Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon, nitơ và nhiệt độ tới khả năng tạo màng biocellulose, ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

Lý do chọn đề tài Khoa học công nghệ ngày một phát triển, con người luôn luôn muốn khám phá và tìm ra các nguồn nguyên liệu mới với mong muốn đáp ứng nhu cầu thiết yếu của mình Trong qu

TỚI KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BIOCELLULOSE,

ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẦM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Hà Nội, 2019

TỚI KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BIOCELLULOSE,

ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẦM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Người hướng dẫn khoa học

PGS.TS ĐINH THỊ KIM NHUNG

LỜI CẢM ƠN

Em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất, chân thành nhất bằng tất

cả tấm lòng của mình đến PGS TS inh Thị Kim Nhung trong suốt thời gian vừa qua đã hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thiện khóa luận này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn và lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô trong tổ vi sinh vật thuộc khoa Sinh – KTNN, trường ại học Sư phạm

Hà Nội 2 đã hướng dẫn và khuyến khích em trong suốt khoảng thời gian học tập vừa qua

Em xin bày tỏ lòng biết ơn và cảm ơn đến Ban giám hiệu của trường ại học Sự phạm Hà Nội 2 và Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN

đã giúp đỡ và tạo điều kiện để cho em có thể hoàn thành tốt nhất đề tài nghiên cứu của mình

Lời cảm ơn cuối cùng em xin được gửi tới gia đình, bạn bè và người thân đã luôn quan tâm giúp đỡ em trong khoảng thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn!

N n t n 05 n m 2019

Sinh viên

Kiều Thị Mai

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan toàn bộ những nội dung trong khóa luận này là

cả quá trình tìm hiểu lâu dài và toàn bộ đều là sự thật ây cũng là thành quả nghiên cứu nỗ lực của riêng bản thân em trong thời gian qua Tất cả các số liệu trong khóa luận đều đƣợc thu thập từ thực nghiệm đã qua xử

lý thống kê, không có số liệu nào là sao chép hay bịa đặt và không trùng với kết quả đã đƣợc công bố

Nếu có sai sót em xin hoàn toàn nhận trách nhiệm

N n t n 05 n m 2019

Sinh viên

Kiều Thị Mai

MỤC LỤC

MỞ ẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

5 óng góp của đề tài 3

Chương 1 4

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Nhu cầu dinh dưỡng và nhiệt độ của vi sinh vật có khả năng lên men tạo màng Biocellulose 4

1.1.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon 4

1.1.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 5

1.1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 5

1.2 Cấu trúc và tính chất của màng Biocellulose 5

1.2.1.Cấu trúc của màng Biocellulose 5

1.2.2 Một số tính chất của màng Biocellulose 6

1 2 3 Qúa trình tổng hợp Biocellulose từ vi khuẩn Gluconacetobacter 6

1.2.4 Chức năng của cellulose với vi khuẩn Gluconacetobacter 8

1 2 5 Túi bảo quản thực phẩm 9

1.3 Lịch sử nghiên cứu vấn đề 9

1 3 1 Trên thế giới 9

1.3.2 Ở Việt Nam 10

Chương 2 ỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 ối tượng nghiên cứu và hóa chất 12

2 1 1 ối tượng nghiên cứu 12

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 12

2.1.3 Hóa chất 12

2 1 4 Các loại môi trường 13

2 1 4 1 Môi trường giữ giống (MT1) 13

2 1 4 2 Môi trường nhân giống (MT2) 13

2 1 4 3 Môi trường lên men (MT3) 13

2.2 Phạm vị nghiên cứu, địa điểm và thời gian 14

2 3 Phương pháp nghiên cứu 14

2 3 1 Phương pháp vi sinh 14

2 3 1 1 Phân lập tuyển chọn chủng Gluconacetobacter theo phương pháp truyền thống (Phương pháp Vinogradski và Beijerinck) 14

2 3 1 2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế bào trên tiêu bản nhuộm kép 15

2 3 1 3 Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường thạch nghiêng 15

2 3 2 Phương pháp hóa sinh 16

2 3 2 1 Phương pháp kiểm tra hoạt tính catalase 16

2 3 2 2 Xác định khả năng oxy hóa acid acetic 16

2 3 2 3 Xác định khả năng tổng hợp cellulose 17

2 3 3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon, nitơ và nhiệt độ đến khả năng tạo màng Biocellulose 17

2 3 3 1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon 17

2 3 3 2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ 17

2 3 3 3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ 18

2 3 4 Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng Biocellulose 18

2 3 5 Phương pháp sấy khô và đóng thành bao bì đựng thực phẩm 18

2 3 6 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 18

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20

3 1 Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng Biocellulose 20

3 1 1 Phân lập Gluconacetobacter có khả năng sinh màng Biocellulose 20

3.1.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng Biocellulose dai, mỏng 21

