Ứng dụng công nghệ sóng siêu âm trong quá trình trích ly hoạt chất sinh học lentinan từ quả thể nấm hương (lentinula edodes)”

Xuất phát từ những thực tế trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Ứng dụng công nghệ sóng siêu âm trong quá trình trích ly hoạt chất sinh học lentinan từ quả thể nấm Hương Lentinula

Trang 1

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này

là trung thực

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này

đã được cảm ơn và các thông tin được trích dẫn trong chuyên đề này đã đượcghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Sinh viên

Trần Thị Thu Hương

Trang 2

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được khóa luận này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi

đã nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ và hướng dẫn của các thày giáo, cô giáo, gia đình và bạn bè xung quanh.

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Đức Tiến –

trưởng Bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm và Môi trường nông nghiệp – Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghiệp sau thu hoạch đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện và hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp này.

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Bích Thủy trưởng Bộ

môn Công nghệ sau thu hoạch khoa Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã hướng dẫn, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện

đề tài.

Đồng thời, tôi xin được cảm ơn các anh, chị ở bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm và Môi trường nông nghiệp – Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời yêu thương chân thành nhất đến gia đình và bạn bè đã động viên, khích lệ tôi trong suốt thời gian qua.

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu trên.

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Sinh viên

Trần Thị Thu Hương

Trang 3

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU viii

PHẦN THỨ NHẤT - MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích – Yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

PHẦN THỨ HAI – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu chung về nấm Hương 3

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm thực vật của nấm Hương 3

2.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ nấm Hương trên thế giới và Việt Nam 4

2.1.3 Thành phần hóa học 5

2.2 Giới thiệu về hoạt chất sinh học lentinan trong nấm Hương 7

2.2.1 Khái niệm về lentinan 7

2.2.2 Tác dụng của lentinan 9

2.3 Trích ly hoạt chất sinh học lentinan từ quả thể nấm Hương 10

2.3.1 Cơ sở khoa học duy trì và trích ly hoạt chất lentinan của nấm Hương 10 2.3.2 Ứng dụng sóng siêu âm trong quá trình trích ly hoạt chất sinh học lentinan 11

Trang 4

2.3.3.Tình hình nghiên cứu khai thác hoạt chất sinh học lentinan từ nấm Hương 14

2.4 Một số chế phẩm lentinan thương mại 16

PHẦN THỨ BA: ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 19

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 19

3.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 19

3.2 Nội dung nghiên cứu 19

3.3 Phương pháp nghiên cứu 20

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 20

3.3.2 Phương pháp cô và thu nhận chế phẩm nấm Hương trích ly 25

3.3.3 Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm nấm Hương trích ly 26

3.3.4 Phương pháp phân tích chỉ tiêu lí hóa 27

3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 29

PHẦN THỨ TƯ: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu quả trích ly lentinan 30

4.2 Ảnh hưởng của điều kiện xử lý nguyên liệu đến hiệu quả trích ly lentinan 31

4.2.1 Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu quả trích ly lentinan 31 4.2.2 Ảnh hưởng của thời gian ngâm nguyên liệu đến hiệu quả trích ly lentinan 32

4.3 Ảnh hưởng của thời gian xử lý sóng siêu âm đến hiệu quả trích ly lentinan 33

4.4 Xác định các thông số của quá trình trích ly lentinan 34

4.4.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu quả trích ly lentinan 34 4.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ trích ly đến hiệu quả trích ly lentinan 35

4.4.3 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu quả trích ly lentinan 36

Trang 5

4.5 Quy trình tạo chế phẩm nấm Hương trích ly 38

4.5.1 Thu nhận chế phẩm nấm Hương trích ly 38

4.5.2 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm cao nấm Hương 40

PHẦN THỨ NĂM: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Kiến nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC

Trang 6

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Sản lượng nấm Hương ở Nhật Bản từ năm 2003 đến năm 2009 4

Bảng 2.2 Thành phần các hợp chất chính trong nấm Hương 5

Bảng 2.3 Các hoạt chất trong nấm Hương và công dụng 7

Bảng 2.4 Hàm lượng β-glucan trung bình của nấm Hương và một số nấm khác 8

Bảng 2.4 Một số chỉ tiêu kĩ thuật của chế phẩm Lentinex 17

Bảng 2.5 Tiêu chuẩn kỹ thuật cho sản phẩm bột nấm Hương trích ly 18

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của loại dung môi dến hiệu quả trích ly lentinan 30

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu tới hiệu quả trích ly lentinan 31

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của thời gian ngâm nguyên liệu đến hiệu quả trích ly lentinan 32 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của thời gian xử lý sóng siêu âm đến hiệu quả trích ly lentinan 33

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu quả trích ly lentinan 34

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu quả trích ly lentinan 35

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu quả trích ly lentinan 36

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của thời gian trích ly lần 2 tới hiệu suất trích ly lentinan 37 Bảng 4.9 Thông số kỹ thuật của chế phẩm nấm Hương 39

Trang 7

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Nấm Hương 4

Hình 2.2 Cấu tạo lentinan của nấm Hương 8

Hình 2.3 Quá trình hình thành, phát triển và nổ vỡ của bọt khí trong môi trường lỏng 13

Hình 2.4 Một số chế phẩm lentinan thương mại 18

Hình 3.1 Quy trình sản xuất chế phẩm nấm Hương 26

Hình 4.1 Quy trình công nghệ sản xuất cao nấm Hương 40

Trang 8

DANH MỤC VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

Dry matterLentinula Edodes MyceliumInterleukin

Trang 9

PHẦN THỨ NHẤT - MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Đất nước ta đang trên đường hội nhập và phát triển cùng với sự phát triểncủa khoa học và công nghệ thì chất lượng cuộc sống của người dân ngày mộtnâng cao Người tiêu dùng không chỉ quan tâm đến những thực phẩm giàu dinhdưỡng mà còn có nhu cầu cao về những thực phẩm có khả năng phòng và điềutrị bệnh tật Đây là những thực phẩm chức năng có thành phần dinh dưỡng đặchiệu đối với cơ thể, có tác dụng tăng cường đề kháng và giúp cơ thể phòng bệnh.Các thành phần đó thường là các hoạt chất sinh học được tách chiết từ các loạirau quả tự nhiên

Từ nhiều thế kỷ qua nấm ăn đã được biết đến như một nguồn thực phẩm

bổ dưỡng có lợi cho sức khỏe Nấm ăn được gọi là loại thực phẩm vừa là rauvừa là thịt vì nó có rất ít chất béo, cung cấp ít năng lượng nhưng lại rất giàu

protein và acid amin Nấm Hương hay còn gọi là nấm Đông Cô (Lentinula edodes) đã rất quen thuộc trong ẩm thực của cả phương Đông và phương Tây.

