Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm a h7n9 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá (nicotiana benthamiana) thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌCLÊ THỊ THỦY NGHIÊN C U T O KHÁNG NGUYÊN ỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN ẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI T H P C A VIRUS GÂY B NH CÚM A/H7N9 Ổ HỢP CỦA VIRUS GÂY BỆNH CÚM A/H7N9 ỢP CỦA VIRU

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LÊ THỊ THỦY

NGHIÊN C U T O KHÁNG NGUYÊN ỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN ẠO KHÁNG NGUYÊN

TÁI T H P C A VIRUS GÂY B NH CÚM A/H7N9 Ổ HỢP CỦA VIRUS GÂY BỆNH CÚM A/H7N9 ỢP CỦA VIRUS GÂY BỆNH CÚM A/H7N9 ỦA VIRUS GÂY BỆNH CÚM A/H7N9 ỆNH CÚM A/H7N9

B NG PH ẰNG PHƯƠNG PHÁPBIỂU HIỆN TẠM THỜI ƯƠNG PHÁPBIỂU HIỆN TẠM THỜI NG PHÁPBI U HI N T M TH I ỂU HIỆN TẠM THỜI ỆNH CÚM A/H7N9 ẠO KHÁNG NGUYÊN ỜI TRONG CÂY THU C LÁ ( ỐC LÁ ( Nicotiana benthamiana)

THÔNG QUA VI KHU N ẨN Agrobacterium

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Bích Ngọc và PGS.TS.Chu Hoàng Hà đã hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôitrong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi luôn nhậnđược sự giúp đỡ của tập thể cán bộ hướng dẫn, các thầy cô giáo, các nhà khoa học,các anh chị em đồng nghiệp và quý cơ quan, phòng ban Tôi xin chân thành cảm ơnBan Lãnh đạo, Bộ phận đào tạo sau đại học, các phòng chức năng của Viện Côngnghệ sinh học đã tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án

Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Côngnghệ tế bào thực vật, phòng Công nghệ ADN ứng dụng Viện Công nghệ sinh học,Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

Luận án được thực hiện tại, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thửnghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệViệt Nam Với sự hỗ trợ về tài chính và điều kiện làm việc trong khuôn khổ đề tàicấp Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã luôn độngviên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!

Nghiên cứu sinh

Lê Thị Thủy

Lê Thị Thủy

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi các số liệu và kết quả trình bàytrong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên tạp chí khoa học chuyênngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; phần còn lại chƣa ai công bốtrong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các số liệu, nội dung đã trình bày trongluận án

2019

Tác giả

Lê Thị Thủy

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN Ii MỤC LỤC Iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Vi DANH MỤC BẢNG Viii DANH MỤC HÌNH Xi MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Nội dung nghiên cứu 3

4 Những đóng góp mới của luận án 3

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 4

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Đặc điểm cấu trúc của virus cúm A/ H7N9 5

1.1.1 Nguồn gốc virus cúm A/H7N9 5

1.1.2 Đặc điểm cấu trúc virus cúm A/H7N9 . 6

1.1.3 Đa hợp tạo nên phân type A/H7N9 9

1.1.4 Đặc điểm kháng nguyên bề mặt của virus cúm A/H7N9 10

1.1.5 Tình hình dịch cúm A/H7N9 13

1.2 Vacxin phòng chống bệnh cúm A 16

1.2.1 Một số loại vacxin phòng bệnh cúm A hiện nay 16

1.2.2 Vacxin tái tổ hợp từ thực vật 19

1.2.3 Vacxin phòng bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam 20

1.2.4 Một số nghiên cứu về vắc xin cúm ở Việt Nam 21 1.3 Biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vật thông qua Agrobacterium 24

1.3.1 Hệ thống biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vât 24

1.3.2 Quá trình biểu hiện tạm thời thông qua Agrobacterium 26

1.3.3 Các chiến lược tăng cường biểu hiện protein tái tổ hơp ở thực vật………

28 1.3.4 Tinh sạch protein tái tổ hợp ở thực vật……… 34

1.4 Nano kim cương (NDs) và những ứng dụng tiềm năng trong công nghệ sinh học 37

1.4.1 Giới thiệu chung về vật liệu nano kim cương 37

1.4.2 Ứng dụng của Nanodiamons trong khoa học sự sống và công nghệ sinh học 37

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41

2.1 Vật liệu 41

2.1.1 Chủng vi khuẩn 41

2.1.2 Các vector và vật liệu thực vật, động vật 41

2.1.3 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 42

2.1.4 Hóa chất……… 42

2.1.5 Thiết bị……… 43

2.2 Phương pháp nghiên cứu 43

2.2.1 Các phương pháp thiết kế gen, thiết kế vector chuyển gen và tạo chủng A tumefaciens cho biểu hiện tạm thời 43

2.2.2 Thiết kế cấu trúc vector mang gen HA phục vụ chuyển gen 45

2.2.3 Các phương pháp trong biểu hiện tạm thời và đánh giá mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp trong lá thuốc lá 47

2.2.4 Tách chiết và tinh sạch protein tái tổ hợp ……… 50

2.2.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học của protein kháng nguyên tinh sạch……… 51

2.2.6 Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm……… 55

Chương 3: KẾT QUẢ NHIÊN CỨU 56

3.1 Tổng hợp nhân tạo và thiết kế vector hỗ trợ biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên HA……… 56

3.1.1 Tổng hợ nhân tạo gen mã hóa kháng nguyên HA……… 56

3.1.2 Kết quả tạo vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên HA mono_ELP 59

3.1.3 Kết quả tạo vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên HA trimeric_ELP 62

3.1.4 Kết quả tạo vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên HA

trimeric 65

trimeric bằng phản ứng liên kết ngang……… 83

nguyên HA và phức hệ HA trimeric:ND trên động vật………… 91

Chương 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 95

kháng nguyên HA……… 95

4.3.1 Khả năng tạo phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND 104

4.3.2 Khả năng gây ngƣng kết hồng cầu của kháng nguyên HA và phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND(1:12) 105

4.4 Khả năng kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột 105

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 108

NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 110

TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 111

TÀI LIỆU THAM KHẢO 115

PHỤ LỤC

2b CMV Cucumber mosaic virus , (Protein 2b của virus khảm dƣa chuột)

Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresisTris Acetate EDTA

Thermus aquaticus DNA polymerasepolymerase

DANH MỤC BẢNG

gây bệnh và tính nhạy cảm với thuốc kháng virus của virus cúm

gia cầm A(H7N9) phân lập từ đợt dịch thứ năm……… 14

Bảng 1.2 Danh sách một số giống gốc vắc xin cúm A/H7N9 chuyển giao cho cơ sở có nhu cầu sản xuất………

20 Bảng 1.3 Sự so sánh các đặc trưng kỹ thuật giữa CVD diamons, Titanium và thép không gỉ 38

Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu gen HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric-IgMFc 42

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 44

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng nối ghép gen 44

Bảng 2.4 Thiết kế thí nghiệm dãy trực giao L9 (34)……… 49

Bảng 3.1 Nồng độ protein HA trong mẫu lá biểu hiện tạm thời protein HA khi không sử dụng vector hỗ trợ và có sử dụng vector hỗ trợ HcPro PRSV/2b CMV……… 72

Bảng 3.2 Kết quả phân tích phương sai của các công thức thí nghiệm trong thí nghiệm trực giao……… 75

Bảng 3.3 Mức độ biểu hiện và khả năng gây ngưng kết hồng cầu của protein HA 90

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc virus cúm A 8

Hình 1.2 Nguồn ngôc các phân đoạn gen của chủng virus H7N9 tái tổ hợp 9

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc Hemagglutinin 12

Hình 1.4 Sơ đồ mô tả bằng phương pháp biểu hiện tạm thời thông qua Agrobacterium……… 27

Hình 1.5 Quy trình tinh sạch protein bằng phương pháp mITC……… 36

Hình.1.6 Cấu trúc tinh thể của Nanodiamons……… 37

Hình.1.7 Hình ảnh minh họa cho ứng dụng ND trong dẫn thuốc………… 40

Hình 2.1 Chuyển gen vào lá cây thuốc lá bằng phương pháp biểu hiện tạm thời nhờ A tumefaciens 48

Hình 2.2 Cơ chế gây phản ứng ngưng kết hồng cầu 52

Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm gây miễn dịch trên chuột bạch BALB/C 54

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen HA 59

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector pRTRA_HA mono_ELP. 60

Hình 3.3 Kết quả thiết kế vector pCB301_35S_ HA mono_ELP 61

Hình 3.4 Kết quả thiết kế vector pCB301_35S_ HA mono_ELP 62

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector tách dòng bằng enzyme giới hạn BamHI/PspOMI 63

Hình 3.6 Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen pCB301_35S_ HA trimeric_ELP 64

Hình 3.7 Kết quả kiểm tra vector pCB301_35S_ HA trimeric_ELP bằng enzyme cắt giới hạn 65

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector tách dòng bằng enzyme giới hạn BamHI/PspOMI 66

Hình 3.9 Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen pCB301_35S_ HA trimeric 67

Hình3.10 Kết quả kiểm tra vector pCB301_35S_ HA trimeric 68

SDS-PAGE và lai miễn dịch ……… 82

trimeric-IgFMc……… 88

Hình 3.26 Kết quả ngƣng kết hồng cầu Hemagglutinin HA 89

.