3 1 3 Nghiên cứu động thái sinh trưởng của các chủng G.xylinus T1 24

3.2 Ảnh hưởng của cacbon tới khả năng tạo màng Biocellulose của chủng G.xylinus T1 25

3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ tới khả năng lên men tạo màng Biocellulose của chủng G.xylinus T1 30

3.3.1 Ảnh hưởng của nitơ hữu cơ 30

3.3.2 Ảnh huởng của nitơ vô cơ 32

3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng lên men tạo màng Biocellulose của chủng G.xylinus T1 34

3 5 Xây dựng quy trình tạo màng Biocellulose và ứng dụng trong bảo quản thực phẩm 36

3.5.1 Xây dựng quy trình tạo màng Biocellulose 36

3.5.2 Ứng dụng trong bảo quản thực phẩm 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 1 Quá trình hình thành cellulose trong tế bào vi khuẩn

Gluconacetobacter 7

Hình 2 2 Con đường chuyển hoác cacbon trong vi khuẩn Gluconacetobacter 8

Hình 3 1 Khuẩn lạc vi khuẩn mẫu phân lập 20

Hình 3 2 Vòng phân giải CaCO3 21

Hình 3 3 Màng Biocellulose sinh ra từ vi khuẩn Gluconacetobacter 23

Hình 3 4 Lên men tạo màng trên MT3 có sự thay đổi hàm lượng cacbon 28

Hình 3 5 Lên men tạo màng trên MT3 có hàm lượng glucose là 10g/l 29 Hình 3 6 Lên men tạo màng trên MT3 có hàm lượng pepton là 5g/l 31

Hình 3 7 Lên men tạo màng trên MT3 có sự thay đổi hàm lượng (NH4)2SO4 32

Hình 3 8 Lên men tạo màng trên MT3 có hàm lượng (NH4)2SO4) là 3g/l 33

Hình 3 9 Màng nuôi cấy ở nhiệt độ 30C 35

Hình 3 10 Màng Biocellulose sau 5 ngày lên men 37

Hình 3 11 Cà chua được bọc bằng màng Biocellulose 39

Hình 3 12 Cà chua bị hỏng sau 7 ngày 39

Hình 3 13 Cà chua bọc túi nilông bị hỏng sau 12 ngày 39

Hình 3 14 Cà chua bọc màng Biocellulose hỏng sau 23 ngày 39

Hình 3 15 Bảo quản dưa chuột 39

Hình 3 16 Dưa chuột bị hỏng sau 5 ngày 39

Hình 3 17 Mận được bảo quản thường, túi nilông và băng màng

Biocellulose 40

Hình 3 18 Mận được bảo quản sau 10 ngày 40 Hình 3 19 Thịt được bảo quản thường, túi nilông và băng màng

Biocellulose 40

Hình 3 20 Thịt bọc nilon hỏng sau 2 ngày 40

Hình 3 21 Thịt được bọc trong màng Biocellulose hỏng sau 7 ngày 40

Gluconacetobacter xylinus

Môi trường Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

Số thứ tự

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Một số đặc tính của màng Biocellulose 23 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến độ dày màng Biocellulose

của chủng G xylinus T1 26

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khối lượng tươi của màng

Biocellulose của chủng G xylinus T1 26

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khối lượng khô của màng

Biocellulose của chủng G xylinus T1 27

Bảng 3 5 So sánh bảo quản một số loại thực phẩm bằng màng

Biocellulose, túi nilông và không bảo quản 46

Bảng 3.6 Số lượng tế bào tại các thời điểm của chủng vi khuẩn

G xylinus T1 (× tế bào/ml) 46 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến khả năng tạo màng

Biocellulose của chủng G xylinus T1 46 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của hàm lượng Pepton đến khả năng tạo màng

Biocellulose của chủng G xylinus T1 45

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến hình thành màng

Biocellulose của chủng G xylinus T1 47

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng hình thành màng

Biocellulose 47

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Biểu đồ quá trình sinh trưởng của chủng G xylinus T1 24

