Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng biocellulose ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

Xuất phát từ lí do trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng Biocellulose ứng dụng trong bảo quản thực phẩm”.. Mục tiêu của đề t

TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Hà Nội, 2019

TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Người hướng dẫn khoa học

PGS.TS ĐINH THỊ KIM NHUNG

Hà Nội, 2019

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, em đã được các thầy cô giáo giảng dạy nhiệt tình tận tâm, truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích để làm hành trang cho sự phát triển của bản thân sau này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung đã giúp đỡ, chỉ bảo tận tình giúp em trong suốt quá trình học tập

và thực hiện đề tài này

Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn Thực Vật – Vi Sinh, khoa Sinh – KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giảng dạy và giúp đỡ em thực hiện đề tài này

Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, Trung tâm thông tin thư viện, phòng thí nghiệm Vi Sinh trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi để em thực hiện và hoàn thành đề tài này

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm, động viên giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài này

Hà Nội, tháng 05 năm 2019

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thành Mơ

Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân tôi, tất cả các số liệu đều được thu thâp từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, hoàn toàn không có số liệu sao chép Đề tài này nghiên cứu không trùng với công trình nghiên cứu của các tác giả khác

Trong đề tài, tôi có sử dụng một số dữ liệu của một số tác giả khác làm dẫn chứng, tôi xin phép các tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình

Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng bảo vệ

Hà Nội, tháng 05 năm 2019

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thành Mơ

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 1

3 Nội dung chính của đề tài, các vấn đề cần giải quyết 1

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1

5 Tính mới của đề tài 2

NỘI DUNG 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của Gluconacetobacter trong sinh giới 3

1.2 Đặc điểm sinh lí - sinh hóa của Gluconacetobacter 4

1.3 Biocellulose 5

1.3.1 Cấu trúc 5

1.3.2 Một số tính chất 5

1.3.3 Cơ chế tổng hợp 6

1.3.4 Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter 7

1.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất màng Biocellulose hiện nay 7

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 7

1.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 8

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 10

2.1 Đối tượng nghiên cứu 10

2.2 Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian 10

2.3 Thiết bị và hóa chất 10

2.3.1 Thiết bị 10

2.3.2 Hóa chất 10

2.3.3.1 Môi trường giữ giống 11

2.3.3.2 Môi trường nhân giống 11

2.3.3.3 Môi trường lên men 11

2.4 Phương pháp nghiên cứu 11

2.4.1 Phương pháp vi sinh 11

2.4.1.1 Phân lập chủng Gluconacetobacter theo phương pháp truyền thống (Phương pháp Vinogradski và Beijerinck) 11

2.4.1.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế bào trên tiêu bản nhuộm kép 12

2.4.1.3 Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường thạch nghiêng 13

2.4.1.4 Phương pháp tuyển chọn giống vi khuẩn Gluconacetobacter cho màng mỏng 13

2.4.1.5 Phương pháp hoạt hoá giống 13

2.4.2 Phương pháp hóa sinh 14

2.4.2.1 Xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ 14

2.4.2.2 Phát hiện hoạt tính catalase 14

2.4.2.3 Phát hiện khả năng oxi hóa acid acetic 14

2.4.2.4 Phát hiện khả năng oxi hóa rượu etylic thành acid acetic 15

2.4.2.5 Phát hiện khả năng tổng hợp cellulose 15

2.4.3 Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng Biocellulose 15

2.4.4 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 15

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 17

3.1 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo màng Biocellulose 17

3.1.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo màng

Biocellulose 17

3.1.2 Tuyển chọn chủng Gluconacetobacter xylinus T3 có khả năng lên men tạo màng Biocellulose 18

3.2 Nghiên cứu động thái sinh trưởng của chủng Gluconacetobacter xylinus T3 25

3.3 Ứng dụng lên men tạo sản phẩm 28

3.4 Ứng dụng trong bảo quản thực phẩm 29

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33

1 Kết luận 33

2 Kiến nghị 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

PHỤ LỤC 3

Hình 1.1 Sợi cellulose của màng Biocellulose 5

Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp cellulose ở Gluconacetobacter 7

