VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAMVIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÊ THỊ THỦY NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS GÂY BỆNH CÚM A/H7N9 BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIỂU HIỆN TẠM THỜI TR
Trang 1VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LÊ THỊ THỦY
NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP
CỦA VIRUS GÂY BỆNH CÚM A/H7N9 BẰNG PHƯƠNG PHÁP
BIỂU HIỆN TẠM THỜI TRONG CÂY THUỐC LÁ
(Nicotiana benthamiana) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens
Chuyên ngành: Sinh lý thực vật
LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC
Hà Nội, 2019
Trang 2Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Người hướng dẫn khoa học:
1.PGS.TS Phạm Bích Ngọc
2 PGS.TS Chu Hoàng Hà Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án Tiến sĩ phiên chính thức họp tại:
Viện Công nghệ sinh học
Vào hồi giờ ngày tháng năm 2019
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc Gia Việt Nam
- Trang web: http: luanvan.moet.gov.vn
- Viện Công nghệ sinh học
Trang 3MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của đề tài
Cúm A/H7N9 là chủng virus cúm gia cầm mới được phát hiện tại Trung Quốc vào năm
2013 Virus cúm A/H7N9 gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh với tỷ lệgây chết cao trong đàn gia cầm bị bệnh Virus cúm A/H7N9 là một phân type trong nhóm viruscúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, có protein Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) trên
bề mặt capsid của hạt virus mang tính kháng nguyên tham gia quá trình đáp ứng miễn dịch Khángnguyên HA có 16 type (ký hiệu từ H1 đến H16) và kháng nguyên NA có 9 type (ký hiệu từ N1 đếnN9) Kháng nguyên HA được mã hóa bởi phân đoạn 4 của hệ gen virus cúm A, có đặc tính kết hợpvới thụ thể đặc hiệu trên bề mặt màng của tế bào nhiễm HA có khả năng đột biến trong gen tạo nên
sự khác biệt làm thay đổi tính kháng nguyên, đặc biệt là điểm cắt của enzym protease ở vị trí có sựglycosyl hóa đã được xác định bao gồm Asn30, Asn46, Asn249 trên tiểu phần HA1 và Asn421,Asn493 trên tiểu phần HA2 Cả 5 vị trí này đều có tính bảo thủ cao trên kháng nguyên H7 của cácchủng virus H7N9 gây bệnh trên người và gia cầm chuỗi nối giữa HA1 và HA), hoặc tái tổ hợpbiến chủng làm thay đổi kháng nguyên bề mặt dẫn đến sự thay đổi tương quan đáp ứng miễn dịch.Kháng nguyên NA do phân đoạn 6 mã hóa, đây là một protein bề mặt làm nhiệm vụ enzym phângiải thụ thể tế bào và cắt liên kết glycosid của phân tử acid sialic (N-acetylneuramic acid) giảiphóng virus trong quá trình lây nhiễm Kháng nguyên NA do phân đoạn 6 mã hóa, đây là mộtprotein bề mặt làm nhiệm vụ enzym phân giải thụ thể tế bào và cắt liên kết glycosid của phân tửacid sialic (N-acetylneuramic acid) giải phóng virus trong quá trình lây nhiễm
Trong đợt dịch cúm đầu tiên từ ngày 31/03/2013 có ba trường hợp nhiễm virus cúm gia cầmA/H7N9 trên người được phát hiện và công bố tại Thượng Hải và An Huy, Trung Quốc Chỉtrong một thời gian ngắn, tính đến ngày 09/06/2013 loại virus nguy hiểm này đã lây lan ra 11 tỉnhthành của Trung Quốc, gây ra 131 trường hợp nhiễm bệnh, đa phần bị suy hô hấp nặng, trong đó
39 người đã tử vong (WHO, 2013) Trong đợt dịch cúm A/H7N9 thứ 5 trên người tại Trung Quốcdiễn ra từ 19/1/2017 đến 14/2/2017 đã khiến 36 người chết trên tổng số 304 người mắc bệnh(WHO, 2017) Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) nhận định đây là một tỷ lệ cao bất thường cho một
sự lây nhiễm mới và xác định H7N9 là chủng virus rất nguy hiểm đối với con người
Các nghiên cứu về hệ gen, xác định các vùng biến đổi của virus cúm A/H7N9 đã cho thấy virus A/H7N9 tỏ ra thích ứng nhanh hơn và có độc lực cao hơn với tế bào của loài có vú (người, heo, ) so vớicác chủng virus cúm gia cầm khác Cho đến nay chưa có bằng chứng nào về việc virus cúm A/H7N9 lâytruyền từ người sang người - yếu tố cơ bản để A/H7N9 có thể biến chuyển thành một đại dịch cúm Tuynhiên, vì sự lan truyền giữa người và người đã từng xảy ra với virus H7 (dịch H7N7 ở Hà Lan năm 2003)nên cũng cần phải cảnh giác về khả năng lây truyền người-người của virus H7N9 hiện nay
Ở Việt Nam chưa ghi nhận trường hợp cúm A/H7N9 trên người cũng như trên gia cầm; tuynhiên, nguy cơ xâm nhập, lan truyền và gây bùng phát dịch rất cao do Việt Nam có đường biêngiới trải dài với Trung Quốc Vấn đề cấp bách hiện nay ngoài việc triển khai các biện pháp phòngbệnh chủ động như sử dụng trang thiết bị cho việc giám sát như máy đo thân nhiệt từ xa, các hệthống xét nghiệm xác định virus… cần thiết nghiên cứu chủ động sản xuất vacxin phòng bệnh.Trong những năm gần đây một hướng mới đã được ứng dụng để phát triển các loại vacxin cúmkhác nhau, trong đó có hướng nghiên cứu tạo vacxin thực vật Hệ thống biểu hiện ở thực vật rất hữudụng vì vacxin được tạo ra hứa hẹn sẽ có giá thành thấp hơn từ 10-20 lần so với phương pháp truyềnthống Tuy nhiên, protein tái tổ hợp được tích luỹ trong cây trồng chuyển gen lại không cao và thiếumột phương thức tinh sạch protein tái tổ hợp hiệu quả Để khắc phục nhược điểm này, hiện nay hệthống biểu hiện tạm thời là phương pháp hữu ích để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp ở thực vật Phươngpháp này có ưu điểm nhanh, hàm lượng protein tái tổ hợp cao, không bị ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen đíchtrong tế bào thực vật và có thể tiến hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàn toàn như lá
Nhận thấy việc nghiên cứu biểu hiện các kháng nguyên của virus cúm A/H7N9 trong tế bào thựcvật là rất cấp thiết Hơn nữa mô hình sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp bằng phương pháp biểu hiệntạm thời ở thực vật có thể sản xuất vacxin với số lượng lớn và nhanh chóng (1-2 tháng) đáp ứng kịp
Trang 4thời khi dịch bệnh xảy ra Việc kết hợp kháng nguyên tái tổ hợp với vật liệu nano (ND) nhằm sản xuấtvacxin dạng như virus nhằm tăng cường hoạt tính kháng nguyên Với cơ sở khoa học và ứng dụng nhưtrên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “ Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/
H7N9 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá (Nicotiana benthamiana.) thông qua vi khuẩn Agrobacterium”.