Biểu đồ 3.2 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến

khả năng tạo màng Biocellulose 28

Biểu đồ 3.3 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng pepton đến khả

năng tạo màng Biocellulose 31

Biểu đồ 3.4 Biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng nitơ ((NH4)2SO4) tới

khả năng hình thành màng Biocellulose của chủng

G.xylinus T1 33

Biểu đồ 3.5 Mối tương quan giữ nhiệt độ với sự hình thành màng

Biocellulose 35

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Khoa học công nghệ ngày một phát triển, con người luôn luôn muốn khám phá và tìm ra các nguồn nguyên liệu mới với mong muốn đáp ứng nhu cầu thiết yếu của mình Trong quá trình nghiên cứu để tìm

ra nguồn nguyên liệu mới các nhà khoa học đã phát hiện ra rất nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau và ứng dụng trong thực tiễn cuộc sống hàng ngày Một trong những nguồn nguyên liệu đang được thu hút sự chú ý hiện nay đó là cellulose vi khuẩn có khả năng hình thành nên màng

sinh học Biocellulose

Màng sinh học Biocellulose với những đặc tính rất ưu việt được

xem như là một nguồn polymer sinh học mới lạ, được tạo ra do vi khuẩn

Gluconacetobacter Chúng có đặc tính và cấu trúc tương tự như

cellulose của thực vật Cellulose của vi khuẩn chúng có những đặc tính đặc biệt ưu việt hơn sơ với cellulose của thực vật như về độ dẻo dai, độ chắc, bền, đàn hồi Với những đặc điểm nổi trội như vậy chúng đã được ứng dụng vào nhiều các lĩnh vực như: Màng phân tách để xử lý nước (Brown, 1989, Jonas và Fonah, 1998), công nghiệp sản xuất giấy, mặt nạ dưỡng da, thực phẩm hay thay thế thực phẩm ặc biệt trong lĩnh vực y

học, màng Biocellulose đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da

trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điều trị các

bệnh tim mạch Vậy nên màng sinh học Biocellulose có nhiều tiềm năng

để có thể thay thế túi nilông trong tương lai và khả năng đánh giá độ nhiễm khuẩn của thực phẩm

Trong nhiều nghiên cứu cho thấy rằng cacbon, nitơ và nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật

trong quá trình tạo màng sinh học Biocellulose ể hiểu rõ hơn về bản chất của quá trình tạo màng Biocellulose và ảnh hưởng của nguồn cacbon, nitơ và nhiệt độ đến khả năng tạo màng sinh học Biocellulose

mỏng dai, và có thời gian nuôi cấy ngắn nhất tôi đã lựa chọn đề tài:

“N ên cứu ản ưởng của nguồn cacbon, n tơ v n ệt đ tới khả

n n tạo m n B ocellulose ứng dụng trong bảo quản thực phẩm”

2 Mục tiêu của đề tài

Xác định được hàm lượng cacbon, nitơ và nhiệt độ thích hợp cho

quá trình tạo màng Biocellulose trên môi trường dịch nước dừa hoặc dịch

nước mía ịnh hướng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

3 Nội dung nghiên cứu

3 1 Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo

là xây dựng khung xương tế bào Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các enzyme, acid nucleic và các sản phẩm trao đổi chất Nhiệt độ thuận lợi giúp cho sinh vật sinh trưởng và phát triển tốt nhất

4.2 Ý n ĩa t ực tiễn

Tạo màng Biocellulose trong thời gian ngắn nhất (khoảng 4 ngày)

và tốt nhất với chi phí thấp, bước đầu sản xuất túi bảo quản thực phẩm

có khả năng phân hủy ngoài tự nhiên để thay thế túi nilông

5 Đóng góp của đề tài

Tuyển chọn được chủng vi khuẩn G.xylinus T1 có khả năng tạo

màng mỏng, dai và bền Tìm được nguồn cacbon, nitơ và nhiệt độ thích

hợp cho quá trình lên men tạo màng Biocellulose của chủng vi khuẩn

G.xylinus T1 bao gồm: đường glucose với hàm lượng 10 - 12 (g/l); nitơ

vô cơ là (NH4)2SO4 với hàm lượng là từ 3 (g/l), nguồn nitơ hữu cơ là pepton với hàm lượng là 5 (g/l) và ở nhiệt độ là 30C

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nhu cầu dinh dưỡng và nhiệt độ của vi sinh vật có khả năng lên

men tạo màng Biocellulose

1.1.1 Ản ưởng của nguồn cacbon

ể vi sinh vật có thể sinh trưởng và phát triển tốt cần cung cấp nguồn cacbon phù hợp, tùy thuộc vào nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô cơ hay hữu cơ Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon của vi sinh vật phụ thuộc vào các yếu tố: Thành phần hóa học

và tính chất sinh lí của nguồn thức ăn, đặc điểm sinh lí của từng loại vi sinh vật

Người ta thường sử dụng đường để làm thức ăn cacbon khi nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị dưỡng Cần chú ý rằng đường đơn ở nhiệt

độ cao có thể chuyển hóa thành các loại hợp chất có màu tối gọi là đường cháy rất khó hấp thụ Trong môi trường kiềm sau khi khử trùng đường còn rễ bị axit hóa và làm biến đổi pH môi trường ể tránh các hiện tượng này khi khử trùng môi trường chứa đường người ta thường sử dụng nồi hấp ở áp lực 0,5atm (112,5C) và duy trì trong vòng 30 phút

