Xây dựng quy trình nhân nhanh giống hồng vân khôi (rosa souvenir de la malmaison) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô

Hiện nay, phương pháp nhân giống mới bằng kĩ thuật nuôi cấy mô đáp ứng được những nhu cầu trên, giúp cung cấp số lượng lớn cây sạch bệnh, đồng đều, đặc biệt là sản xuất ra số lượng cây l

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH-KTNN -*** -

LÊ THỊ LÂM

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG

HOA HỒNG VÂN KHÔI (Rosa “Souvenir de la malmaison”)

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI, 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH-KTNN -*** -

LÊ THỊ LÂM

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG

HOA HỒNG VÂN KHÔI (Rosa “Souvenir de la malmaison”)

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dẫn

TS LA VIỆT HỒNG

HÀ NỘI, 2019

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS La Việt Hồng-Khoa Sinh

KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng dẫn, động viên

và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn ban giám hiệu Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, ban chủ nhiệm Khoa Sinh-KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ bộ môn Thực vật, Khoa sinh-KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị, phương tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Trong thời gian thực hiện đề tài, tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình

của cô Mai Thị Hồng-Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật đã giúp đỡ, góp

ý để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn

Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên góp ý cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành đề tài

Hà Nội , ngày 14 tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Lê Thị Lâm

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và một số cộng sự khác Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực

do tôi nghiên cứu

Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Lê Thị Lâm

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu 2

3 Phạm vi nghiên cứu 3

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Nguồn gốc và phân bố của cây hoa hồng 4

1.2 Vị trí phân loại của cây hoa hồng 4

1.3 Đặc điểm hình thái của giống hồng Vân Khôi 5

1.4 Điều kiện sinh thái 6

1.5 Giá trị của cây hoa hồng 8

1.5.1 Giá trị sử dụng của cây hoa hồng Vân Khôi 8

1.5.2 Giá trị kinh tế của cây hoa hồng 8

1.5.3 Giá trị sinh thái của cây hoa hồng 9

1.6 Tình hình sản xuất hoa hồng trên thế giới và ở Việt Nam 9

1.6.1 Tình hình sản xuất hoa hồng trên thế giới 9

1.6.2 Tình hình sản xuất hoa hồng ở Việt Nam 10

1.7 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam 11

1.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 11

1.7.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 13

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.1.1 Vật liệu thực vật 15

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 15

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15

2.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 15

2.3.1 Dụng cụ 15

2.3.2 Thiết bị 15

2.4 Môi trường nuôi cấy 15

2.5 Điều kiện phòng nuôi cấy 16

2.6 Phương pháp nghiên cứu 16

2.6.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 16

2.6.2 Phương pháp xử lí số liệu thống kê 18

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

3.1 Tạo vật liệu khởi đầu 19

3.2 Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro 20

3.3 Ra rễ-tạo cây in vitro hoàn chỉnh 25

3.4 Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiên tự nhiên 26

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28

KẾT LUẬN 28

KIẾN NGHỊ 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ

viết tắt

Tên tiếng anh Tên tiếng việt

o

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu lên quá trình tạo vật liệu khởi đầu 19 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BAP lên khả năng tái sinh chồi in vitro

từ đốt thân hoa hồng Vân Khôi (sau 5 tuần nuôi cấy) 21 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BAP, BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân nhanh chồi hoa hồng Vân Khôi in vitro (sau 5 tuần nuôi cấy) 23 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng hình thành rễ-tạo cây in vitro hoàn chỉnh (sau 2 tuần nuôi cấy) 25

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây hoa hồng Vân Khôi dùng làm vật liệu nghiên cứu…………5 Hình 3.1 Chồi bật ra từ đốt thân hồng Vân Khôi sau 8 ngày (a) và 14 ngày (b) nuôi cấy trên môi trường MS 20 Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BAP lên khả năng tái sinh chồi in vitro

từ đốt thân hoa hồng Vân Khôi (sau 5 tuần nuôi cấy) 22 Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BAP, BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân nhanh chồi hoa hồng Vân Khôi in vitro (sau 5 tuần nuôi cấy) 24 Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng hình thành rễ-tạo cây in vitro hoàn chỉnh (sau 2 tuần nuôi cấy) a, b, c, d tương ứng với các công thức bổ sung NAA từ 0,25; 0,50; 0,75 và 1,00 (mg/l) 26 Hình 3.5 Ảnh hưởng của giá thể lên khả năng sống sót, hình thành rễ mới trong điều kiện tự nhiên ở cây hồng Vân Khôi 26 Hình 3.6 Cây hồng Vân Khôi phát triển ở ngoài tự nhiên trên môi trường TS1 + phân chuồng ủ hoại (1:1) trong 4 tuần (a) và trong 2 tháng (b) 27 Hình 3.7 A: Giá thể TS1 của hãng Klasmann-Deilmann (Đức) 27 B: Cây hoa hồng Vân Khôi dùng làm vật liệu nghiên cứu 5

Hoa hồng là một trong những loại hoa thương mại quan trọng của ngành công nghiệp hoa thế giới [28] Hoa hồng không chỉ có nhiều hình dáng, kích thước và màu sắc khác nhau mà còn có hương thơm dịu dàng, quyễn rũ,

do vậy hoa hồng còn được dùng để sản xuất các loại tinh dầu, vitamin C từ hoa hay thuốc chữa một số bệnh như ho, đường ruột và đường hô hấp từ lá, đây chính là lý do mà hoa hồng được mệnh danh “nữ hoàng” của các loài hoa Các nước Hà Lan, Colombia, Kenya, Israel, Italy, Hoa Kỳ và Nhật Bản là những nước sản xuất hoa hồng hàng đầu thế giới [16] Hoa hồng thể hiện cho hòa bình, tươi trẻ, là hoa của tình yêu, tình hữu nghị, của niềm vui và sự tốt lành [4] Thực tế cho thấy, nhu cầu tiêu thụ hoa hồng ngày càng lớn, để đáp thực tế trên, chúng ta cần có biện pháp giải quyết các vấn đề về giống và nuôi trồng, đem lại lơi nhuận kinh tế cao cho người trồng hoa, giảm bớt giá thành cho người tiêu thụ hoa và hướng tới xuất khẩu Do đó, nhu cầu cấp thiết về giống cung cấp cho sản xuất phải luôn được cải tiến, cho ra chất lượng giống tốt và năng suất cao

Cây hoa hồng thường được nhân giống vô tính bằng các phương pháp như giâm hom, chiết và ghép Các phương pháp này khá tốn công sức, thời gian và hiệu quả thành công không cao, đặc biệt là đối với các giống hồng ngoại Hơn nữa, cây giống được nhân lên bằng phương pháp truyền thống cũng thường xuyên bị nhiễm bệnh, từ đó ảnh hưởng tới sản lượng và chất lượng hoa [25] Hiện nay, phương pháp nhân giống mới bằng kĩ thuật nuôi cấy mô đáp ứng được những nhu cầu trên, giúp cung cấp số lượng lớn cây sạch bệnh, đồng đều, đặc biệt là sản xuất ra số lượng cây lớn trong thời gian ngắn và có thể sản xuất quanh năm Việc áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô đã thúc đẩy nhanh việc đưa giống hồng Vân Khôi vào sản xuất đại trà, đây là

số giống hồng đã được nghiên cứu và hoàn thiện [25, 19, 32, 20, 27, 17, 13, 33] Ở Việt Nam, đã có một số công bố nhân giống thành công như ở cây hoa hồng cổ SaPa bằng phương pháp nuôi cấy mô [5], nhân giống và cảm ứng ra hoa trong ống nghiệm ở cây hồng Cơm [1], cây hồng Tỉ Muội [8] Đến nay chưa có bất kỳ công bố nào được thực hiện trên đối tượng cây hoa hồng Vân Khôi

Hoa hồng Vân Khôi , là giống Hồng cổ của Pháp tên là Rosa “Souvenir

De la Malmaison”, có bông hoa to màu hồng phấn, mùi thơm thoang thoảng

dễ chịu, hồng Vân Khôi là giống hồng bụi hiếm, thời gian trưng hoa lâu, được rất nhiều người yêu chuộng Cây phát triển tốt nhất trong vùng khí hậu khô, nóng, dễ bị bệnh khi sống ở những nơi ẩm ướt Do vậy việc nhân giống bằng các phương pháp vô tính như giâm, chiết, ghép còn gặp nhiều khó khắn Để chủ động nguồn giống, phục vụ cho nhu cầu trong nước cũng như xuất khẩu thì phương pháp nhân nhanh giống hồng Vân Khôi bằng phương pháp nuôi cấy mô là hướng đi đúng đắn, giúp cung cấp một số lượng lớn cây giống chất lượng cao, đồng đều, sạch bệnh, khắc phục được nhược điểm thoái hóa, lưu

gữ nguồn gen cho chọn giống cây trồng

Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi lựa chọn và thực hiện nghiên

cứu đề tài: “Xây dựng quy trình nhân nhanh giống hồng Vân Khôi (Rosa

“Souvenir de la malmaison”) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô” để đưa ra được

quy trình nhân nhanh phù hợp, tạo ra số lượng cây con lớn, đồng đều và sạch bệnh trong thời gian ngắn, làm tiền đề cho việc cung cấp cây giống có chất lượng tốt, phục vụ cho nhu cầu sản xuất

2 Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu

2.1 Mục đích

Xây dựng quy trình nhân nhanh giống hồng Vân Khôi bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tạo cơ sở cung cấp giống cho quá trình sản xuất

3

2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu

1) Tạo vật liệu in vitro cho nuôi cấy mô

2) Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro

3) Ra rễ-tạo cây in vitro hoàn chỉnh

4) Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên

Góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu in vitro về giống hồng

Vân Khôi, tạo cơ sở để nghiên cứu tiếp ở các giống hoa hồng khác cũng như cây thân gỗ khác

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng phục vụ cho việc sản xuất giống hồng Vân Khôi đồng đều và sạch bệnh trong thời gian ngắn, cung cấp nội địa

và xuất khẩu

4

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc và phân bố của cây hoa hồng