Nấm Hương có giá trị dinh dưỡng cao và giá trị dược liệu tốt cho con người.Các nhà khoa học đã khẳng định nấm Hương chứa nhiều chất có hoạt tính sinhhọc cao, trong đó phải kể đến lentinan Lentinan được chiết từ vách tế bào củaquả thể nấm, có tác dụng dược lý chính trong nấm Hương như: hạ huyết áp, tăngcường khả năng miễn dịch, kháng khuẩn và virut, phòng ngừa ung thư,… ỞNhật, lentinan đã được nghiên cứu dùng như một liệu pháp phụ trợ trong tiếntrình dùng hóa trị liệu cho các bệnh nhân ung thư Tuy nhiên, ở nước ta hiện naynấm Hương chủ yếu được sử dụng ở dạng tươi hoặc các sản phẩm sấy khô Vìvậy, với lợi ích to lớn của lentinan đối với sức khỏe thì việc nghiên cứu các sảnphẩm có hoạt tính sinh học lentinan chiết xuất từ nấm Hương sẽ đáp ứng hơnnữa nhu cầu của người tiêu dùng

Có nhiều phương pháp chiết xuất lentinan từ các phương pháp truyềnthống đến các phương pháp hiện đại Ngày nay siêu âm là một lĩnh vực nghiêncứu đang phát triển nhanh chóng, đặc biệt trong ngành công nghệ thực phẩm đểphân tích, trích ly các sản phẩm thực phẩm Sử dụng sóng siêu âm trong trích lylentinan là một kỹ thuật hiện đại góp phần khắc phục một số nhược điểm của

Trang 10

toàn hiệu quả và thân thiện với môi trường Ứng dụng siêu âm trong thực phẩm

là một công nghệ mới, trên thế giới nhiều công trình nghiên cứu đã áp dụng vàcho kết quả cao

Xuất phát từ những thực tế trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài

“Ứng dụng công nghệ sóng siêu âm trong quá trình trích ly hoạt chất sinh học lentinan từ quả thể nấm Hương (Lentinula edodes)”

1.2 Mục đích – Yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Ứng dụng công nghệ sóng siêu âm trong quá trình trích ly hoạt chất sinh

học lentinan từ quả thể nấm Hương (Lentinula edodes) dùng cho chế biến thực

phẩm chức năng

1.2.2 Yêu cầu

- Xác định được loại dung môi đến hiệu quả trích ly lentinan

- Xác định được các điều kiện xử lý nguyên liệu đến hiệu quả trích lylentinan

- Xác định được thời gian xử lý sóng siêu âm đến hiệu quả trích lylentinan

- Xác định được các thông số của quá trình trích ly lentinan

- Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm nấm Hương trích ly

Trang 11

PHẦN THỨ HAI – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu chung về nấm Hương

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm thực vật của nấm Hương

a Nguồn gốc

Nấm Hương hay còn gọi là nấm Đông Cô tên khoa học là Lentinula edodes

là một loại nấm ăn có nguồn gốc bản địa ở Đông Á Trên thế giới nấm Hươngđược gọi theo tên tiếng Nhật là Shiitake Nấm Hương được biết đến với nhiềutên khác nhau như: Nấm Đông Cô, Hương Cô, Hương Tím, Hương Tẩm…[1]

b Phân loại nấm Hương

Phân loại khoa học nấm Hươngtheo Wikipedia [31]

Giới (regnum): Fungi

Ngành (phylum): Basidiomycota

Lớp (class): Homobasidiomycetes

Bộ (ordo): Agaricales

Họ (familia): Tricholomataceae hay Marasmiaceae hoặc Omphalotaceae

Chi (genus): Lentinula

Loài (species): L.edodes

Ngoài loài nấm Hương chủ yếu này còn có 2 loài nấm Hương ăn được

khác cùng thuộc chi Lentinula Đó là nấm Hương da hổ (Scaly Mushroom) – Lentinula tigrnus và nấm Hương da (Scaly Lentines) – lentinula lepideus [1].

c Đặc điểm thực vật

Nấm Hương là một trong những loại nấm hoại sinh thuộc nhóm nấm mọc

trên gỗ, thích hợp ở vùng khí hậu ôn đới, mát ẩm Quả thể nấm trưởng thành có

mũ nấm hình dạng như cái ô, kích thước thay đổi trong phạm vi 3-25cm Trongđiều kiện nhiệt đới thích hợp trên bề mặt mũ nấm có các sợi lông nhỏ màu tối.Khi khô hạn, mũ nấm có thể sinh ra các vảy từ màu nhạt đến màu tối NấmHương có thịt dày màu trắng, gần phía ngoài có màu nâu đỏ nhạt Cuống nấm cóđường kính 0,5-1,2cm, dài khoảng 2,5-8cm, hình trụ hay hình bẹp Các phiếnnấm ở bên dưới mũ nấm có chiều rộng khoảng 3-4mm mang các đảm bào tử [1]

Trang 12

Hình 2.1 Nấm Hương

2.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ nấm Hương trên thế giới và Việt Nam

Trên thế giới, nấm Hương là một trong những loại nấm được thu hái tựnhiên và nuôi trồng từ lâu đời Ở các nước phương Tây, nông dân trồng nấmHương theo quy mô công nghiệp, nấm được trồng trên nhiều loại gỗ như gỗ shii,

gỗ sồi, hạt dẻ, gỗ thích [22]

Nhật Bản là nước sản xuất nấm Hương lớn nhất thế giới trong những năm

1970, Trung Quốc đứng thứ hai, tiếp theo là Hàn Quốc và Đài Loan [7] Hiệnnay, Trung Quốc đã trở thành nước sản xuất nấm Hương lớn nhất thế giới Việcsản xuất loại nấm đặc biệt này đang được mở rộng ra các nước khu vực ĐôngBắc Á và lan dần sang các nước Mỹ [1]

Ở Nhật Bản, các khu sản xuất nấm Hương chính nằm ở phía tây Nhật Bảnnhư Kyushu và Shikoku Khoảng 40 – 50% tổng sản lượng là ở Oita, Miyazaki

và Kyushu Nấm Hương tươi được sản xuất tại khu vực Kanto gần Tokyo [7]

Bảng 2.1 Sản lượng nấm Hương ở Nhật Bản từ năm 2003 đến năm 2009

Trang 13

Tại Việt Nam, chỉ có một số địa phương như Đà Lạt, Sa Pa, Tam Đảo lànhững nơi có điều kiện khí hậu thuận lợi cho việc nuôi trồng nấm Hương quanhnăm Một số tỉnh miền cao như Cao Bằng, Hà Giang, Lạng Sơn và các tỉnh đồngbằng Bắc Bộ có thể trồng nấm Hương nhưng thời gian thu hái nấm rất ngắn từ3-6 tháng [1].

