Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro phục vụ chuyển gen ở cây đậu nho nhe (vigna umbellata)

Đối với các cây họ Đậu như đậu tương, đậu xanh, đậu cove việc xây dựng hệ thống tái sinh in vitro đã được nghiên cứu và khẳng định.. Còn đối với đậu Nho nhe, một loài cây hai lá mầm có

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

VŨ THU TRANG

NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO

PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU NHO NHE

(VIGNA UMBELLATA)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

VŨ THU TRANG

NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO

PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU NHO NHE

(VIGNA UMBELLATA)

Ngành: Di truyền học

Mã số: 8.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên - 2019

Tôi xin cam đoan nội dung trình bày trong luận văn là kết quả nghiên cứu

của tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của GS.TS Chu Hoàng Mậu Các số liệu, kết

quả sử dụng trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công

trình nào khác

Tác giả luận văn

Vũ Thu Trang

Xác nhận của BCN Khoa Xác nhận của cán bộ hướng dẫn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn thạc sĩ này

Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ của Đề tài khoa học-công nghệ cấp Bộ Giáo dục & Đào tạo mang mã số B2017-TNA-38 do GS.TS Chu Hoàng Mậu làm chủ nhiệm

Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa học này

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã động viên và giúp đỡ trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này

Tác giả luận văn

Vũ Thu Trang

g

đoan……… i

Lời cảm ơn……… ii

Mục lục……… iii

Danh mục hình……… iv

Danh mục bảng……… v

Danh mục chữ viết tắt……… vi

Mở đầu ……… 1

1 Đặt vấn đề ……… 1

2 Mục tiêu nghiên cứu ……… 2

3 Nội dung nghiên cứu……… 2

Chương 1 Tổng quan tài liệu……… 3

1.1 Cây đậu Nho nhe……… 3

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm sinh học của đậu Nho nhe…… 4

1.1.2 Giá trị dinh dưỡng và giá trị sử dụng của đậu Nho nhe 6

1.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật 8

1.2.1 Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy in vitro mô tế bào thực vật

8 1.2.2.Môi trường nuôi cấy tế bào thực vật……… 9

thực

vật……… 13

1.3 Hệ thống tái sinh cây in vitro phục vụ chuyển gen ở cây họ Đậu 15

Chương 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 18 2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên

2.2.1 Phương pháp khử trùng hạt, tạo cây con nuôi cấy in vitro 19

2.2.2 Tái sinh chồi đậu Nho nhe từ mô sẹo……… 20

2.2.3 Tái sinh đa chồi đậu Nho nhe từ lá mầm và chồi ngọn… 21

2.2.4 Môi trường ra rễ……… 22

2.2.5 Ra cây và chế độ chăm sóc……… 23

2.2.6 Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu……… 24

Chương 3 Kết quả và thảo luận……… 25

3.1 Kết quả nghiên cứu khử trùng hạt đậu Nho nhe……… 25

3.2 Tái sinh in vitro cây đậu Nho nhe……… 28

3.2.1.Tái sinh chồi cây đậu Nho nhe từ mô sẹo……… 28

3.2.2 Tái sinh chồi cây đậu Nho nhe từ nách lá mầm và chồi ngọn… 29

3.2.3 Ảnh hưởng của BAP đến tái sinh chồi từ chồi ngọn in vitro 33

3.2.4 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi in vitro……… 37

3.3 Chuyển cây in vitro ra môi trường tự nhiên……… 39

Kết luận và đề nghị……… 42

1 Kết luận……… 42

2 Đề nghị……… 42

Tài liệu tham khảo……… 43

Phụ lục ……… 48

Hình 3.1 Hạt đậu Nho nhe nảy mầm trên môi trường GM……… 27

Hình 3.2 Hình ảnh mô sẹo từ mảnh lá sau 3 tuần nuôi cấy trên môi

trường có bổ sung 2,4-D 1mg/l……… 29 Hình 3.3 Mô sẹo nuôi cấy trên môi trường SIM sau 4

Hình 3.5 Hình ảnh đa chồi từ chồi ngọn sau 4 tuần nuôi cấy………… 31

Hình 3.6 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ tạo đa chồi của chồi ngọn dưới tác động

Hình 3.9 Cụm chồi nuôi cấy trên môi trường tái sinh chồi với BAP

1,5mg/l sau 4 tuần ……… 37 Hình 3.10 Cây đậu Nho nhe trên môi trường chứa IBA

Hình 3.11 Cây tái sinh in vitro hoàn chỉnh để ra bầu đất……… 40

Hình 3.12 Cây tái sinh in vitro hoàn chỉnh được trồng trong bầu đất

chứa giá thể đất thịt, trấu hun tỷ lệ 2:1 sau 2

tuần………

41

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thành phần các loại môi trường nuôi cấy dùng cho hệ thống

cây 24 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ Javen và thời gian khử trùng đến sự

nảy mầm của hạt đậu Nho nhe sau 7 ngày nuôi cấy………

26 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BAP đến phát sinh chồi của cây đậu Nho

nhe… 35 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ IBA tới khả năng tạo rễ của chồi tái

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của giá thể tới sức sống của cây đậu Nho nhe tái

DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

ARN : Ribonucleic Acid

IAA : Indole-3-acetic acid

IBA : Indole-3-butyric acid

SEM : Shoot Elongation Medium

SIM : Shoot Induction Medium

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu Nho nhe có tên khoa học Vigna umbellata (Thunb.) Ohwi & Ohashi

thuộc họ Đậu (Fabaceae) hay thường được gọi là đậu gạo, đậu nâu Loài đậu này được phát hiện lần đầu tiên ở Ấn Độ, sau đó được Ohwi và Ohashi miêu tả khoa học đầu tiên vào năm 2010 Đậu Nho nhe phân bố khá rộng từ miền Nam Trung Quốc sau đó lan rộng ra miền Bắc Việt Nam, Lào, Thái Lan, Ở nước

ta, đậu Nho nhe được trồng chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía Bắc như Cao Bằng, Lào Cai, Yên Bái