Hình 3.3 Khuẩn lạc vi khuẩn phân lập trên môi trường thạch đĩa 17

Hình 3.4 Vi khuẩn của mẫu T1 phân lập trên môi trường thạch nghiêng 18

Hình 3.5 Vi khuẩn của mẫu Y1 phân lập trên môi trường thạch nghiêng 18

Hình 3.6 Vòng phân giải CaCO3 20

Hình 3.7 Đặc điểm màng của 4 chủng Biocellulose 21

Hình 3.8 Hình thái tế bào học của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter T3 23

Hình 3.9 Hình thái tế bào học của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Y2 23

Hình 3.10 Cấy vi khuẩn vào bình nuôi lắc 24

Hình 3.11 Nuôi lắc chủng vi khuẩn phân lập được 24

Hình 3.12 Màng Biocellulose sinh ra từ vi khuẩn Gluconacetobacter 24

Hình 3.13 Biểu đồ biểu diễn động thái phát triển của chủng vi khuẩn T3 26

Hình 3.14 Màng Biocellulose sau 5 ngày lên men 29

Hình 3.15 Hình ảnh bảo quản thịt trong 3 điều kiện khác nhau 31

Hình 3.16 Thịt để ngoài môi trường không bảo quản hỏng sau 2 ngày 32

Hình 3.17 Thịt bọc trongtúi nilong hỏng sau 2 ngày 32

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter

theo Frateur năm 1950 4Bảng 3.2 Đặc điểm của các chủng phân lập đƣợc 17

Bảng 3.3 Đặc điểm hình thành màng Biocellulose của 4 chủng

Gluconacetobacter 20

Bảng 3.4 Hàm lƣợng acid acetic hình thành của 4 chủng

Gluconacetobacter 21

Bảng 3.5 Hoạt lực lên men của các chúng vi khuẩn 23

Bảng 3.6 Khả năng kết lắng của 2 chủng vi khuẩn Gluconacetobacter

1

1 Lý do chọn đề tài

Màng Biocellulose được tổng hợp từ một số loại vi khuẩn, có bản chất

là cellulose được liên kết với các tế bào vi khuẩn Màng này vừa có cấu trúc

và đặc tính cơ học rất giống với cellulose của thực vật, nhưng lại có một số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền cơ học và khả năng thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, khả năng polymer hóa lớn

Màng Biocellulose có nhiều ứng dụng đa dạng trong các lĩnh vực khác

nhau như y học, mỹ phẩm, bảo vệ môi trường, công nghiệp đặc biệt là trong lĩnh vực thực phẩm Theo xu hướng của thời đại, xã hội ngày càng phát triển thì việc chú trọng đến sức khỏe là điều thiết yếu Xuất phát từ lí do trên,

chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn chủng vi sinh vật có

khả năng tạo màng Biocellulose ứng dụng trong bảo quản thực phẩm”

2 Mục tiêu của đề tài

Tuyển chọn được 1 đến 2 chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng

Biocellulose ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

3 Nội dung chính của đề tài, các vấn đề cần giải quyết

3.1 Phân lập, tuyển h n hủng vi sinh vật ó khả năng tạo màng Biocellulose

3.2 Nghiên ứu động thái phát triển của chủng tuyển h n

3.3 Xá định quá trình lên men tạo sản phẩm và ứng dụng bảo quản thực phẩm

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

4.1 Ý nghĩa khoa h : Nghiên cứu đặc tính và quá trình lên men tạo màng

của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn Kết quả nghiên cứu là dữ liệu góp phần bổ sung cho các nghiên cứu và ứng dụng của màng

Biocellulose trong đời sống

4.2 Ý nghĩa thự tiễn: Tuyển chọn được chủng vi khuẩn Gluconacetobacter

xylinus T3 có khả năng tạo màng Biocellulose mỏng, dai, nhẵn ứng dụng

2

trong bảo quản thực phẩm, giúp giữ thực phẩm tươi ngon, lâu bị hỏng bởi vi sinh vật gây hại ở điều kiện thường