2 Mục tiêu nghiên cứu
Biểu hiện và xác định được đặc điểm cấu trúc của kháng nguyên HA trimeric và phức hệkháng nguyên HA trimeric:ND
Đánh giá được hoạt tính sinh học, khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch trên động vật thínghiệm của kháng nguyên tái tổ hợp HA trimeric và phức hệ HA trimeric:ND
3 Nội dung nghiên cứu
(1):Thu thập thông tin, tổng hợp gen mã hóa kháng nguyên và thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên HA; (2) :Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên HA của virus H7N9 ở thuốc lá ;(3): Nghiên cứu tạo phức hệ và khả năng gây ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên HA và HA trimeric:ND (1:12); (4): Nghiên cứu khả năng kích thích đáp ứng miễn
dịch của kháng nguyên HA và phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND trên động vật thí nghiệm
4 Đóng góp mới của luận án
- Đã thiết kế thành công 4 cấu trúc vector biểu hiện pCB301/HA mono_ELP pCB301/HAtrimeric_ELP, pCB301/HA trimeric và pCB301/HA trimeric-IgMFc mang gen HA được tổng hợp
nhân tạo từ gen HA của chủng virus cúm H7N9 và tạo chủng Agrobacterium mang vector tương ứng
- Biểu hiện và tinh sạch thành công protein HA tái tổ hợp pCB301/HA mono_ELP,
pCB301/HA trimeric_ELP, pCB301/HA trimeric và pCB301/HA trimeric-IgMFc trong cây thuốc
lá bằng phương pháp mITC và IMAC
- Đã xác định được cấu trúc trimeric của kháng nguyên HA và khả năng gây ngưng kết hồngcầu của protein HA với hiệu giá ngưng kết của HA trimeric_ELP và HA trimeric bằng 2 HAU,
HA trimeric:ND (1:12) bằng 1024 HAU với lượng 5 µg tại giếng đầu tiên
- Các kháng nguyên HA dạng HA trimeric và HAtrimeric:ND (1:12) đều gây đáp ứng miễn dịch
ở chuột trong đó HA trimeric:ND (1:12) kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh hơn HA trimeric
5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
5.1 Ý nghĩa khoa học
Luận án cung cấp cơ sở khoa học quan trọng trong việc thiết kế các cấu trúc vector chuyển genmang gen HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric-IgMFc mã hóa cho cáckháng nguyên HA tái tổ hợp; biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp trên cây thuốc lá bằng phương pháp
biểu hiện tạm thời; tách chiết, tinh sạch và đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể của
các kháng nguyên tái tổ hợp này trên động vật thí nghiệm Kết quả đề tài luận án là bằng chứng khoahọc về tiềm năng của việc sản xuất, phát triển vacxin tiểu đơn vị phòng virus cúm trong thực vật
5.2 Ý nghĩa thực tiễn
Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen HA mã hóa các kháng nguyên tái tổ hợp
HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric-IgMFc của chủng virus cúm
đang lưu hành tai Trung Quốc và các chủng A tumefaciens mang các vector này có thể được sử
dụng để nghiên cứu biểu hiện, sản xuất và phát triển vacxin tiểu đơn vị phòng virus cúm
Quy trình biểu hiện gen HA trên lá cây thuốc lá bằng phương pháp biểu hiện tạm thời với cácđiều kiện tối ưu của đề tài luận án có thể ứng dụng để sản xuất các kháng nguyên tái tổ hợp HAmono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric-IgMFc hoặc các protein tái tổ hợp khác.Kháng nguyên tái tổ hợp HA trimeric : ND được tạo ra trong đề tài luận án là ứng viên tiềmnăng cho sản xuất vacxin tiểu đơn vị phòng bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam
CHƯƠNG 1
Trang 5TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận án đã tham khảo và tổng kết 19 tài liệu trong nước, 140 tài liệu nước ngoài với các nội dung liênquan bao gồm: (1) Đặc điểm cấu trúc của virus cúm A/ H7N9 như: nguồn gốc virus cúm A/H7N9, đặcđiểm cấu trúc virus cúm A/H7N9, đa hợp tạo nên phân type A/H7N9, đặc điểm kháng nguyên bề mặt củavirus cúm A/H7N9, tình hình dịch cúm A/H7N9; (2) Vacxin phòng chống bệnh cúm A như: Một số loạivacxin phòng bệnh cúm A hiện nay, vacxin tái tổ hợp từ thực vật, các nghiên cứu về vacxin cúm A/H7N9trên thế giới, một số nghiên cứu vacxin cúm gia cầm ở Việt Nam hiện nay; (3) Biểu hiện tạm thời proteintái tổ hợp ở thực vật như: Hệ thống biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vât, quá trình biểu hiện tạm
thời thông qua Agrobacterium tumefaciens, các chiến lược tăng cường biểu hiện protein tái tổ hơp ở thực
vật, sản xuất protein tái tổ hợp bằng phương pháp biểu hiện tạm thời, tinh sạch protein tái tổ hợp ở thực vật;(4) Nano kim cương (NDs) và những ứng dụng tiềm năng trong công nghệ sinh học như: giới thiệu chung
về vật liệu nano kim cương, Ứng dụng của Nanodiamons trong khoa học sự sống và công nghệ sinh học.Với các tài liệu thu thập được cũng như kết quả phân tích cho thấy chủng virus cúm H7N9trước đây đã từng xuất hiện nhưng chỉ gây ra dịch bệnh trên chim tại Hà Lan, Nhật Bản và Hoa
Kỳ Ba trường hợp nhiễm virus cúm gia cầm A/H7N9 đầu tiên trên người được phát hiện và công
bố tại Thượng Hải và An Huy, Trung Quốc vào ngày 31/03/2013 (WHO, 2013) Đặc biệt, sựbùng phát dịch cúm H7N9 trên người gần đây nhất được ghi nhận tại Trung Quốc diễn ra từ19/1/2017 đến 14/2/2017 được xem là đợt dịch thứ 5 đã khiến 36 người chết trên tổng số 304người mắc bệnh (WHO, 2017) Dữ liệu theo dõi về mặt virus học đã phân tích trình tự genomecủa 83 chủng phân lập từ môi trường (2 trường hợp) và người bệnh (81 trường hợp) cho thấy cácchủng gây bệnh trên người vẫn tương tự những chủng đã được phân tích năm 2013