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Virus cúm A/H7N9 là chủng virus cúm gia cầm được phát hiện tại TrungQuốc từ năm 2013 Cúm A/H7N9 gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độlây lan nhanh với tỷ lệ gây chết cao trong đàn gia cầm bị bệnh (Gao và cs., 2013).Virus cúm A/H7N9 là một phân type trong nhóm virus cúm A thuộc họ

Orthomyxoviridae Trên bề mặt capsid của hạt virus có protein Hemagglutinin (HA)

và Neuraminidase (NA) mang tính kháng nguyên tham gia quá trình đáp ứng miễndịch Kháng nguyên HA có 18 type (ký hiệu từ H1 đến H18) và kháng nguyên NA

có 11 type (ký hiệu từ N1 đến N11) Kháng nguyên HA được mã hóa bởi phân đoạn

4 của hệ gen virus cúm A, có đặc tính kết hợp với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt màngcủa tế bào nhiễm và phân đoạn 6 mã hóa cho neuraminidase (NA) là những proteinnằm trên bề mặt có tính kháng nguyên và gây bệnh HA có khả năng đột biến tronggen tạo nên sự khác biệt làm thay đổi tính kháng nguyên, đặc biệt là điểm cắt củaenzym protease ở vị trí có sự glycosyl hóa đã được xác định bao gồm Asn30,

trí này đều có tính bảo thủ cao trên kháng nguyên H7 của các chủng virus H7N9 gâybệnh trên người và gia cầm, Gen HA gồm 2 đoạn là HA1 và HA2 nối với nhaubằng chuỗi oligopeptide, mã hóa cho gồm một dãy các amino acid là arginine vàlysine (-RRRKK-), tạo nên điểm cắt của protease Đây là vùng quyết định độc lựccủa virus hay tính gây bệnh của virus cúm Phần HA1 và HA2 bộc lộ ra ngoài màng

và có khả năng làm ngưng kết hồng cầu và chịu trách nhiệm cho việc gắn kết virusvào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ trong giai đoạn đầu tiên của quá trình xâm nhiễm(Svedda và cs., 1981)

Trong đợt dịch cúm đầu tiên từ ngày 31/03/2013 có ba trường hợp nhiễm viruscúm gia cầm A/H7N9 trên người được phát hiện và công bố tại Thượng Hải và AnHuy, Trung Quốc Chỉ trong một thời gian ngắn, tính đến ngày 09/06/2013 loại virusnguy hiểm này đã lây lan ra 11 tỉnh thành của Trung Quốc, gây ra 131 trường hợpnhiễm bệnh, đa phần bị suy hô hấp nặng, trong đó 39 người đã tử vong (WHO, 2013)

Trong đợt dịch cúm A/H7N9 thứ 5 trên người tại Trung Quốc diễn ra từ 19/1/2017 đến14/2/2017 đã khiến 36 người chết trên tổng số 304 người mắc bệnh (WHO, 2017) Tổchức Y tế Thế giới (WHO) nhận định đây là một tỷ lệ cao bất thường cho một sự lâynhiễm mới và xác định H7N9 là chủng virus rất nguy hiểm đối với con người.

Các nghiên cứu về hệ gen, xác định các vùng biến đổi của virus cúm A/H7N9

đã cho thấy virus A/H7N9 tỏ ra thích ứng nhanh hơn và có độc lực cao hơn với tếbào của loài có vú (người, heo ) so với các chủng virus cúm gia cầm khác Chođến nay chưa có bằng chứng nào về việc virus cúm A/H7N9 lây truyền từ ngườisang người - yếu tố cơ bản để A/H7N9 có thể biến chuyển thành một đại dịch cúm.Tuy nhiên, vì sự lan truyền giữa người và người đã từng xảy ra với virus H7 (dịchH7N7 ở Hà Lan năm 2003) nên cần phải cảnh giác về khả năng lây truyền người-người của virus H7N9 hiện nay

Ở Việt Nam chưa ghi nhận trường hợp cúm A/H7N9 trên người cũng nhưtrên gia cầm; tuy nhiên, nguy cơ xâm nhập, lan truyền và gây bùng phát dịch rất cao

do Việt Nam có đường biên giới trải dài với Trung Quốc Vấn đề cấp bách hiệnnay, ngoài việc ngăn chặn lây lan và triển khai các biện pháp phòng bệnh thì việcnghiên cứu chủ động sản xuất vacxin phòng bệnh hết sức quan trọng

Trong những năm gần đây một hướng mới đã được ứng dụng để phát triểncác loại vacxin cúm khác nhau, trong đó có hướng nghiên cứu tạo vacxin thực vật

Hệ thống biểu hiện ở thực vật rất hữu dụng vì vacxin được tạo ra hứa hẹn sẽ có giáthành thấp hơn từ 10-20 lần so với phương pháp truyền thống Tuy nhiên, proteintái tổ hợp được tích luỹ trong cây trồng chuyển gen lại không cao và thiếu mộtphương thức tinh sạch protein tái tổ hợp hiệu quả Để khắc phục nhược điểm này,hiện nay hệ thống biểu hiện tạm thời là phương pháp hữu ích để sản xuất khángnguyên tái tổ hợp ở thực vật Phương pháp này có ưu điểm nhanh, hàm lượngprotein tái tổ hợp cao, không bị ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen đích trong tế bào thựcvật và có thể tiến hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàn toàn như lá

Nhận thấy việc nghiên cứu biểu hiện các kháng nguyên của virus cúmA/H7N9 trong tế bào thực vật là rất cần thiết Hơn nữa mô hình sản xuất kháng

nguyên tái tổ hợp bằng phương pháp biểu hiện tạm thời ở thực vật có thể sản xuấtvacxin với số lượng lớn và nhanh chóng (1-2 tháng) đáp ứng kịp thời khi dịch bệnhxảy ra Việc kết hợp kháng nguyên tái tổ hợp với vật liệu nano nhằm sản xuất vacxindạng như virus like particle để làm tăng hoạt tính kháng nguyên Với cơ sở khoa học

và ứng dụng như trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái

tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trong

cây thuốc lá (Nicotiana benthamiana) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Biểu hiện và xác định được đặc điểm cấu trúc của kháng nguyên HA và phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND (Nanodiamon)

- Đánh giá được hoạt tính sinh học, khả năng kích thích đáp ứng miễn dịchtrên động vật thí nghiệm của kháng nguyên tái tổ hợp HA trimeric và phức hệ HAtrimeric:ND

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Thu thập thông tin, tổng hợp gen mã hóa kháng nguyên và thiết

kế vector biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên HA

Nội dung 2: Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên HA của virus

H7N9 ở lá thuốc lá

Nội dung 3: Nghiên cứu tạo phức hệ và khả năng gây ngưng kết hồng cầu của

kháng nguyên HA và HA trimeric:ND (1:12)

Nội dung 4: Nghiên cứu khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch của kháng

nguyên HA và phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND trên động vật thí nghiệm

4 Những đóng góp mới của luận án

- Đã thiết kế thành công 4 cấu trúc vector biểu hiện pCB301/HA mono_ELPpCB301/HA trimeric_ELP, pCB301/HA trimeric và pCB301/HA trimeric-IgMFcmang gen HA được tổng hợp nhân tạo từ gen HA của chủng virus cúm H7N9 và

tạo chủng Agrobacterium mang vector tương ứng.