2.1.3 Thành phần hóa học

Nấm Hương có giá trị dinh dưỡng cao với đầy đủ các thành phần nhưprotein, đường, chất béo, các vitamin nhóm B… Đặc biệt hơn nữa trong nấmHương có các axit amin thiết yếu như: leucine, lysine với một tỷ lệ tương đốicao, được ví như các "protein lý tưởng" cho dinh dưỡng của con người Hàmlượng các thành phần tương ứng được thể hiện trong bảng 2.2 như sau:

Trang 14

nucleotide như 5‘-GMP (guanosin – 5‘ monophosphat), amino acid tự do, chuỗipeptit, đường và acid hữu cơ (acid malic, acid fumalic, acid glutaric, acid oxalic,acid lactic, ) [22].

Hơn nữa, trong nấm có tới 40 loại enzym, đáng chú ý nhất là các enzymβ-1,3 glucozidaza, kitinaza, lipoidaza, ligninaza, pepsin, tannaza, pectinaza,glycozidase, insulinase, asparaginase, peroxydase, lactase, tyrozin oxydase [1]

Ngoài giá trị dinh dưỡng, từ lâu đời người ta đã biết đến nấm Hương cónhững giá trị dược liệu rất đáng chú ý Trong thành phần hóa học của nấm nàykhông thể không kể đến các hoạt chất sinh học như: Polysaccharides, sterol,Eritadenine, Mặc dù chỉ với hàm lượng nhỏ nhưng các hoạt chất sinh học nàylại đóng vai trò quyết định tới đặc tính sinh học của nấm Hương Nhómpolysaccharides hòa tan trong nước chiếm khoảng 1-5% trọng lượng nấmHương khô, đặc biệt là lentinan có tác dụng chống khối u, tăng khả năng miễndịch Ngoài ra, các thành phần polysaccharides hòa tan như pectin, dextrin,xyloglucan, heterogalactans có tác dụng loại trừ và kìm hãm sự phát triển của tếbào ung thư trong cơ thể, nên được dùng điều trị ung thư và đã được công nhậnsáng chế ở Nhật và Mỹ [22]

Hiện nay, các nhà khoa học đã tìm ra được rất nhiều các hoạt chất sinhhọc trong nấm Hương Năm 2010, Pisen P.S và cộng sự đã nghiên cứu và thống

kê lại các thành phần hoạt chất sinh học và vai trò của chúng, kết quả thể hiệntheo bảng 2.3

Trang 15

Bảng 2.3 Các hoạt chất trong nấm Hương và công dụng

Lentinan, KS-2-α-mannan-peptide, LEM,

LAP (heteroglucan-protein), EP3

Kìm hãm sự phát triển tế bào ung

thưManoglucan, phức polysaccharide

protein, glucan, lentinan, polysaccharide

L-II, (1-3)-β-D-glucan

Điều hòa miễn dịch

LEM, Lenthionine, dịch chiết bằng

nóng và ethanol

Tăng cường chức năng gan

Polyphenolic, dịch chiết bằng nước và

cồn methanol

Chống oxy hóa

(Pisen P.S và cộng sự, 2010)

2.2. Giới thiệu về hoạt chất sinh học lentinan trong nấm Hương

2.2.1 Khái niệm về lentinan

Năm 1969 các nhà khoa học Nhật Bản đã xác định được chất lentinan từvách tế bào của quả thể nấm Hương, đây là chất có hoạt tính sinh học cao tạo ratác dụng dược lý của loại nấm này Lentinan là một β-glucan có bản chấtpolysaccharide [1] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng glucan với liên kết beta gọi

là β-glucan có hoạt tính sinh học cao hơn so với các nhóm glucan khác Ngoài

ra, theo Wasser (2011) chỉ ra rằng hiệu quả của β-glucan ảnh hưởng bởi cấu trúcmạch, chiều dài mạch, tỷ lệ phân nhánh và khả năng hòa tan Nghiên cứu củaIshibashi và cộng sự (2001) đã chứng minh rằng β-glucan hòa tan có hoạt tínhmiễn dịch mạnh hơn so với β-glucan không hòa tan [15]

Bảng 2.4 Hàm lượng β-glucan trung bình của nấm Hương và một số nấm khác

Trang 16

(mg/g DM) trong nước tan trong nước

(Theo Manzi và Pizzoferrato 2000) [15]

Lentinan là một β-glucan tan trong nước Công thức phân tử của lentinan

là (C6H10O5)n, khối lượng phân tử trung bình là 400-800 kDa Cấu trúc xoắn ốc

có chứa các phân tử glucose với cầu nối β-1,3-D glycosidic mạch chính, trong

đó cứ 5 phân tử glucose ở mạch chính liên kết với 2 phân tử glucopyranose vớiliên kết β-1,6-D glicosidic tạo mạch nhánh [15, 17]

Hình 2.2 Cấu tạo lentinan của nấm Hương

Lentinan không hòa tan trong nước lạnh, acid và các dung môi hữu cơnhư ether, chloroform, pyridine, hexamethylphosphoramide; hòa tan trong nướcnóng và dimethyl sulfoxide, hòa tan tốt trong dung dịch kiềm và acid formic.Lentinan là chất khá ổn định với acid mạnh như acid sulfuric (H2SO4) và acidhydrochloric (HCl) nhưng có thể dễ dàng bị phân hủy khi gặp kiềm ở nhiệt độ cao.Nhiệt độ lentinan bắt đầu phân hủy ở 1500C và phân hủy hoàn toàn ở 2500C [8]

2.2.2 Tác dụng của lentinan

2.2.2.1 Chống ung thư, kháng u

Trang 17

Sau khi phân lập lentinan từ nấm Hương bởi Chihara (1969), hầu hết cácthực nghiệm chống ung thư được thực hiện với polysaccharide này ở Nhật Bản.Cũng chính Chihara là một trong những nhà nghiên cứu đầu tiên báo cáo cáctính chất kháng u của lentinan.