Hoa hồng cổ đại có nguồn gốc từ cây Tầm xuân (xuất hiện từ kỉ Đệ Tam, cách đây 3,5-7 triệu năm), chủ yếu phân bố ở đại lục ôn đới bắc bán cầu, còn loại ra hoa 4 mùa có nguồn gốc khởi nguyên ở vùng Á nhiệt đới Hoa hồng thơm được hình thành do sự lai tạo giữa cây Tầm xuân và cây hoa bốn mùa [4] Ở Trung Quốc, hoa hồng đã xuất hiện từ rất lâu và sau đó được xuất khẩu sang các nước khác như Châu Âu (trước thế kỉ XVII), Pháp (cuối thế kỉ XV) [4] Hoa hồng hiện nay có nguồn gốc rất phức tạp, nó là kết quả của sự

tạp giao giữa cây Tầm Xuân (Rosa Multiflora), cây Mai Khôi (Rosa Rugosa)

và cây hoa hồng (Rosa Indica)

Cây hoa hồng có tên khoa học là Rosa sp., thuộc họ Rosaceae Bộ

Rosales, lớp hai lá mầm, hầu hết các giống hoa hồng hiện nay đều có nguồn

gốc từ Rosa sp

Họ hoa hồng có khoảng 115 Chi và hơn 3000 loài, phân bố ở Hà Lan,

Mỹ, Nhật, là những nước sản xuất hoa hồng chính, trong đó Hà Lan là nước trồng và xuất khẩu hoa hồng lớn nhất thế giới Hiện nay, ở Việt Nam, các giống trồng đều là giống nhập từ hà lan, Pháp, Mỹ, Trung Quốc được trồng phổ biến ở Đà Lạt, Tiền Giang, Hậu Giang và nhất là Sa Đéc, Cái Mơn với nhiều giống quý và mới lạ [8]

Hồng cổ Bạch vân Khôi là giống Hồng cổ của Pháp tên là Rosa

“Souvenir De la Malmaison”, được lai tạo bởi Jean Beluze ở Pháp năm 1843

Hiện được xếp vào nhóm Hồng cổ thế giới thuộc họ Rosaceae Đây là một

giống hồng bụi, cánh kép, màu phấn hồng, bông chùm, mùi hương dễ chịu và thơm lâu, hoa quanh năm với số lượng bông tương đối lớn Ở Việt Nam có nhiều tên gọi như: Hồng Vân Khôi , Hồng Cung Phủ, Hồng Tiến Vua, Hồng Văn Khôi , hiện được xếp vào nhóm Hồng cổ Việt Nam, phân bố rải rác ở 1

số tỉnh niềm Trung và khu vực miền núi phía Bắc [35]

1.2 Vị trí phân loại của cây hoa hồng

Hoa hồng Vân Khôi xếp vào Ngành Hạt kín, Lớp hai lá mầm, Bộ

Rosales, Họ Rosaceae, Chi Rosa L

5

Chi Rosa L với hơn 100 loài với màu hoa đa dạng, phân bố từ miền ôn

đới đến nhiệt đới, phần lớn có nguồn gốc bản địa Châu Á, số ít còn lại có nguồn gốc Châu Âu, Bắc Mĩ và Tây Bắc Phi Các loài hồng có thể tạo ra nhờ lai ghép, có mùi hương dịu dàng và màu sắc đa dạng: hồng, đỏ, trắng, vàng hay phấn hồng Hoa hình chén, quả bế, tụ nhau trong đế hoa dày tôn lên thành quả Các loài trong chi này có thể là thân bụi hoặc thân leo, cành có ít hoặc nhiều gai cong, lá kép lông chim lẻ, lá chét khía răng, có lá kèm [36]

1.3 Đặc điểm hình thái của giống hồng Vân Khôi

Hình 1.1 Cây hoa hồng Vân Khôi dùng làm vật liệu nghiên cứu

6

c Lá

Là cây thường xanh, lá kép lông chim mọc cách, ở cuống có lá kèm nhẵn, mỗi lá có từ 3-5, hay từ 7-9 lá chét, xung quanh lá chét có nhiều cưa nhỏ Lá có màu xanh đậm, răng cưa nông

d Hoa

Hoa của giống hồng Vân Khôi có mùi thơm nhẹ nhàng nhưng thơm lâu, cánh hoa mềm, có màu hồng phấn, đậm dần về phía nhụy, nhiều cánh (khoảng 30-70 cánh), xếp chặt, các vòng ngoài cánh to hơn và có màu nhạt hơn Kích thước trung bình của một bông hoa là khoảng 8 -10 cm, hoa mọc kiểu đơn độc hoặc cụm nhỏ khoảng trên dưới 3 bông Cuống dài, có gai bé, hoa hồng là hoa lưỡng tính, nhị và nhụy nằm trên cùng 1 hoa, nhị dính vào nhau bao quanh nhụy; khi chin, hạt phấn rơi vào đầu nhụy nên cây tự thụ phấn Đài hoa màu xanh

e Quả

Quả hình trái xoan còn lá đài, vỏ dày Thuộc loại quả nang có chứa nhiều hạt khô

f Hạt

Hạt nhỏ, có lông, khả năng nảy mầm kém

1.4 Điều kiện sinh thái

Hoa hồng là loài ưa chiếu sáng, ưa đất ẩm và thoát nước tốt, thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới

a Ánh sáng

Cường độ ánh sáng ảnh hưởng rất rõ đến sự phát sinh cành, phân hóa khả năng phát dục của hoa, từ đó ảnh hưởng đến sản lượng hoa của giống hồng này Cây hồng không thích hợp trồng ở nơi có bóng, sử dụng cách chiếu sáng bổ sung làm tăng số lượng cành [4]