- Biểu hiện và tinh sạch thành công protein HA tái tổ hợp pCB301/HA

mono_ELP, pCB301/HA trimeric_ELP, pCB301/HA trimeric và pCB301/HAtrimeric-IgMFc trong cây thuốc lá bằng phương pháp mITC và IMAC

- Đã xác định được cấu trúc trimeric của kháng nguyên HA và khả năng gây ngưng kết hồng cầu của protein HA với hiệu giá ngưng kết của HA trimeric_ELP

và HA trimeric bằng 2 HAU, HA trimeric:ND (1:12) bằng 1024 HAU với lượng 5

µg tại giếng đầu tiên

- Các kháng nguyên HA dạng HA trimeric và HAtrimeric:ND (1:12) đều gâyđáp ứng miễn dịch ở chuột trong đó HA trimeric:ND (1:12) kích thích đáp ứng miễndịch mạnh hơn HA trimeric

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

5.1 Ý nghĩa khoa học

Luận án cung cấp cơ sở khoa học quan trọng trong việc thiết kế các cấu trúcvector chuyển gen mang gen HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và

HA trimeric-IgMFc mã hóa cho các kháng nguyên HA tái tổ hợp; biểu hiện kháng

nguyên tái tổ hợp trên cây thuốc lá bằng phương pháp biểu hiện tạm thời; tách

chiết, tinh sạch và đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể của cáckháng nguyên tái tổ hợp này trên động vật thí nghiệm Kết quả đề tài luận án làbằng chứng khoa học về tiềm năng của việc sản xuất, phát triển vacxin tiểu đơn vịphòng virus cúm trong thực vật

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen HA mã hóa các khángnguyên tái tổ hợp HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric-

IgMFc của chủng virus cúm đang lưu hành tại Trung Quốc và các chủng A.

tumefaciens mang các vector này có thể được sử dụng để nghiên cứu biểu hiện, sản

xuất và phát triển vacxin tiểu đơn vị phòng virus cúm

Quy trình biểu hiện gen HA trên lá cây thuốc lá bằng phương pháp biểu hiệntạm thời với các điều kiện tối ưu của đề tài luận án có thể ứng dụng để sản xuất cáckháng nguyên tái tổ hợp HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HAtrimeric-IgMFc hoặc các protein tái tổ hợp khác

Kháng nguyên tái tổ hợp HA trimeric : ND được tạo ra trong đề tài luận án làứng viên tiềm năng cho sản xuất vacxin tiểu đơn vị phòng bệnh cúm gia cầm ở ViệtNam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm cấu trúc của virus cúm A/ H7N9

1.1.1 Nguồn gốc virus cúm A/H7N9

Sự thích ứng trên vật chủ ở động vật có vú của virus cúm A/HAxNAy chính là

sự chuyển đổi thụ thể sialic acid thích ứng từ loài chim sang thích ứng gần hơn đốivới người (Paulson và cs., 2013) Trong hai năm (2012 - 2013), một số chủng tái tổhợp phân type HAxNAy đã được hình thành tạo nên các phân type gây nhiễm vàgây bệnh trên người, đáng quan tâm nhất là H7N9 gây chết người phát hiện năm

2013 (Liu và cs., 2013; Yang và cs., 2013; Cui và cs., 2014) và H10N8 công bố cuối năm 2013 (To và cs., 2013; 2014; Chen và cs., 2014) Virus cúm A (H7N9) là

một phân nhóm nhỏ của một nhóm lớn các virus cúm A mang gen kháng nguyên

HA (H7), lưu hành giữa các loài chim Đã có nhiễm một số phân nhóm khác củavirus cúm A mang gen H7 trên người, bao gồm các phân type H7N2, H7N3, H7N7

và đã được thông báo tại Australia, Canada, Italy, Mexico, Hà Lan, Vương quốcAnh và Hoa Kỳ, tuy nhiên, mức độ biểu hiện và

tầm quan trọng của sự truyền lây rất giới hạn

(http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/latest_update_h7n9/en/index.htm)

Virus cúm A/H7N9 là chủng virus cúm gia cầm mới được phát hiện tạiTrung Quốc Ngay sau khi dịch cúm xảy ra, các nghiên cứu về virus cúm A/H7N9

đã được tiến hành nhằm thu thập dữ liệu, giải mã hệ gen, xác định các vùng biếnđổi, từ đó tìm ra phương thức để phòng và chống dịch bệnh Mẫu virus cúm A/H7N9 được lấy từ ba bệnh nhân nhiễm bệnh đầu tiên (kí hiệu A/Shanghai/1/2013,

A /Shanghai/2/2013, và A/Anhui/1/2013) đã được giải mã và trình tự các vùng mãhóa của 8 phân đoạn gen virus đã được đăng trên cơ sở trình tự dữ liệu của tổ chứcSáng kiến toàn cầu về chia sẻ dữ liệu cúm (GISAID)

Trước đây, hầu hết các ca nhiễm H7N7 ở người xảy ra do tiếp xúc chăn nuôigia cầm bị dịch bệnh, biểu hiện triệu chứng đơn giản, chủ yếu là viêm kết mạc vàviêm nhẹ đường hô hấp trên, ngoại trừ một ca tử vong, đã xảy ra ở Hà Lan

(Koopmans và cs., 2004) Dịch cúm A (H7N9) bắt đầu được ghi nhận tại Trung

Quốc từ 3/2013 đến tháng 2/2018 có tới 5 đợt dịch, trong đó đợt dịch thứ

5 diễn ra từ tháng 10/2016 tới tháng 10/2017 là đợt dịch lớn nhất từ trước tới nay cả

về quy mô, số lượng ca mắc bệnh và tốc độ lây lan tạo thành đợt dịch thứ 5 với 541trường hợp mắc so với 135 ca nhiễm được báo cáo trong đợt dịch

đầu tiên, 320 ca nhiễm được báo cáo trong vụ dịch thứ hai, 226 ca nhiễm ở vụ dịchthứ ba và 119 ca nhiễm ở vụ dịch thứ tư Dịch đạt đỉnh cao vào tháng 2/2017 vớikhoảng 50-60 trường hợp mắc mới/tuần, sau đó từ tháng 3 đến nay có xu hướnggiảm dần với khoảng 18-34 trường hợp mắc mới/tuần Từ 3/2017 đến nay đã ghinhận thêm 3 địa phương thuộc khu vực Cam Túc, Tây Tạng và Thiểm Tây cótrường hợp bệnh mới Như vậy trong đợt dịch thứ 5 đã ghi nhận các trường hợpmắc cúm A/H7N9 tại 17 tỉnh tại Trung Quốc Theo Tổ chức Y tế Thế giới, từ tháng2/2013 đến tháng 1/2018, có tổng cộng 1.624 trường hợp xác định mắc cúm H7N9

ở người trong đó có ít nhất 621 trường hợp tử vong tại Trung Quốc Hầu hết cáctrường hợp nhiễm là do trực tiếp tiếp xúc với động vật hoặc với môi trường nhiễm,

đặc biệt là chợ động vật sống (Yu và cs., 2013) Tuy nhiên xu hướng thích ứng của

virus cúm A/H7N9 trên tế bào niêm mạc phổi và thụ thể tiếp đón hemagglutinin H7ngày càng cao, đây là mối lo sinh học của việc lan truyền giữa người và người

(Knepper và cs., 2013; Dortmans và cs., 2013).

1.1.2 Đặc điểm cấu trúc virus cúm A/H7N9

Phân tích thành phần hoá học các hạt virus cúm A có chứa khoảng 0,8 - 1,1%RNA, 70-75% là protein, 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbohydrate (Murphy vàWebsters 1996) Dưới kính hiển vi điện tử, hầu hết các hạt của virus (virion) códạng hình cầu đường kính từ 50 -100 nm Một số ít có dạng hình sợi đường kính 20

nm và dài từ 200-300nm Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ

bọc ngoài (envelope) và lõi chứa ARN Vỏ virus với bản chất là protein có nguồngốc từ màng tế bào nhiễm đã được đặc hiệu hóa để gắn protein màng của virus vào,bao gồm một số protein được glycosyl hoá (glycoprotein) và một số protein dạngtrần không được glycosyl hoá (non-glycosylated protein) Protein bề mặt có cấutrúc từ glycoprotein, bao gồm protein gây ngưng kết hồng cầu HA, protein enzymcắt thụ thể NA và protein đệm M (matrix) Lipid tập trung ở màng virus, chủ yếu làlipid có gốc photpho, số còn lại là cholesterol, glucolipid và một ít carbohydrategồm các loại đường galactose, mannose, ribose, fructose, glucosamin Bên trongvirus có cấu trúc phức tạp gồm protein capsid và các sợi ARN nối với nhau thànhcác nucleocapsid có cấu trúc đối xứng xoắn Vỏ của virus được cấu tạo bởi 2 lớplipid, trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu

có độ dài khoảng từ 10 -14 nm có đường kính 4-6 nm, đó là những kháng nguyên

bề mặt của virus bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm : HA, NA, MA( matrix) vàcác dấu ấn khác của virus ( Bender và cs., 1999; Zhou và cs., 2007) Có sự phân bốkhông đồng đều giữa các phân tử HA và NA (tỉ lệ khoảng 4HA/1NA), đây là hailoại kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tếbào cảm nhiễm (Murphy và Webster, 1996; Wagner và cs., 2002)

Hệ gen virus cúm A là ARN sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt(Hình 1.1A), mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus, các phân đoạn được sắpxếp theo trật tự: PB2, PB1 (PB1 và PB1-F2), PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS(NS1 và NS2) (Murphy và Webster, 1996; Rabadan và cs., 2006) Mỗi phân đoạnARN của virus cúm A có cấu trúc xoắn bậc 2 α đối xứng dài 50 -100 nm, đườngkính 9 -10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein (NP) với bản chất là lipoprotein, tạothành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) (Hình 1.1B)

Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc virus cúm A

(A) Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A; (B) Cấu trúc phức hợp

ribonucleoprotein RNP của virus cúm

(Nguồn: Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge)Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptidetạo nên vòm (loop) tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi RNAduy nhất có độ dài từ 10.000 -15.000 nucleotide (tuỳ theo từng chủng virus cúm A)

và có cấu trúc xoắn α (α-helix) bên trong vỏ virus

HA có chức năng giúp virus bám dính vào tế bào cảm thụ và đưa vật liệu ditruyền của virus vào bên trong tế bào NA có chức năng thúc đẩy sự lắp ráp để giảiphóng virus từ các tế bào cảm thụ Các glycoprotein HA và NA quyết định tínhkháng nguyên đặc hiệu của từng phân type virus khác nhau và cũng là vị trí để cácloại thuốc kháng virus trong điều trị bệnh sẽ gắn kết và phát huy tác dụng diệt virus.Đồng thời HA và NA còn có vai trò quan trọng trong việc quyết định tính khángnguyên trong sản xuất vacxin

Về mặt dịch tễ học, virus cúm A có nhiều biến chủng khác nhau, thích ứng hầunhư với mọi loài vật chủ và hệ gen luôn luôn biến đổi, định kỳ gây nên những vụdịch cúm trong lịch sử ở động vật và người ( Ito và cs., 1998; Webster 1998) Dođặc tính biến đổi nội gen nhanh chóng và trao đổi gen để tái tổ hợp tạo biến thể mới

truyền lây trong quần thể sinh vật, cho nên virus cúm A thuộc nhóm virus nguyhiểm gây bệnh động vật sang người (zoonotic infections) Virus cúm A/H7N9 đượccoi là loại biến chủng có mức độ độc lực cao cho các loài động vật và người, cónhiều minh chứng khoa học là chủng này bắt nguồn từ H6N2 hoặc trao đổi genthông qua H9N2 (Horimoto và cs., 2001; Xu và cs., 1999).

1.1.3 Đa hợp tạo nên phân type gen của virus cúm A/H7N9

Đặc điểm sinh học phân tử và thành phần tái tổ hợp gen của hệ gen virus A/H7N9:Phân đoạn gen kháng nguyên HA (H7) được lấy từ các chủng ZJ12-like (H7N3) nguồngốc vùng Zhejiang, Trung Quốc (đại diện: chủng A/duck/ Zhejiang/12/2011(H7N3)) cóvật chủ là vịt; phân đoạn gen kháng nguyên NA(N9) tái tổ hợp từ các chủng KO14-like(H7N9) nguồn gốc Hàn Quốc (đại diện: A/wild bird/Korea/A14/2011 (H7N9)) có vậtchủ là chim hoang dã; và 6 phân đoạn gen cấu trúc còn lại (tổ hợp gen chức năngenzyme PB2; PB1; PA; tổ hợp gen cấu trúc NP; M; NS) hoàn toàn thu nhận từ chủngBJ16-like (H9N2) (đại diện: A/brambling/Beijing/16/2012 (H9N2)) có vật chủ là chimbrambling hoang dã (Gao và cs., 2013) (Hình 1.2)

Hình 1.2 Nguồn gốc của các phân đoạn gen của chủng virus H7N9 tái tổ hợp

Ghi chú: (1) vi rút cúm vịt nhà A/H7N3 (2) vi rút cúm chim hoang dã A/H7N9 (3)

vi rút cúm gà A/H9N2 (4) vi rút cúm tái tổ hợp A/H7N9 (5) vi rút lây sang người.

(Nguồn: Gao và cs., 2013)

Phân tích tái tổ hợp các phân đoạn và quan hệ phả hệ của các chủng

H7N9-2013 (đại diện là A/Anhui/1/H7N9-2013(H7N9) với 221 chủng virus cúm A khác chothấy, chủng A/Anhui/1/2013(H7N9) có độ tương đồng đến 98,98% đến 100%nucleotit với các chủng cúm A/H9N2 vùng Zhejiang (đại diện là chủngA/environment/Zhejiang/16/2013(H9N2) (Feng và cs., 2013; Yu và cs., 2014).Chủng cúm A/H9N2 vùng Zhejiang được tái tổ hợp gen cấu trúc NS từ chủngA/chicken/Dawang/1/2011-like (H9N2) và năm gen cấu trúc khác (PB2, PB1, PA,

PN, M) của chủng A/ brambling/Beijing/16/2012-like (H9N2) (Feng và cs., 2013).Điều đặc biệt quan tâm là sự tồn tại của vật chủ gia cầm và cúm A/H9N2 là thườngxuyên nên khả năng cúm A/H7N9 có thể là điều kiện thuận lợi cho quá trình tái tổhợp trao đổi phân đoạn gen của H9N2 do vậy, đặc tính cấu trúc của H7N9 chịu ảnhhưởng của cúm A/H9N2 (Yu và cs., 2014) Tuy nhiên cho đến nay, chưa biết virusA/H7N9 này đã được tái tổ hợp lúc nào, trên loài động vật nào từ các nguồn genthành phần nói trên, sau quá trình tam hợp từ 3 dòng virus cho gen nguyên thủy.Mặc dù vậy, phân dòng gây dịch H7N9 gây nhiễm trên người này có khả năng lantruyền nhanh, chủ yếu khu trú ở gia cầm sống tập trung ở chợ và do vậy đây lànguồn tiếp xúc thường xuyên cho người, tạo nên sự lây nhiễm trong cộng đồng(Lam và cs., 2013)

1.1.4 Đặc điểm kháng nguyên bề mặt của virus cúm A/H7N9

Dựa trên các nghiên cứu về virus cúm A/H7N9, vị trí điểm phân cắt đơn phân

PEIPKGR/GLF (Li và cs., 2015) Trình tự gen HA của các chủng virus cúm H7N9

gây bệnh trên người và gia cầm tại Trung Quốc không mang vị trí điểm cắt HAgồm mạch liên tục các axit amin kiềm (multi–basic cleavage sites, ví dụ

PQRESRRKK/GLF) – đặc điểm đặc trưng của các virus cúm H5 và H7 độc lực

cao (Senne và cs., 1996; Subbarao và cs., 2003) Tuy nhiên, các ca bệnh nhiễm cúmA/H7N9 đều có biểu hiện lâm sàng giống với cúm A/H5N1 như : tổn thương cơ,tiêu cơ nặng nề, viêm thận, suy phủ tạng bệnh nặng, nguy cơ tử vong cao Điều

này chứng tỏ virus H7N9 có khả năng tái bản hiệu quả trên người, mặc dù khángnguyên HA của chúng được coi là độc lực thấp Điều này làm dấy lên những lo ngạitrong quá trình bùng phát các chủng virus cúm H7 độc lực thấp trên gia cầm có thểsinh ra một chủng độc lực cao nhờ thu nhận được vị trí phân cắt HA đa axit aminkiềm Điều này đã từng xảy ra với virus cúm H7N1 khi bùng phát trên gà ở Italy(Capua và cs., 1999, 2000).

Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, virus H7N9 tỏ ra thích ứng nhanh hơn với tếbào của loài có vú, hơn những type khác do có sự biến đổi trong hệ gen Đột biếnđiểm trên gen mã hóa kháng nguyên HA của virus H7N9 đưa đến sự thay thếglutamine bằng leucine ở vị trí 226 (Q226L) được cho là làm giảm khả năng kếthợp với các thụ thể ở gia cầm (có mối nối α-2,3) nhưng lại làm tăng khả năng kếthợp với các thụ thể ở người (có mối nối α-2,6) (Gao và cs., 2013) Đột biến Q226Lđược tạo ra trong phòng thí nghiệm tại vị trí loop 210 của protein HA cũng cho thấy

sự thay đổi điểm bám từ thụ thể của gia cầm ban đầu sang thụ thể của người và làmtăng khả năng virus được truyền đi qua không khí (Herfst và cs., 2012; Imai và cs.,2012) Điều này có nghĩa là sự phát tán và lan truyền virus H7N9 sẽ dễ dàng hơn.Protein Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) là kháng nguyên bề mặtđặc trưng cho bản chất của từng chủng virus cúm A (Keawcharoen và cs., 2005), cóvai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình gây nhiễm và góp phần rất lớn quyết địnhtính gây bệnh của virus Protein Hemagglutinin là một glycoprotein thuộc protein

màng type I (lectin), có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in

vitro), kháng thể đặc hiệu với HA có thể phong tỏa sự ngưng kết đó, được gọi là

kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI- Hemagglutinin Inhibitory test) Có 18

phân type HA đã được phát hiện, trong đó có 3 phân type (H1, H2 và H3) thích ứnglây nhiễm gây bệnh ở người liên quan đến các đại dịch cúm đã xảy ra trong lịch sử(Murphy và Webster, 1996 ) Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid củamột virus, có vai trò quan trọng trong quá trình nhận diện virus và khởi động quátrình xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc hemagglutinin

Chú thích: Lipid bilayer of envelope: Lớp màng bao lipid kép, 4 Major antigenic variable

regions: 4 vùng biến đổi kháng nguyên chính, Receptor site: vị trí gắn với receptor