5 Tính mới của đề tài

Dựa vào hình thái, màu sắc, kích thước khuẩn lạc và đặc tính sinh học của 12 chủng vi khuẩn phân lập được thì qua quá trình sơ tuyển lần 1 chúng

tôi đã sơ tuyển được 2 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Gluconacetobacter

xylinus; tuyển chọn lần 2 thu được 1 chủng vi khuẩn là Gluconacetobacter xylinus T3 có khả năng lên men tạo màng Biocellulose mỏng, dai, nhẵn, có

thể ứng dụng trong bảo quản thực phẩm giúp giữ thực phẩm lâu hơn so với bảo quản bằng túi nilong mà vẫn giữ được độ tươi ngon và độ cứng của sản phẩm

3

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của Gluconacetobacter trong

Ngày nay, việc phân loại vi khẩn acetic nói chung và vi khuẩn

Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan điểm khác nhau Vì vậy,

đòi hỏi cần nghiên cứu sâu hơn về loại vi khuẩn này

Gluconacetobacter là loại trực khuẩn hình que, thẳng hay hơi cong,

kích thước khoảng 2µm Tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động Các tế bào này được bao bọc bởi lớp màng nhày

có bản chất là hemicellulose, màng này khi nhuộm acid H2SO4 bắt màu xanh

và nhuộm fucshin thì bắt màu hồng Trong môi trường, Gluconacetobacter có

khả năng tích lũy 4,5% acid acetic, khi nồng độ acid trong môi trường quá cao

sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn [8] Chúng có thể sống chung với nấm men trong một loại nước giải khát dân gian làm bằng nước chè và đường loãng, pH thích hợp từ 5,4 – 6,2, nhiệt độ thích hợp từ 25 – 300C, còn gọi là “ Thủy hoài sâm”, ở Nga người ta gọi là “Nấm chè”, ở Trung Quốc có tên “ Hải bảo”, “ Vị nấm”, người Pháp gọi là “Champiognon De Lougue Vie – Nấm trường sinh

Vi khuẩn Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, hóa dị

dưỡng Tế bào của chúng thường được tìm thấy trong nhiều nơi như giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả hoặc trong đất

4

Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng [5], vi khuẩn Gluconacetobacter có

bao nhầy cấu tạo bởi cellulose Thành phần cấu tạo của bao nhầy chủ yếu là các polysaccarit (chủ yếu là glucose), ngoài ra còn có polypeptit, protein Bao nhầy này có tác dụng bảo vệ, cung cấp dinh dưỡng, giúp vi khuẩn bám vào giá thể

1.2 Đặc điểm sinh lí - sinh hóa của Gluconacetobacter

Đặc điểm sinh lý: Chủng Gluconacetobacter có thể phát triển ở nhiệt

độ từ 25 – 350C và pH = 4 – 6 Nhiệt độ và pH tối ưu sẽ thay đổi dựa vào từng giống Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái ngay cả ở trong môi trường tối ưu Chủng

Gluconacetobacter chịu được pH thấp, vì vậy thường bổ sung acid acetic vào

môi trường nuôi cấy để giảm sự nhiễm khuẩn lạ

Đặc điểm sinh hóa: Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ vào các tiêu chuẩn như: Khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt tính catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường

Hoyer, Đặc điểm phân biệt của chủng Gluconacetobacter với các chủng

khác trong một chi được trình bày trong bảng 1.1:

Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn

Gluconacetobacter theo Frateur năm 1950

1 Oxy hóa ethanol thành acid

acetic

Chuyển hóa môi trường chứa Bromphenol Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng

+

2 Hoạt hóa catalase Hiện tượng sủi bọt khí +

3 Sinh trưởng trên môi

trường Hoyer

Sinh khối không tăng -

4 Chuyển hóa Glycerol thành

5

1.3 Biocellulose

1.3.1 Cấu trú

Màng Biocellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β - 1,4

glucopyranose mạch thẳng Nó có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính của chúng lại khác xa nhau

Chuỗi polyme β - 1,4 glucopyranose khi mới hình thành sẽ liên kết với

nhau tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm Những sợi nhỏ kết

tinh tạo sợi lớn hơn – gọi là các sợi vĩ mô, những sợi vĩ mô này thường kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo thành những dải lớn Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với những dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc vandesvan tạo thành dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng Khi quần thể vi khuẩn sinh trưởng thì kích thước của màng sẽ tăng lên [9], [4], [15]