Chu kì chiếu sáng và độ dài bước sóng có liên qua tới sự phát dục của hoa và vị trí mầm hoa Trong điều kiện mùa hè, phản ứng quang hợp của hoa hồng khá mạnh, 90% chất khô trong cây là do quang hợp, tuy nhiên quang hợp chịu ảnh hưởng của giống, cường độ ánh sáng, nhiệt độ, trạng thái nước

và nồng độ CO2 Trong điều kiện bão hòa CO2, nhiệt độ thích hợp cho quang hợp, khi nhiệt độ tăng qúa 25 C thì cường độ quang hợp giảm mạnh Trong

Độ ẩm đất thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây hoa hồng

là từ 60-70 C, đối với độ ẩm không khí là từ 80-85 C Đặc biệt, nếu độ ẩm trong đất cũng như trong không khí quá cao và vào mùa mưa to, kéo dài liên tục năm sáu tháng, đa số các giống hồng bị các loại nấm và sâu bệnh tấn công, khiến cây bị đốm lá, vàng lá, rụng lá, suy kiệt và chết [3]

f Dinh dưỡng

Khả năng hấp thụ dinh dưỡng khoáng phụ thuộc vào nguồn gốc cây trồng và ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng hoa Vì vậy việc cung cấp

8

dinh dưỡng cho cây phù hợp là cần thiết để đạt sản lượng tốt nhất Thiếu nito cây châm sinh trưởng, phân cành yếu, lá vàng, rễ bị rụng, nhỏ, dài, ít và khả năng quang hợp giảm Thiếu phospho gây trở ngại cho việc tổng hợp protein, khả năng hình thành tinh bột kém, hoa khó nở Nhiều phospho ức chế sự hấp thụ sắt Thiếu canxi, nụ không phát triển thành hoa Thiếu lưu huỳnh làm cây sinh trưởng chậm nhưng thừa lại gây độc cho cây [9]

1.5 Giá trị của cây hoa hồng

Cây hoa hồng là một trong những cây trồng được trồng phổ biến ở nước ta và trên thế giới Hồng Vân Khôi là một giống hồng đẹp, bông to, thơm và lâu tàn, có thể dùng làm mỹ phẩm hay trang trí, đem lại nhiều giá trị tinh túy cho con người

1.5.1 Giá trị sử dụng của cây hoa hồng Vân Khôi

Cây hồng Vân Khôi là một trong những giống hồng được ưa chuộng nhất trên thế giới với các ưu điểm vượt trội: Bông to, màu sắc thanh thoát, lâu tàn, đặc biệt có mùi thơm dịu dàng nhưng để lại ấn tượng sâu sắc với người trưng hoa Do vậy hoa hồng thường xuất hiện trong các buổi lễ sang trọng, tượng trưng cho sự trang nhã, tôn kính và hòa bình, được dùng trong các ngày

lễ đặc biệt của phái nữ, thể hiện tình cảm cho đối phương Ngoài ra, do có mùi thơm nhẹ nhàng, vừa không quá đậm lại không quá nhạt, loài Hồng này được tách chiết tinh dầu thơm; lá của giống hồng thường được giã ra đắp mụn nhọt, vết thương, bệnh đường tiêu hóa [4]

1.5.2 Giá trị kinh tế của cây hoa hồng

Vì những tính năng nổi bật về màu sắc, kích cỡ bông, mùi hương, tác dụng dược liệu, nghề trồng hồng ở nước ta và trên thế giới ngày càng phát triển mạnh mẽ, mang lại lợi nhuận kinh tế cao gấp 6 lần so với nghề trồng lúa truyền thống

Vùng hoa ở huyện Mê Linh rộng gần 400 ha với hàng chục cánh đồng đều cho thu nhập bình quân trên 50 triệu đồng/ha Đặc biệt những cánh đồng hoa ở huyện Mê Linh đã cho thu nhập từ 70-90 triệu đồng/năm [34] Hiệu quả kinh tế mà hoa hồng đem lại cho người dân vùng trồng hoa ở Mê Linh là rất lớn, đã cải thiện đời sống vật chất cũng như tinh thần cho người dân nơi đây

9

1.5.3 Giá trị sinh thái của cây hoa hồng

Cây hoa hồng là một loài sinh trưởng khá mạnh trong điều kiện khí hậu

và thời tiết thuận lợi, năng suất sinh học của cây hồng cũng góp phần làm tăng năng suất sinh học của sinh giới Ngoài ra cây còn giúp tạo cảnh quan, là nơi cư trú của nhiều sinh vật như Nhện, Sâu ăn lá cây; Giúp phủ xanh vùng đất, giữ nước nhờ rễ, tham gia vào quá trình tuần hoàn tự nhiên