(Nguồn: Wagner và cs., 2002)Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 Å, cấu tạo gồm 3 đơn phân(trimer) (Hình 1.3), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ hai tiểu đơn vịHA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa) Các đơn phân sau khi tổng hợp đã được glycosylhóa (glycosylation) và gắn vào mặt ngoài capsid là tiểu đơn vị HA2, phần đầu tự dohình chỏm cầu được tạo bởi dưới đơn vị HA1 chứa vị trí gắn thụ thể thích hợp của

HA trên bề mặt màng tế bào đích (Bosch và cs., 1981)

Trên phân tử HA có hai vùng kỵ nước ở tận cùng đầu N và đầu C Vùng kỵ nước

ở đầu tận cùng N định hướng cho protein ra khỏi màng tế bào và bị cắt bỏ khỏi HA

trưởng thành, còn vùng tận cùng đầu C (gốc amino acid từ 186-211 của HA2) cónhiệm vụ neo giữ phân tử protein trên vỏ virus (Chen và cs., 1999) Sự biến đổi tronggen mã hoá cho kháng nguyên HA là nguyên nhân gây ra các vụ dịch hằng năm

Trình tự mã hóa chuỗi nối và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng nhưcác vị trí amino acid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích ứng, được coi làcác chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA Protein HA

kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA vàtham gia vào phản ứng trung hòa virus Vì thế HA được coi là protein vừa quyếtđịnh tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus vừa là đích của bảo vệmiễn dịch nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm và là cơ sở trongđiều chế các vacxin phòng cúm hiện nay (Horimoto và cs., 2006; Keawcharoen vàcs., 2005).

1.1.5 Tình hình dịch cúm A/H7N9

Chủng virus cúm H7N9 trước đây đã từng xuất hiện nhưng chỉ gây ra dịchbệnh trên chim tại Hà Lan, Nhật Bản và Hoa Kỳ Ba trường hợp nhiễm virus cúmgia cầm A/H7N9 đầu tiên trên người được phát hiện và công bố tại Thượng Hải và

An Huy, Trung Quốc vào ngày 31/03/2013 (WHO, 2013) Chỉ trong một thời gianngắn, tính đến ngày 09/06/2013 loại virus nguy hiểm này đã lây lan ra 11 tỉnh thànhcủa Trung Quốc, gây ra 131 trường hợp nhiễm bệnh, đa phần bị suy hô hấp nặng,trong đó 39 người đã tử vong

Sau khi dịch cúm xảy ra, Uỷ ban Nông nghiệp Thành phố Thượng Hải đã ralệnh tiêu hủy các mẫu chim bồ câu và gia cầm có biểu hiện nhiễm cúm H7N9 Chođến nay, hơn 20.000 con gia cầm đã bị tiêu hủy tại các khu vực kinh doanh gia cầmtại Thượng Hải Chính quyền Thượng Hải và Hàng Châu cũng ra lệnh tạm thờiđóng cửa một số khu vực kinh doanh gia cầm sống để đối phó với nạn dịch Ướctính thiệt hại do dịch cúm H7N9 gây ra đối với ngành công nghiệp gia cầm ở TrungQuốc đã lên đến 2,7 tỷ USD (Flannery R, 2013) Bên cạnh đó, giá các sản phẩm liênquan đến gia cầm tiếp tục giảm mạnh, lượng tiêu thụ sụt giảm nhanh chóng và hàngloạt lao động trong ngành gia cầm bỏ việc

Bên cạnh đó, các trường hợp nhiễm bệnh liên quan đến du lịch cũng được báocáo ở Malaysia, Đài Loan, Hồng Kông và Canada Từ tháng 3/2013 đến 10/2015WHO đã ghi nhận hơn 700 trường hợp người nhiễm bệnh và hơn 200 trường hợp

tử vong Theo báo cáo của cơ quan y tế công cộng Canada, từ khi trường hợp đầutiên được phát hiện năm 2013 đến nay, đã xảy ra 4 đợt bùng phát dịch cúm A/H7N9

ở người Đợt 1 từ tháng 3/2013 đến tháng 5/2013 xảy ra ở các tỉnh Thượng Hải, An

Huy và 11 tỉnh phía Đông Trung Quốc Đợt 2 từ tháng 10/2013 đến tháng 3/2014,dịch cúm đã lan truyền đến tỉnh Giang Tô phía Nam Trung Quốc với biên độ lớnhơn cả về số lượng và mức độ nguy hiểm Đợt 3 từ tháng 10/2014 đến tháng3/2015, phần lớn các trường hợp được báo cáo trong tháng 1 và 2 ở tỉnh GiangĐông phía Nam Trung Quốc Ngày 26/1/2015 trường hợp nhiễm cúm A/H7N9 từTrung Quốc đầu tiên được phát hiện ở Canada và trường hợp thứ 2 ngày 29/1/2015.

Số lượng người nhiễm và chết bởi cúm A/H7N9 đợt 3 tương tự đợt 2 Đợt 4 đượcthông báo bởi tổ chức FAO (Food and Agriculture Organization) ngày 15/10/2015sau khi 2 trường hợp nhiễm cúm A/H7N9 được phát hiện ở Trung Quốc Các bằngchứng đến nay cho thấy cúm A/H7N9 xảy ra theo mùa chủ yếu vào mùa Đông Xuân

Cụ thể, tất cả các chủng có vị trí bám thụ thể 177V và 217 L/I ( trong đó H3

có vị trí 186V và Q226L/I) trong HA1 Tất cả virus đều mất 69-73 axit amin ở NA,

59 chủng có 627K trong PB2, 10 chủng mang 701N, 78 chủng mang I368V trong

PB, giống với virus phân lập năm 2013 Một số thay đổi axit amin quan trọng liênquan đến khả năng gây bệnh và thích ứng trên người đã được tìm thấy (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Một số thay đổi axit amin liên quan đến khả năng lây

nhiễm, gây bệnh và tính nhạy cảm với thuốc kháng virus của virus

cúm gia cầm A(H7N9) phân lập từ đợt dịch thứ năm.

E 20 2

Phân tích virus được phân lập gần đây từ Trung Quốc và Hồng Kông khôngcho thấy sự thay đổi trong các thay đổi đã biết liên quan độc tính và sự thích ứng ởngười So sánh với chủng virus vacxin, sự thay thế amino axit trong HA của một sốvirus đã được xác định ở vị trí kháng nguyên Phân tích hiện đang được tiến hành

để xác định xem các virus vacxin hiện có có liên quan kháng nguyên với virus ở đợtdịch thứ năm hay không Theo Tổ chức Y tế thế giới không loại trừ khả năng cúmgia cầm A/H7N9 lây từ người sang người trong những ổ dịch mới đây tại TrungQuốc Mặc dù, cho đến nay chưa có bằng chứng nào về việc virus cúm A/H7N9 lâytruyền từ người sang người - yếu tố cơ bản để H7N9 có thể biến chuyển thành mộtđại dịch cúm Tuy nhiên, vì sự lan truyền giữa người và người đã từng xảy ra vớivirus H7 (dịch H7N7 ở Hà Lan năm 2003) nên cũng cần phải cảnh giác về khả nănglây truyền người-người của virus H7N9 hiện nay

Ở Việt Nam chưa ghi nhận trường hợp cúm A/H7N9 trên người cũng nhưtrên gia cầm; tuy nhiên, nguy cơ xâm nhập, lan truyền và gây bùng phát dịch rất cao

do Việt Nam có đường biên giới trải dài với Trung Quốc Hơn nữa, cúm H7N9cũng thuộc nhóm virus cúm A cùng với các subtype khác như H5N1, H1N1 vốnđược chứng minh là có độc lực cao và có thể tái tổ hợp với nhau để tạo nên chủngmới nguy hiểm hơn Trong quá khứ và hiện tại, Việt Nam là một trong những nước

bị ảnh hưởng nặng nề bởi các đợt dịch cúm, tiêu biểu là cúm A/H5N1 Chính vìvậy, vấn đề cấp bách hiện nay ngoài việc triển khai các biện pháp phòng bệnh chủđộng như sử dụng trang thiết bị cho việc giám sát như máy đo thân nhiệt từ xa, các

hệ thống xét nghiệm xác định virus… cần thiết nghiên cứu chủ động sản xuất vắcxin do đây là chủng virus mới, cộng đồng chưa có miễn dịch, chưa có vắc xinphòng bệnh, đồng thời hiện cũng không có thuốc điều trị đặc hiệu nên khi lây sangngười dễ bùng phát thành dịch và khó khăn trong điều trị