Màng Biocellulose có cơ chế kết tinh khác với cellulose của thực vật ở

chỗ chúng không có sự kết hợp hemixellulose, lignin hay những thành phần khác mà chúng được cấu tạo từ các sợi microfibil tạo nên những bó sợi song song Sau đó chúng sẽ kết hợp với nhau tạo thành mạng lưới cellulose [11]

Hình 1.1 Sợi cellulose của màng Biocellulose

1.3.2 Một số tính hất

Chung và Shyu (1999) đã nghiên cứu tính chất của Biocellulose như độ

cứng, độ dính, độ dai và ảnh hưởng của dung dịch đường, muối lên tính chất

6

của Biocellulose [12] Các mảnh Biocellulose có độ cứng là 3,68 kg/cm2 Độ

cứng của các màng Biocellulose tăng lên khi được nhúng bằng dung dịch

muối và sẽ giảm khi nhúng vào dung dịch đường Các sản phẩm từ cellulose

vi khuẩn có một số tính chất sau:

Độ bền hóa học, độ bền cơ học và sức căng cao

Khả năng giữ nước và độ ẩm cao, do đó có thể điều chỉnh độ xốp của màng

Có thể theo dõi, kiểm soát lý tính của cellulose do cấu trúc của cellulose vi khuẩn có khả năng biến đổi trong quá trình nuôi cấy

Kiểm soát được kích thước, cấu trúc và chất lượng của cellulose (kiểm soát được cellulose kết tinh dị hình) trong quá trình nuôi cấy tạo cellulose

Như chúng ta thấy, cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà không gắn lygnin, mặt khác có thể dễ dàng bị một số nhóm

vi sinh vật phân khác giải Vì vậy, cellulose vi khuẩn được xem là nguồn vật liệu mới có nhiều ưu thế trong tương lai [9], [6]

1.3.3 Cơ hế tổng hợp

Quá trình tổng hợp Biocellulose là một tiến trình bao gồm nhiều bước

được điều hòa một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại enzyme, phức hợp xúc tác các loại protein điều hòa [1], [10]

Theo tác giả Alina Krystynowics và cộng sự thì thì quá trình tổng hợp

Biocellulose có 4 enzyme tham gia xúc tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Gluconacetobacter là: Glucokinase, Phosphoglucomutase, Glucose - 1 -

phosphate uridylytransferase (UDPG pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose synthase (CS) Trong đó UGP là enzyme có vai trò quan trọng nhất

7

Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp cellulose ở Gluconacetobacter

1.3.4 Chứ năng ủa ellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter

Màng Biocellulose nằm ở mặt thoáng của môi trường nuôi cấy có tác dụng như một lớp bảo vệ cho các tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter trước

các nhân tố có hại của môi trường Nhiều tài liệu cho rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn giúp bảo vệ chúng khỏi tia cực tím Khoảng 23% số tế

bào Gluconacetobacter được bao bọc bởi màng Biocellulose sống sót sau 1 giờ xử lí bằng tia cực tím Khi tách Biocellulose ra khỏi tế bào, khả năng sống

sót của chúng giảm đáng kể, chỉ còn 3%

Ngoài ra, màng Biocellulose còn là giá thể chống đỡ cho các tế bào vi

khuẩn đồng thời cũng giúp chúng lấy các chất dinh dưỡng từ môi trường một cách dễ dàng hơn so với khi ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose

1.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất màng Biocellulose hiện nay

1.4.1 Tình hình nghiên ứu trên thế giới

Trên thế giới, màng Biocellulose đã được ứng dụng rất nhiều trong các

lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình

xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi

8

trường cơ chất sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm Tuy nhiên,

những ứng dụng phổ biến trên thế giới của màng Biocellulose là dùng trong

ngành thực phẩm và mỹ phẩm Một số tác giả: Hamlyn và cộng sự (1997), Cienchanska (2004), Legeza và cộng sự (2004), Wan và Millon (2005), Czaja

và cộng sự (2006) đã sử dụng màng Biocellulose đắp lên các vết thương hở,

vết bỏng và đã thu được kết quả tốt Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã được