1.6 Tình hình sản xuất hoa hồng trên thế giới và ở Việt Nam

1.6.1 Tình hình sản xuất hoa hồng trên thế giới

Kinh nghiệm và thành công về sản xuất hoa của nhiều nước trên thế giới đã đem lại Kinh tế thịnh vượng cho nhiều nước, nhất là các nước như Hà Lan, Thái Lan Ở Ấn Độ, vào năm 2005 với diện tích gần 70 ngàn ha, sản lượng hoa hàng năm của Ấn Độ đạt không đạt dưới 200 ngàn tấn hay 500 triệu cành hoa cắt, Isarel với công nghệ hiện đại và chiến lược tốt đã trở thành nước có nền công nghiệp hoa phát triển hàng đầu Thế giới (chiếm 6% thị trường hoa thế giới) Ở Vân Nam, Trung Quốc, đến năm 2005 diện tích trồng hoa là 14 ngàn ha, doanh thu khoảng 5,11 tỷ nhân dân tệ, xuất khẩu 41 triệu USD [11]

Tổng giá trị hoa tiêu thụ trên thị trường thế giới là 42 tỷ USD, trong đó hoa hồng chiếm 15 tỷ USD, còn lại là hoa Cúc, hoa Cẩm Chướng thơm, hoa Lay Ơn và các loài hoa khác dự kiến sẽ tăng lên rất nhanh trong các năm tới Diện tích trồng hoa trên thế giới ngày càng mở rộng trong đó diện tích trồng hoa của Châu Á khoảng 134 ngàn ha, chiếm 60% tổng diện tích hoa của Thế giới Các nước sản xuất hoa hồng trên thế giới là Hà Lan, Hoa Kỳ, Colombia, Nhật, Iran; trong đó Hà Lan là nước chủ nhà xuất khẩu hoa lớn nhất thế giới với khoảng 4 tỷ USD tương đương 21 tỷ cành trên một năm Hoa Kỳ là nước trồng hoa hồng nhiều nhưng nhập khẩu cũng nhiều, năm 1996 Mỹ sản xuất 3,5 tỷ cành và nhập khẩu 8,3 tỷ cành Ở Châu Á, Trung Quốc là nước bắt đầu sản xuất hoa hồng từ những năm 50 của thế kỷ XX, hiện nay Quảng Đông là tỉnh trồng hoa hồng nhiều nhất Trung Quốc có diện tích 4320 ha, sản xuất 2,96 tỷ bông

Về tình hình xuất khẩu, nhìn chung giá trị xuất khẩu hoa cắt cành, hoa

bó toàn cầu giảm trung bình -7,3% kể từ năm 2012, đây là năm các lô hàng

10

hoa cắt cành đạt được giá trị 8,3 tỷ USD Trong giai đoạn từ năm 2015-2016, giá trị xuất khẩu hoa cắt cành giảm -4,6% so với các năm trước đó Đặc biệt, trong chín tháng đầu năm 2017, doanh thu của ngành sản xuất hoa cắt cành tăng 10% và có dấu hiệu tăng trưởng mạnh mẽ, giá thành so với năm 2016 giảm đáng kể Trong số các châu lục, các nước Châu Âu có giá trị xuất khẩu hoa cắt cành cao nhất trong năm 2016 với các lô hàng lên đến 4 tỷ đô la Mỹ, chiếm 52,3% giá trị xuất khẩu hoa toàn cầu Các nước Châu Mỹ Latinh (trừ Mexico) và Caribea chiếm 28,4%, tiếp theo là các nước Châu Phi ở mức 10,5%, các nhà cung cấp ở châu Á là 7% và Bắc Mỹ là 1,5% Trong nhiều năm, Hà Lan luôn là trung tâm của thị trường hoa thế giới Sản lượng hoa xuất khẩu của Hà Lan chiếm gần 50% sản lượng hoa cắt cành trên toàn Thế giới [38]

1.6.2 Tình hình sản xuất hoa hồng ở Việt Nam

Hoa hồng đa dạng về hình thức, kích cỡ, màu sắc và đặc biệt có một mùi thơm dịu dàng làm say đắm lòng người Do vậy Hoa hồng là một trong những loài hoa được ưa chuộng và trồng phổ biến nhất trên thế giới Chính vì thế trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã phát triển ngành sản xuất hoa hồng, mang lại những lợi ích cho nền kinh tế Ở một số nước Châu Âu và Trung Quốc, mặc dù có sức tiêu thụ rất lớn nhưng chỉ sản xuất được vào mùa hè, nhiệt độ các mùa còn lại xuống quá thấp, đây chính là cơ hội cho nước có điều kiện thuận lợi như Việt Nam phát triển ngành sản xuất hoa hồng xuất khẩu Hoa cắt cành hiện đang là 1 trong những điểm mạnh cho các nhà sản xuất hoa ở Việt Nam giúp thu được nguồn ngoại tệ cho Quốc gia Hiện nay, trên cả nước có khoảng 4 ngàn ha diện tích sản xuất hoa cắt cành với sản lượng khoảng 13 tỷ bông tập trung chủ yếu ở các đô thị lớn