ối với các loại đường đơn tốt nhất là sử dụng phương pháp hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal) hoặc lọc riêng dung dịch đường (thường dùng ở nồng độ 20%) bằng nến lọc hoặc bằng màng lọc vi khuẩn sau đó dùng thao tác vô trùng để bổ sung vào môi trường đã khử trùng [3]

ể nuôi cấy các loại vi khuẩn khác nhau người ta thường dùng nồng độ đường không giống nhau Với vi khuẩn, xạ khuẩn người ta thường dùng 0,2 - 0,5% đường Hầu hết vi sinh vật chỉ đồng hóa được các loại đường ở dạng đồng phân D Các hợp chất chứa cả C và N (pepton, nước thịt, nước chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch, nước chiết giá đậu) có thể sử dụng vừa làm nguồn cacbon vừa làm nguồn nitơ đối với vi sinh vật [2]

1.1.2 Ản ưởng của nguồn n tơ

Môi trường để nghiên cứu về cellulose của vi khuẩn là môi trường

do Hestrin và Schramm thiết lập, có chứa cao nấm men và pepton là nguồn hữu cơ, (NH4)2SO4 là nguồn nitơ vô cơ Nguồn nitơ vô cơ mà vi sinh vật dễ hấp thụ nhất là NH3 và [2]

Sau khi đồng hóa trong môi trường sẽ tích lũy anion vô cơ

và vì thế mà làm hạ thấp rất nhiều trị số pH của môi trường Muối amon của các axit hữu cơ ít làm chua môi trường hơn do đó có lúc được sử dụng nhiều hơn Ure là nguồn thức ăn nitơ trung tính về mặt sinh lí Nhiều khi để nuôi cấy vi sinh vật bằng nguồn nitơ là ure người ta phải bổ sung thêm muối amon Sở dĩ như vậy là bởi vì phải có thức ăn nitơ để hấp thụ cho vi sinh vật phát triển đã thì mới có thể sản sinh ra được ureaza để thủy phân ure [3]

Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp đối với nhiều loại tảo, nấm sợi và xạ khuẩn nhưng ít thích hợp với nhiều loại nấm men và vi khuẩn Sau khi vi khuẩn sử dụng hết gốc các ion kim loại còn lại

sẽ làm kiềm hóa môi trường

1.1.3 Ản ưởng của nhiệt đ

Nhiệt độ là một yếu tố quan trọng đến sự hoạt động của các vi sinh

vật trong quá trình tạo màng Biocellulose Trong quá trình sinh trưởng

nếu như trong điều kiện nhiệt độ thấp vi sinh vật sẽ sinh trưởng rất chậm, thời gian nuối cấy kéo dài ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp cellulose

1.2 Cấu trúc và tính chất của màng Biocellulose

1.2.1.Cấu trúc của m n B ocellulose

Biocellulose đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực vật Màng Biocellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme -1,4 glucopynanose Có thành phần hóa học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính của chúng lại khác xa nhau [18]

Chuỗi polyme -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành sợi nhỏ có kích thước 1,5nm Những sợi nhỏ kết tinh tạo

thành sợi lớn hơn – sợi vĩ mô (microfibril) (Jonas and Farah, 1998) [23],

những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo thành dải

robbon (Yamanaka et.al 2000) [24] Dải ribbon có chiều dài khoảng từ

1-9nm Những dải ribbon được kéo dài ra từ tế bào này sẽ liên kết với

những dải ribbon của tế bào khác bằng liên kết hidro hoặc lực Van Der Waals tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng

trên bề mặt môi trường nuôi cấy

1.2.2 M t số tín c ất của m n B ocellulose

Brown A J (1886), đã nghiên cứu lớp màng do vi khuẩn

Gluconacetobacter tạo ra trên môi trường nuôi cấy và thấy có bản chất là

hemicellulose Hemicellulose là những polysaccarid không tan trong

nước nhưng tan trong dung dịch kiềm tính [17]

Ngoài ra màng Biocellulose có độ tinh sạch rất tốt, tốt hơn nhiều

so với các cellulose khác không những vậy chúng còn có khả năng tự

phân hủy sinh học, tái chế hay hồi phục hoàn toàn Chúng còn có độ bền

cơ học cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp và ổn định về kich thước