1.2 Vắc xin phòng chống bệnh cúm A

1.2.1 Một số loại vắc xin phòng bệnh cúm A hiện nay

Vắc xin được hiểu là chế phẩm có tính kháng nguyên dùng để tạo miễn dịchđặc hiệu chủ động, nhằm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với một số tác nhân

gây bệnh cụ thể Kháng nguyên (là thành phần chủ yếu của vắc xin ): là những phân

tử kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể Khả năng kích thích sinh miễn dịch củakháng nguyên gọi là tính kháng nguyên.Tính kháng nguyên của một vaccine mạnhhay yếu phụ thuộc vào tổng số nhóm quyết định kháng nguyên, trọng lượng phân

tử, thành phần hóa học, cấu trúc lập thể, khả năng tích điện… của các phân tử khángnguyên Một kháng nguyên ngoài tính kháng nguyên mạnh còn cần có tính đặc hiệucao để tạo được sự bảo vệ tốt cho cơ thể.Tính đặc hiệu phụ thuộc vào tích chất vàcấu trúc của các nhóm quyết định tính kháng nguyên Kháng nguyên để chế tạo vắcxin có thể là kháng nguyên của vi sinh vật, thành phần các yếu tố gây bệnh của visinh vật, DNA, protein tái tổ hợp

Hiện nay, có một số hướng tiếp cận để tạo vắc xin cúm: (1) vắc xin n cúm bấthoạt; (2) vắc xin tiểu đơn vị và (3) vắc xin DNA

Vắc xin bất hoạt: Vắc xin bất hoạt được sản xuất từ chủng virus tái tổ hợp

(reassortant virus) Chủng virus này được tạo thành bằng cách lắp ráp gen HA và NAcủa chủng virus gây bệnh hiện hành (được khuyến cáo bởi WHO) vào chủng virus cókhả năng sinh sản nhanh ở trong trứng gà như chủng PR8 (Kilbourne, 1969) Chỉnhững chủng virus tái tổ hợp nào có khả năng sinh trưởng nhanh (A high growthreassortant-HGR) giống như chủng PR8, đồng thời mang gen HA, NA của chủng virusgây bệnh được khuyến cáo bởi WHO mới được chọn để làm chủng sản xuất VirusHGR mang gen HA và NA của chủng virus gây bệnh hiện hành được nuôi trong phôitrứng gà Virus trong dịch niệu được bất hoạt bằng hóa chất, thông thường dùngformalin ngoài ra còn dùng β-propiolactone, binary enthyleneimine (Fiore và cs., 2009;Hickling và D'Hondt, 2006) Với việc sản xuất vắc xin dựa trên phôi trứng gà, thời giancần thiết cho toàn bộ quá trình chuẩn bị vắc xin (từ khi xác định các chủng virus đếnvắc xin sẵn sàng / vắc xin cuối cùng) mất khoảng 5-6 tháng (Kang và cs., 2009; Wright,2008) Riêng vắc xin dùng cho gia cầm thường thì không cần phải tinh sạch mà dùngluôn dịch niệu thô sau khi bất hoạt và trộn với tá dược Mặc dù vậy cần phải có hàngtrăm triệu quả trứng sạch bệnh (nuôi trong điều kiện vô trùng) mỗi năm, để sản xuấtvắc xin cúm (Wright, 2008)

Vắc xin dưới đơn vị (vắc xin tiểu đơn vị): là vắc xin thay vì sử dụng toàn bộ

vi sinh vật, hay độc tố của chúng mà sử dụng các mảnh protein của mầm bệnh để

kích thích sinh miễn dịch Rất nhiều hệ thống biểu hiện in vitro được sử dụng để

biểu hiện vaccine trong phòng thí nghiệm, nhưng hiện nay chưa một công nghệ nàođược ứng dụng thành công đưa ra thành phẩm Hệ thống biểu hiện rất đa dạng từ tếbào thực vật đến tế bào động vật, nấm men, vi khuẩn, virus Nhưng hệ thống sửdụng tế bào côn trùng nhiễm virus baculovirus được sử dụng phổ biến hơn cả đểbiểu hiện HA HA thu được bằng cách ly tâm tế bào, phá hủy tế bào và bất hoạtbằng hóa chất, nhũ hóa giống với việc làm vacxin bất hoạt Một phương pháp khác

để sản xuất vắc xin cúm là dựa vào nuôi cấy tế bào động vật Phương pháp nàyđược đưa ra từ giữa những năm 90 của thế kỷ trước nhưng đến nay vẫn đang ở giaiđoạn nghiên cứu thử nghiệm Tế bào thận động vật có vú được sử dụng nhiều nhất.Quá trình này giống với quá trình lên men vi sinh vật, vì thế có thể mở rộng quy

mô Tuy nhiên chưa có dòng tế bào động vật nào cho phép nhân nhanh virus cúm,nguy cơ vắc xin bị nhiễm các mầm bệnh hoặc độc tố của người và vật nuôi vẫn tồntại, và giá thành không giảm so với phương pháp cũ (Wright, 2008)

Vắc xin DNA: là loại vắc xin sử dụng chính đoạn ADN của mầm bệnh mã

hoá kháng nguyên biểu hiện trên tế bào vật chủ thích nghi Tế bào này sẽ giúp sao

mã, giải mã và dịch mã để tạo ra các protein kháng nguyên Các protein khángnguyên này sẽ kích thích hệ thống miễn dịch sinh miễn dịch nếu kháng nguyên nàyxâm nhập vào lần sau Vắc xin ADN là các nucleic acid trần chứa cDNA mã hóacho protein Hemagglutinin dưới sự điều khiển của promoter động vật Cũng giốngnhư virus làm giảm độc lực, Vacxin ADN có khả năng cảm ứng cả hai hệ thốngmiễn dịch: miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào Với động vật thí nghiệm là gà thì

sự đáp ứng miễn dịch của Vacxin ADN có phần kém so với các vắc xin tái tổ hợp,

vaccine tiểu đơn vị biểu hiện in vitro, in vivo Hơn nữa, để có đáp ứng miễn dịch

hiệu quả thì Vacxin ADN cần lượng lớn ADN và cần ít nhất ba lần tiêm Đây cũng

là hai lý do chính làm cho Vacxin ADN vẫn chưa thể ứng dụng cho việc sản xuấtlượng lớn làm vắc xin (Kodihalli và cs, 1999)

1.2.2 Các nghiên cứu về Vắc xin cúm A/H7N9 hiện nay trên thế giới

Cả hai chủng A/H7N9 là A/Shanghai/2/2013(H7N9) và chủngA/Anhui/1/2013(H7N9) được chọn làm ứng viên cung cấp gen kháng nguyên H7

cho công nghệ di truyền ngược tạo vắc xin (Gao et al., 2013) Từ hai chủng này các

chủng vacxin đã được tạo ra bằng công nghệ di truyền ngược, trong đó có chủngNIBRG-268 (tại NIBSC, Vương Quốc Anh), NIIDRG-10.1 tại NIID, Nhật Bản; và

virus/candidates_reagents/a_h7n9/en/index.html) Trung Quốc cũng đã tạo vaccine

và thử nghiệm thành công đáp ứng miễn dịch cúm A/H7N9

Nhiều cơ sở nghiên cứu và các hãng sản xuất vắc xin thương mại đã nhanhchóng tạo chủng vắc xin và thử nghiệm miễn dịch kịp thời, trong đó phải kể đến:+ Cuối tháng 10/2013, Trung Quốc công bố đã tạo được chủng vắc xin cúmA/H7N9 và đã bước đầu thử nghiệm trên động vật Hãng Sinovac Biotech Ltd củaTrung Quốc đã chế tạo và thử nghiệm thành công vắc xin cúm A/H7N9, đang xúctiến phê chuẩn lâm sàng (clinical trail application, CTA) với cơ quan thẩm quyền

vaccines/virus/candidates_reagents/summary_a_h7n9_cvv_20140124.pdf?ua=1

+ Tháng 11/2013, các nhà khoa học Mỹ tại Novavax công bố thử nghiệm lâmsàng thành công một loại vắc xin H7N9, từ chủng A/Anhui/1/13 (H7N9), tạo ra hạtvirus (VLP, virus like particle) sản xuất trong tế bào côn trùng bằng công nghệbaculovirus tái tổ hợp Virus vắc xin kết hợp phân đoạn gen hemagglutinin HA(H7)

và neuraminidase NA(N9) của chủng A/Anhui/1/13 với phân đoạn M (M1) của

chủng A/Indonesia/5/2005(H5N1) (Fries et al., 2013).