Ðậu đỗ nói chung và đậu Nho nhe nói riêng là nhóm cây có giá trị dinh dưỡng cao, đóng vai trò thiết yếu để nâng cao tiêu chuẩn thực phẩm cho con người đặc biệt ở những nước đang phát triển trong tình trạng thiếu hụt protein Ðậu Nho nhe thường được sử dụng làm thức ăn cho người và vật nuôi, là cây một năm, hệ rễ phát triển mạnh, có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm nên thường được trồng luân canh với lúa và ngô để tăng vụ và cải tạo đất bạc màu chống xói mòn Đậu Nho nhe là cây sinh trưởng rất nhanh, sau 3 tháng có thể phủ kín đất, đặc biệt hàm lượng dinh dưỡng trong thân và lá cao, làm phân bón rất tốt Một số những nghiên cứu gần đây, còn cho thấy đậu Nho nhe ngoài

là cây lương thực thiết yếu còn có tác dụng trong việc chữa bệnh Ở Trung Quốc, đậu Nho nhe được dùng như một loại dược liệu để chữa các bệnh liên quan đến đau nhức xương khớp, hay sắc uống để giải độc, giảm phù nề [41] Tuy nhiên, các cây trồng thuộc họ Đậu có khả năng chống chịu kém đối với các tác nhân bất lợi từ ngoại cảnh và khả năng này ngày càng bị suy giảm nghiêm trọng do biến đổi khí hậu Do vậy nghiên cứu tìm biện pháp cải thiện khả năng chống chịu của cây họ Đậu nói chung và cây đậu Nho nhe nói riêng được quan tâm và mang tính thời sự

Có nhiều cách tiếp cận nghiên cứu nâng cao khả năng chống chịu của cây

họ Đậu bằng lai hữu tính, đột biến thực nghiệm và công nghệ gen Trong đó ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để làm tăng khả năng chống chịu các stress phi sinh học là một hướng tiếp cận có triển vọng Việc xây dựng hệ thống tái sinh

là một trong những giai đoạn có ý nghĩa quan trọng và quyết định rất lớn đến

sự thành công của kỹ thuật chuyển gen Đối với các cây họ Đậu như đậu tương,

đậu xanh, đậu cove việc xây dựng hệ thống tái sinh in vitro đã được nghiên cứu

và khẳng định Còn đối với đậu Nho nhe, một loài cây hai lá mầm có thể tái sinh trong ống nghiệm hay không, tái sinh từ bộ phận nào của cây, công thức môi trường thích hợp cho tái sinh đa chồi Đây là những câu hỏi đặt ra cho nghiên cứu này

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi xây dựng đề tài cho luận văn thạc

sĩ là: “Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro phục vụ chuyển gen ở cây đậu Nho nhe (Vigna umbellata)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được hệ thống tái sinh đa chồi in vitro phục vụ chuyển gen ở cây

đậu Nho nhe

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu điều kiện khử trùng hạt để tạo mẫu sạch trong ống nghiệm

- Nghiên cứu tái sinh đa chồi in vitro qua mô sẹo, nách lá mầm, chồi ngọn

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng BAP, kinetin đến sự tạo đa chồi ở cây đậu Nho nhe

- Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi in vitro

- Nghiên cứu điều kiện chuyển cây đậu Nho nhe in vitro ra ngoài môi trường tự

nhiên

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU NHO NHE

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm sinh học của đậu Nho nhe

Đậu Nho nhe có những tên khác như: đậu gạo, đậu nâu, đậu Cao Bằng,

đậu đà, thua dài Tên khoa học của đậu Nho nhe là Vigna umbellata (Thunb.)

Ohwi & Ohashi Đậu Nho nhe thuộc chi Đậu (Vigna), họ Đậu (Fabaceae), bộ Đậu (Fabales), lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida)

Chi Vigna là một trong những chi lớn của họ Đậu, bao gồm 7 chi phụ là Vigna, Haydonia, Plectropic, Macrohynchus, Ceratotrophic, Lasionspron, Sigmoidotrotopis Đậu Nho nhe theo quan điểm lấy hạt bao gồm các loại thuộc hai chi phụ là Vigna và Ceratotrophic Chi phụ Ceratotrophic còn được gọi là

nhóm đậu Châu Á mang những mức độ điển hình thể hiện ở mức độ cao nhất

cho Vigna Năm 1970, Vercourt đã công bố 5 trong 16 loài của Ceratotrophic

đã được thuần hóa là: Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczel), đậu gạo (Vigna umbellata (Thunb.)), đậu adzukia (Vigna anguilaris (Willd), đậu ván (Vigna aconiti (Jacp)), Vigna trilobala (L.) Wilczel

Đậu Nho nhe là dạng cây thân thảo, có thể mọc thẳng đứng, bán thẳng hoặc xoắn có dây leo, thường có chiều dài từ 30-100 cm, một số loài có thể cao đến 200 cm Thân cây có rãnh, phân nhánh Khi cây còn non có lông ngắn, mịn, trắng phát triển bao phủ, lông này sẽ rụng dần khi cây lớn lên

Lá của đậu Nho nhe phần lớn là mọc cách, thường là lá kép ba lá chét, lá kèm hình ngọn giáo, chiều dài của lá từ 6-9 cm, cuống lá dài từ 5-10 cm Hệ thống rễ của đậu Nho nhe phát triển mạnh mẽ, rễ cái có thể cắm sâu xuống đất 100-150 cm có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm

Hoa thường có màu vàng tươi hoặc vàng nhạt Cụm hoa hình chùm mọc

ra từ nách lá Hoa lưỡng tính, đều hoặc không đều, mẫu 5 Hoa thường có 10 nhị, màng hạt phấn có 3 rãnh - lỗ Bộ nhụy gồm có 1 noãn với nhiều noãn đảo hay cong

Quả của đậu Nho nhe dài hình dải cong, mọc đứng dài từ 7,5-12,5 cm, rộng 4- 6 mm, chứa khoảng 6-10 hạt Hạt đậu dài 6-8 mm, rốn hạt lõm Hạt đậu Nho nhe có màu sắc đa dạng: vàng lục, vàng nâu, nâu, đen, đốm hoặc màu rơm Các hạt màu vàng lục thường trở thành màu nâu vàng trong quá trình lưu trữ Hạt màu vàng nâu được cho là có giá trị dinh dưỡng cao hơn cả

Đậu Nho nhe phát triển nhanh vào mùa hè Ở Ấn Độ và Nepal, đậu Nho nhe được gieo vào tháng 2, tháng 3 để thu hoạch vào mùa hè và tháng 7, tháng

8 để thu hoạch vào tháng 12 Thời kỳ sinh trưởng của cây thay đổi tùy theo giống và vùng địa lý Khi được trồng ở Ăng-gô-la (vĩ độ 6°-17°S), theo báo cáo, cây trưởng thành sau 60 ngày kể từ khi gieo hạt, nhưng ở Tây Bengal ở bán cầu bắc, cây trồng cần khoảng 130 ngày để tạo ra năng suất hạt giống kinh

tế [40]

