và khoa Vi sinh bệnh việnBạch Mai

 Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu:

o Bơm, kim tiêm lấy máu dùng 01 lần

o Mỗi đối tợng lấy 4 ml máu tĩnh mạch Máu đợc đựng trong ốngnghiệm thuỷ tinh ly tâm tách huyết thanh bằng pipet riêng Bảoquản huyết thanh trong ống nghiệm nhựa có nút đậy, giữ ở nhiệt

độ - 200c cho đến khi làm xét nghiệm

2.2.4 Sinh phẩm và hoá chất

* Sinh phẩm sử dụng cho kỹ thuật ELISA xác định kháng thể anti-HCV:

- Bộ sinh phẩm chẩn đoán MONOLISA HCV plus để phát hiện HCV (Biorad – Pháp)

anti-* Sinh phẩm sử dụng cho kỹ thuật PCR:

- Bộ sinh phẩm dùng trong kỹ thuật RT real-time PCR định lợng HCV-RNACOBAS AmpliPrep/ COBAS TaqMan HCV Test (Roche – Pháp)

2.2.5 Các kỹ thuật đợc sử dụng trong nghiên cứu

2.2.5.1 Kỹ thuật phát hiện Anti-HCV

a Nguyên lý:

Bộ sinh phẩm chẩn đoán Anti-HCV Monolisa anti-HCV plus củahãng Biorad dựa trên nguyên lý của thử nghiệm miễn dịch gắn men giántiếp cho phép phát hiện kháng thể anti-HCV trong huyết thanh hoặc huyếttơng bệnh nhân, theo phơng pháp “bánh kẹp” với việc sử dụng 3 proteintái tổ hợp của virus viêm gan C (protein cấu trúc và protein không cấu trúcNS3, NS4) có khả năng gắn với kháng thể anti-HCV trong mẫu huyếtthanh tạo phức hợp kháng nguyên – kháng thể trên bề mặt giếng Sau khirửa giếng các protein không gắn của mẫu sẽ bị loại trừ Thêm cộng hợp đềkháng IgG ngời gắn peroxidase vào các giếng Cộng hợp này gắn đặc hiệuvới phần IgG ngời có trong phức hợp kháng nguyên – kháng thể Sau khiloại bỏ phần cộng hợp không gắn, thêm dung dịch cơ chất TMB vào cácgiếng Màu xanh sẽ xuất hiện trong các giếng có chứa anti-HCV d ơngtính

KN gắn bản KT anti-HCV KKT: Cộng hợp đề Cơ chất TMB C22-3, C33-c, kháng IgG ng òi

- Đọc kết quả trên máy đọc ELISA nh sau:

- Thử nghiệm có giá trị khi thoả mãn 2 điều kiện sau:

+ OD chứng âm nhỏ hơn 0,150

+ OD chứng dơng lớn hơn hoặc bằng 1,000 và nhỏ hơn 2,400

- Tính giá trị trung bình của chứng dơng: ODR4

ODR4= [OD(C1) + OD(D1) + OD(E1)]/3

- Tính giá trị ngỡng: CO= ODR4/5

- Mẫu huyết thanh có giá trị OD nhỏ hơn giá trị ng ỡng (CO)(cut-offvalue) là mẫu âm tính với thử nghiệm

- Mẫu huyết thanh có giá trị OD lớn hơn hoặc bằng giá trị ngỡng(CO) là mẫu dơng tính với thử nghiệm

- Nhắc lại thử nghiệm khi:

+ Thử nghiệm không có giá trị

+ Giá trị OD của mẫu thử bằng hoặc lớn hơn 10% giá trị ng ỡng(CO) đợc xem là dơng tính ban đầu với thử nghiệm Các mẫu này cần tiếnhành kiểm tra lại trên 2 giếng Mẫu thử cho kết quả d ơng tính với ít nhấtmột trong hai giếng kiểm tra lại này sẽ đợc coi là mẫu dơng tính với anti-HCV Mẫu thử âm tính ở cả hai giếng kiểm tra lại đ ợc xem là mẫu âmtính

2.2.5.2 Xét nghiệm xác định HCV-RNA bằng kỹ thuật RT real-time PCR trên máy Real time PCR của Roche

a Nguyên lý: Kỹ thuật này dựa trên quá trình phiên mã ng ợc RNA

virus viêm gan C thành cDNA (DNA bổ sung - ComplementaryDeoxyribonucleic Acid), sau đó xử dụng các cặp mồi đặc hiệu để xác địnhDNA đích này và khuếch đại đoạn DNA đích lên nhiều lần

* Xác định và định lợng HCV-RNA bằng kỹ thuật RT real-timePCR với bộ sinh phẩm COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV test trênmáy Real time PCR của Roche (COBAS TaqMan 48 Analyze)

- Phát hiện và định lợng HCV-RNA trong huyết thanh bệnh nhânnhiễm HCV dựa trên nguyên lý của kỹ thuật PCR, khuyếch đại một

đoạn gen đặc hiệu ở vùng 5’UTR của genome HCV Độ nhạy 10 IU/

ml huyết thanh, ngỡng phát hiện 40cp/ml, độ đặc hiệu > 99,99% chotất cả các genotype của HCV

b Các bớc tiến hành:

RNA – HCV trong mẫu huyết thanh của bệnh nhân đợc tách triếtqua hệ thống tách triết tự động Ampliprep, sau đó đợc chuyển sang chạyPCR trên máy Real time PCR của Roche : COBAS TaqMan 48 Analyzer

để xác định và định lợng HCV - RNA Real – time PCR(Roche) xác định

và định lợng HCV – RNA là kỹ thuật đợc FDA công nhận dùng cho chẩn

đoán [24]

2.2.5.3 Đo hoạt độ men AST và ALT trong huyết thanh

Làm tại khoa Hoá Sinh – Bệnh viện Bạch Mai

 Đánh giá tỷ lệ theo chiều hớng bằng Test xu hớng

 So sánh nguy cơ nhiễm giữa 2 nhóm theo thời gian bằng đo lờng nguycơ tơng đối (RR)

d c

c b a

a RR





2.2.7 Các biện pháp hạn chế sai số