đăng ký bản quyền về làm màng Biocellulose từ Acetobacter xylinum dùng để

trị bỏng Các nhà khoa học Jonas và Farad (1998), Czaja và cộng sự (2006) đã dùng màng làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ

1.4.2 Tình hình nghiên ứu tại Việt Nam

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về Gluconacetobacter và màng

Biocellulose còn khá mới mẻ nhưng đã thú hút được sự quan tâm của nhiều

tác giả Các nghiên cứu mới chỉ quan tâm với cấu tạo, đặc tính và quá trình tạo màng với các ứng dụng trong thực tiễn như chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng, làm mặt nạ dưỡng da, sản xuất thạch dừa Năm 1997 có công trình của tác giả Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Thị Mùi nghiên cứu môi trường nước giá đỗ thay thế nước dừa trong sản xuất thạch dừa từ chủng vi

khuẩn Gluconacetobacter xylinus Năm 1995 – 2000 các công trình nghiêm cứu về ki khuẩn Gluconacetobacter và khă năng lên men sinh acid của nhóm

tác giả Lê Văn Nhương, Nguyễn Thị Ngọt, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Văn Cách Các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc nghiên cứu quá trình sinh

acid, khả năng tạo màng Biocellulose, đặc tính của màng Công trình nghiên

cứu của nhóm tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Đỗ Thu Hương, Nguyễn Khắc Thanh, Nguyễn Duy Hưng và cộng sự về ảnh hưởng của môi trường dinh

dưỡng và điều kiện lên men cho vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus ứng

dụng làm thạch dừa năm 2000 Năm 2006, tác giả Nguyễn Văn Thanh trưởng

bộ môn Vi sinh – Ký sinh trường Đại học Y dược học thành phố Hồ Chí Minh đã chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học dầu mù u bằng phương pháp lên men Năm 2008 có nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung đã

chọn được 1 chủng Gluconacetobacter NH 1, khảo sát khả năng tạo màng của chủng này Công trình của nhóm tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Trần Thị Mai,

9

trong lên men tạo màng Biocellulose cho chủng Gluconacetobacter BHN2

Gần đây, những nghiên cứu của nhóm tác giả Đinh Thị Kim Nhung về

thu nhận màng từ vi khuẩn Gluconacetobacter, ứng dụng màng trong điều trị

bỏng Hiện nay nhóm nghiên cứu đang tập trung theo hướng tuyển chọn cho màng dai và mỏng

10

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng

Biocellulose

2.2 Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian

- Phạm vi nghiên cứu: Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng tạo

màng Biocellulose trong ứng dụng bảo quản thực phẩm

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

- Thời gian : Từ 08/2018 – 05/2019

2.3 Thiết bị và hóa chất

2.3.1 Thiết bị

Trong quá trình tiến hành thí nghiệm chúng tôi đã sử dụng những dụng

cụ thiết bị như: nồi hấp khử trùng, tủ sấy (Haraeus, Đức), box cấy vô trùng (Haraeus, Đức), cân điện tử (Precica XT 320 M, Thụy Sỹ), micropipep (Gilson, Pháp), tủ lạnh (Tawasi, Nhật), kính hiển vi quang học (olympus

CX41, Nhật), hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thủy tinh, bình tam giác, lam kính, lamen, đèn cồn,… và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác

Tất cả các dụng cụ, thiết bị và hóa chất trên đều do phòng Vi sinh, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp

2.3.2 Hóa hất

- Nguồn đường: glucose, saccarose, ethanol, fructose, sorbitol

- Nguồn nitơ:

+ Nguồn nitơ vô cơ: (NH4)2SO4

+ Nguồn nitơ hữu cơ: pepton, cao thịt

- Một số hóa chất vô cơ: KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaOH

- Một số loại thuốc nhuộm: tím gentian, dung dịch fushsin, dung dịch lugol

- Nước dừa, agar,…

11

2.3.3.1 Môi trường giữ giống

Glucose: 20g (NH4)2SO4 : 3g

Pepton: 5g Thạch agar: 20g MgSO4.7H2O: 2g KH2PO4: 2g Nước máy: 1000 ml

Nguồn vật liệu: dung dịch nước dừa bổ sung dịch lên men Kombucha tỉ

lệ 2% lên men tĩnh trong vòng 4 ngày tạo lớp màng trắng trong dày 2 mm

Sử dụng phương pháp pha loãng Pasteur Chuẩn bị 10 ống nghiệm có đậy nút bông sấy vô trùng, cho vào mỗi ống nghiệm 9ml nước cất, đậy nút