Đậu Nho nhe là một cây họ đậu linh hoạt có thể phát triển ở vùng cận nhiệt đới ẩm đến khí hậu ôn đới ấm áp và mát mẻ Cây không chịu được sương giá nhưng chịu được nhiệt độ cao, thường được tìm thấy mọc ở những khu vực có nhiệt độ trung bình từ 18-30°C Phạm vi nhiệt độ cho sự tăng trưởng là 10-40°C với mức tối ưu trong khoảng từ 18-30°C Đậu Nho nhe phát triển tốt ở vùng khí hậu ẩm ướt và mặc dù có khả năng chịu hạn tốt, nhưng để có năng suất tốt,

nó đòi hỏi lượng mưa hàng năm là 1000-1500 mm Phạm vi lượng mưa hàng năm được báo cáo cho cây tăng trưởng là 300-2000 mm với mức tối ưu trong khoảng 700-1500 mm Đậu Nho nhe phát triển mạnh trong điều kiện ánh sáng đầy đủ, sự tăng trưởng của nó có thể bị cản trở nếu trồng xen canh với cây trồng khác chẳng hạn như ngô, lúa [40]

Loài đậu này có thể được trồng trên nhiều loại đất, cả những loại đất thoái hóa, khô cằn, nghèo dinh dưỡng nhưng để có năng suất tối ưu, nó đòi hỏi phải

có đất màu mỡ Tuy nhiên, độ phì nhiêu của đất cao có thể cản trở sự hình thành

quả và làm giảm năng suất hạt Phạm vi pH đất cho sự tăng trưởng là 5,5-8 với mức tối ưu trong khoảng 6-7,5

Đậu Nho nhe là một loại cây khỏe mạnh, có khả năng chống lại nhiều loại sâu bệnh, nó không cần phân bón hoặc chăm sóc đặc biệt trong quá trình tăng trưởng Nó có nguồn gốc từ châu Á, được tìm thấy đầu tiên ở Ấn Độ và miền trung Trung Quốc sau đó lan sang Malaysia Loài đậu này được người Ả Rập đưa vào Ai Cập, dọc theo bờ biển phía Đông châu Phi và các đảo Ấn Độ Dương Ngày nay, đậu Nho nhe được trồng rộng rãi ở các nước nhiệt đới châu

Á, ít được trồng ở Hoa Kỳ, Úc, Tây Nam châu Á, vùng nhiệt đới châu Phi và châu Mỹ Ở các cùng nhiệt đới châu Phi, nó được trồng ở Tây Phi, Đông Phi

và các đảo Ấn Độ Dương, và ít gặp hơn ở Trung và Nam Phi Ở nước ta, đậu Nho nhe được trồng chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía Bắc như Cao Bằng, Lào Cai, Yên Bái,

Hiện nay, chưa có số liệu cụ thể về tình hình sản xuất đậu Nho nhe, tuy nhiên loài đậu này được sản xuất chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á, Nhật Bản

là nước nhập khẩu chính, các nhà xuất khẩu chính là Thái Lan, Myanmar và Trung Quốc Madagascar cũng là một trong những nước xuất khẩu chính đậu Nho nhe Xuất khẩu trung bình hàng năm từ năm 1998-2000 ước tính là 1100 triệu tấn [40]

Hình 1.1 Cây đậu Nho nhe (ảnh chụp của tác giả tại vườn thí nghiệm Khoa

Sinh học, 6/2018)

1.1.2 Giá trị dinh dưỡng và giá trị sử dụng của đậu Nho nhe

Đậu Nho nhe là một loại đậu ít được biết đến và chưa được sử dụng đúng cách Tuy nhiên, gần đây loại đậu này đã gây được sự chú ý nhờ giá trị tiềm năng về mặt dinh dưỡng của nó Chất lượng dinh dưỡng của hạt đậu Nho nhe

cao hơn so với nhiều loại đậu khác thuộc họ Vigna Trong nghiên cứu hiện tại,

16 kiểu gen khác nhau của hạt đậu Nho nhe đã đánh giá được các thành phần dinh dưỡng chính là: hàm lượng protein, chất béo tổng hợp, chất xơ, carbohydrate, vitamin, khoáng chất, axit amin và axit béo [28] Hạt đậu Nho nhe khô chứa nước 13,3%, protid 20,9%, lipid 0,9%, glucid 64,9%, xơ 4,8%, tro 4,2%, 100g cung cấp năng lượng là 1373KJ Ðậu gạo còn chứa nhiều Ca,

Fe, P và các loại vitamin của nhóm B như thiamin, niacin, riboflavin Nghiên cứu gần đây cho thấy đậu Nho nhe có hàm lượng Ca cao so với các loại cây

trồng họ Đậu khác tốt cho các bà mẹ đang cho con bú Protein cô đặc được điều chế từ hạt đậu đã cho thấy tác dụng chống tăng huyết áp ở chuột đồng

Botrytiscinerea, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani và Mycosphaerella arachidicola [16] Hơn nữa, nó đã cho thấy giảm thiểu và chống lại hoạt động

sao mã ngược của HIV-1 [18] Ở Ấn Độ lá đậu Nho nhe cùng với bột gạo được dùng làm thuốc đắp vào bụng để trị đau dạ dày.Tuy nhiên, các yếu tố chống dinh dưỡng cũng tìm thấy trong hạt đậu Nho nhe bao gồm các yếu tố ức chế trypsin, phytates, tannin và oligosacarit Việc ngâm, tách vỏ, nảy mầm và nấu chín có thể làm giảm đáng kể các yếu tố chống dinh dưỡng này [33], [34] Đậu Nho nhe là một cây họ đậu đa năng, không phổ biến như các loại đậu

khác: đậu đũa (Vigna unguiculata), đậu adzuki (Vigna angulari) và đậu xanh (Vigna radiata), đậu Nho nhe lại là một loại thực phẩm quan trọng và thiết yếu

trong dinh dưỡng của con người ở các nước đang phát triển, thiếu hụt nguồn dinh dưỡng trong thức ăn như: Ấn Độ, Nepal, Thái Lan… trong đó có Việt Nam đặc biệt là các tỉnh miền núi phía Bắc (Lào Cai, Yên Bái, Cao Bằng…) Tất cả các bộ phận của cây đậu đều có thể ăn được và sử dụng trong các chế phẩm thức ăn Hạt khô có thể luộc ăn với cơm hoặc chúng có thể thay gạo khi hầm hoặc nấu súp Ở một số nước, hạt này được xay ra để tạo thành loại bột dinh dưỡng có trong thức ăn dành cho trẻ em Quả non, lá, rau mầm được luộc và ăn như rau Quả non đôi khi còn để ăn sống Đậu Nho nhe rất hữu ích cho chăn nuôi Những thứ còn lại sau thu hoạch như thân cây, lá, hạt… có thể

để tươi hoặc phơi khô sử dụng làm thức ăn cho ra súc

Đậu Nho nhe được dùng để làm phân xanh, nó mọc rất nhanh và che phủ kín mặt đất như một hàng rào sống hay hàng rào sinh học Ở những ngọn đồi ở vùng biên giới Nepal, người nông dân dùng cây đậu với hai mục đích chính là làm thức ăn cho gia súc, cải tạo các loại đất