Lentinan được nghiên cứu thử nghiệm trên Sarcoma 180 ở chuột (Chihara

và cộng sự, 1969, 1970) Sau khi tiêm lentinan vào những con chuột nghiên cứuthì thấy kích thước khối u đã giảm 80% hoặc thoái hóa hoàn toàn [25] Mộtnghiên cứu khác của Mah-Lee Ng và Ann Tech Yap (2002) đã đánh giá về hiệuquả chống ung thư của lentinan trên ung thư ruột kết khi đưa vào thức ăn hàngngày cho chuột AKR, 3mg mỗi con chuột mỗi ngày trong 7 ngày Kết quả chothấy kích thước khối u nhỏ hơn nhiều so với chuột không tiêm tế bào lympho [19]

Điều trị lentinan còn cho thấy kết quả rất tốt trong việc kéo dài thời giansống của bệnh nhân ung thư, đặc biệt là những người ung thư dạ dày và ruột(Furue và cộng sự, 1981) Ở bệnh nhân ung thư dạ dày tái phát, phản ứng ungthư giảm, sự sống trung bình được kéo dài Trị liệu phối hợp giữa lentinan vớitegafur uracil sẽ làm tăng thời gian sống hơn nhiều so với chỉ dùng tegafururacil Trường hợp ung thư dạ dày, mức sống sau 1, 2, 3 năm sau khi uốngtegafur tăng chỉ khoảng 0% - 2,9% Trong khi các bệnh nhân có trị liệu kết hợpvới lentinan đạt mức sống cao hơn tương ứng là 19,5% sau 1 năm, 10,4% sau 2năm, 6,5% sau 3 năm Kết quả tương tự cũng thu được ở các bệnh nhân ung thưruột già và ung thư vú [9]

2.2.2.2 Tăng cường khả năng miễn dịch

Các polysaccharide trong nấm Hương, đặc biệt là lentinan có tác dụnglàm tăng khả năng miễn dịch bằng cách thúc đẩy quá trình gia tăng số lượng,kích hoạt các đại thực bào, tăng cường hoạt động của tế bào lymphocyte T,lymphocyte B và tế bào NK – những tế bào đóng vai trò chính trong việc bảo vệ

cơ thể [20] Như đã nói ở trên, lentinan có tác dụng chống ung thư nhưng khôngtấn công các tế bào ung thư trực tiếp mà bằng cách kích hoạt các phản ứng miễndịch khác nhau Lentinan hoạt động như một hỗ trợ bảo vệ tế bào chủ, có khảnăng khôi phục hoặc kích thích các kháng thể tham gia vào cơ chế bảo vệ tế bàochủ, không gây độc trực tiếp [27]

Trang 18

Trong một nghiên cứu invivo ở chuột bị viêm phúc mạc, kết hợp điều trịlentinan với gentamicin cho thấy tỷ lệ sống sót cao hơn đáng kể so với nhóm đốichứng Theo Kurashige và cộng sự (1997) lentinan kích hoạt hoạt động bài tiếtcác đại thực bào phúc mạc và sản xuất ra các cytokine Các cytokine tạo ra oxyhoạt động có tác dụng diệt khuẩn [22].

Lentinan còn được báo cáo trong nhiều nghiên cứu sinh khác về khả năng giatăng các phản ứng chống viêm (Suga và cộng sự, 1986), sự giãn nở mạch máu (Maeda

và cộng sự, 1991) và tăng thêm các chất trung gian miễn dịch như IL-1, IL-3, nhân tốkích thích và ức chế chuyển đổi tế bào gây độc (Chihara, 1992)

2.2.2.3 Kháng khuẩn và virut

Lentinan và các dẫn xuất của nó đã được chứng minh có hiệu quả trongviệc kháng khuẩn, virus, kháng nấm bệnh và ký sinh trùng Một số công trìnhnghiên cứu về tác dụng của các chất lentinan và Lentinula Edodes Mycelium(LEM) từ nấm Hương đối với virus được tiến hành tại Nhật Kết quả cho thấyđối với HIV/AIDS lentinan đơn độc không có tác dụng gì đối với HIV nhưngnếu phối hợp với Azido Thymidine (AZT) thì tác dụng diệt virus tăng lên 24 lần

so với dùng AZT đơn độc [22]

Ngoài ra, lentinan có tác dụng kích thích sức đề kháng chống lại virusviêm niêm mạc, virus viêm não, virut hô hấp ở chuột, adenovirus loại 12, chống

lại các ký sinh trùng Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni và các vi khuẩn Bacilus subtilis, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Candida albicans, trực khuẩn kháng thuốc chống lao [22].

2.3. Trích ly hoạt chất sinh học lentinan từ quả thể nấm Hương

2.3.1 Cơ sở khoa học duy trì và trích ly hoạt chất lentinan của nấm Hương

Trích ly là quá trình tách một hoặc một số chất tan trong chất rắn bằngmột chất lỏng khác – gọi là dung môi

Yêu cầu đối với dung môi: Dung môi phải có tính hoà tan chọn lọc, khôngđộc, không ăn mòn thiết bị, rẻ và dễ tìm

Cơ chế hoà tan: Dung môi thấm qua các mao quản vào các tế bào nguyênliệu, thời gian thấm phụ thuộc vào kính thước nguyên liệu, chiều dài mao quản,bản chất dung môi Quá trình hoà tan phụ thuộc vào bản chất hoá học của các

Trang 19

chất tan và dung môi Các chất có nhiều nhóm phân cực (-OH, -COOH) dễ tantrong dung môi phân cực (nước, cồn, propyl, ) Các chất có nhiều nhómkhông phân cực (chất béo, CH3 – C2H5- và đồng đẳng) dễ tan trong dung môikhông phân cực.

Lentinan có bản chất là một polysaccharide, do đó các phương pháp táchchiết lentinan cũng dựa trên nguyên lý chung tách chiết các polysaccharide.Polysaccharide là nhóm chất hữu cơ phổ biến và có khối lượng lớn nhất trongnấm Hương Chúng là các gluxit với phân tử rất lớn gồm nhiều đơn vịmonosaccharide liên kết với nhau tạo nên Polysaccharide có thể không tan nhưcellulose nhưng cũng có nhóm polysaccharide có độ trương nở và hoà tan tốttrong nước nóng và nước lạnh như tinh bột, guaran gum, lenantin,ergothioneine… Cenllulose chiếm một lượng khá lớn và có độ nhớt vừa phảinên các chất trong nấm Hương dễ hòa tan khi được trích ly bằng nước, enzym vàcồn… mà không bị mất hoạt tính sinh học Ngoài ra, các hợp chất này rất bềnđối với nhiệt

Nhóm chất khử tan hoàn toàn trong nước và rất bền nhiệt, ở 1210C trong

30 phút vẫn không làm mất hoạt tính sinh học của chúng Chính vì vậy, dịch

chiết nấm hương rất thuận lợi trong việc chế biến thức ăn và bổ sung vào thựcphẩm dinh dưỡng, tạo dược phẩm

2.3.2 Ứng dụng sóng siêu âm trong quá trình trích ly hoạt chất sinh học

lentinan

2.3.2.1 Khái niệm về sóng siêu âm

Siêu âm là sóng cơ học, hình thành do sự lan truyền dao động của cácphần tử trong không gian, có tần số lớn hơn tần số giới hạn trên ngưỡng nghecủa con người, tức là có tần số lớn hơn 20 kHz [2] Theo Povey M.I.W vàMason T.J (1998) siêu âm được ứng dụng trong thực phẩm thường trong khoảng20kHz – 100kHz