Tính hút nước của màng Biocellulose thì màng có khả năng giữ nước

đáng kể (lên đến 90%), có tính xốp, độ ẩm cao

1.2.3 Qu trìn tổng hợp Biocellulose từ vi khuẩn Gluconacetobacter

Khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter ở trong môi trường có

nguồn dinh dưỡng đầy đủ (chủ yếu là cacbohydrat, các vitamin ,

, và các chất kích thích sinh trưởng), ở đây chúng sẽ thực hiện quá

trình trao chất bằng cách hấp thụ chất dinh dưỡng từ môi trường bên

ngoài vào cơ thể, một phần để cơ thể sinh trưởng và phát triển, còn lại để

tổng hợp cellulose và thải ra môi trường Ta thấy các sợi tơ nhỏ phát

triển ngày càng dài hướng từ đáy lên bề mặt trong môi trường nuôi cấy

[19] Thiaman (1962) đã giải thích cách tạo thành cellulose như sau: các

tế bào Gx khi sống trong môi trường lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi

chất của mình bằng cách hấp thụ đường glucose, kết hợp đường với acid

béo để tạp thành tiền chất nằm ở màng tế bào Tiền chất này được tiết ra

ngòai nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với một enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose

ìn 1.1 Qu trìn ìn t n cellulose tron tế b o v k uẩn

Gluconacetobacter

Quá trình sinh tổng hợp Biocellulose là một tiến trình bao gồm

nhiều bước được điều hòa một cách chuyên biệt và chính sác bằng một

hệ thống chứa nhiều loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều

hòa

Theo Alaban C A và cộng sự (1967) [16] các enzyme tham gia vào

quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn gồm:

CS : Cellulose synthase

FK : fructokinase

ìn 2.2 Con đường chuyển o cacbon trong vi khuẩn

Gluconacetobacter 1.2.4 Chức n n của cellulose với vi khuẩn Gluconacetobacter

Màng Biocellulose nằm ở mặt thoáng của môi trường nuôi cấy có tác dụng như một lớp bảo vệ cho các tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter

trước các nhân tố có hại của môi trường Có những ghi nhận cho rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím

Khoảng 23% số tế bào Gluconacetobacter được bao bọc bởi

Biocellulose sống sót sau 1 giờ xử lý bằng tia cực tím Khi tách Biocellulose ra khỏi tế bào, khả năng sống của chúng giảm đáng kể, chỉ

còn 3% [20]

Không những vậy màng Biocellulose còn là giá thể chống đỡ cho

các tế bào vi khuẩn, đồng thời cũng giúp chúng lấy chất dinh dưỡng từ môi trường một cách dễ dàng hơn so với khi ở trong môi trường lỏng

không có mạng lưới cellulose

1.2.5 Tú bảo quản thực phẩm

Như chúng ta đã biết, túi nilông là một loại túi nhựa rất bền, dẻo, mỏng, nhẹ và tiện dụng Túi nilông dường như đã rất gần gũi trong cuộc sống hằng ngày của mỗi chúng ta và trở thành vật dụng không thể thiếu Tuy nhiên, theo nghiên cứu thì phải mất từ 500 - 1000 năm thì túi nilông mới bị phân hủy trong môi trường tự nhiên Và nếu với cứ đà sản xuất và

sử dụng túi nilông như hiện nay thì sẽ đến một ngày trái đất của chúng ta

sẽ ngập trong túi nilông ể giải quyết vấn đề này đã có rất nhiều những giải pháp được đưa ra như: túi nhựa thay thế, túi giấy thay thế… Tuy nhiên những loại túi này vẫn còn rất nhiều hạn chế như túi nhựa có thể tái sử dụng nhưng khó phân hủy, túi giấy thì chỉ sử dụng được một vài lần và chi phí khá cao Vậy nên có một giải pháp được đưa ra đó là sử

dụng túi bảo quản thực phẩm được làm từ màng Biocellulose

Theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Thùy Vân (2009) [16]

màng Biocellulose sau khi đã được xử lý có độ dẻo dai cao, khả năng hút

ẩm tốt và ngăn cản được sự xâm nhập của vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc

do đó có thể ứng dụng làm màng bao chống vi sinh vật, đồng thời giảm lượng hóa chất bảo quản trong thực phẩm Ứng dụng làm màng bảo quản thực phẩm là một trong ứng dụng quan trọng của cellulose vi khuẩn trong ngành công nghệ tế bào bao bì trong những năm gần đây (Yoshinaga 1997) [21]

1.3 Lịch sử nghiên cứu vấn đề

1.3.1 Trên t ế giới

Nghiên cứu về màng Biocellulose và ứng dụng của nó đã được tiến

hành ở nhiều nước trên thế giới Tác giả Brown (1999) dùng màng

Biocellulose làm môi trường phân tách cho quá trình xử lí nước, dùng

làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng tế bào Brown, Jonas

và Farad dùng màng như một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi tuyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm ặc biệt là Jay shah, Brown M,R (2005) đã dùng

màng Biocellulose làm vải đặc biệt, Jonas và Farad (2008) dùng màng

Biocellulose để sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ chất để cố định

pritein thay cho sắc kí Barbana Surma và các cộng sự (2008) đã đưa ra phương pháp chế tạo màng, ảnh hưởng của nguồn cacbon, đường glucose, manitol và xylose đến quá trình tạo màng, cấu trúc sợi cellulose của màng và ứng dụng trong sản xuất giấy ặc biệt trong y học người ta