1.2 NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

1.2.1 Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Tính toàn năng của tế bào

Tất cả các tế bào của một cơ thể đều mang thông tin di truyền giống nhau

Do đó chúng có tiềm năng tổng hợp nên các protein giống nhau Các tế bào được lấy từ bất kỳ mô sống nào của cơ thể thực vật (bao phấn, đỉnh sinh trưởng,

lá mầm, đoạn thân, rễ…) đều có thể được kích thích để tái sinh thành cây hoàn chỉnh đặc trưng cho loài, phát triển và ra hoa kết quả bình thường Quá trình này có thể thông qua phát sinh cơ quan hoặc hình thành phôi vô tính và được nuôi cấy trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng cần thiết Các loại mô đã phân hoá tách từ cơ thể thực vật có khả năng tái sinh trực tiếp thành cây hoàn chỉnh, hoặc là phát triển thành tế bào mô sẹo Đó là loại tế bào không phân hoá, phân chia liên tục và có khả năng phân hoá thành phôi, chồi để tạo cây hoàn chỉnh Khả năng đó gọi là tính toàn năng của tế bào [9], [14]

Phản biệt hóa và tái biệt hóa

Quá trình tái sinh được chia làm hai giai đoạn: phản biệt hóa và tái biệt hóa Phản biệt hóa là giai đoạn đưa tế bào từ trạng thái đã biệt hóa trở lại trạng thái chưa biệt hóa Các tế bào đã biệt hóa là những tế bào có chức năng nhất định và có cấu trúc phù hợp để hoàn thành chức năng ấy Quá trình phản biệt hóa biến tế bào đã biệt hóa thành những tế bào có hình thức giống như những

tế bào ở đỉnh sinh trưởng (tế bào mầm phôi), chúng có đặc điểm: tế bào đậm đăc, không bào nhỏ li ti hoặc không có, nhân to, kích thước tế bào lớn Những

tế bào như vậy coi như đã được phản biệt hóa xong và trong những điều kiện nuôi cấy nhất định chúng sẽ phát triển thành cơ thể mới Các mô phản biệt hóa cần nuôi trên môi trường chứa các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm

Auxin gồm: 2,4-D, α-NAA, IAA, IBA [7]

Tái biệt hóa là giai đoạn tế bào đã phản biệt hóa phát triển thành cây hoàn chỉnh và chỉ có các tế bào phôi mới có thể hình thành cơ thể mới [7]

Trong cùng một cơ thể, mỗi tế bào đều có khả năng biệt hóa, phản biệt hóa và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau Những tế bào càng chuyên hóa về một chức năng nào đó (đã biệt hóa sâu) thì càng khó xảy

ra quá trình biệt hóa và ngược lại, như các tế bào mạch dẫn ở thực vật, tế bào thần kinh ở động vật Người ta đã chứng minh rằng: những tế bào càng gần trạng thái của phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu [1]

1.2.2 Môi trường nuôi cấy tế bào thực vật

Cơ sở cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là việc xem xét các thành phần cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Đầu những năm 20 đã

có một số công trình sử dụng môi trường dinh dưỡng tổng hợp, ngoài muối khoáng và nguồn cacbon còn bổ sung thêm vitamin và một số chất khác [7] Trong những năm 60, nhiều môi trường nuôi cấy đã được xây dựng và được sử dụng cho đến nay chỉ cần cải tiến chút ít. Đó là các môi trường White, Knop (1953), Môi trường giàu chất dinh dưỡng Murashige - Skoog (1963) [23], Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình Gamborg (1968) [8]

Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy Tùy theo mục đích nuôi cấy muốn duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, muốn tạo rễ, tạo mầm hay muốn tái sinh cây hoàn chỉnh, môi trường nuôi cấy phải thay đổi nhiều hay ít Tuy vậy, tất cả các môi trường nuôi cấy bao giờ cũng có các thành phần chính gồm: muối khoáng, cacbon, vitamin, các chất điều khiển sinh trưởng, các nhóm chất bổ sung, chất độn [7]

Các nguyên tố khoáng đa lượng:

Là những nguyên tố muối khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30ppm, tức là trên 30mg/l, bao gồm các nguyên tố sau: N, P, S, K, Mg, Ca Các nguyên

tố này có chức năng tham gia vào quá trình trao đổi chất của tế bào và xây dựng lên thành tế bào

Các nguyên tố vi lượng

Các nguyên tố vi lượng được coi là cơ sở của sự sống bởi vì hầu hết các quá trình tổng hợp chuyển hóa các chất đều được thực hiện nhờ các enzyme mà trong thành phần của enzyme đều có các nguyên tố vi lượng Ngoài ra, các nguyên tố vi lượng còn có tác động sâu sắc đến quá trình quang hợp, hô hấp, hấp thụ nước…Tuy nhiên, nhu cầu muối khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu, rất ít các nguyên tố vi lượng được chứng minh là không thể thiếu được đối với sự phát triển của mô và tế bào Vì vậy, sự cung cấp các nguyên tố vi lượng và nồng độ của chúng trong các môi trường nuôi cấy hầu hết là dựa vào kinh nghiệm, trong các trường hợp cụ thể

Vitamin

Mặc dù các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả năng tự

tổng hợp được hầu hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng, do

đó phải bổ sung thêm từ bên ngoài, đặc biệt các vitamin thuộc nhóm B như: Vitamin B1, Vitamin B2, Vitamin B6 Myo-inositol cũng hay được sử dụng vì

nó có vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp thành tế bào

Các chất kích thích sinh trưởng

Các chất kích thích sinh trưởng có vai trò hết sức quan trọng đến kết quả

cũng như sự thành công của toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro Nó ảnh hưởng

trực tiếp tới sự phản biệt hóa, tái biệt hóa và sinh trưởng của tế bào, đặc biệt là

sự biệt hóa các cơ quan như chồi và rễ Nhu cầu về chất kích thích sinh trưởng đối với từng loài cây qua từng giai đoạn nuôi cấy là khác nhau Vì vậy, để nuôi

cấy in vitro thành công cần phải tiến hành các nghiên cứu cụ thể để tìm ra nồng

độ cũng như tỷ lệ các chất kích thích sinh trưởng phù hợp

Người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở thực vật đó

là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic Những chất này được phân thành các nhóm vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng sinh lý, tuy nhiên tùy thuộc vào đối tượng nghiên cứu mà chúng có những tác động chồng chéo

và hỗ trợ nhau Còn một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởng nhất định Trong nuôi cấy mô tế bào người ta thường sử dụng ba nhóm chất điều tiết sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin, giberelin [11], [13].Nhóm auxin là nhóm kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh lí học thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất Auxin là những hoocmon thực vật có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hóa cơ quan, kiểu tác động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hóa màng tế bào Nhóm auxin bao gồm các chất sau: 2,4 Diclorophenoxy axetic axit (2,4D), α- naphtylaxetic axit (NAA), Indotaxetic axit (IAA), trong đó 2,4D dễ gây độc

nhưng có tác dụng kích thích quá trình phânchia tế bào và thường được sử dụng nhiều nhất, NAA có tác dụng tạo rễ cho cây non [11], [13].

Nhóm cytokinin là nhóm chất hóa học có ảnh hưởng quyết định đến kích thích phân chia tế bào Đại diện cho nhóm cytokinin gồm: Kinetin; 6 – Benzyl amino purine (BAP); 6-Dimethylalylamnino purine(2iP); Zeatin Hiện nay một thế hệ mới của chất điều hòa sinh trưởng, chẳng hạn như thidiazuron (TDZ) – một cytokinin thuộc các phenylureas, đang nổi lên như là một thay thế thành công cho tái sinh trực tiếp với tần số cao của phôi vô tính [17], [26]

Nhóm giberelin là nhóm được phát hiện qua quá trình nghiên cứu bệnh nấm lúa von Nó tác động làm tế bào dãn ra và phân chia, làm cây lùn có thể cao lên được, như ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng Đại diện cho nhóm này là axit giberilic (GA3), được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp [11], [13]

Ethylen là nhóm có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của cây nhưng gần đây nó mới được coi là hoocmon thực vật Ethylen thường được

sử dụng để làm chín quả ở chuối, ra hoa đồng loạt ở dứa, nó cũng ảnh hưởng đến quá trình phân bào Đối với cà chua trong điều kiện ethylen nồng độ cao sẽ kéo dài khả năng ra rễ của thân [11], [13]

Axit absixic là hợp chất ức chế sinh trưởng thực vật tự nhiên ảnh hưởng đến tính ngủ nghỉ của hạt, mầm và rụng lá, tăng cường ra hoa cho một số cây ngắn ngày thông qua việc tổng hợp ARN và protein[11], [13]

Chất phụ gia

Nước dừa chứa hàm lượng dinh dưỡng cao, được sử dụng để cung cấp dinh dưỡng cho mẫu nuôi cấy mô tế bào thực vật Các chất có hoạt tính trong nước dừa hiện đã được chứng minh là myo-insitol và một số amino acid khác

Nước dừa được sử dụng để kích thích sự phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây Nước dừa thường được lấy từ quả để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản Ngoài nước dừa, chuối xanh, khoai tây và cà chua cũng là những chất tự nhiên giàu dinh dưỡng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật

Than hoạt tính cũng là một chất phụ gia có nhiều tác dụng tích cực trong nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu là tạo điều kiện tối cho môi trường nuôi cấy, có tác dụng hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vật như các hợp chất phenolic, dịch rỉ nâu sinh ra từ môi trường nuôi cấy Những chất này gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu Than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi có nó vì thế có sự kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ Ngoài ra, than hoạt tính cũng có thể hấp thụ các vitamin, cytokinin và auxin, làm thay đổi tỉ lệ thành phần các chất

có trong môi trường nuôi cấy cũng như pH môi trường

1.2.3 Các yếu tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Vật liệu nuôi cấy

Tất cả các mô chưa hóa gỗ đang sinh trưởng mạnh như: mô phân sinh ngọn, tượng tầng, đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non,… khi đặt vào môi trường

có chứa một lượng hoocmon thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo Tuy nhiên, mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo, phân hóa thành rễ, thân, cành, lá,… rất khác nhau Do đó việc chọn mẫu thực vật để sử dụng trong quá trình nuôi cấy có vai trò quyết định Các kết quả nghiên cứu cho thấy, để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, người ta chú trọng đến các chồi bên và mô phân sinh đỉnh [3]

Vô trùng trong nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy có chứa đường, muối khoáng và vitamin, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá

trình nuôi cấy đòi hỏi các yêu cầu sau: Vô trùng mô cấy, vô trùng dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy Trong thao tác cấy cần phải tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt môi trường nuôi cấy Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm, khuẩn Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mô cấy Ngoài ra, còn sử dụng các chất làm giảm sức căng bề mặt như: Tween 80, fotoflo, teepol vào dung dịch diệt nấm, khuẩn [5], [14]

Ánh sáng và nhiệt độ

Ánh sáng là nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả năng

nuôi cấy in vitro ở những cây có diệp lục tố Cường độ ánh sáng trên dàn nuôi

cấy phải là ánh sáng có phổ gần như ánh sáng tự nhiên (230 -780 nm) Nhiệt

độ của phòng nuôi cấy được duy trì từ 25 -28oC [5]

Môi trường nuôi cấy

Tất cả các môi trường nuôi cấy đều gồm năm thành phần chính sau: các muối khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, nguồn cacbon, các chất điều hòa sinh trưởng, chất độn Ngoài ra, người ta còn bổ sung thêm một số chất hữu cơ có thành phần xác định như acid amin, hoặc không xác định như: nước dừa, dịch chiết nấm men, vào trong môi trường tùy theo nhu cầu riêng của từng đối tượng nuôi cấy Trong những năm 60 nhiều môi trường nuôi cấy đã được xây dựng và được sử dụng cho đến ngày nay, đó là các môi trường: Môi trường

nghèo chất dinh dưỡng White, Knop (1953); Môi trường giàu chất dinh dưỡng Murashige - Skoog (1963) [23]; Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình Gamborg (1968) [8].

1.3 HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY

HỌ ĐẬU

Trong thực tế thì các cây họ Đậu nói chung và cây đậu Nho nhe nói riêng đều được sản xuất dễ dàng và hoàn toàn không có nhu cầu cần nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô Tuy nhiên, việc nghiên cứu chuyển gen ở các cây họ Đậu sẽ khó thực hiện và thành công nếu trước hết không tiến hành việc tái sinh cây Rudrabhatla Sairam và cs (2005) đã tổng hợp các kết quả nghiên cứu phát triển kỹ thuật tái sinh ở cây một lá mầm và cây hai lá mầm; sự tái

sinh cây được thực hiện bằng nuôi cấy in vitro từ phôi soma hoặc từ một bộ

phận khác độc lập trên cây và điều đó còn phụ thuộc vào kiểu gen của giống [32]

Các cây trồng họ Đậu đều thuộc lớp 2 lá mầm,việc xây dựng hệ thống tái

sinh in vitro đã được nghiên cứu và khẳng định Một số nghiên cứu hệ thống tái sinh ở một loài cây thuộc chi Vigna đã thu được kết quả khả quan Kết quả tạo phôi soma từ tế bào nuôi cấy huyền phù ở cây đậu đũa (Vigna unguiculata)