Phân tích hiện đang được tiến hành để xác định xem các virus vacxin hiện có liên quan khángnguyên với virus ở đợt dịch thứ năm hay không Theo Tổ chức Y tế thế giới không loại trừ khả năngcúm gia cầm A/H7N9 lây từ người sang người trong những ổ dịch mới đây tại Trung Quốc Mặc dù,cho đến nay chưa có bằng chứng nào về việc virus cúm A/H7N9 lây truyền từ người sang người - yếu
tố cơ bản để H7N9 có thể biến chuyển thành một đại dịch cúm Tuy nhiên, vì sự lan truyền giữa người
và người đã từng xảy ra với virus H7 (dịch H7N7 ở Hà Lan năm 2003) nên cũng cần phải cảnh giác vềkhả năng lây truyền người-người của virus H7N9 hiện nay Điều này gây ra nhiều khó khắn cho việcnghiên cứu sản xuất vacxin phòng chống virus cúm A Các vacxin được sản xuất từ các chủng virusdòng châu Âu và dòng Bắc Mỹ dưới hai dạng chủ yếu là vaccine sống – nhược độc và vacxin vô hoạt.Vacxin vô hoạt thường an toàn, có khả năng phòng ngừa các triệu chứng lâm sang nhưng hiệu quả bảo
hộ không cao Vacxin nhược độc tạo ra miễn dịch nhược độc tốt hơn với các chủng tương đồng nhưngmức bảo hộ có thể giảm dần do giảm mức tương đồng với các chủng mới, có nguy cơ phát triển độctính trở lại, bản thân của virus vacxin sau nhiều lần truyền nhiễm có thể đột biết trở thành cường độc
Để nâng cao hiệu quả phòng chống virus cúm A, việc nghiên cứu sản xuất các loại vacxin thế hệmới có sự bảo hộ cao với các biến chủng mới hiện nay là rất cần thiết Vacxin tiểu đơn vị được sản xuấttrong thực vật phòng chống virus cúm là hướng nghiên cứu mới đã được đánh giá là có triển vọng và
ưu điểm như ổn định và bền vững, đảm bảo hoạt tính sinh học, dễ dàng sản xuất với khối lượng lớn, chiphí sản xuất thấp Protein HA là những protein kháng nguyên mang gen của chủng virus H7N9 đượclựa chọn là những ứng viên có tiềm năng để sản xuất vacxin tiểu đơn vị phòng chống virus cúm A.Hiện này có rất nhiều hệ thống biểu hiện protein HA của virus cúm đã được thử nghiệm, trong những
hệ thống đó chúng tôi đã sử dụng hệ thống biểu hiện gen tạm thời ở thực vật bằng phương pháp biểu
hiện tạm thời nhờ Agrobacterrium là phương pháp để sản xuất kháng nguyên có nhiều ưu điểm đã
được chứng minh như: Hàm lượng kháng nguyên cao, thời gian biểu hiện nhanh, không bị ảnh hưởngcủa vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có thể tiến hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàntoàn như mô lá Với sự hiểu rõ về cấu trúc phân tử hệ gen và tính kháng nguyên của virus cúm A gâybệnh trên gia cầm và các thành tựu đạt được về biểu hiện, sản xuất vacxin tiểu đơn vị trong thực vậtphòng chống bệnh cúm là căn cứ để chúng tôi thực hiện đề tài luận án này
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Trang 62.1 VẬT LIỆU
2.1.1 Chủng vi khuẩn
Chủng Escherichia coli DH5α; Chủng A tumefaciens C58C1; Chủng A tumefaciens
C58C1 mang vector pIBT-35S-HC-Pro PVY chứa gen mã hóa protein HcPro PVY
2.1.2 Các vector và vật liệu thực vật, động vật
Vector pUC/HA mang gen mã hóa cho kháng nguyên nhân tạo được tổng hợp bởi công ty SGIDNAcủa Thụy Điển; Vector tách dòng pBT (Phan và cs., 2005); Vector pRTRA35S-HA-histag-cmyc-100xELP-KDEL và vector pRTRA-35S-H5pII-histag-cmyc-ELP-KDEL và VectorpRTRA_35S_SP_His_ H5_pII_IgMFc _cmyc_KDEL đã được thiết kế (Phan và cs., 2013); Cácvector chuyển gen pCB301-Kan (dựa vào pCB301 của Xiang và cs., 1999) và pBT/Hcpro PRSV;
Cây thuốc lá N benthamiana; Chuột bạch chủng BALB/C
2.1.3 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Các mồi sử dụng để khuếch đại vùng mang các gen mã hóa H7: cặp mồi nhân gen HA mono_ELP là H7-BamHI_F, H7-BamHI_R; cặp mồi nhân gen HA trimeric TrH7-PspOMI_R, H7-BamHI_F và H7-BamHI_R; cặp mồi nhân gen HA trimeric-IgMFc là M-BamHI-trimer_R, H7-BamHI_F; cặp Mồi giải trình tự gen H7 35S-SQF và 35STerm
2.1.4 Hóa chất
Kit tách chiết RNA từ thực vật GenElute TM Total RNA Miniprep (Sigma), kit tách chiếtplasmid QIAprep Spin Miniprep , kit thôi gel QIAquick Gel Extraction và kit tinh sạch DNAQIAamp DNA mini của hãng QIAGEN, thang DNA 1 Kb, protein (Fermentas), các loại enzyme hạnchế của Fermentas Các hoá chất khác như: Yeast extract, NaCl, Agarose, Sucrose, Trypton, KCl,Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, Glycerol, CaCl2, Ethanol 70%, nước khử ion; các loạikháng sinh kanamycin, rifamycine, spectinomycin và các hóa chất thông dụng khác của các hãngFermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech… Kháng thể kháng cmyc đượctổng hợp từ khuẩn bởi phòng thí nghiệm trọng điểm-Viện Công nghệ sinh học, kháng thể anti-mouseIgG cộng hợp HRP (Promega - USA), kháng nguyên scFv (50 ng/µl) có trình tự cmyc được tổnghợp bởi phòng thí nghiệm trọng điểm-Viện Công nghệ sinh học, hóa chất hiện màu TMB (3,3’,5,5’tetramethylbenzidine), DAB (Diaminobenzidine) Kit hiện phim Super Signal West Pico Trial(Thermo Scientific)
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Các phương pháp thiết kế gen, thiết kế vector chuyển gen và tạo chủng A tumefaciens cho biểu hiện tạm thời.