đã chế tạo ra các phức chất (vật liệu composite) từ sự kết hợp giữa cellulose và chitosan, hoặc cellulose và polyvinul, các phức chất này được sử dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm sạch máu điều trị các bệnh tim mạch a số các tác giả nước ngoài đều nghiên cứu theo hướng sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn và ứng dụng trong chế biến thực phẩm, công nghiệp giấy và đặc biệt là y học

Ngoài ra, màng Biocellulose còn được sử dụng trong công nghệ

làm đẹp để tạo ra những chiếc mặt nạ để đáp ứng cho nhu cầu làm đẹp, công nghiệp giấy để tạo ra những loại giấy có chất lượng cao Năm 2006

Czajt và các cộng sự đã sử dụng màng Biocellulose đã được sử lý để đáp

lên vết bỏng, vế thương hở đã thu được kết quả khả quan, không những vậy ông và các cộng sự cũng dùng màng để làm da nhân tạo

1.3.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng Biocellulose mới

chỉ ở những bước đầu Trần Thị Trường An và Nguyễn Thúy Hương tại trường ại Học Quốc Gia, ại học Bách Khoa-HCM đã bước đầu sử dụng màng mỏng cellulose vi khuẩn hấp phụ bacteriocin để bảo quản thịt tươi qua sơ chế tối thiểu [8] Năm 1997, Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Thị Mùi cũng đã nghiên cứu môi trường nước giá đỗ thay thế nước dừa

trong sản xuất thạch dừa từ vi khuẩn Gluconacetobacter Năm 2006,

nhóm nghiên cứu của Nguyễn Văn Thanh, Huỳnh Thị Ngọc Lan đã

nghiên cứu về màng từ Gluconacetobacter tẩm dầu mù u dùng trong

điều trị bỏng [10]

Hiện nay những nghiên cứu và ứng dụng màng từ chủng

Gluconacetobacter ngày càng được quan tâm Ngày càng có nhiều

nghiên cứu, công bố liên quan đến chủng Gluconacetobacter sự hình

thành màng và ứng dụng của màng Năm 2006, tác giả Nguyễn Văn Thanh, Tưởng bộ môn Vi Sinh – Kí Sinh, Trường đại học Y Dược học

Tp HCM đã chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học dầu tù mù bằng phương pháp lên men Màng có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt

và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò như màng sinh học, có thể thay thế da tạm thời [10] Với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn đều có nguồn gốc từ thiên nhiên không gây đau rát và không chứa các yếu tố gây kích ứng da nên có thể dùng màng sinh học để ngăn ngừa biến chứng nhiễm trùng vết thương bỏng, tạo điều kiện che phủ sớm vết thương, qua đó rút ngắn thời gian điều trị và giảm thiểu sẹo xấu trên vùng bỏng sâu [1]

Tuy nhiên các nghiên cứu khoa học bước đầu chỉ quan tâm tới quá trình tạo màng, đặc điểm và cấu trúc và tính chất của màng Còn các

ứng dụng của màng Biocellulose vào thực tiễn mới chỉ được sử dụng

trong công nghệ chế tạo màng sinh học dùng trị bỏng và được ứng dụng trong sản xuất thạch dừa Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm

Vi sinh Trường ại Học Sư Phạm Hà Nội 2 đã phân lập và tuyển chọn

được chủng Gluconacetobacter có khả năng tạo màng Biocellulose là

một bước tiến mới quan trọng góp phần mở đường cho sản xuất các loại túi đựng thực phẩm thay thế cho túi nilông

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu và hóa chất

2.1.1 Đố tượn n ên cứu

ối tượng nghiên cứu: Chủng vi khuẩn sinh vật có khả năng tạo

màng Biocellulose tuyển chọn từ môi trường lên màng Biocellulose nhân

- Kính hiển vi quang học (olympus CX41, Nhật)

- Hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thủy tinh, bình tam giác, lam kính, la men, đèn cồn,… và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác

Tất cả các dụng cụ các thiết bị và hóa chất đều do phòng Vi sinh, Khoa Sinh - KTNN, Trường ại học Sư Phạm Hà Nội 2 cung cấp

2.1.3 óa c ất

- Nguồn Cacbon: Ethanol, Glucose, Saccarose, Acid acetic, Agar

- Nguồn Nitơ : Nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2SO4 ; nguồn nitơ hữu cơ là pepton, cao thịt