được thực hiện bởi Ramakrishnan và cs (2005) [29] và cũng bằng phương pháp

này Prem và cs (2001) đã thu tần số tái sinh in vitro cao [27] Nghiên cứu khả năng tái sinh của 27 giống Đậu thuộc chi Vigna có nguồn gốc từ Phillipine,

Madagascar, Pakistan, India, Australia, China, Japan Renato và cs (2001) đã cho thấy kỹ thuật tái sinh cây từ nách lá mầm của hạt nảy mầm 4 ngày tuổi đạt hiệu quả tái sinh 80% - 100% và tái sinh chồi trực tiếp từ mắt lá mầm như là

chỉ thị cho hệ gen của loài đậu Vigna châu Á (subgenus Ceratotropis) [30], [31] Tái sinh từ nách lá mầm của cây (Vigna unguiculata (L.) Walp.) có tỷ lệ

tái sinh là 100% Jayanti Sen và Spra Guha Mukherjee (1998) đã công bố kết quả nghiên cứu tái sinh cây ở đậu xanh từ phôi soma và từ nách lá mầm phục

vụ chuyển gen [21], Ignacimuthu và Franklin (1999) [19], Renato và cs (1999, 2001) [30], [31], Mai Trường và cs (2001) [12], Sita và cs (2006) [37], Kaviraj

và cs (2006) [22] Năm 2007, Sonia và cs đã thu được kết quả chuyển gen mã hóa protein ức chế enzyme α-amylase vào cây đậu xanh thông qua lây nhiễm

bằng Agrobacterium được thực hiện nhờ tái sinh đa chồi từ nách lá mầm [38] Đánh giá hiệu quả chuyển gen ở cây Vigna mungo khi sử dụng kỹ thuật cấy in vitro từ nách lá mầm của Muruganantham và của Amutha và cs (2006) cũng đã

khẳng định hiệu quả của phương pháp này [24] Bhadra và cs (1991) đã nghiên cứu tái sinh đa chồi thành công trên cây đậu Nho nhe Các chồi được tạo ra từ nách lá mầm của hạt đậu Nho nhe nảy mầm trên môi trường MS cơ bản, bổ sung muối B5, NAA (0,1-0,5mg/l), BAP (0,5mg/l), kinetine (0,5mg/l) và zeatin (0,5-1mg/l), môi trường kéo dài chồi được bổ sung IBA (0,005mg/l) và BAP (0,2mg/l), Cây ra rễ trên môi trường MS cơ bản [15] Tuy nhiên cho đến nay

có rất ít công trình nghiên cứu tối ưu tái sinh đa chồi ở đậu Nho nhe

Sự tái sinh in vitro ở cây đậu tương được tạo đa chồi từ nách lá mầm đã

được nghiên cứu, tuy nhiên đậu tương là đối tượng thực vật rất khó thực hiện

nuôi cấy in vitro từ khâu khử trùng, tạo mô sẹo, tái sinh cây, tạo rễ và ra cây

[3] Những năm gần đây, kết quả tái sinh đa chồi từ nách lá mầm của đậu tương được công bố bởi Nguyễn Thị Thúy Hường (2011), Nguyễn Thu Hiền (2014), Lò Thị Mai Thu (2014), Lò Thành Sơn (2015) [2], [4], [6], [10] Các tác giả đã làm nghiên cứu được các chồi được tạo ra từ nách lá mầm hạt đậu tương nảy mầm đã gây tổn thương trên môi trường MS bổ sung BAP 2mg/l, các chồi được kéo dài trong môi trường có bổ sung GA3 0,5mg/l + IAA 0,1mg/l, ra rễ trên môi trường bổ sung IBA 0,1mg/l và ra cây trong bầu ở điều kiện nhà lưới

Việc chuyển gen để tạo nên những dòng cây chuyển gen có đặc tính sinh học ưu việt hơn giống gốc là cần thiết tuy nhiên tỷ lệ thành công của chuyển

gen vào cây trồng phụ thuộc rất nhiều vào hệ thống nuôi cấy và tái sinh in vitro sau chuyển gen Tái sinh cây in vitro với hiệu suất cao được xem là mấu

chốt quyết định đến sự thành công trong quy trình tạo cây chuyển gen [36]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

2.1.1 Vật liệu thực vật

Hạt đậu Nho nhe thu tại huyện Lục Yên, Tỉnh Yên Bái có hạt nhỏ, nhiều màu khác nhau như xanh, vàng nâu, nâu đen Hạt đậu Nho nhe không bị mọt, nấm mốc được khử trùng, cho nảy mầm trong ống nghiệm để thu nguyên liệu

phục vụ nghiên cứu tái sinh in vitro

12 giờ/ ngày với cường độ chiếu sáng là 2000lux

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Thời gian nghiên cứu từ tháng 5/2018 đến tháng 4/2019

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các bước nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ thí nghiệm tổng quát trình bày ở hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

2.2.1 Phương pháp khử trùng hạt, tạo cây con nuôi cấy in vitro

Mẫu nuôi cấy là hạt đậu Nho nhe trưởng thành có thể nhiễm nấm mốc và

vi khuẩn vì vậy cần phải khử trùng để loại bỏ

Chọn khoảng 100-150 hạt đậu Nho nhe: hạt mẩy, vỏ bóng mịn, rốn hạt rõ, hạt có màu vàng nâu Tiến hành khử trùng trong box cấy Hạt đậu Nho nhe được chọn tráng qua nước cất vô trùng 2-3 lần sau đó khử trùng bề mặt bằng cách lắc nhẹ trong cồn 70 độ với thời gian 1 phút, sau đó tráng lại bằng nước cất khử trùng 3 lần Thêm dung dịch Javen, lắc đều trong 20-25 phút, sau đó rửa bằng nước cất khử trùng 3 đến 4 lần Thí nghiệm với các nồng độ Javen và thời gian khác nhau như sau để tìm kết quả tốt nhất:

Javen 50%, trong thời gian 15 phút, 20 phút, 25 phút;

Javen 60%, trong thời gian 15 phút, 20 phút, 25 phút;

Javen 70%, trong thời gian 15 phút, 20 phút, 25 phút;

Môi trường hạt nảy mầm: Hạt sau khi khử trùng được thấm khô bằng giấy thấm khử trùng và cấy vào bình tam giác chứa môi trường nảy mầm GM bảng 2.1 có bổ sung agar 9g/l, sucrose 30g/l Nuôi bình hạt trong phòng nuôi cấy có ánh sáng 2000 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày Ngày tuổi của hạt nảy mầm được tính kể từ khi gieo hạt Khảo sát khả năng nảy mầm hạt sau 7 ngày, theo dõi tỷ lệ nảy mầm của hạt