Tại vùng trồng Hoa Tây Tựu-Từ Liêm-Hà Nội, khu vực Mê Linh-Hà Nội thì hoa hồng và Hoa Cúc là hai loài hoa cho thu nhập cao và thường xuyên [4]

Ở khu vực trung du và miền núi phía Bắc với khoảng 55,26%, sản lượng 26,53 triệu bông/năm Hiện nay, các giống hồng trồng ở Việt Nam hầu hết là các giống nhập từ Hà lan, Hoa Kỳ, Pháp, Trung Quốc với nhiều giống quý và lạ

11

Đến năm 2014, hoa hồng đã được trồng phổ biến tại Mê linh, Văn Khê, Đại Thịnh với diện tích khoảng 1152 ha Trước đây các giống hoa hồng trồng được nhập chủ yếu từ Đà Lạt, nhưng gần đây, chúng bị thoái hóa, hoa nhỏ, chóng tàn và màu sắc không đẹp, chính vì vậy, gần đây người dân đã mạnh dạn trồng những giống hoa hồng nhập ngoại như Hồng Pháp và Hồng Italia Các giống hồng này cho bông to, và đẹp hơn Hồng Đà Lạt do chúng thích nghi với điều kiện nơi đây [37]

1.7 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam

1.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Vào năm 1946, Lamments lần đầu tiên công bố sử dụng nuôi cấy phôi

để nhân giống hoa hồng

Nickell và Tulecke (1959) và Weinstein (1962) bằng cách nuôi cấy tế bào, nuôi cấy huyền phù và mô sẹo với mong muốn hiểu biết về sự biệt hóa

và tái sinh [27]

Soomro và cs (2003) sử dụng IBA 0,6 mg/l kết hợp NAA 0,1 mg/l để

nâng cao tỉ lệ ra rễ của giống Rosa Indica lên khoảng 50%, và sử dụng IAA

2,0 mg/l kết hợp IBA 2,0 mg/l để tăng tỉ lệ chồi lên 70% sau khoảng 12 tuần

Roy và cs (2004) trong giai đoạn tạo rễ đã dùng IAA 1mg/l hoặc 0,5

mg/l cho tỉ lệ ra rễ cao (85%) ở giống Rosa sp

Al-Khalifah và cs (2005) sử dụng BAP 3,0 mg/l kết hợp Kin 0,2 mg/l thì cây

Rosa Hybrid L có tỉ lệ chồi tăng 71,1 %

Hamed và cs 2006 trên cây Rosa indica L.trên môi trường có bổ sung

BAP 1,5 mg/l sau 7 ngày cho kết quả cao (100% chồi hình thành) còn khi sử dụng Kin 0,5 mg/l kết hợp với BAP 0,5 mg/l sau 10 ngày có 98% chồi hình thành

Khosravi và cs (2007) trên cây Rosa Hybrid có bổ sung 0,004 mg/l

MAP kết hợp với 0,005 mg/l NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất

Trong nghiên cứu của Attia O Attia và cs (2012) trên đối tượng Rosa

hybrid L cv., môi trường MS chứa BAP 2 mg/l kết hợp với Kin nồng độ 1

mg/l là tốt nhất cho sự bắt chồi trong khi đó môi trường MS có bổ sung BAP

3 mg/l kết hợp 1 mg/l Kin là tốt nhất cho sự nhân chồi Môi trường 1 mg/l

12

BAP kết hợp 1 mg/l Kin là tốt nhất cho sự kéo dài chồi, tỷ lệ ra rễ đạt cao nhất (66,7%) trong môi trường MS bổ sung 2 mg/l IBA [15]

Trong nghiên cứu của Alsemaan (2013) đã nghiên cứu sự tái sinh của

hai giống hoa hồng Damask của Iran (Rosa damascena Mill.), BAP ở các

nồng độ (0; 1; 2 và 3 mg/l), GA 3 ở các nồng độ (0; 0,1; 0,25 và 0,5 mg/l) và NAA ở các nồng độ (0 và 1 mg/l) đã được sử dụng Kết quả cho thấy môi trường MS có bổ sung BAP (1-2 mg/l), GA 3 (0,1 mg/l) và NAA (0-0,1 mg/l) cho tỷ lệ nhân và sự sinh trưởng là tốt nhất [13]

Trong nghiên cứu của Rajeshbabu và cs (2014) về cây Rosa

bourboniana đã quan sát trên môi trường MS bổ sung BAP, NAA và IAA

trong khoảng 0,25 đến 2,0 mg/l Trong số các nồng độ được nghiên cứu, BAP

ở mức 1,00 mg/l cho thấy tối đa 71% sự tăng sinh chồi với 17,33 ± 1,21 số chồi trên mẫu với chiều cao chồi là 4,26 ± 0,18 cm Sự kết hợp của BAP (1,00 mg/l) và NAA (0,10 mg / l) cho thấy 70% phản ứng chồi với số chồi là 8,33 ± 0,81 và chiều cao trung bình trên chồi là 5,30 ± 0,80 cm Sự kết hợp giữa BAP (1,00 mg/l) và IAA (0,15 mg/l) cho ra 56% mẫu sống và số chồi 6 ± 0,89, và chiều cao chồi trung bình là 4,16 ± 0,2 cm Môi trường MS có bổ sung IAA 1,0 mg/l với 92% ra rễ với khoảng 30,83 ± 1,16 rễ [28]