Phân tích và tổng hợp thông tin về trình tự gen HA mã hóa cho kháng nguyên hemagglutinincủa virus cúm A/H7N9 đang gây bệnh ở Trung Quốc trên Ngân hàng GenBank Thu thập thông tin
về các bộ mã phổ biến được ưu tiên sử dụng trong bộ máy sản xuất protein của thực vật Lựa chọncác bộ mã ưu tiên tương thích để cải biến trình tự gen HA sao cho phù hợp với hệ biểu hiện thực vật,đồng thời bổ sung trình tự nhận biết của một số enzyme cắt hạn chế cho mục đích thiết kế vectorchuyển gen Đặt hàng công ty để tổng hợp nhân tạo đoạn gen HA đã đổi mã
Thành phần phản ứng PCR bao gồm : DNA khuôn 50 ng, Mồi xuôi 0,1 µM, Mồi ngược0,1 µM, dNTPs 0,2 µM, Pfu DNA polymerase 2,5 U, 10X đệm Pfu DNA polymerase 5 µl, Tổng
thể tích 50 µl Chu trình nhiệt như sau: 94oC/3 phút; 30 chu kỳ lặp lại các bước 94oC/30 giây,
58oC/30 giây, 72oC/1 phút 30 giây; 72oC/5 phút Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose0,8% sau đó đưuọc tinh sahj và xử lý với enzyme cắt giới hạn đã được thiết kế để ghép nối vàoplasmid pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xELP và biến nạp vào E.coli theo phương pháp sốc nhiệtcủa Sambrook và cộng sự (2012)
Trang 7Khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp được chọn lọc trên môi trường LB đặc bổ sung khángsinh 50 mg/l kanamycin Vector tái tổ hợp được tách chiết từ các khuẩn lạc cho kết quả PCRdương tính (Colony-PCR) được giải trình tự, sử dụng các cặp mồi như trình bày trong Bảng2.1 và phân tích kiểm tra tính chính xác bằng phần mềm BioEdit 7.0 và Lasergen 7(DNAstarinc, Madison, WI, USA).
2.2.2 Thiết kế cấu trúc vector mang gen HA phục vụ chuyển gen
Vector nhân dòng pRTRA tái tổ hợp mang gen mã hóa kháng HA mono_ELP, HA
trimeric_ELP, HA trimeric, HA trimeric-IgFMc và vector chuyển gen thực vật pCB301 cùng
được phân cắt bằng enzyme HindIII Các sản phẩm cắt từ vector pRTRA bao pCB301 35S-HAmono_ELP, pCB301 35S-HA trimeric_ELP, pCB301 35S-HA trimeric – KDE và pCB301 35S-
HA trimeric_ELP–KDE và được ghép nối vào khung vector pCB301 sử dụng T4 DNA ligase và
được biến nạp vào tế bào E coli DH5α khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt (Sambrook và cs.,
2012) Việc chọn các dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp được thực hiện trên môi trường LBđặc có chứa 50 mg/l kanamycin và bằng phản ứng Colony-PCR Các vector tái tổ hợp mang genđích pCB301 35S-HA mono_ELP, pCB301 35S-HA trimeric_ELP, pCB301 35S-HA trimeric –KDE và pCB301 35S-HA trimeric_ELP–KDE, được tách chiết từ các dòng khuẩn lạc dương tính
và kiểm tra bằng phản ứng cắt với enzyme giới hạn HindIII và NcoI Các vector chuyển gen sau
đó được biến nạp vào chủng A tumefaciens C58C1 bằng phương pháp xung điện Tách chiết và
tinh sạch plasmid: Plasmid được tinh sạch theo phương pháp của Sambrook và cộng sự (2012)
Sử dụng bộ kít do hãng Fermentas cung cấp để tinh sạch plasmid Phương pháp xử lý AND bằngenzyme cắt giới hạn: Thành phần phản ứng cắt được thực hiện theo sự hướng dẫn của hãng sảnxuất bọ Kit sử dụng enzyme
2.2.3 Các phương pháp trong biểu hiện tạm thời và đánh giá mức độ biểu hiện của protein tái
mM MgCl2; 10 mM MES; pH 5,6) tới OD600 = 0,5 để dùng cho biến nạp Dịch khuẩn có thể dùngriêng rẽ hay trộn với nhau theo tỷ lệ 1:1, tùy theo mục đích của thí nghiệm
2.2.3.2 Phương pháp xâm nhiễm khuẩn vào cây thuốc lá
Cây Nicotiana benthamiana từ 4-8 tuần tuổi được dùng để biến nạp Trước khi biến nạp, bọc giấy
quanh bầu đất sau đó mới úp ngược cây xuống Toàn bộ lá cây bị nhấn dìm trong bình chứa vi khuẩnbên trong bình hút chân không Hút chân không ở 27 inches Hg, 2 phút Xả không khí ra từ từ, mởnắp Các cây thuốc lá sau khi biến nạp được tiếp tục nuôi và chăm sóc trong buồng sinh trưởng cóđiều kiện ánh sáng 5.000 – 7.000 Lux, nhiệt độ 25 ± 2oC, độ ẩm 60 - 70%
2.2.3.3 Tách chiết protein tổng số
Protein tổng số từ mẫu lá được tách bằng dịch chiết: PBS (Phosphate-buffered saline) 0,05% Tweentheo tỉ lệ 1:2 (Trọng lượng mẫu lá - g) : Thể tích dịch chiết - ml) và bảo quản -20oC Hàm lượngprotein tổng số được đo ở bước sóng 595 nm theo phương pháp của Bradford năm (1976) với đườngchuẩn được dựng bằng BSA (Bovine Serum Albumin)
2.2.3.4 Điện di SDS-PAGE và lai miễn dịch Western blot
Mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp trong mẫu protein tách chiết từ lá xâm nhiễm khuẩnđược đánh giá bằng lai miễn dịch Western Blot theo phương pháp của Burnette và cs, 1981
Điện di SDS-PAGE: Bản gel được chuẩn bị theo công thức của Laemmli, 1970.
Trang 8Western blot : Sau khi điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide-SDS, protein được
chuyển qua màng bằng máy Pierce G2 Fast Blotter ở chế độ 25 V và 1,3 mA trong 20 phút Màng
chứa kháng nguyên được phủ bằng 5% sữa tách bơ pha trong dung dịch PBS 0,05% Tween trong 5giờ Rửa màng bằng dung dịch PBST 3 lần, mỗi lần 5 phút
2.2.4 Tách chiết và tinh sạch protein tái tổ hợp
2.2.4.1 Phương pháp tinh sạch protein dựa vào sắc ký ion cố định kim loại IMAC (Immobilized Metal ion Chromatography)
Lá thuốc lá biểu hiện protein tái tổ hợp được làm lạnh trong nitơ lỏng và nghiền thành dạngđồng nhất trong máy xay sinh tố Protein tổng số được tách chiết trong đệm 50 mM Tris (pH 8,0).Dịch chiết được phân tách bằng ly tâm 2 lần (25,000 v/p, 30 phút, 4oC) và được trộn với agarose gắnNi-NTA Hỗn hợp được trộn đều trong 30 phút, 4oC và được đưa vào cột sắc ký Rửa cột chứa hỗnhợp trên 2 lần với đệm rửa (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 30 mM Imidazole, pH 8,0)
2.2.4.2 Phương pháp tinh sạch protein gắn ELP bằng mITC (membrane-based Inverse Transition Cycling)
Nghiền 100 g lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ Bổ sung 200 ml Tris-HCl 50 mM (pH 8.0)lạnh Ly tâm 13000 v/p trong 30 phút ở 4oC Bổ sung NaCl đến nồng độ 2 M Ly tâm 13000 v/ptrong 30 phút ở 4oC Dung dịch được đưa qua màng polyethersulfone (PES) 0,22 µm ở 4oC để thudịch chiết trước xử lý Dịch chiết được làm ấm đến nhiệt độ phòng và lọc qua màng cellulose acetate0,2 µm sử dụng máy bơm Rửa màng 2 lần bằng NaCl 2M để loại protein lẫn Nước Milipore-Q lạnhđược chuyển qua màng lọc để thu hồi protein gắn ELP
2.2.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học của protein kháng nguyên tinh sạch
2.2.5.1 Phương pháp đánh giá khả năng hình thành oligomer của protein HA trimeric bằng phản ứng liên kết ngang (crosslinking reaction)
Để kiểm tra khả năng hình thành trạng thái oligomer của protein gắn cấu trúc tạo trimer,phản ứng crosslinking được thực hiện theo Weldon và cs, 2010 Cụ thể, 1 µg protein tái tổ hợptinh sạch được trộn với Bis [sulfosuccinimidyl] suberate (BS3) đến nồng độ 5 mM và ủ trong 30phút ở nhiệt độ phòng Dừng phản ứng bằng cách bổ sung 1M Tris-HCl pH 8.0 đến nồng độ 50
mM và ủ trong 15 phút Sau phản ứng, protein được điện di biến tính trên gel SDS-PAGE 4-10%
và chuyển lên màng cho phân tích Western blot
2.2.5.2 Phản ứng ngưng kết hồng cầu
Chuẩn bị tế bào hồng cầu: Thu 8 ml mẫu máu từ tĩnh mạch ở cánh gà khỏe mạnh, chưa từng tiêm
chủng với loại vacxin nào và được hòa trong dung dịch Alserver với tỷ lệ 1: 1 Dung dịch sau đóđược đi ly tâm với thể tích tương đương của PBS với tốc độ 1500 vòng/10 phút để hồng cầu lắngxuống đáy Quá trình được lặp lại hai lần với PBS Sau đó hút 2 ml hồng cầu cho vào 198 ml PBS đểthu được tế bào hồng cầu gà 1% và được bảo quản ở tủ 4°C
Phản ứng ngưng kết hồng cầu: Phản ứng ngưng kết hồng cầu được thực hiện theo OIC (OIC, 2014) Bổ
sung thêm 50 µl kháng nguyên vào giếng đầu tiên của một tấm nhựa vi chuẩn độ có đáy hình chữ V chứa 50
µl PBS Pha loãng 2 lần trên toàn bộ hàng, sau đó bổ sung thêm 50 µl 1% tế bào hồng cầu vào mỗi giếng Kếtquả đã được đọc sau khi ủ đĩa ở 25°C trong 30 min Nồng độ pha loãng đến điểm cuối cùng cho phản ứng
ngưng kết hồng cầu được xách định là một đơn vị ngưng kết (HAU) (Phan và cs., 2014).
2.2.5.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học của protein HA trimeric tinh sạch khi kết hợp với hạt Nano kim cương
Phương pháp sản xuất hạt Nano kim cương (NDs)
Bột kim cương (Diamond Innovations, USA) đã được chức năng hóa bề mặt với các nhóm cóchứa oxy bằng phương pháp xử lý trong hỗn hợp axit oxy hóa mạnh (3 thể tích H2SO4: 1 thể tích HNO3)trong lò vi sóng làm nóng (~ 100 °C) như mô tả trong nghiên cứu trước đó của Pham Dinh Minh và cộng
sự (2013) Việc xử lý được thực hiện trong lò vi sóng lò phản ứng (100W, Model Discover, CEM) trong
3 giờ Vào cuối giai đoạn làm nóng trong lò vi sóng, chúng tôi cũng đã có biện pháp phòng ngừa để đảmbảo rằng axit dư còn lại được pha loãng trước khi thu thập NDs Lưu ý rằng, để an toàn, lò phản ứng visóng được đặt trong một hộp hơi hóa học để bảo vệ người thực hiện khỏi sự tiếp xúc NO2
Tổng hợp phức hệ H7 trimeric-ND
Trang 9Hạt Nano kim cương có nồng độ 10 mg hạt/ ml được siêu âm trong 1 giờ trước khi trộn với khángnguyên tinh sạch theo tỷ lệ 1:1 (g protein:g hạt), 1:3, 1:5, 1:7, 1:9, 1:12 và 1:15 trong 2 loại đệm khácnhau PBS và nước deion nhằm tìm ra điều kiện thích hợp cho hoạt tính của protein cũng như đạt được độtan của hỗn hợp HApII-NDs tốt nhất Hỗn hợp hạt và protein tiếp tục được siêu âm trong 1 giờ.