Dựa vào tần số, sóng siêu âm được chia làm 3 loại:

- Siêu âm tần số thấp, cường độ cao (20kHz – 100kHz, cường độ lớn hơn 10W/cm2) làm thay đổi thành phần của môi trường, phá hủy thành tế bào nguyênliệu, biến tính protein Do đó được ứng dụng rộng rãi như một quá trình hỗ trợ

Trang 20

trong nhiều lĩnh vực như: kết tinh, sấy, bài khí, trích ly, lọc, đồng hoá, làm mềmthịt, quá trình oxi hoá, quá trình tiệt trùng [5]

- Siêu âm tần số cao, cường độ thấp (100kHz – 2MHz, cường độ dưới 1W/cm2)được sử dụng như một kỹ thuật phân tích, không làm phá hủy cấu trúc của mẫu.Điều này được ứng dụng để xác định tính chất thực phẩm, đo tốc độ dòng chảy,kiểm tra bao gói thực phẩm [5]

- Siêu âm chẩn đoán (5-10MHz) có cơ chế chính là dòng âm thanh, dùng để đo

hệ số tốc độ và hấp thụ sóng trong môi trường, dùng trong y học và phân tíchhóa học [2]

2.3.2.2 Nguyên lý tác động của sóng siêu âm

a. Hiện tượng xâm thực khí

Khi sóng siêu âm được truyền vào môi trường chất lỏng, các chu trình kéo

và nén liên tiếp được tạo thành Trong điều kiện bình thường, các phân tử chấtlỏng ở rất gần nhau nhờ liên kết hóa học Khi có sóng siêu âm, trong chu trìnhnén các phân tử ở gần nhau hơn và trong chu trình kéo chúng bị tách ra xa Áplực giãn trong chu trình kéo đủ mạnh để thắng các lực liên kết giữa các phân tử,

do đó tạo thành những bọt khí nhỏ Bọt khí trở thành hạt nhân của hiện tượngxâm thực khí, bao gồm bọt khí ổn định và bọt khí tạm thời (Kuldiloke J., 2002)

Các bọt khí lớn dần đến một kích cỡ nhất định mà tại đó năng lượng củasóng siêu âm không đủ để duy trì pha khí khiến các bọt khí nổ tung dữ dội Khi

đó các phân tử va chạm với nhau mãnh liệt tạo nên hiện tượng “ sốc sóng” tronglòng chất lỏng, kết quả là hình thành những điểm có nhiệt độ và áp suất rất cao

Trang 21

Hình 2.3 Quá trình hình thành, phát triển và nổ vỡ của bọt khí trong

môi trường lỏng

b. Hiện tượng vi xoáy

Sóng siêu âm cường độ cao truyền vào trong lòng chất lỏng sẽ gây nên sựkích thích mãnh liệt Tại bề mặt tiếp xúc giữa 2 pha lỏng/rắn, sóng siêu âm gâynên sự hỗn loạn cực độ do tạo thành những vi xoáy (Scheba và cộng sự, 1991).Hiện tượng này làm giảm ranh giới giữa các pha, tăng cường sự truyền khối đốilưu và thúc đẩy xảy ra sự khuyếch tán ở một vài trường hợp mà khuấy trộnthông thường không đạt được

2.3.3.3 Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến quá trình trích ly

Cơ chế của sóng siêu âm làm tăng hiệu suất của quá trình trích ly:

- Sóng siêu âm làm phá vỡ thành tế bào nguyên liệu, phân tách được liênkết giữa hemicellulose và lignin giúp cho quá trình thoát chất tan được dễ dàng

- Hiện tượng xâm thực khí tạo ra một áp lực lớn xuyên qua dung môi vàtác động đến tế bào nguyên liệu, hình thành các ion tự do trong dung dịch thúcđẩy các phản ứng hóa học như tăng cường phản ứng polymer hóa và depolymerhóa hỗ trợ trích ly các chất tan

- Sự dao động mạnh của hiện tượng vi xoáy làm tăng khả năng truyềnnhiệt và truyền khối từ dung môi vào nguyên liệu

Trang 22

2.3.3 Tình hình nghiên cứu khai thác hoạt chất sinh học lentinan từ nấm

Hương

2.3.3.1.Tình hình nghiên cứu khai thác hoạt chất sinh học lentinan từ nấm Hương trên thế giới

Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về phương pháp trích

ly các hoạt chất sinh học trong nấm Hương nói riêng và nấm dược liệu nóichung Qua các kết quả nghiên cứu đó cho thấy hoạt chất sinh học của nấmHương có tác dụng dược lý chính là nhóm polysaccharides, trong đó lentinan làhợp chất có hoạt tính sinh học được quan tâm nhiều

Các phương pháp trích ly lentinan từ nấm Hương đầu tiên đã được nghiêncứu ở Nhật Bản trong nhiều năm

Theo Chihara và cộng sự (1970), lentinan đầu tiên được phân lập bằngphương pháp trích ly nấm Hương tươi (2kg) với nước nóng trong 8 đến 15 giờ.Polysaccharides thô thu được bằng cách ly tâm và tủa với ethanol để loại bỏ cáctạp chất Từ phần polysaccharide thô tiến hành tinh chế thu hồi lentinan tinhkhiết Với phương pháp của Chihara, hàm lượng lentinan trích ly được rất cao,

từ 2 kg quả thế nấm Hương thu được 0,31 g bột trắng lentinan, lentinan có độtinh khiết cao 96,03% [8]

Năm 1999, sau hai thập kỷ nghiên cứu chuyên sâu về nấm ăn và nấmdược liệu, Mizuno và cộng sự của ông tại Nhật Bản đã nghiên cứu thành côngviệc khai thác, phân đoạn và tinh chế các polysaccharides từ quả thể nấm Quátrình khai thác polysaccharides thô bằng cách tủa với ethanol 80%, tiếp tục chiếtxuất bằng nước nóng 1000C trong 3 giờ, sau đó loại tiếp bằng amoni oxalat 2%

và NaOH 5% Kết quả thu được α-glucan và β-glucan bằng phương pháp sắc kýlọc gel và sắc ký trao đổi ion qua cột cellulose [25]

Năm 2001, nghiên cứu của Ng Mah-Lee và Yap Ann- Teck đã đưa raphương pháp hóa sinh trích ly lentinan Phương pháp này sử dụng dung môi lànước (100oC), tủa polysaccharides bằng ethanol 95% (4oC) rồi ly tâm tách cặn,làm khô để thu được lentinan Tiến hành trích ly bằng phương pháp này đối với100g nấm Hương tươi sẽ thu được 325mg lentinan Phương pháp này thực hiệnđơn giản, dễ tiến hành, chi phí thấp [27]