Theo Saklani Kumud và cs (2015), môi trường chứa 5,0 mg/l BAP kết hợp với 2,5 mg/l Kin là môi trường tốt nhất cho sự nhân nhanh chồi hoa hồng đạt 9,25 chồi/mẫu, môi trường chứa ½ MS bổ sung 2 mg/l NAA kết hợp với 0,5 mg/l BAP là môi trường hiệu quả nhất cho quá trình ra rễ đạt 4,75 rễ/mẫu, giá thể rèn luyện chứa cát và đất vườn với tỷ lệ 1:1 cho thấy tỷ lệ sống sót cao nhất đạt 60% trong điều kiện tự nhiên [21]

Omidi (2016) nhân giống in vitro trên BAP giống hoa hồng với hai (Kashan và Kazanlik) từ Rosa damascene Mill và một (Tuscany superb) từ

Rosa gallica thì môi trường MS bổ sung 2 mg/l BAP kết hợp với 0,2 mg/l

IBA đã cho sự tăng sinh chồi tối ưu; môi trường 2 mg/l IBA rất hiệu quả đối với cảm ứng rễ [26]

Theo Subhash Kajla và cs., (2018), trên cây hoa hồng Rosa hybriad L

môi trường 2 mg/l BAP + 0,25 mg/l IAA cho hệ số chồi cao nhất là 6,6

13

chồi/mẫu, môi trường ½ MS bổ sung 1 mg/l NAA + 1,0 mg/l IBAP là môi trường tốt nhất cho sự hình thành rễ sau 11 ngày

1.7.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở nước ta, một số công trình nghiên cứu đã có kết quả bước đầu với một số giống hoa hồng như Hoa hồng Cơm trong báo cáo Nguyễn Thị Kim

Thanh (2005) [10], Nguyễn Thị Kim Thảo (2015) khi tiến hành nhân nhanh in

vitro trên giống hoa hồng Trắng

Trong nghiên cứu gần đây trên cây Hoa hồng cơm trong nuôi cấy mô, đoạn cành bánh tẻ mang mắt ngủ, không sâu bệnh, sinh trưởng tốt được rửa sạch dưới vòi nước, ngâm trong xà phòng loãng 15 phút rồi rửa sạch xà phòng dưới vòi nước chảy Sau đó, mẫu được ngâm trong ethanol 70% trong 1 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng trước khi được khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 15 phút và cuối cùng được rửa bằng nước cất vô trùng từ 3-5 lần [1] Hay trong nghiên cứu từ năm 2009, các đốt thân chưa mắt ngủ được cắt thành các đoạn dài 3-4 cm, và khử trùng bằng cách sử dụng ethanol 70% trong 10-20 giây, sau đó ngâm trong dung dịch javel 40% có bổ sung 2 giọt chất nhũ hóa tween-20 trong 20 phút, cuối cùng được rửa sạch bằng nước cất 2-3 lần và cắt ngắn ở 2 đầu còn khoảng 1 cm [24]

Nguyễn Thị Kim Thanh (2005) đã công bố kết quả nhân nhanh giống

hồng đỏ và trắng bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro, sử dụng môi trường cơ bản

MS + 20 g/l Sucrose + 5,6 g/l Agar với các kết quả cho từng công đoạn Tạo

vật liệu khởi đầu mắt ngủ được khử trùng bằng HgCl2 0,5 % trong 5 phút cho

tỉ lệ sạch hơn 60% Các mẫu sau khi khử trùng được cấy vào môi trường có

bổ sung BAP hoặc Kin 1mg/l, sau 14 ngày 100% mẫu đều bật chồi Nhân

chồi (sau 4 tuần nuôi cấy) đối với giống hồng đỏ sử dụng BAP 2mg/l cho hệ

số nhân cao nhất là 3,47 chồi trên mẫu còn đối với giống hồng trắng dùng

BAP 1,5 mg/l cho hệ số nhân cao nhất là 5,94 chồi trên mẫu Ra rễ tạo cây in

vitro hoàn chỉnh được dùng trên môi trường IBA 2mg/l hoặc NAA 2 mg/l

Theo Nguyễn Thị Kim Hằng (2005) trên giống hồng Rosa Chinensis,

trong giai đoạn nhân nhanh sử dụng BAP 1,5 mg/l cho hệ số nhân cao nhất,

sử dụng NAA 1mg/l hoặc NAA kết hợp với Than hoạt tính 2g/l để tạo ra cây hoàn chỉnh là tốt nhất

14

Theo Hồ Tân (2006) trên cây hoa hồng Rosa Chinensis, tỷ lệ chồi tăng

cao nhât khi bổ sung BAP 1mg/l và tỷ lệ rễ cao nhất khi bổ sung thêm 2ml/l NAA

Theo Lê Minh Lý (2007) về giống hồng Rosa Hybrid môi trường thích

hợp để nhân chồi là môi trường có bổ sung BAP 1-2 mg/l

Theo báo cáo của Nguyễn Nhật Linh và cs (2012), Than hoạt tính

(Activated charcoal) thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của cây in vitro [2]