+ Trung tâm Kiểm soát và phòng chống bệnh tật Hoa kỳ (CDC), Viện quốcgia về Tiêu chuẩn và Kiểm soát sinh học Vương quốc Anh (NIBSC) và một số cơquan khác ở Nhật Bản và Hoa Kỳ, bằng công nghệ di truyền ngược đã tạo ra mộtloạt virus giống gốc vắc xin của A/H7N9 (Bảng 1) từ các chủngA/Shanghai/2/2013(H7N9) và A/Anhui/1/2013(H7N9) (và sẳn sàng chuyển giaocho các đối tác có nhu cầu sử dụng làm vắc xin

Bảng 1.2 Danh sách một số giống gốc vắc xin cúm A/H7N9 chuyển giao cho cơ

sở có nhu cầu sản xuất

HA và NA tổng hợp IDCDC-RG32A.3 Di truyền ngược CDC, USA

1.2.3 Vắc xin tái tổ hợp từ thực vật

Những năm gần đây, ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong sản xuất cácprotein chức năng đang được chú trọng và ngày càng đóng góp nhiều trong chămsóc sức khỏe con người và động vật Sử dụng thực vật chuyển gen để sản xuất cácprotein chức năng nói chung và vắc xin nói riêng được khái quát thành thuật ngữ

“molecular farming in plants” (Fischer và cs., 2000) Sở dĩ hệ thống biểu hiện ởthực vật đóng vai trò quan trọng trong sản xuất protein chức năng vì chúng có một

số ưu điểm so với các hệ thống biểu hiện khác: (1) Bất kỳ một protein tái tổ hợpnào cũng có thể được sản xuất theo qui mô nông nghiệp do đó chi phí sản xuất thấp,thực vật được thu hoạch, cất giữ theo phương thức truyền thống mà không cần bất

cứ đầu tư thêm cơ sở hạ tầng (Schillberg và cs., 2003) (2) Tế bào thực vật là tế bàocủa sinh vật nhân thật do đó cho phép thực hiện việc định vị chính xác protein tái tổ

hợp trong tế bào, cũng như cho phép protein có những biến đổi sau dịch mã (Wagner

và cs., 2004) (3) Protein tái tổ hợp được tích lũy trong tế bào thực vật có thể đạt mứccao: lên tới 14,4% lượng protein tổng số trong lá trưởng thành (Verwoerd và cs.,1995) Đặc biệt, khi được gắn với elastin-like polypeptids (ELP), protein tái tổ hợp cóthể tích lũy lên tới 25% protein tổng số trong hạt (Scheller và cs., 2006) (4) Protein tái

tổ hợp sản xuất từ thực vật sẽ tránh được sự tạp nhiễm của các virus (HIV, HBV,SV40…) và vi khuẩn (Fischer và cs., 2000; Daniell và cs., 2001)

Kháng nguyên đầu tiên biểu hiện thành công trong cây trồng được Curtiss vàCardineau công bố vào năm 1990 khi tác giả biểu hiện kháng nguyên bề mặt củachủng Streptococus (SpaA) trong cây thuốc lá Khối mô thực vật chứa khángnguyên SpaA được trộn với thức ăn của chuột có khả năng cảm ứng để tạo ra khángthể kháng SpaA Công trình này đã được nhóm tác giả đăng ký bằng sáng chế vàonăm 1990 Tiếp theo Mason và cs đã biểu hiện thành công kháng nguyên bề mặt củavirus viêm gan B (HBsAg) và lúc đó thuật ngữ vacxin ăn được (edible vaccine)được đưa ra (Mason và cs., 1992)

Vắc xin ăn được có thể cảm ứng hệ thống miễn dịch niêm mạc (mucosalimmune system-MIS) Miễn dịch niêm mạc (ở đường hô hấp, đường tiết niệu vàđường ruột) là hàng rào bảo vệ đầu tiên của cơ thể (Van Ginkel và cs., 2000) Ởhàng rào bảo vệ này có những tế bào chuyên hóa để có thể nhận biết các khángnguyên được gọi là tế bào M (Van Ginkel và cs., 2000) Mặc dù chức năng của tếbào M vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ nhưng một số nghiên cứu gần đây chorằng chúng có liên quan tới quá trình hấp thụ, vận chuyển, chế biến và trình diệnkháng nguyên (Van Ginkel và cs., 2000) Hệ thống miễn dịch niêm mạc khi bị kíchthích sẽ sản sinh ra các immunoglobulin tiết dạng A (secretory immunoglobulintype A (S-IgA) S-IgA có thể cản trở sự tương tác giữa mầm bệnh và các thụ thể ởtrên bề mặt tế bào đường niêm mạc (Berinstein và cs., 2005)

1.2.4 Một số nghiên cứu về vắc xin cúm ở Việt Nam

Virus cúm gia cầm (CGC) H5N1 xâm nhập vào Việt Nam cuối năm 2003.Virus cúm A/H5N1 có đặc tính đột biến rất nhanh và đến nay, đã có nhiều biến

chủng H5N1 được phát hiện và phân lập ở nhiều nước từ châu Á sang châu Âu Ở ViệtNam, cũng đã phát hiện nhiều chủng virus A/H5N1 được xếp loại vào các nhánh(clade) khác nhau như: Clade 1, clade 3, clade 2.3.4, clade 2.3.2.1, 2.3.4.1, 2.3.4.2,2.3.4.3, … (Cục Thú y, 2017) Có thể nói, khả năng biến chủng của virus CGCA/H5N1 thể độc lực cao là rất phức tạp Sự tiến hoá của virus cúm A/H5N1 làm thayđổi tính kháng nguyên, ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch của gia cầm (GC) khi đượctiêm phòng vắc xin (Nguyễn Hoàng Đăng và cs, 2016) Bên cạnh đó, cũng từ năm 2014đến nay, đã xuất hiện thêm subtype H5N6 của virus cúm type A, gây nên các ổ dịch ởcác tỉnh miền Bắc và miền Trung (Nguyễn Đăng Thọ và cs, 2016) Virus có nguồn gốcgen HA thuộc về clade 2.3.4.4 là subclade của clade 2.3.4 đã từng lưu hành trong cácnăm 2008 – 2012 và gây ra những thiệt hại lơn cho ngành chăn nuôi GC ở nước ta.Virus A/H5N1 clade 2.3.2.1C, kể từ khi xuất hiện ở Việt Nam năm 2012, đã gây bệnhtại khắp các tỉnh miền Bắc, Bắc Trung bộ và vùng duyên hải Miền Trung Nhóm virusnày gây nên các ổ dịch ở Lạng Sơn và lây lan tới Quảng Ngãi, gây chết nhiều ngan, vịt.Đến nay, nhánh virus này tập trung chủ yếu ở các tỉnh Nam Bộ, Bắc Bộ, Bắc Trung bộ,Tây Nguyên và các tỉnh duyên hải Miền Trung (Cục Thú y, 2014-2017) Việc xuất hiệnnhiều phân nhóm mới của virus CGC A/H5N1 và khả năng biến chủng ngày càng phứctạp của chúng đang là thách thức lớn với ngành chăn nuôi và y tế cộng đồng (TrầnXuân Hạnh và cs, 2013, Nguyễn Đăng Thọ và cs, 2016) Trong khuôn khổ Đề tài

“Nghiên cứu sự phân bố các biến chủng (clade mới của vi rút cúm A/H5N1 trên đàn giacầm ở Việt Nam làm cơ sở cho việc phòng chống dịch bệnh đạt hiệu quả cao”, có mã

số ĐTĐL.CN-10/15 do Bộ Khoa học và Công nghệ cấp kinh phí, hiệu lực một số loạivắc xin phòng bệnh CGC hiện hành được đánh giá bằng thí nghiệm công cường độc(CCĐ) với biến chủng A/H5N1 clade 2.3.2.1C, thông qua khả năng bảo hộ bệnh lâmsàng và tác dụng giảm bài thải virus cường độc trên gà được dùng vắc xin

Cho đến nay, sau gần 10 năm xuất hiện tại Việt Nam, virus cúm A/H5N1 vẫn làmột tác nhân nguy hiểm cho gia cầm và các ổ dịch thường xuyên tái phát hàng năm,nhìn chung, nhánh virus clade 2.3.2.1 và clade 1.1 vẫn tiếp tục gây gây bệnh ở hầu

khắp các tỉnh miền Bắc, miền Trung và Tây Nguyên; nhánh virus clade 1.1 gâybệnh ở một số tỉnh phía Nam Riêng nhánh mới 2.3.2.1 chia thành 3 phân nhánh (A,

B và C), khiến cho hiệu lực vắc xin hiện tại giảm và chương trình tiêm phòng gặp nhiều khó khăn (Nguyễn Ngọc Tiến, 2013)

- Virus thuộc clade 2.3.2.1A, xuất hiện từ giữa năm 2010 đến đầu năm 2012

tại hầu khắp các tỉnh miền Bắc, miền Trung, Tây Nguyên và Đông Nam Bộ, hiệnnay (2014) đã có mặt trên toàn bộ lãnh thổ Việt Nam Vắc xin phòng chống clade2.3.2.1A (vắc xin Re-5) đã có và clade này chưa gây nguy hại lớn ở nước ta

- Virus thuộc clade 2.3.2.1B, được phát hiện tại một số địa phương năm 2012,

như Quảng Ninh, Bắc Ninh, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Phú Thọ, Nam Định, TháiBình, Sơn La, Ninh Bình, Nghệ An Năm 2013 không thấy công bố phân lập, có xu hướng không còn tồn tại