Trang 23

Ngày nay với khoa học công nghệ ngày càng phát triển, các nhà khoa họctrên thế giới tiếp tục nghiên cứu khai thác lentinan với các phương pháp hiện đạinhư trích ly bằng enzym, sử dụng hỗ trợ của sóng siêu âm, vi sóng

Phương pháp enzym thích hợp với các mẫu phân tích có chứa hàm lượngβ-glucan thấp Sử dụng enzym β-1,3-glucanase để tách chiết β-glucan sau đótiến hành tinh chế Phương pháp này đạt hiệu suất thu hồi hơn 80%, thời giantách chiết ngắn nhưng yêu cầu về thiết bị hiện đại, chi phí cao [18] Một nghiêncứu khác nghiên cứu chiết xuất các polysaccharide trong nấm Hương bằngphương pháp enzym, sử dụng enzym phân hủy cellulase 0,5%, pectinase 0,5%,proteinase 1,0% tại pH 4,5 nhiệt độ 500C thời gian 80 phút thì lượngpolysaccharide đạt 4,588% [10]

He Bingcun và Wang Yi’na năm 2007 nghiên cứu trích ly lentinanpolysaccharides từ nấm Hương bằng vi sóng và khảo sát các yếu tố ảnh hưởngbao gồm tỷ lệ nguyên liệu, nhiệt độ trích ly, thời gian trích ly, thời gian gianhiệt Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu là tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/25,nhiệt độ là 800C, 3 giờ gia nhiệt, thời gian gia nhiệt vi sóng là 30 phút Trích lymột lần cho lentinan polysaccharides cao nhất là 7,70% [11]

Khai thác bằng sóng siêu âm nhằm phá vỡ vách tế bào là một phươngpháp được ứng dụng khá rộng rãi Sóng siêu âm được sử nhiều trong việc xử lýnguyên liệu thực vật để chiết xuất các chất có phân tử thấp [13] Theo ZhangWen Bo (2001), nếu trước khi tiến hành trích ly các polysaccharide từ nấmHương, nguyên liệu được xử lý bằng sóng siêu âm (tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

là 1/15, nhiệt độ trích ly 900C, cường độ siêu âm 400W, thời gian 3h) thì khảnăng trích ly được các polysaccharide cao hơn khả năng trích ly cácpolysaccharide bằng nước nóng Cụ thể khi trích ly nấm Hương bằng sóng siêu

âm hàm lượng polysaccharide tăng từ 6,22% đến 8,66% so với trích ly bằngnước nóng [29]

Một nghiên cứu khác nghiên cứu của Nian Bao-yi và cộng sự (2004) đãđưa ra quá trình trích ly lentinan bằng nước có hỗ trợ bằng sóng siêu âm Điềukiện tối ưu của quá trình là công suất siêu âm 80W, thời gian 13 phút, tỷ lệnguyên liệu/dung môi là 1/15, sau đó trích ly bằng nước nóng trong 2 giờ Kết

Trang 24

quả cho thấy tăng hiệu quả kinh tế và tính khả thi của phương pháp siêu âm,giảm chi phí sản xuất [20].

2.3.4.1 Tình hình nghiên cứu khai thác hoạt chất sinh học lentinan từ nấm Hương trong nước

Nấm Hương rất quen thuộc đối với người Việt Nam từ lâu đời Tuy nhiên,các nghiên cứu về việc trích ly các hợp chất quan trọng trong nấm Hương vẫncòn là một vấn đề mới mẻ

Gần đây các nghiên cứu liên quan đến hoạt chất sinh học, sản xuất thựcphẩm chức năng đang ngày càng được quan tâm nhiều hơn Năm 2005, NguyễnThị Chính và cộng sự đã tiến hành các nghiên cứu về công nghệ sản xuất nấm

dược liệu, bao gồm nghiên cứu về nấm Hương như đề tài “Nghiên cứu đặc tính sinh học và công nghệ nuôi trồng nấm Hương, hoạt tính kháng sinh của Lentinula edode” Nghiên cứu khác về quá trình tách chiết β-glucan của viện Công nghiệp Thực phẩm (2005) theo đề tài “Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất beta glucan từ thành tế bào nấm men dùng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm” Hay nghiên cứu sản xuất một số sản phẩm thực phẩm chức năng trong đó cũng nghiên cứu về nấm Hương và hoạt chất sinh học

lentinan trong nấm Hương của thạc sĩ Nguyễn Đức Tiến, Viện Cơ điện Nôngnghiệp và Công nghệ sau thu hoạch thực hiện [4] Điều này cho thấy việc khaithác các hoạt chất sinh học nói chung và lentinan nói riêng đã và đang đượcnghiên cứu rất nhiều Tuy nhiên các báo cáo chỉ tập trung nghiên cứu về đặc tínhcủa các hoạt chất có trong nấm Hương cũng như các nấm dược liệu khác

2.4 Một số chế phẩm lentinan thương mại

Nấm Hương được nuôi trồng và sản xuất thương mại khá phổ biến trênthế giới Sản phẩm của nó được sử dụng chủ yếu ở dạng tươi và sấy khô Donhững giá trị dinh dưỡng và tác dụng phòng chữa bệnh của hoạt chất sinh họclentinan đem lại nên các nhà khoa học trên thế giới đang ngày càng quan tâmđến việc nghiên cứu tách chiết lentinan từ nấm Hương để phục vụ nhiều lĩnh vựctrong đời sống Một số sản phẩm dạng bột, dạng lỏng hoặc viên nang có giá trịdinh dưỡng và phòng trị bệnh đã được cung cấp vào nhiều thị trường các nướctrên thế giới

Trang 25

Ở Nhật Bản, lentinan được sử dụng dưới dạng viên nang như một loạithuốc có hiệu lực chống ung thư dạ dày và ung thư vú (theo Taguchi và Kaneko,1985; Kaneko và cộng sự, 1989) Nó được sử dụng kết hợp với các loại thuốctây khác như một chất bổ trợ (Ger, 1997) Liều lượng thông thường ở Nhật Bản

là 2-10 mg/tuần (theo Gordon và cộng sự, 1995) [27]