Nguyễn Thị Phương Thảo (2015), trên cây hoa hồng Cơm (Rosa

sericea LINDL) 99,78% mẫu đoạn thân hoa hồng bật chồi trên môi trường

MS bổ sung 2,0 mg/l BAP và 0,05 mg/l α-NAA; Môi trường nhân nhanh chồi tốt nhất là môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l BAP; 100% chồi hoa hồng in vitro ra rễ trên môi trường ¼ MS Bổ sung AgNO3 và COCl2 vào môi trường

có ảnh hưởng tích cực đến sự ra hoa in vitro hoa hồng Cơm [1]

Bùi Thị Thu Hương (2017), đối với cây hồng cổ Sapa (Rosa gallica L.)

thì môi trường nhân nhanh tối ưu nhất là môi trường có bổ sung 1,5 mg/l BAP kết hợp với 0,5 mg/l Kin cho hệ số nhân là 2,48; môi trường ¼ MS cho tỉ lệ ra

rễ tốt nhất với 98,89 % sau 6 tuần nuôi cấy, số rễ trung bình cao nhất là 3,36 rễ/cây [5]

15

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Vật liệu thực vật của chúng tôi là giống hồng Vân Khôi có tên khoa học

là Rosa “Souvenir De la Malmaison”

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu là đoạn thân chứa mắt ngủ của cây hồng Vân Khôi được thu thập tại huyện Mộc Châu, tỉnh Sơn La, trồng tại vườn thực nghiệm

Sinh học, Khoa Sinh-KTNN, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành từ 12/2017-04/2019 tại Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, Khoa Sinh-KTNN, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2

2.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

2.3.1 Dụng cụ

Dao cấy, khay cấy, kéo, kẹp, bình thủy tinh 200 ml, bình xịt ethanol, đèn ethanol tại Phòng sinh lí thực vật-Khoa Sinh KTNN, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2

2.3.2 Thiết bị

Các thiết bị sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật Cân kĩ thuật (Sartorius, Đức), máy đo pH (HM30G/TOA, Đức), nồi hấp khử trùng (HV-110/ HIRAYAMA, Nhật), tủ lạnh Hitachi (31AG5D, Thái lan), máy cất nước hai lần (Hamilton, Mỹ), buồng cấy vô trùng (AV-110/TELSTAR), máy khuấy từ gia nhiệt (ARE/VELP, Italia), cân phân tích (Sartorius, Đức) tại Phòng sinh lí thực vật-Khoa Sinh KTNN, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2

2.4 Môi trường nuôi cấy

Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đều sử dụng môi trường dinh dưỡng

cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) bổ sung 30g/l saccharose, 7g/l Agar

và các chất điều hòa sinh trưởng 6-Benzyl amino purine (BAP), Napththalen acetic acid (α-NAA), Indolo-3-axit axetic (IAA ), pH từ 5,7-5,8

α-Môi trường nuôi cấy được khử trùng trong nồi khử trùng ở 117 o

C trong

15 phút

16

2.5 Điều kiện phòng nuôi cấy

Các thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm:

- Ánh sáng: Các mẫu đều được nuôi cấy với cường độ chiếu sáng 2000lux

- Quang chu kì 16 giờ/ngày

Gồm các thí nghiệm:

a Tạo vật liệu khởi đầu in vitro:

Sử dụng đốt thân (dài 2-3 cm chứa mắt ngủ) để khử trùng bề mặt bằng cách rửa sạch dưới vòi nước chảy trong 25 phút, sau đó lắc trong ethanol 70% trong thời gian khác nhau, kí hiệu I 1-9: 2,5; 5,0 hoặc 10 phút kết hợp với xử

lý bằng dung dịch javel 5 % (v/v, pha chế bằng dung dịch tẩy rửa chứa NaClO 5,3%) trong 5, 10, hoặc 15 phút Rửa lại bằng nước cất khử trùng 2-3 lần

Mẫu được cấy lên môi trường MS có bổ sung 30 g/l saccharose, 7 g/l agar Theo dõi tỷ lệ mẫu sạch chết và tỷ lệ sạch sống, tỷ lệ mẫu mẫu nhiễm sau 2 tuần nuôi cấy

Tỷ lệ sạch chết = (Số mẫu sạch chết/tổng số mẫu sạch) * 100% (%)

Tỷ lệ mẫu sạch sống = (Số mẫu sạch sống/tổng số mẫu sạch) * 100% (%)

Tỷ lệ mẫu nhiễm = (Số mẫu nhiễm/tổng số mẫu) * 100% (%)

b Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro

 Tái sinh chồi in vitro:

Nuôi cấy đốt thân (dài 2-3 cm chứa mắt ngủ) được khử trùng bề mặt trên môi trường MS có bổ sung 30 g/l saccharose, 7 g/l agar, bổ sung BAP với các nồng độ khác nhau, kí hiệu SI 1-8: 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75 và 2,0 mg/l