2.2.2 Tái sinh chồi đậu Nho nhe thông qua mô sẹo

Hạt đậu Nho nhe sau khi gieo nảy mầm (6-7 ngày tuổi), lựa chọn các cây con có lá thật, kích thước 3-4 cm, tiến hành dùng kéo thu lá, cắt bỏ viền lá và gân chính Sau đó cắt thành những mảnh lá có kích thước khoảng 0,5 x 1cm đặt vào môi trường cảm ứng mô sẹo gồm: MS, sucrose 30g/l, agar 9g/l, pH=5,8, 2,4-D (0-4mg/l) Cấy mật độ 6 mẫu/ bình môi trường loại 250ml

Mẫu được chia thành hai lô, ở lô thứ nhất, mẫu nuôi cấy dưới ánh sáng đèn neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày Ở lô thứ hai, mẫu được nuôi cấy 7 ngày trong tối, sau đó được đưa ra nuôi cấy 2 tuần dưới điều kiện phòng nuôi cấy (ánh sáng 2000 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày ) Xác định tỷ lệ mẫu tạo

mô sẹo, đánh giá chất lượng mô sẹo trên các công thức thí nghiệm Công thức đối chứng sử dụng môi trường MS, sucrose 30g/l, agar 9g/l, không bổ sung các chất kích thích sinh trưởng

Đánh giá tỷ lệ tạo mô sẹo thu được sau 3 tuần nuôi cấy theo công thức:

Rc = 𝑁𝑟𝑁𝑠𝑣(%) Trong đó

Rc: Tỷ lệ tái sinh chồi (%);

Nr: Tổng số mô tái sinh chồi;

Nsv: Tổng số mô nuôi cấy;

2.2.3 Tái sinh đa chồi đậu Nho nhe thông qua nách lá mầm và chồi ngọn

(1) Nách lá mầm:

Hạt đậu Nho nhe sau khi gieo nảy mầm (3-4 ngày tuổi) thì tiến hành dùng dao cắt bỏ phần thân và rễ mầm, vết cắt dưới mắt lá mầm khoảng 2-3mm Tách đôi 2 lá mầm thành 2 mẫu cấy riêng biệt sao cho phần thân mầm còn lại được chia đều cho 2 lá mầm Cắt ngang bỏ phần đuôi lá mầm, tiếp đến hủy bỏ chồi chính và gây tổn thương nách lá mầm bằng cách dùng mũi dao nhọn chích nhẹ 5-7 lần vào cùng nách lá mầm Như vậy, từ một hạt giống nảy mầm cho ra 2

mẫu cấy Sau đó các mẫu cấy được cấy úp nghiêng 45 độ trên môi trường cảm ứng chồi SIM bảng 2.1 Cấy với mật độ 6 mẫu/ bình môi trường loại 250ml, nuôi cấy trong 8 tuần

(2) Chồi ngọn:

Hạt đậu Nho nhe sau khi gieo nảy mầm (5-6 ngày tuổi), tiến hành dùng kéo cắt lấy đoạn ngọn (3-4cm) ra khỏi bình, tiếp đó cắt lấy phần chồi ngọn (0,5-1cm), cắt bỏ lá giữ lại phần cuống lá và chồi ngọn Sau đó các mẫu cấy được cấy vào môi trường cảm ứng chồi SIM bảng 2.1 Cấy với mật độ 6 mẫu/ bình môi trường loại 250ml, nuôi cấy trong 8 tuần

Đánh giá tỷ lệ tạo đa chồi trên từng vật liệu nghiên cứu (nách lá mầm, chồi ngọn) sau 8 tuần theo công thức:

Ci (%) = 𝑁𝑐𝑝

𝑁𝑡 x 100%

Trong đó:

Ci: Tỷ lệ tái sinh chồi ;

Ncp: Tổng số mẫu tái sinh chồi ;

Nt: Tổng số mẫu nuôi cấy ;

2.2.4 Môi trường ra rễ

Khi chồi đạt chiều cao từ 4-5cm, chuyển sang môi trường ra rễ RM bảng 2.2 để tạo cây hoàn chỉnh Mỗi bình cấy từ 3-4 mẫu Đánh giá khả năng hình thành và phát triển rễ của cây tái sinh sau 8 tuần

Bảng 2.1 Thành phần các loại môi trường nuôi cấy dùng cho hệ thống tái sinh cây đậu Nho nhe

Loại môi trường Ký

Cảm ứng nảy mầm GM MS*; sucrose 30g/l; agar 9g/l; pH = 5,8

Cảm ứng tạo đa chồi SIM

MS*; BAP (0,5, 1, 1,5, 2mg/l); sucrose

30g/l; agar 9g/l; nước dừa 10%; pH = 5,8

MS*; Kinetine (0,5, 1, 1,5, 2mg/l); sucrose 30g/l; agar 9g/l; pH = 5,8

Cảm ứng ra rễ RM MS*; IBA (0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5mg/l);

sucrose 30g/l; agar 9g/l; pH = 5,8

Chú thích: MS*: Môi trường cơ bản của Murashige và Skoog, 1962 [23]

Các khâu nuôi cấy từ tạo cảm ứng đa chồi đến khi ra rễ được tiến hành ở nhiệt độ dao động trong khoảng 25oC ± 2oC, dưới ánh sáng đèn của phòng cây với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày

2.2.5 Ra cây và chế độ chăm sóc

Các bình nuôi cấy chứa cây tái sinh hoàn chỉnh được chuyển ra khỏi phòng nuôi cấy để trong phòng có ánh sáng và nhiệt độ bình thường 2-3 ngày để cây thích nghi Sau đó mở nút bông, cho nước vào ngâm, lắc nhẹ cho thạch rời khỏi

rễ cây Dùng panh kẹp nhẹ kéo cây ra khỏi bình tam giác, rửa hết thạch bám quanh rễ bằng nước sạch sau đó trồng trên các loại giá thể khác nhau bảng 2.2 Pha loãng dung dịch MS cơ bản 10 lần tưới nhẹ vào gốc, cứ 5 tiếng tưới 1 lần

Sử dụng mái che chắn cho cây khỏi các tác động trực tiếp từ môi trường tự nhiên (nắng, mưa, gió…) Sau khi cây sống ra rễ và lá mới, có thể đưa ra ngoài vườn ươm

Bảng 2.2 Giá thể nuôi cây

2.2.6 Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu

Sử dụng bộ phần mềm SPSS để phân tích các trị số thống kê như trung bình mẫu, sai số và so sánh sự khác nhau giữa các trị số trung bình ở mức ý nghĩa

α = 0,05

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 KẾT QUẢ KHỬ TRÙNG HẠT ĐẬU NHO NHE