12

bông hấp thanh trùng trong nồi hấp giữ ở 1150C, làm trong thời gian 120 phút Chuyển vào bốc cấy vô trùng, dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch từ bình tam giác chứa mẫu màng gốc cho vào ống nghiệm thứ nhất, đậy nút bông, vontex trong 5 phút, thu được ống dịch pha loãng mức 10-1 Tiếp tục hút 1ml dịch từ ống có độ pha loãng 10-1

cho vào ống nghiệm thứ 2 Tiếp tục pha loãng ở các độ pha loãng 10-3

, 10-4…10-10 Căn cứ vào số lượng vi khuẩn có trong mẫu, chúng tôi chọn các mẫu có độ pha loãng 10-6

– 10-8 để tiến hành các bước tiếp theo

Phương pháp phân lập trên môi trường thạch đĩa: chuẩn bị môi trường, hấp khử trùng, đổ môi trường thạch đĩa Dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch màng đã chuẩn bị ở trên (với các độ pha loãng 10-6

– 10-8) nhỏ vào các hộp lồng đã chứa môi trường thạch, dùng que trang thủy tinh trang đều khắp bề mặt thạch Đặt ngược các hộp lồng, bao gói cẩn thận, giữ trong tủ ấm 300

C Sau 3 – 4 ngày lấy ra quan sát khuẩn lạc (hình thái, kích thước, màu sắc, mép viền khuẩn lạc, độ trơn bóng, vòng phân giải CaCO3)

Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng đã loại bỏ CaCO3, tách các khuẩn lạc riêng rẽ từ hộp lồng, cấy truyền vào các ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng đã khử trùng, nuôi trong tủ ấm ở 300

C Sau 3 – 4 ngày, quan sát làm tiêu bản nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram

2.4.1.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế bào trên tiêu bản nhuộm kép

Lấy các khuẩn lạc trên các ống nghiệm thạch nghiêng, làm vết bôi trên lam kính, cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn Nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram:

13

9 Hong khô trên ngọn lửa đèn cồn

Đưa lên vật kính 5 – 40 quan sát sau đó đưa lên tiêu bản dưới kính dầu

100 với độ phóng đại 1000 lần Nếu tế bào vi khuẩn nhuộm màu hồng (Gram

âm) đó chính là vi khuẩn Gluconacetobacter

2.4.1.3 Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường thạch nghiêng

Các chủng giống sau khi phân lập và sơ bộ đã xác định là

Gluconacetobacter được cấy trên môi trường thạch nghiêng (đã loại bỏ

CaCO3), nuôi trong tủ ấm 3 – 4 ngày ở 300C Cấy truyền giữ giống trên môi trường thạch nghiêng 2 tháng 1 lần

2.4.1.4 Phương pháp tuyển chọn giống vi khuẩn Gluconacetobacter cho màng mỏng

Mục đích nghiên cứu này là tuyển chọn các chủng vi khuẩn

Gluconacetobacter cho màng mỏng, nhẵn, dai để chế tạo màng sinh học làm

túi đựng bảo quản thực phẩm Vì vậy cần tiến hành các chỉ tiêu sau:

 Quan sát đặc điểm quá trình tạo màng Biocellulose (thời gian tạo

màng, đặc điểm của màng, độ dày mỏng của màng, )

 Quan sát kích thước và hình dạng tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram, kiểm tra đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng mới phân lập

Các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sau khi tuyển chọn sẽ được

nuôi trong môi trường dịch thể để kiểm tra khả năng tạo màng Chúng tôi tuyển chọn 3 lần liên tiếp để thu được chủng có khả năng tạo màng tốt nhất dùng cho các bước nghiên cứu tiếp theo

2.4.1.5 Phương pháp hoạt hoá giống

Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1100 C trong 20 phút Sau