Chế phẩm Lentinex được sản xuất bởi công ty Glyca Nova A/S – mộtcông ty Đan Mạch Lentinex là một sản phẩm lỏng màu nâu sáng Nó chứa hàmlượng lentinan khoảng 1mg/ml, ngoài ra còn có glucose, đường, protein và được

sử dụng bổ sung vào chế độ ăn uống Tính an toàn của Lentinex đã được thửnghiệm trong một nghiên cứu lâm sàng, kết quả chỉ ra rằng Lentinex không gâyhại cho con người Lentinex đã được thử nghiệm bổ sung vào thực phẩm nhưbánh mì, sữa chua, nước trái cây, nước giải khát, bánh kẹo và các loại dầu thựcphẩm Kết quả chỉ ra rằng trộn Lentinex vào nguyên liệu không ảnh hưởng đếnđặc tính cảm quan của sản phẩm, hơn nữa hoạt tính sinh học lentinan cũngkhông ảnh hưởng trong quá trình chế biến Các sản phẩm bổ sung này được bánrộng rãi ở Mỹ và các nước phương Đông, ngày càng phát triển ở Châu Âu [21]

Bảng 2.4 Một số chỉ tiêu kĩ thuật của chế phẩm Lentinex

(Theo Virginio Agostoni Carlo và cộng sự, 2010)

Sản phẩm bột nấm Hương trích ly (Shiitake Mushroom Extract) của TrungQuốc sản xuất, tên thương mại là Changyue Sản phẩm ở dạng bột màu vàng nhạtvới hàm lượng lentinan 20% Sản phẩm đạt tiêu chuẩn ISO, GMP, Kosher

Bảng 2.5 Tiêu chuẩn kỹ thuật cho sản phẩm bột nấm Hương trích ly

Trang 26

Chỉ tiêu cảm quan

Hình 2.4 Một số chế phẩm lentinan thương mại

PHẦN THỨ BA ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

Trang 27

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Nguồn nấm Hương (Lentinula edodes) do viện Di Truyền Nông Nghiệp

cung cấp Sử dụng quả thể nấm Hương khô có hàm ẩm nhỏ hơn 12%

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu

- Hóa chất: cồn 450, cồn 700, phenol, D-glucose, H2SO4 96%

- Thiết bị: Máy sấy (Grot DZ 47-63, Trung Quốc), máy đo OD (Zuzi4110ED – Spectrophotometer, Đức), máy siêu âm (Ultrasonic LC 30, Đức), máyxay (Điện cơ An Phát, Việt Nam), cân phân tích, cân kĩ thuật, tủ lạnh

- Dụng cụ: Bình tam giác, bình định mức, micropipet, pipet thường, ốngđong, ống nghiệm, đũa thủy tinh, phễu, đũa thủy tinh, nhiệt kế

3.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm và Môi trường nôngnghiệp – Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch

Thời gian nghiên cứu từ 01/2013 đến 05/2013

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu quả trích ly lentinan

- Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện xử lý nguyên liệu đến hiệu quảtrích ly lentinan

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý sóng siêu âm đến hiệu suấttrích ly lentinan

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số của quá trình trích ly lentinan

- Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm nấm Hương trích ly

Trang 28

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

3.3.1.1 Ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu quả trích ly lentinan

Dung môi ảnh hưởng lớn tới hiệu suất trích ly, chất lượng của dịch chiết

và thành phẩm Dung môi sử dụng phải hòa tan chọn lọc cao, không độc chongười sử dụng, rẻ tiền, dễ kiếm Chúng tôi tiến hành khảo sát các loại dung môi:

CT1: Dung môi là nước

Mỗi công thức lặp lại 3 lần

3.3.1.2 Ảnh hưởng của điều kiện xử lý nguyên liệu đến hiệu quả trích ly lentinan

a Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu quả trích ly lentinan

Nấm Hương được thái lát, xay ở các kích thước phù hợp Ở đây chúng tôitiến hành khảo sát ở các kích thước

Trang 29

+ Khối lượng mẫu 10g

+ Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/20

+ Nhiệt độ 950C

+ Thời gian 1,5h

+ Dung môi trích ly là kết quả nghiên cứu của thí nghiệm mục 3.3.1.1

Dịch trích ly thu được đem lọc qua giấy lọc Sau đó lấy mẫu đo OD vàxác định hàm lượng polysaccharides

b Ảnh hưởng của thời gian ngâm nguyên liệu trong dung môi đến hiệu quả trích ly lentinan

Nấm Hương được ngâm trong dung môi ở nhiệt độ phòng trước khi trích

ly để tăng hiệu suất trích ly Chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện sau:

CT8: Không ngâm nguyên liệu

CT9: Ngâm nguyên liệu 0,5h

CT10: Ngâm nguyên liệu 1h

CT11: Ngâm nguyên liệu 1,5h

Sau đó đem trích ly nấm Hương ở cùng điều kiện:

+ Thời gian 1,5h

+ Kích thước nguyên liệu là kết quả nghiên cứu của thí nghiệm mục3.3.1.2.a

Dịch trích ly thu được đem lọc qua giấy lọc Sau đó đo OD và xác địnhhàm lượng polysaccharides

Trang 30

3.3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian xử lý sóng siêu âm đến hiệu quả trích ly lentinan

Nguyên liệu được đưa vào máy siêu âm có tần số 20kHz để xử lý trước khitrích ly Tiến hành khảo sát thời gian xử lý bằng sóng siêu âm:

CT12: Không xử lý nguyên liệu bằng sóng siêu âm

CT13: Xử lý nguyên liệu trong 5 phút

Sau đó đem trích ly nấm Hương ở cùng điều kiện:

+ Thời gian 1,5h

+ Thời gian ngâm nguyên liệu trong dung môi là kết quả nghiên cứu củamục 3.3.1.2.b

3.3.1.4 Xác định các thông số của quá trình trích ly ảnh hưởng đến hiệu quả trích

ly lentinan

a Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến hiệu quả trích ly lentinan

Tỷ lệ nguyên liệu nấm Hương khô và dung môi được khảo sát ở các tỷ lệ:CT17: Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/10

Trang 31

CT18: Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/15

Nấm Hương với các tỷ lệ trên đem trích ly ở cùng điều kiện

+ Thời gian 1,5h

+ Thời gian ngâm nguyên liệu trong dung môi là kết quả nghiên cứu củamục 3.3.1.2.b

+ Thời gian xử lý nguyên liệu bằng sóng siêu âm là kết quả nghiên cứucủa mục 3.3.1.3

b Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu quả trích ly lentinan

Tiến hành khảo sát các nhiệt độ trích ly khác nhau ở cùng một điều kiện.CT21: Nhiệt độ trích ly 250C

CT22: Nhiệt độ trích ly 650C

Nấm Hương với các tỷ lệ trên đem trích ly ở cùng điều kiện

+ Thời gian 1,5h

Trang 32

+ Thời gian ngâm nguyên liệu trong dung môi là kết quả của thí nghiệmmục 3.3.1.2.b

+ Thời gian xử lý nguyên liệu bằng sóng siêu âm là kết quả của thínghiệm mục 3.3.1.3

+ Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là kết quả của thí nghiệm mục 3.3.1.4.a

c Ảnh hưởng của thời gian trích ly lần 1 đến hiệu quả trích ly lentinan

Tiến hành khảo sát thời gian trích ly lần 1 theo các công thức sau

CT25: Thời gian trích ly 0,5h

CT26: Thời gian trích ly 1h

CT27: Thời gian trích ly 1,5h

CT28: Thời gian trích ly 2h

Để thí nghiệm dễ dàng chúng tôi cố định các điều kiện

+ Thời gian ngâm nguyên liệu trong dung môi là kết quả của thí nghiệmmục 3.3.1.2.b

+ Thời gian xử lý nguyên liệu bằng sóng siêu âm là kết quả của thínghiệm mục 3.3.1.3

+ Nhiệt độ trích ly là kết quả của thí nghiệm mục 3.3.1.4.b

Trang 33

Dịch trích ly thu được đem lọc qua giấy lọc Sau đó lấy mẫu đo OD vàxác định hàm lượng polysaccharides.

c Ảnh hưởng của thời gian trích ly lần 2 tới hiệu quả trích ly lentinan

Để trích ly triệt để hoạt chất trong nguyên liệu, chúng tôi tiến hành trích lylần 2 Sau khi trích ly lần 1 tách bã đem trích ly tiếp lần 2 Thời gian trích ly lần

2 chúng tôi khảo sát ngắn hơn trích ly lần 1

CT29: Thời gian trích ly 20 phút

Nấm Hương được trích ly cùng điều kiện

+ Nhiệt độ trích ly là kết quả của thí nghiệm mục 3.3.1.4.b

3.3.2 Phương pháp cô và thu nhận chế phẩm nấm Hương trích ly

Để làm sạch tạp chất và cặn của dịch trích ly, chúng tôi đã dùng phươngpháp lọc dịch bằng giấy lọc khổ lớn, kích thước 60 x 60cm 2 lần sau đó lọcbằng giấy lọc tinh có đường kính 11cm

Dịch trích ly sau khi lọc đem cô trên thiết bị cô chân không đuổi dungmôi để thu nhận chế phẩm nấm Hương

Trang 34

3.3.3 Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm nấm Hương trích ly

Hình 3.1 Quy trình sản xuất chế phẩm nấm Hương

Thuyết minh quy trình

1 Xử lý nguyên liệu

Nấm Hương khô sau khi đã loại bỏ mốc, hỏng được xay tới kích thước phùhợp Sau đó đem ngâm trong nước và xử lý bằng sóng siêu âm trước khi trích lyMục đích: Tách các tạp chất không mong muốn, tăng diện tích tiếp xúc bềmặt giữa nguyên liệu và dung môi trích ly thuận lợi cho các qua trình sau

Trang 35

Nguyên liệu nấm Hương sau khi đã xử lý được đem trích ly bằng thiết bịchuyên dụng với các thông số trích ly phù hợp.

Mục đích: Tách tối đa các hoạt chất lentinan trong nấm Hương

- Sử dụng phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi

Nguyên tắc: Sấy mẫu trong thời gian dài để tách lượng nước tự do và liênkết trong sản phẩm Trong quá trình sấy cần theo dõi và cân khối lượng mẫu đếnkhi khối lượng không đổi thì dừng sấy Lượng nước trong nguyên liệu đã bayhết phần còn lại là chất khô

Độ ẩm (W%) được tính theo công thức sau:

G1 – G2 W(%) = * 100

Trong đó: G1: Khối lượng mẫu + chén sứ trước khi sấy (g)

G2: Khối lượng mẫu + chén sứ sau khi sấy (g)

G0: Khối lượng chén sứ (g)

Trang 36

3.3.4.2 Định lượng polysaccharide tan trong dịch chiết nấm Hương

Định lượng polysaccharide bằng phương pháp tủa bằng cồn Dịch chiếtnấm Hương sau khi lọc sạch đem tủa bằng cồn 960C trong điều kiện lạnh ở nhiệt

độ 40C để qua đêm Lọc thu lấy lượng kết tủa, sấy đến khối lượng không đổi

Định lượng polysaccharide theo phương pháp cân trọng lượng

X % =  100



v m

V P

Trong đó X: Hàm lượng polysaccharide (%)

P: Khối lượng polysaccharide thô (g) V: Thể tích dịch chiết (ml)

v: Thể tích dịch chiết đem phân tích (ml)m: Khối lượng mẫu (g)

3.3.4.3 Định lượng hoạt chất sinh học lentinan trong dịch chiết nấm Hương

Sử dụng phương pháp acid phenol – sulfuric [26]

Dựa trên việc hấp thụ tại bước sóng 490 nm của phức chất tạo bởi phenol

và cacbohydrate Hàm lượng glucan được xác định bằng cách so sánh với mộtđường chuẩn Sử dụng máy quang phổ hấp thụ, chọn bước sóng 490 nm, xâydựng đường chuẩn, đo các mẫu phân tích Tùy từng điều kiện phương phápphenol-sulfuric có độ chính xác đến ± 2%

 Xây dựng đường chuẩn

Quy trình lập đường chuẩn glucan như sau:

- Pha phenol 4%: cân 4g phenol, hòa tan trong bình định mức 100ml bằngnước cất, sau khi phenol tan hết ta thêm nước cất đến vạch định mức

- Cân 0,1g D-glucose tinh khiết (chất chuẩn), hòa tan trong bình định mức1lít bằng nước cất sau khi glucose tan hết ta thêm nước cất đến vạch định mức

Ta có dung dịch chuẩn với nồng độ 0,01mg/ml

- Từ dung dịch chuẩn ta pha thành dãy chuẩn với các nồng độ: 0,02mg/ml;0,01mg/ml; 0,005mg/ml; 0,002mg/ml; 0,001mg/ml

- Lấy 5ml mỗi nồng độ chất chuẩn đưa vào các lọ 10ml

Trang 37

- Thêm lần lượt vào tất cả các lọ chuẩn 0,5ml dung dịch phenol 4% sau đóthêm lần lượt vào tất cả các lọ 2,5ml dung dịch H2SO4 96%.

- Chuyển dãy chuẩn ra các cuvet và đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng

là 490nm

 Tính toán xác định hàm lượng lentinan trong nấm Hương

- Từ đường chuẩn xác định được nồng độ mẫu phân tích

- Hàm lượng glucan được tính theo công thức sau:

Hàm lượng lentinan (mg/g) =

Trong đó: x là nồng độ chất chuẩn xác định từ đường chuẩn (mg/ml)

V là thế tích dịch trích ly (200ml)

n là hệ số pha loãng

P là khối lượng mẫu ban đầu đem phân tích (10g)

- Giá trị trung bình được tính từ 3 mẫu song song

3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý thống kê theo phần mềm Excel, IRISTAT 4.0

Định dạng
Số trang	74
Dung lượng	0,96 MB