Vô trùng mẫu cấy là bước đầu tiên đóng vai trò quyết định sự thành công

của việc xây dựng hệ thống tái sinh in vitro Vì vậy, cần lựa chọn phương pháp

khử trùng và loại hóa chất thích hợp để loại bỏ hoàn toàn các nguồn vi khuẩn, nấm mốc, virus khỏi mẫu trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy Có rất nhiều loại hóa chất được sử dụng để khử trùng Tuy nhiên, nồng độ khử trùng thích hợp cho các đối tượng khác nhau là hoàn toàn khác nhau

Hạt đậu Nho nhe là loại hạt nhỏ, giàu chất dinh dưỡng điều kiện lý tưởng cho các loại vi sinh vật, nấm mốc phát triển Vì vậy, việc nghiên cứu đưa ra công thức khử trùng tối ưu là rất cần thiết để chuẩn bị mẫu cho quá trình nuôi

cấy in vitro tiếp theo Phương pháp khử trùng thích hợp phải đảm bảo được các

yêu cầu, tỷ lệ hạt bị nhiễm thấp, thân mầm to, mập và chồi sinh trưởng phát triển tốt

Chúng tôi đã tiến hành vô trùng sơ bộ hạt đậu Nho nhe bằng cách lắc nhẹ hạt trong cồn 700 1 phút và javen ở các nồng độ 50%, 60%, 70% với ngưỡng thời gian khác nhau 15, 20, 25 phút Sau khi khử trùng, hạt được cấy vào môi trường MS có bổ sung sucrose 30 g/l và agar 9 g/l Ðánh giá khả năng thu được mẫu sạch và khả năng nảy mầm của hạt là bước tiếp theo để tìm ra công thức khử trùng tốt nhất

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, đối với công thức khử trùng 1, sử dụng dung dịch Javen pha loãng 50% cho thấy tỷ lệ mẫu nhiễm rất cao, tỷ lệ nảy mầm thấp Cụ thể với thời gian khử trùng là 15, 20, 25 phút tỷ lệ mẫu nhiễm lần lượt

là 30%, 23%, 17%, tỷ lệ nảy mầm lần lượt 70%, 77%, 82% Nếu tăng thời gian khử trùng tỷ lệ mẫu nhiễm có thể sẽ giảm nhưng tỷ lệ mẫu nhiễm độc sẽ tăng ảnh hưởng tới khả năng nảy mầm của hạt cũng như chất lượng chồi

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ Javen và thời gian khử trùng đến sự nảy

mầm của hạt đậu Nho nhe sau 7 ngày nuôi cấy

CT Javen

(%)

Thời gian khử trùng (phút)

Số mẫu (hạt)

Kết quả Mẫu

nhiễm (%)

Mẫu chết (%)

Mẫu sạch (%)

Nảy mầm (%)

chết lần lượt là 15%, 24%, 35% mặc dù tỷ lệ mẫu sạch ở thời gian 20, 25 phút

là 100% Như vậy, đây chưa phải nồng độ thích hợp để khử trùng hạt

Ở công thức khử trùng 2, với dung dịch javen pha loãng 60% tỷ lệ mẫu nhiễm giảm đáng kể đồng thời tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ hạt nảy mầm tăng cao Ở thời gian khử trùng là 15 phút thì tỷ mẫu nhiễm là 8%, thời gian 20, 25 phút thì

tỷ lệ mẫu sạch nảy mầm rất cao lần lượt là 98%, 90% tuy nhiên mẫu chết lại xuất hiện ở thời gian khử trùng 25 phút với tỷ lệ 9% Như vậy, từ số liệu trên cho thấy công thức khử trùng thích hợp nhất là javen 60% với thời gian khử trùng là 20 phút

Kết quả nghiên cứu cho thấy, javen nồng độ 60% với thời gian 20 phút là điều kiện thích hợp nhất cho khử trùng hạt đậu Nho nhe, tỷ lệ mẫu sạch 100%, khả năng hạt bị chết thấp đảm bảo tỷ lệ nảy mầm cao 98% và chất lượng chồi tốt Trong thực tế hạt đậu là đối tượng khó khử trùng, nếu khử trùng bằng Javen

ở nồng độ quá cao và thời gian quá dài thì tỷ lệ hạt bị tổn thương, bị chết cao, hạt nảy mầm kém và không đồng đều Ngược lại, nếu nồng độ Javen thấp thì không đủ liều lượng để làm sạch cũng như diệt các vi sinh vật, nấm mốc nên tỷ

lệ nhiễm sau khi cấy cao

Hình 3.1 Hạt đậu Nho nhe nảy mầm trên môi trường GM

3.2 TÁI SINH IN VITRO CÂY ĐẬU NHO NHE

3.2.1 Tái sinh chồi đậu Nho nhe từ mô sẹo

Sử dụng mảnh lá cho thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo Lá đậu Nho nhe 6 ngày tuổi được cắt thành các mảnh nhỏ có kích thước khoảng 0,5 x 1cm, cấy trên môi trường cảm ứng tạo mô sẹo gồm: MS, sucrose 30g/l, agar 9g/l; pH= 5,8, 2,4-D (0-4mg/l), mẫu được chia thành 2 lô thí nghiệm Ở lô thứ nhất, mẫu nuôi cấy dưới ánh sáng đèn neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, nhiệt độ

25 ± 2oC Ở lô thứ hai, mẫu được nuôi cấy 7 ngày trong tối, sau đó được đưa ra nuôi cấy 2 tuần dưới điều kiện phòng nuôi cấy (ánh sáng 2000 lux, nhiệt độ 25

± 2oC, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày)

Sau 3 tuần nuôi cấy, ở lô thứ 2 với 2,4-D nồng độ từ 0,5-3,5mg/l tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo là rất cao 95-100%, hầu hết tất cả các mẫu lá đều tạo mô sẹo tuy nhiên tính chất mô sẹo có sự khác nhau ở các nồng độ Cụ thể ở nồng độ 0,5mg/l; 1,5mg/l các mô sẹo đều màu trắng, đặc và có nhiều rễ không thích hợp cho quá trình tái sinh Ở các nồng độ 2,0-3,5mg/l tỷ lệ tạo mô sẹo giảm dần song tính chất mô sẹo đều không thích hợp cho quá trình tái sinh Ở công thức đối chứng và 2,4-D nồng độ 4mg/l không tạo mô sẹo

Xét đồng thời các chỉ tiêu cho thấy 2,4-D nồng độ 1,0mg/l là công thức thích hợp nhất cho quá trình tạo mô sẹo từ mảnh lá ở cây đậu Nho nhe

Trong đó, ở lô thứ nhất các mẫu nuôi cấy đặt trong điều kiện phòng nuôi cấy ánh sáng đèn neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC không tạo mô sẹo, các mẫu cấy khô dần và chết