- Các muối khoáng: KH2PO4, MgSO4.7H2O

- Thuốc nhuộm: Tím gentian, Fushsin, Lugol

- Nước dừa nguyên chất

2.1.4 C c loạ mô trường

2.1.4.1 Môi trường giữ giống (MT1)

6 Sobitol 20g

8 Nước dừa 1000ml 1000ml 1000ml 1000ml

2.2 Phạm vị nghiên cứu, địa điểm và thời gian

- Phạm vi, địa điểm: Phòng thí nghiệm vi sinh trường HSP Hà Nội 2

- Thời gian: Từ ngày 10/8/2018 - 5/2019

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Từ màng thu được dùng đũa thủy tinh đã vô trùng vớt màng lên lấy một lương nhỏ, rửa bằng nước cất vô trùng sau đó đưa vào ống nghiệm chứa nước cất thanh trùng, vontex đều sẽ thu được ống nghiệm chứa mẫu màng gốc

Tiếp theo chuẩn bị 10 ống nghiệm được đậy bằng nút bông đã được sấy vô trùng sau đó cho 9ml nước cất vào mỗi ống rồi đậy nút bông

và hấp thanh trùng ở 1210

C, 1atm trong thời gian 15 phút Chuyển các ống nghiệm vào bốc cấy vô trùng, dùng pipet đã được vô trùng hút 1ml dịch tù ống nghiệm có chứa mẫu màng gốc cho vào ống nghiệm thứ nhất, đậy nút bông và vontex trong 5 phút sẽ thu được ống nghiệm có chứa dịch pha loãng ở mức 10-1 Tiếp tục hút 1ml dịch ở ống có độ pha loãng 10-1

cho vào ống nghiệm thứ hai, thu được dịch pha loãng ở mức

10-2 Tiếp tục pha loãng ở các độ pha loãng 10-3; 10-4 10-7 Căn cứ vào

số lượng vi khuẩn có ở trong mẫu, chúng tôi chọn các mẫu ở độ pha loãng 10-4

- 10-7 để tiến hành các bước tiếp theo

Phân lập trên môi trường thạch đĩa: Chuẩn bị môi trường 1 (MT1)

đã hấp khử trùng, đổ môi trường thạch đĩa Dùng pipet vô trùng hút 100ml dịch màng đã chuẩn bị ở trên (với các độ pha loãng 10-4 - 10-7) nhỏ vào các hộp lồng đã chứa môi trường thạch, dùng que trang thủy tinh đã được vô trùng trang đều trên khắp bề mặt thạch ặt ngược các hộp lồng, bao gói cẩn thận, để trong tủ ấm 300C, sau 3 - 4 ngày lấy ra quan sát khuẩn lạc (hình thái, kích thước, màu sắc, độ trơn bóng, viền mép khuẩn lạc, vòng phân giải CaCO3)

Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng (MT1), tách các khuẩn lạc riêng

rẽ từ hộp lồng, cấy chuyển vào các ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng đã khử trùng, nuôi trong tủ ấm ở 300

C Sau 3 - 4 ngày, quan sát,

làm tiêu bản nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram [14]

2.3.1.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp

tế bào trên tiêu bản nhuộm kép

Dùng que cấy lấy khuẩn lạc ở trong các ống thạch nghiêng, làm vết bôi trên lam kính, cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn sau đó nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram

ưa lên vất kính 5 - 40 quan sát rồi tiếp tục đưa tiêu bản dưới vật kính dầu 100 với độ phóng đại 1000 lần Nếu tế bào vi khuẩn nhuộm có

màu hồng là Gram âm, đó chính là vi khuẩn Gluconacetobacter

2.3.1.3 Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường thạch nghiêng

Các chủng giống sau khi đã phân lập và sơ bộ xác định là

Gluconacetobacter sau đó sẽ được cấy trên môi trường thạch nghiêng

(đã được loại bỏ ) tiếp tục được nuôi trong tủ ấm tùa 3 - 4 ngày ở

30C Sau đó giữ lạnh ở tủ với nhiệt độ là 4C để bảo quản giống Cấy truyền giữ giống trên môi trường thạch nghiêng hai tháng một lần để

tránh hiện tượng thoái hóa giống

2.3.1.4 Phương pháp hoạt hoá giống

Giống trong ống nghiệm được bảo quản ở tủ lạnh, trước khi sử

dụng cần phải hoạt hóa giống, nhân giống để đảm bảo đủ số lượng tế bào

vi sinh vật cho quá trình lên men

Phương pháp hoạt hóa giống là phương pháp sử dụng môi trường tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 121C trong vòng 20 phút Sau đó đem sử lý trong đèn tím 15 phút, dùng que cấy cấy truyền giống từ ống thạch nghiêng vào MT3 và nuôi lắc 135 vòng/phút

trong 24 giờ [5,15]