- Riêng virus thuộc clade 2.3.2.1C, xuất hiện năm 2012, gây bệnh khắp các

tỉnh miền Bắc, Bắc Trung bộ và vùng duyên hải miền Trung Nhóm này mới xâmnhập vào Việt Nam, gây bệnh và làm chết nhiều vịt, ngan, từ ổ dịch từ Lạng Sơn vàlây lan cho đến Quảng Ngãi, Khánh Hòa; hiện nay có phát hiện tại các tỉnh NamTrung Bộ và có xu hướng dịch chuyển sâu vào phía Nam, để trở nên một nhánh

virus nổi trội trong cả nước (Nguyễn Ngọc Tiến và cs , 2011; Nguyễn Ngọc Tiến, 2013; Trần Xuân Hạnh và cs., 2013; Văn Đăng Kỳ, 2012; Nguyễn Thị Bích Nga và

cs., 2013) Vacxin hiện đang sử dụng không có khả năng phòng chống lại clade

2.3.2.1C này và cũng chưa có vắc xin mới được sản xuất Như vậy, clade 2.3.2.1Cđang là thách thức lớn đối với chăn nuôi gia cầm và y tế cộng đồng, nếu clade nàythích ứng gây bệnh trên người

Để đánh giá hiệu lực của một số loại vacxin phòng bệnh cúm gia cầm hiệnđang được sử dụng tại Việt Nam chống lại biến chủng virus cúm A/H5N1 clade2.3.2.1C cường độc mới xuất hiện, thí nghiệm đã được thực hiện trên gà được tiêmmột trong ba loại vắc xin : Navet-vifluvac, Re-5 và Re-6 Xét nghiệm huyết thanhsau khi gây miễn dịch bằng phản ứng HI, sử dụng kháng nguyên đồng chủng vớikháng nguyên trong vacxin cho thấy: Vắc xin Navet-vifluvac kích thích tạo kháng

thể với hiệu giá là 4,7 log2; với vắc xin Re-5 là 7,8 log2 và với vacxin Re-6 là 5,2log2 Kết quả công cường độc cho gà bằng virus cúm gia cầm A/H5N1 clade2.3.2.1C như sau: Vắc xin Navet-vifluvac bảo hộ được 80% số gà thí nghiệm; trongkhi đó với vacxin Re-6 là 90% và vacxin Re-5 là 40% Cả 3 loại vắc xin đều có tácdụng làm giảm rõ rệt lượng virus bài thải từ gà đã tiêm phòng khi so sánh với gàkhông được tiêm (Tô Long Thành và cs., 2018)

1.3 Biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vật thông qua Agrobacterium

1.3.1 Hệ thống biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vât

Hệ thống biểu hiện tạm thời là một phương pháp rất hữu ích để phân tích khảnăng biểu hiện của một protein đích trong thực vật vì phương pháp này nhanh,không bị ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có thể tiến hànhbiểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàn toàn như lá (Fischer và cs., 1999) Trongnhững năm gần đây biểu hiện tạm thời của protein trong thực vật trở nên một quytrình chiếm ưu thế hơn so với việc tạo ra những cây chuyển gen ổn định vì nó đạtđược sự biểu hiện protein ở mức độ cao

Biểu hiện tạm thời ở thực vật đã được chứng minh mang các ưu điểm tương

tự khi biến nạp bền vững được định nghĩa bằng việc gắn gen đích vào hệ gen của tế

bào thực vật Với khả năng có thể sản xuất trên quy mô lớn trên đồng ruộng nên quá

trình sản xuất protein tái tổ hợp được đặt tên là “canh tác phân tử” (Molecularfarming) Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp trong thực vật đang được quan tâmđặc biệt nhờ những ưu thế có tính cạnh tranh cao so với các hệ thống khác như vikhuẩn, côn trùng và tế bào động vật Các ưu thế có thể kể đến như sau:

Thực vật thuộc nhóm sinh vật nhân chuẩn nên quá trình tổng hợp proteintương tự như động vật với quá trình cải biến sau dịch mã như quá trình glycosylhóa protein (Cabanes-Macheteau và cs., 1999) Trong khi đó, vi khuẩn không thểthực hiện hầu hết các thay đổi sau dịch mã quan trọng cho các protein ở động vật có

vú Khi sự khác biệt sau dịch mã giữa thực vật và động vật có vú được giải quyếtthì có thể được thiết kế để biểu hiện ở thực vật các protein cần biến đổi sau dịch mã(Bakker và cs., 2001)

Protein tái tổ hợp có thể được đưa trực tiếp vào các khoang nội bào thực vậtnhư không bào, lưới nội chất hay các thể protein- những nơi lưu trữ tương đối ổnđịnh (Conrad và Fiedler 1998) Protein cũng có thể được biểu hiện trong các cơquan tử như lục lạp (Staub và cs., 2000; Daniell và cs., 2001.) hoặc các cơ quan dựtrữ như hạt, củ… giúp các protein được giữ ổn định trong thời gian dài, dễ dàngvận chuyển không cần bảo quản lạnh, có thể sử dụng qua đường miệng giúp giảmchi phí sử dụng và bảo quản (Twyman và cs., 2003).

Hệ thống sản xuất này có hiệu quả hơn về mặt kinh tế so với hệ thống nuôi cấy

tế bào động vật và lên men vi sinh vật Chi phí sản xuất trong hệ thống này mặc dùphụ thuộc vào loại protein, mức độ biểu hiện và loại cây trồng hoặc tế bào cũngđược biết chỉ tương ứng với 2-10% giá trị so với hệ thống lên men và bằng 0,1%giá trị của nuôi cấy tế bào động vật (Twyman và cs., 2003)

Thực vật không mang mầm bệnh của người và côn trùng nên protein dùng đểchữa bệnh cho người và động vật sẽ không bị nhiễm các mầm bệnh như trong hệthống sử dụng tế bào động vật (Giddings và cs., 2000)

Protein có thể được biểu hiện ở các bộ phận ăn được của thực vật và có thể sửdụng như vacxin ăn được, chẳng hạn như vacxin thỏ được biểu hiện ở cà chua màkhông cần quá trình tinh sạch phức tạp như nuôi trong tế bào động vật và vi sinh vật(Mason và cs., 2002)

Đối lập với phương pháp biểu hiện tạm thời, hướng nghiên cứu biến nạp bền

vững thông thường được tạo ra thông qua vi khuẩn Agrobacterium là kỹ thuật

được sử dụng rộng rãi để chuyển gen vào cây hai lá mầm như thuốc lá (Fischer vàEmans, 2000), cây đậu (Prasad và cs., 2004) Nhìn chung, gen đích được gắn vào

vector nhị thể, vector này có khả năng sao chép được trong cả E coli và vi khuẩn

Agrobacterium Các dòng cây chuyển gen được phân tích mức độ biểu hiện của

protein tái tổ hợp Những cây mang một bản sao của gen đích và có mức độ biểuhiện cao nhất sẽ được lựa chọn để tạo dòng thuần Dòng thuần mang tính trạngmong muốn sẽ được trồng nhà kính, và protein tái tổ hợp được tinh sạch Thông

thường để tạo ra cây chuyển gen thì phải mất khoảng 3-9 tháng và thời gian nàyphụ thuộc vào từng đối tượng thực vật sử dụng để chuyển gen.

1.3.2 Quá trình biểu hiện tạm thời thông qua Agrobacterium

Phương pháp biểu hiện tạm thời thông qua Agrobacterium ban đầu được

phát triển như một công cụ để kiểm tra sự tương tác của thực vật Hệ gen hoặc mộtphần của hệ gen của virus thực vật đã được nhân dòng trong các vector nhị phân và

biến nạp vào Agrobacterium Các tế bào Agrobacterium mang gen ngoại lai sau đó

được thâm nhập vào không gian giữa các tế bào của mô thực vật, cho phép chuyểncác gen virus vào genome thực vật Vì vậy, DNA mục tiêu từ các sinh vật khác nhau

đã được chuyển vào các tế bào thực vật thông qua quá trình biểu hiện tạm thời nhờ

Agrobacterium, mở ra phạm vi ứng dụng rộng rãi, ngoài việc nghiên cứu tương tác

giữa thực vật và virus Phương pháp biểu hiện tạm thời có thể thực hiện bằng việc

sử dụng ống tiêm để đưa Agrobacterium vào lá cây (Santi và cs., 2008) (Hình 1.4).

Phương pháp biểu hiện tạm thời là phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ

Agrobacterium liên quan đến sự bão hòa áp lực của lá bởi Agrobacterium được

nuôi cấy chứa gen quan tâm, đưa gen đích vào tế bào thực vật (Rivera và cs., 2012).

Sự biểu hiện tạm thời các gen đích trong các lá còn nguyên vẹn đã được chứng

minh bằng sự thâm nhập của Agrobacterium chứa một vector chuyển gen vào không

gian ke lá (Kapila và cs.,1997), đã biểu hiện các protein ngoại lai trong các lá cònnguyên vẹn Nghiên cứu cơ bản này đã chứng minh phương pháp biểu hiện tạm

thời nhờ Agrobacterium như là một kỹ thuật biểu hiện protein Vì vậy, biểu hiện tạm thời được coi là một công cụ mạnh mẽ để khắc phục hạn chế về mức biểu hiện

protein thấp ở thực vật (Salazar-Gonzalez và cs., 2015)