Phương pháp nghiên cứu đặc điểm HA trimeric-ND
Phương pháp đo kích thước và Zeta potential: Sự phân bố kích thước và Zeta potential của
ND trước và sau khi gắn protein được đo bằng máy phân tích hạt (Delsa @ NanoC, BackmanCoulter, USA) Để phân tích kích thước và Zeta potential, ND và ND gắn protein được hòa lạitrong DI-H2O ở nồng độ 50 μg / mL Để đánh giá xu hướng kết tủa của các phức hợp ND -g / mL Để đánh giá xu hướng kết tủa của các phức hợp ND -protein trong đệm muối, các mẫu được hòa tan lại trong 1X PBS trước khi đo kích thước hạt
Phương pháp phân tích ảnh hiển vi điện tử (Transmission Electron Microscopy -TEM): Đặc điểm bề
mặt và hình dạng của ND và phức hệ HApII-ND được kiểm tra bằng ảnh TEM ND và H7:ND đượchòa tan bằng nước deion đến nồng độ 1 mg/mL Hạt trong dung dịch được đặt trên đĩa TEM quan sát
ND và H7:ND được đánh giá hoạt tính sinh học bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu (theo 2.2.5.1) Tỷ
lệ trộn hạt cho kết quả hiệu giá ngưng kết cao nhất được dùng để chuẩn bị cho gây miễn dịch ở chuột.Khả năng bám của protein với hạt cũng được kiểm tra bằng lai miễn dịch
2.2.5.4 Phương pháp gây miễn dịch tạo kháng thể trên chuột
Protein tái tổ hợp sau khi tinh sạch, được chuẩn về nồng độ 50 µg/ml và hỗn hợp protein tái tổhợp trộn với hạt Nano kim cương theo tỷ lệ tốt nhất (gam protein:gam hạt) sử dụng để gây đáp ứngmiễn dịch trên chuột Chuột được chia làm 3 nhóm mỗi nhóm 5 con : Nhóm tiêm PBS trộn hạt;Nhóm tiêm HApII trộn hạt và Nhóm tiêm HA trimeric Chuột được tiêm dưới da ba lần vào ngày
1, 14 và 28 với liều lượng 200 µl Huyết thanh từ máu chuột được thu vào ngày thứ 7 sau lần tiêmthứ 2 và thứ 3 Huyết thanh được chiết từ máu chuột được sử dụng để phát hiện kháng thể IgGđặc hiệu bằng kỹ thuật ELISA và lai Western blot
2.2.5.5 Kiểm tra khả năng tạo đáp ứng kháng thể bằng lai miễn dịch và ELISA
Phản ứng lai miễn dịch: Protein từ gel được chuyển sang sang màng nitrocellulose (4oC qua đêm, ở
20 mA) Màng được phủ trong dung dịch PBS1X chứa 5% sữa không béo trong 2 giờ Tiếp đến,màng được rửa 3 lần với PBS 1X Sau đó, màng được phủ với huyết thanh (pha loãng 500 lần) hoặckháng thể Anti-mouse H7N9 hemagglutinin/HA antibody (SinoBiological InC.) trong 2 giờ Màngđược rửa 3 lần với PBS 1X Màng được phủ với kháng thể anti-mouse IgG có gắn HRP (horseradishPeroxidase) với độ pha loãng 500 lần trong 2 giờ Tiếp đến, màng được rửa bằng dung dịch PBS 1X
3 lần Cuối cùng protein trên màng được hiện màu trong dung dịch hiện màu có chứa cơ chất DAB(Diaminobenzidine) trong 15 phút đến khi hiện băng màu nâu
Phản ứng ELISA: Để kiểm tra huyết thanh chuột, các giếng trong đĩa microtiter (ImmunoPlate
Maxisorp, Nalgen Nunc International, Roskilde, Denmark) được phủ với 50 ng kháng nguyên trongđệm PBS1X và ủ qua đêm ở 40C Sau đó, đĩa được phủ trong dung dịch PBS1X chứa 5% sữa khôngbéo trong 2 giờ Tiếp đến, đĩa được rửa 5 lần với PBS 1X Đĩa được phủ với huyết thanh (pha loãng
5000 lần) trong 2 giờ Đĩa được rửa 5 lần với PBS 1X Sau đó, đĩa được phủ với kháng thể anti-mouseIgG có gắn HRP (Horseradish Peroxidase) với độ pha loãng 500 lần trong 2 giờ được rửa bằng dungdịch PBS 1X 5 lần Cuối cùng, đĩa được hiện màu trong dung dịch hiện màu có chứa cơ chất 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) trong 15 phút, sản phẩm phản ứng cho màu xanh, sau đó cố định màubằng HCl 1N, màu vàng của phản ứng được đo ở bước sóng 450nm
2.2.6 Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm
Xử lý và phân tích thống kê kết quả thực nghiệm: phân tích thống kê được thực hiện trênchương trình Xcxel sử dụng phương pháp Student, t-test 0,05 ≥ p có ý nghĩa thống kê
2.3 Địa điểm nghiên cứu: Phòng công nghệ tế bào thực vật, phòng thử nghiệm sinh học thuộc
Viện Công nghệ sinh học
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trang 103.1 Tổng hợp nhân tạo và thiết kết vector hỗ trợ biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên HA
3.1.1 Tổng hợp nhân tạo gen mã hóa kháng nguyên HA
3.1.1.1 Phân tích trình tự gen HA
Tìm kiếm và khai thác thông tin trên ngân hàng gen quốc tế, chúng tôi đã thu thập được trình
tự nucleotide của gen HA mã hóa cho kháng nguyên hemagglutinin của chủng virus cúm A/H7N9đang gây bệnh trên gia cầm ở Trung Quốc năm 2013 và 2014 với mã số KF918659.1 và KJ411975.1
Theo đó, gen H7 hoàn chỉnh của chủng này bao gồm 1683 nucleotide mã hóa cho 559 axit amin,
trong đó 18 axit amin dẫn đầu là đoạn peptide tín hiệu đóng vai trò quyết định tham gia vào việc vậnchuyển chuỗi polypeptide xuyên qua màng tế bào, tiểu phần HA1 gồm 321 axit amin và tiểu phầnHA2 gồm 220 axit amin Khi biểu hiện trong tế bào thực vật, với mục đích giữ lại protein khángnguyên hemagglutinin ở mạng lưới nội chất, chúng tôi đã loại bỏ chuỗi peptide tín hiệu gồm 18 axitamin dẫn đầu (được ký hiệu màu đen trong Hình 3.1), đồng thời, trong quá trình thiết kế vectorchuyển gen sau này, chúng tôi sẽ sử dụng đoạn trình tự gồm 75 nucleotide (được gạch chân ở Hình
3.1) mã hóa cho LeB4 ER-signal peptide là đoạn peptide tín hiệu của gen LeB4 (mã hóa cho protein legumin type B ở cây đậu răng ngựa Vicia faba) để nối ghép với đoạn gen HA đã được tối ưu hóa
Trên cơ sở trình tự axit amin suy diễn, chúng tôi đã xác định các vị trí axit amin quy định đặc tínhquan trọng của kháng nguyên HA chủng A/Shanghai/2/2013 đang nghiên cứu bao gồm vị trí glycosylhóa, điểm cắt protease, vị trí bám dính thụ thể và vị trí epitope, đồng thời so sánh với kháng nguyên
HA của một số chủng virus H7N9 được phát hiện và phân lập trên người và gia cầm tại các vùngdịch ở Trung Quốc trong các giai đoạn từ 2013-2016
3.1.1.2 Cải biến trình tự gen mã hóa kháng nguyên HA
Để cải biến mã theo hướng phù hợp với bộ máy sản xuất protein của thực vật, căn cứ vàobảng tần suất sử dụng các codon ở thực vật trên ngân hàng dữ liệu mã di truyền Codon UsageDatabase (http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html) kết hợp với việc sử dụng phần mềm CodonOptimization 2.0, chúng tôi đã loại bỏ và thay thế các codon hiếm (khoảng 10%) trong gen H7.Ngoài ra, trình tự ATTTA được cho là gây bất ổn cho quá trình phiên mã (Gutierrez và đtg., 1999)cũng được loại bỏ Thêm vào đó, sự hình thành cấu trúc mRNA thứ cấp được giảm thiểu nhờ sử dụngphần mềm gốc của Invitrogen Mặc khác, để thuận tiện cho việc cắt và nối ghép gen trong quá
trình thiết kế vector chuyển gen vào thực vật, hai vị trí nhận biết của enzyme hạn chế BamHI và PspOMI được thêm vào đầu 5’ và 3’ của gen H7 Việc đổi mã được chúng tôi thực hiện dựa trên
cơ sở các bộ mã thay đổi sao cho phù hợp với hệ thống biểu hiện ở thực vật nhưng không làmthay đổi trình tự của axit amin Trình tự nucleotide và trình tự acid amin suy diễn của các đoạngen trước và sau khi đổi mã được kiểm tra và so sánh bằng phần mềm BioEdit Kết quả cho thấy,
gen HA gốc và gen HA đã cải biến mã có trình tự nucleotide tương đồng 76%, tuy nhiên các vị trí
sai khác không làm ảnh hưởng đến quá trình dịch mã, trình tự axit amin suy diễn từ các gen vẫnđạt độ tương đồng là 100% ở hình 3.2
3.1.2 Kết quả tạo vector chuyển gen mã hóa kháng nguyên HA mono_ ELP
3.1.2.1 Tạo vector tách dòng pRTRA _35S_HA mono_ ELP
Gen HA có kích thước 1644 bp được tổng hợp nhân tạo bởi công ty SGI-DNA (USA) nằm
trong vector pUC/HA Hai đầu đoạn gen này đều chứa trình tự nhận biết của cặp enzyme cắt giới hạn
BamHI và PspOMI Do đó, chúng tôi đã sử dụng chính cặp enzyme này để thu đoạn gen HA từ
vector ban đầu Sản phẩm cắt được điện di thu đoạn có kích thước tương ứng với HA khoảng 1,7 kb.Sản phẩm được thôi gel, tinh sạch và được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8 % với thang DNA 1
kb Kết quả thể hiện (Hình 3.3.A.) đồng thời vectoeer tách dòng trung gian
pRTRA35S_H5-histag-cmycELP-KDEL cũng được xử lý bằng cặp enzyme BamHI và PspOMI để loại bỏ đoạn gen H5 thu
đoạn khu có kích thước 5,05kb Các phân đoạn ADN có kích thước khoảng 1,7kb và 5,05kb được thunhận và tinh sạch phục vụ cho phản ứng ghép nối tạo vector tách dòng tương ứng pRTRA_HAmono_ELP
Trang 11Theo lý thuyết khi cắt vector pRTRA_HA mono_ELP, bằng enzyme BamHI/ và PspOMI thì
plasmid pRTRA tái tổ hợp sẽ cho 2 vạch băng khi kiểm tra trên gel agrose 0,8 % Ở Hình 3.3.B cho
thấy, khuẩn lạc được tách plasmid được kiểm tra cắt bằng BamHI và PspOMI cho các vạch trùng với
kích thước tính toán lý thuyết của pRTRA_35S_100ELP là 5,05 kb và HA là 1,7 kb
Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector pRTRA_HA mono_ELP , bằng enzyme cắt giới
hạn BamHI/PspOMI 3.1.1.2 Tạo vector chuyển gen pCB301_35S_HA mono_ ELP
Vector tách dòng trung gian pRTRA35S_HA mono_ELP, cùng được xử lý bằng enzyme
HindIII nhằm thu được đoạn gen mục tiêu bao gồm promoter 35S_ HA mono_ELP và vector mở
vòng Đối với vector pCB301, để tránh hiện tượng đóng vòng, sản phẩm cắt sau khi tinh sạch được
xử lý tiếp với enzyme SAP Kết quả điện di cho thấy, với sản phẩm cắt vector pCB301 cho 1 băng
nằm ở kích thước khoảng 5,6 kb theo đúng tính toán lý thuyết (Hình 3.5A.2); sản phẩm cắt vectorpRTRA35S_ HA mono_ELP, cho 2 băng, 1 băng có kích thước khoảng 4,1 kb tương ứng vớicassette 35S_ HA mono_ELP và băng còn lại có kích thước khoảng 2,6 kb là đoạn khung vector cònlại (Hình 3.5A.1) Các phân đoạn DNA có kích thước 5,6 kb và 4,1 kb sau đó được thu nhận và tinhsạch để phục vụ cho phản ứng nối ghép tạo vector chuyển gen tương ứng pCB301_35S_ HA
mono_ELP Để biết chắc chắn plasmid đã được biến nạp vào tế bào khả biến E.Coli DH5α bằng
phương pháp sốc nhiệt, chúng tôi tiến hành nuôi và tách plasmid khuẩn biến nạp vector tái tổ hợp(các plasmid cho kết quả dương tính với colony-PCR), sau đó cắt kiểm tra bằng cắt enzyme giới hạn
HindIII (Hình 3.5.B) Các kết quả kiểm tra đã chứng minh vector pCB301_35S_ HA mono_ELP đã được thiết kế thành công Vector tái tổ hợp sau đó được biến nạp vào tế bào A tumefaciens C58C1, đồng thời chủng E.Coli mang vector này được giữ dòng bằng glycerol 100% bảo quản ở -
80oC để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo
Hình 3.5 Kết quả thiết kế vector pCB301_35S_ HA mono_ELP
(A): Xử lý vector pCB301-Kan và vector pRTRA_35S_HA mono_ELP bằng HindIII
(B): Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pCB301 tái tổ hợp bằng HindIII
3.1.3 Kết quả tạo vector chuyển gen mã hóa kháng nguyên HA trimeric_ELP
3.1.3.1 Tạo vector tách dòng pRTRA _35S_ HA trimeric_ELP
Trang 12Vector tách dòng pRTRA_H5pII_ Histag-Cmyc-100xELP cũng được xử lý bằng cặp
enzyme BamHI và PspOMI để loại bỏ đoạn gen H5 thu đoạn khu có kích thước 5,15 kb Các
phân đoạn ADN có kích thước khoảng 1,7kb và 5,15kb được thu nhận và tinh sạch phục vụ chophản ứng ghép nối tạo vector tách dòng tương ứng pRTRA_HApII_ Histag-Cmyc-100xELP và
được dòng hóa trong tế bào E.coli DH5α Ở (Hình 3.6) cho thấy, khuẩn lạc được tách plasmid và kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn BamHI và PspOMI cho các vạch trùng với kích thước tính
toán lý thuyết của pRTRA_35S_pII_ Histag-Cmyc-100xELP là 5,15 kb và HA là 1,7 kb
Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector tách dòng bằng enzyme giới hạn
BamHI/PspOMI M: Marker DNA, (1) pRTRA_35S_ HA trimeric_ELP.
3.1.3.2 Tạo vector chuyển gen pCB301_35S_ HA trimeric_ELP
Kết quả cắt vector pRTRA35S_ HA trimeric_ELP và pBC301cùng được xử lý bằng enzyme
HindIII điện di cho thấy, với sản phẩm cắt vector pCB301 cho 1 băng nằm ở kích thước khoảng 5,6
kb theo đúng tính toán lý thuyết (Hình 3.7.A); sản phẩm cắt vector pRTRA35S_ HA trimeric_ELP,cho 2 băng, 1 băng có kích thước khoảng 4,2 kb tương ứng với cassette 35S_ HA trimeric_ELP vàbăng còn lại có kích thước khoảng 2,6 kb là đoạn khung vector còn lại (Hình 3.7.A)
Các phân đoạn DNA có kích thước 5,6 kb và 4,2 kb sau đó được thu nhận và tinh sạch đểphục vụ cho phản ứng nối ghép tạo vector chuyển gen tương ứng pCB301_35S_ HA trimeric_ELP
Để biết chắc chắn plasmid đã được biến nạp vào chúng tôi tiến hành nuôi và tách plasmid khuẩn biến
nạp vector tái tổ hợp, sau đó kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn HindIII (Hình 3.7.B) Các kết quả
kiểm tra đã chứng minh vector pCB301_35S_ HA trimeric_ELP đã được thiết kế thành công
Vector tái tổ hợp sau đó được biến nạp vào tế bào A tumefaciens C58C1.
Hình 3.7 Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen pCB301_35S_ HA trimeric_ELP
3.1.4 Kết quả tạo vector chuyển gen mã hóa kháng nguyên HA trimeric
3.1.4.1 Tạo vector tách dòng pRTRA _35S_ HA trimeric
Vector tách dòng pRTRA_H5pII sau khi được xử lý bằng enzyme BamHI/PspOMI được gắn với gen HA và được dòng hóa trong tế bào E.coli DH5α Kết quả cho thấy ở (Hình 3.8) khuẩn lạc được tách plasmid và kiểm tra bằng enzyme giới hạn BamHI/PspOMI cho các vạch
trùng với kích thước tính toán lý thuyết của pRTRA_35S_pII_ là 3,6 kb và
HA là 1,7 kb
Trang 13Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector tách dòng bằng enzyme giới hạn
BamHI/PspOMI M: Marker DNA, (1) pRTRA_35S_ HA trimeric.
3.1.4.2 Tạo vector chuyển gen pCB301_35S_ HA trimeric
Vector tách dòng trung gian pRTRA_35S_ HA trimeric và pBC301cùng được xử lý bằng
enzyme HindIII nhằm thu được đoạn gen mục tiêu bao gồm promoter 35S_ HA trimeric Kết quả
điện di cho thấy, với sản phẩm cắt vector pCB301 cho 1 băng nằm ở kích thước khoảng 5,6 kb theođúng tính toán lý thuyết, sản phẩm cắt vector pRTRA 35S_ HA trimeric cho 3 vạch băng: 1 vạch cókích thước khoảng 2,5 kb tương ứng với cassette 35S_ HA trimeric, 2 băng còn lại có kích thướckhoảng 1,7 kb và 0,9 kb là đoạn khung vector còn lại (Hình 3.9.A)
Các phân đoạn DNA có kích thước 5,6 kb và 2,6 kb sau đó được thu nhận và tinh sạch để phục vụcho phản ứng nối ghép tạo vector chuyển gen tương ứng pCB301_35S_ HA trimeric Để biết chắcchắn plasmid đã được biến nạp vào chúng tôi tiến hành nuôi và tách plasmid khuẩn biến nạp vector
tái tổ hợp, sau đó kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn HindIII (Hình 3.9.B) các kết quả kiểm tra đã
chứng minh vector pCB301_35S_ HA trimeric đã được thiết kế thành công Vector tái tổ hợp sau
đó được biến nạp vào tế bào A tumefaciens C58C1.
Hình 3.9 Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen pCB301_35S_ HA trimeric bằng HindIII 3.1.5 Tạo cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen HA trimeric-IgMFc
3.1.5.1 Tạo vector tách dòng mang gen mã hóa protein HA trimeric-IgMFc
Thiết kế vector tách dòng pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc Xử lý đồng thời đoạn gen HA trimeric-IgMFc đã khuếch đại và vector pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc
bằng cặp enzyme BamHI và PspOMI Gen HA đã xử lý enzyme và đoạn khung vector sau khi
loại bỏ gen mã hóa kháng nguyên H5 (khoảng 1,5 kb)còn lại có chiều dài gần 4,3 kb được thu nhận và tinh
theo đúng tính toán lý thuyết (Hình 3.10.D) Như vậy đã
trimeric-IgMFc