2.3.1.5 Phương pháp lên men tạo màng Biocellulose

Sử dụng môi trường lên men tạo màng (MT3) đem hấp thanh trùng ở 110C trong 20 phút để tránh caramen đường Sau đó đem khử khuẩn ở đèn cực tím trong 15 phút Bổ sung vào môi trường 10% giống hoạt hóa

Nuôi cấy ở điều kiện tĩnh và theo dõi màng Biocellulose Sau

khoảng thời gian là 5 ngày thì có thể thu được màng

2.3.2 P ươn p p óa s n

2.3.2.1 Phương pháp kiểm tra hoạt tính catalase

Nhỏ một giọt 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí thì chủng vi khuẩn đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +) Ngược lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase -)

2.3.2.2 Xác định khả năng oxy hóa acid acetic

ể thử khả năng oxy hóa acid acetic của vi khuẩn tuyển chọn thì sử dụng môi trường có thành phần sau:

121C trong 20 phút, để nguội khoảng 40 - 45C đổ thạch đĩa, cấy vi

khuẩn tuyển chọn mới hoạt hóa (18 - 24h) nuôi 6 - 7 ngày ở điều kiện thích hợp Quan sát hiện tượng: Nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng trắng sữa là phản ứng dương tính (acetat bị oxy hóa, calcium giải phóng tạo ra màu trắng sữa), nếu không là âm tính

2.3.2.3 Xác định khả năng tổng hợp cellulose

Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dịch thể ở nhiệt độ 28 - 30C trong vòng 3 - 4 ngày, quan sát sự hình thành màng Kiểm tra khả năng bắt màu của màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch lugol và 60%

nó chuyển hóa thành màu xanh lam

2.3.3 P ươn p p n ên cứu ản ưởng của nguồn cacbon n tơ v nhiệt đ đến khả n n tạo m n B ocellulose

2.3.3.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon

Nguồn cacbon chủ yếu trong môi trường nuôi cấy chủ yếu là hàm lượng đường ể nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng

tạo màng Biocellulose của vi khuẩn, chúng tôi tiến hành sử dụng môi

trường nghiên cứu tạo chuẩn sau đó thay đổi hàm lượng đường glucose, còn lại các thành phần khác của môi trường giữ nguyên theo tỉ lệ của môi trường lên màng cơ bản (MT3) Sau 5 ngày liên tiếp tiến hành thu màng đồng thời so sánh độ dày và khối lượng tươi của màng thu được ở các môi trường thí nghiệm, sau đó lựa chọn ra môi trường có hàm lượng đường thu được màng tốt nhất để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

2.3.3.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ

Thực hiện các thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng

nitơ đến quá trình tạo màng Biocellulose của vi khuẩn Tiến hành thí

nghiệm trên môi trường tạo màng cơ bản có sự thay đổi hàm lượng nitơ

và nguồn nitơ được sử dụng chủ yếu là (NH4)2SO4 [9] Còn lại các yếu tố khác của môi trường nuôi cấy cơ bản được giữ nguyên (MT3) Sau 5 ngày lên men tiến hành thu màng, so sánh và lựa chọn môi trường có hàm lượng (NH4)2SO4 cho màng tốt nhất rồi sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

2.3.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ

Tiến hành thí nghiệm để nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới

khả năng tạo màng Biocellulose của vi khuẩn Thí nghiệm được tiến

hành trên môi trường tạo màng cơ bản (MT3) sau đó đặt chúng ở trong những môi trường có nhiệt độ khác nhau Sau 5 ngày lên men tiến hành

tu màng, lựa chọn môi trường có nhiệt độ cho màng tốt nhất và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

2.3.4 P ươn p p x c định trọn lượn tươ của m n B ocellulose

Sau khi nuôi cấy, màng được lấy ra, để màng ráo nước khoảng 4 - 5 giờ, trên khay nhựa của nhiệt độ phòng thí nghiệm Tiến hành cân màng trên cân điện tử Trọng lượng tươi của màng được tính bằng hiệu số của trọng lượng khay nhựa lúc có và chưa có màng

2.3.5 P ươn p p sấ k ô v đón t n bao bì đựng thực phẩm

Sử dụng máy sấy trong phòng thí nghiệm vi sinh của trường ại

học Sư Phạm Hà Nội 2 để sấy khô màng Biocellulose

2.3.6 P ươn p p t ốn kê v xử lý kết quả

Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp trong cuốn “Ứng dụng tin học trong sinh học” và “Thống kê và ứng dụng” Chúng tôi xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phương pháp như:

 Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm:

Công thức:

1

1 n i i

Trong đó: ̅: Giá trị trung bình tổng thể

X i : Giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm

n: Số lần thí nghiệm

 Trung bình bình phương các sai lệch: