Hoàn thiện quy trình nhân dòng vô tính cây cỏ thi hắt hơi (achillea ptarmica) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Từ những lí do trên chúng tôi quyết Ďịnh tiến hành Ďề tài “Hoàn thiện quy trình nhân dòng vô tính cây Cỏ thi hắt hơi Achillea ptarmica bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật”.. Nội

HƠI (ACHILLEA PTARMICA) BẰNG

KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn:

ThS Phạm Phương Thu, Khoa Sinh - KTNN, trường Ďại học Sư phạm

Hà Nội 2 là người Ďã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, tạo Ďiều kiện thuận lợi trong suốt quá trình tôi thực hiện Ďề tài và hoàn thành khóa luận này

Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN Ďã tạo mọi Ďiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện Ďề tài

Ngoài ra, Ďể hoàn thành Ďề tài này tôi cũng Ďã nhận Ďược những sự chỉ bảo cả về kiến thức chuyên ngành cũng như phương pháp tiến hành thí nghiệm từ tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm sinh lí thực vật, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Tôi xin Ďược cảm ơn những sự giúp Ďỡ quý báu Ďó

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia Ďình, bạn bè Ďã Ďộng viên tôi giúp tôi có thể vượt qua những khó khăn Ďể hoàn thành Ďược Ďề tài này

Hà Nội, ngày… tháng….năm 2018

Sinh viên thực hiện

PHAN THỊ TRANG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam Ďoan Ďây là công trình nghiên cứu của riêng tôi do ThS Phạm Phương Thu hướng dẫn và không trùng lặp với kết quả của các tác giả

khác

Hà Nội, ngày… tháng….năm 2018

Sinh viên thực hiện

PHAN THỊ TRANG

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MS : Murashige và Skoog BAP : 6 - Benzul amino purin NAA :  - Napthlacetic acid Nxb : Nhà xuất bản

TPHCM : Thành Phố Hồ Chí Minh KH&CN : Khoa Học và Công Nghệ NPK : Nitơ, Photpho, Kali ĐHST : Điều hòa sinh trưởng

ĐC : Đối Chứng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn Ďề tài 1

2 Mục Ďích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

NỘI DUNG 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về chi Achillea 3

1.2 Giới thiệu về Cỏ thi hắt hơi 3

1.2.1 Mô tả 3

1.2.2 Phân loại 4

1.2.3 Phân bố 4

1.1.4 Đặc Ďiểm hình thái 4

1.1.5 Điều kiện sinh thái 5

1.3 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật trên thế giới và ở Việt Nam 5

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

2.1 Đối tượng nghiên cứu 9

2.2 Địa Ďiểm tiến hành nghiên cứu 9

2.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 9

2.3.1 Thiết bị 9

2.3.2 Dụng cụ 9

2.4 Môi trường nghiên cứu và các chất Ďiều hòa sinh trưởng thực vật 9

2.5 Điều kiện nuôi cấy 10

2.6 Phương pháp nghiên cứu 10

2.6.1 Tạo vật liệu in vitro từ hạt cây hoa Cỏ thi hắt hơi 10

2.6.2 Nhân nhanh chồi in vitro 11

2.6.3 Ra rễ - tạo cây in vitro hoàn chỉnh 12

2.6.4 Rèn luyện cây Cỏ thi hắt hơi in vitro thích nghi với môi trường tự nhiên 13

2.7 Phương pháp phân tích thống kê số liệu thực nghiệm 13

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15

3.1 Tạo vật liệu khởi Ďầu 15

3.2 Nhân nhanh chồi in vitro 17

3.2.1 Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân nhanh chồi cây Cỏ thi hắt hơi 17

3.2.2 Ảnh hưởng của nước dừa lên khả năng nhân nhanh chồi cây Cỏ thi hắt hơi 20

3.3 Ra rễ - tạo cây in vitro hoàn chỉnh 22

3.4 Rèn luyện cây Cỏ thi hắt hơi in vitro thích nghi với môi trường tự nhiên 24

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Các công thức thí nghiệm xác Ďịnh hiệu quả của chất khử trùng 11 Bảng 2.2: Công thức ảnh hưởng của BAP lên quá trình nhân nhanh 12 Bảng 2.3: Công thức ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình nhân nhanh chồi

in vitro 12 Bảng 2.4: Công thức ảnh hưởng của NAA Ďến sự tạo rễ cây Cỏ thi hắt hơi in

vitro 13 Bảng 2.5: Công thức ảnh hưởng của giá thể Ďến tỷ lệ sống của cây Cỏ thi hắt

hơi 13 Bảng 3.1: Tỷ lệ nảy mầm hạt Cỏ thi hắt hơi ở môi trường MSo sau 2 tuần 15 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân nhanh chồi in vitro sau 4

tuần 18 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nước dừa lên khả năng nhân nhanh chồi in vitro sau

4 tuần 20 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của α-NAA Ďến khả năng ra rễ của chồi và tạo cây in

vitro hoàn chỉnh sau 4 tuần 22 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của giá thể Ďến tỷ lệ sống của cây Cỏ thi hắt hơi sau 2

tuần 25

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cỏ thi hắt hơi – Achillea ptarmica (nguồn internet) 3 Hình 3.1: Vật liệu khởi Ďầu 17 Hình 3.2: Ảnh hưởng của BAP Ďến khả năng nhân nhanh chồi in vitro 19 Hình 3.3: Ảnh hưởng của nước dừa Ďến khả năng nhân nhanh chồi in vitro

21 Hình 3.4: Ảnh hưởng của NAA Ďến khả năng tạo rễ của chồi in vitro 23 Hình 3.5: Một số hình ảnh khi rèn luyện cây 27

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Ngày nay, khi Ďời sống của con người Ďược nâng lên thì nhu cầu chơi hoa, cây cảnh cũng sẽ ngày càng lớn Hoa tươi Ďã trở thành một loại sản phẩm mang giá trị kinh tế cao và chiếm vị trí Ďặc biệt trong thị trường sản phẩm hàng hóa nông nghiệp thế giới Hiện nay ở Việt Nam, cơ cấu cây trồng nông nghiệp chuyển Ďổi nhanh chóng sang cơ cấu thị trường theo hướng phát triển trồng và xuất khẩu hoa cây cảnh, Ďây là một hướng Ďi mới mang lại lợi ích

kinh tế cao

Trong các loại hoa cắt cành hiện nay thì hoa cúc là một loài hoa Ďược ưa chuộng và trồng phổ biến ở nước ta chỉ Ďứng sau hoa hồng [20] Hoa cúc không chỉ Ďem lại giá trị trong Ďời sống tinh thần mà còn Ďem lại hiệu quả kinh tế cao cho người trồng Hoa cúc có nhiều loại với nhiều màu sắc khác nhau, cúc trắng, cúc Ďỏ, cúc tím, cúc vàng,… Là loại cây trồng Ďa dạng về loài, màu sắc, dễ trồng, dễ sản xuất, dễ vận chuyển và tiêu thụ nên nó Ďược nhiều nhà vườn lựa chọn Ďưa vào sản xuất

Cây Cỏ thi hắt hơi có tên khoa học là Achillea ptarmica thuộc chi Achillea, họ Cúc [27] Cây có các chùm hoa màu trắng rực rỡ với vẻ Ďẹp

mong manh, quyến rũ, Ďược trồng trong chậu, trong vườn làm cảnh, làm hoa cắt cành Ďể bàn, trang trí cô dâu và làm hoa cưới Ngoài tác dụng làm cảnh, trang trí, nó còn có các tác dụng khác: “lá có thể ăn sống hoặc nấu chín và

dùng làm thuốc chống côn trùng, ngoài ra Achillea ptarmica mang lại một

loại tinh dầu Ďược sử dụng trong dược liệu thảo dược” [30] Cỏ thi hắt hơi có thể Ďược nhân giống bằng hạt, tuy nhiên phương pháp truyền thống này thường tốn nhiều thời gian và hiệu quả không cao Trong khi Ďó nhân giống

bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (in vitro) cho hiệu quả cao hơn hẳn

Đây là phương pháp kỹ thuật khoa học nhằm tạo ra các giống cây con sạch

bệnh với số lượng lớn trong một thời gian ngắn ở Ďiều kiện vô trùng và cũng

là tiền Ďề quan trọng Ďể góp phần bảo tồn nguồn gen Từ những lí do trên

chúng tôi quyết Ďịnh tiến hành Ďề tài “Hoàn thiện quy trình nhân dòng vô

tính cây Cỏ thi hắt hơi (Achillea ptarmica) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế

bào thực vật”

2 Mục đích nghiên cứu

- Thăm dò các môi trường nuôi cấy thích hợp cho nhân giống Cỏ thi hắt

hơi

- Đưa ra cơ sở cho việc xác Ďịnh quy trình nhân giống in vitro Cỏ thi hắt

hơi nhằm tạo cơ sở cung cấp giống cho quá trình sản xuất

3 Nội dung nghiên cứu

- Tạo vật liệu in vitro từ hạt cây Cỏ thi hắt hơi

- Ảnh hưởng của BAP Ďến khả năng nhân nhanh chồi cây Cỏ thi hắt hơi

trong nhân giống invitro

- Ảnh hưởng của nước dừa Ďến khả năng tạo chồi của cây Cỏ thi hắt

hơi trong nhân giống invitro

- Ảnh hưởng của NAA Ďến khả năng tạo rễ invitro cây Cỏ thi hắt hơi

- Công thức giá thể tối ưu nhất phù hợp với cây Triệu chuông in vitro

ở giai Ďoạn vườn ươm

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học: Cung cấp dẫn liệu khoa học về nuôi cấy in vitro cây

Cỏ thi hắt hơi (A.Ptarmica) phục vụ cho các nghiên cứu sau này

Ý nghĩa thực tiễn: Hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây Cỏ thi

hắt hơi (A.Ptarmica), góp phần sản xuất cây giống có hiệu quả cao, chất

lượng tốt

NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về chi Achillea

Chi Cỏ thi (Achillea) là một chi có khoảng 85 loài thực vật có hoa thuộc

họ Cúc (Asteraceae), nói chung Ďược gọi là Cỏ thi Chúng có mặt ở châu Âu

và các khu vực ôn Ďới của châu Á và một số ít loài ở Bắc Mỹ Các loài thực vật này nói chung có các lá dạng diềm xếp nếp có lông và hương thơm [29] Các loài cây này có các cụm hoa lớn và phẳng bao gồm nhiều hoa nhỏ mọc ở phía trên của thân cây Các hoa có thể có màu trắng, vàng, da cam, Ďỏ hay hồng, tùy theo loài, mọc phổ biến trong vườn [29]

Tên gọi khoa học của chi này Ďược Ďặt theo tên của một nhân vật trong

thần thoại Hy Lạp là Achilles Theo câu chuyện trong llliad, các binh lính của Achilles Ďã sử dụng Cỏ thi Ďể Ďiều trị các vết thương, lá cây Cỏ thi có tác dụng sát trùng và cầm máu [29] Các loài trong chi Achillea Ďều bị ấu trùng của một số loài côn trùng thuộc bộ cánh vảy (lepidoptera) phá hại [29]

1.2 Giới thiệu về Cỏ thi hắt hơi

1.2.1 Mô tả

Hình 1.1: Cỏ thi hắt hơi – Achillea ptarmica (nguồn internet)

Cỏ thi hắt hơi có tên khoa học là Achillea ptarmica, thuộc chi Achillea,

họ Cúc nên mang hầu như tất cả các Ďặc Ďiểm của chi Cỏ thi hắt hơi là một cây trồng lâu năm có thân thảo, mọc um tùm thành từng khóm, có thể cao Ďến 0,6m với tốc Ďộ nhanh Thân thường phân nhánh từ phần dưới, có lông mượt

Lá nhỏ, mọc cách, có màu xanh Ďậm, có răng lề lõm Nó Ďược phổ biến rộng rãi trên khắp châu Âu và rải rác ở Bắc Mỹ, Nga [27],[30]

Cỏ thi hắt hơi có các chùm hoa màu trắng rực rỡ, hoa lưỡng tính, Ďường kính hoa 8-16mm, có vẻ Ďẹp tinh tế nhẹ nhàng, những bông hoa có sức quyến

rũ, Ďó là Ďặc trưng của giống hoa này, hoa nở rộ từ tháng 6 Ďến tháng 8 Loài này thường tìm thấy ở Ďồng cỏ, rãnh, bờ Ďất hoang Chúng rất dễ trồng, chịu khô hạn, không yêu cầu Ďối với Ďất, chịu lạnh [27],[30]

1.2.2 Phân loại

Giới (regnum) : Plantea

Bộ (ordo) : Asterales

Họ (familia) : Asteraceae

Chi (genus) : Achillea

Loài (species) : A ptarmica

Danh pháp : Achillea ptarmica

1.2.3 Phân bố

Achillea ptarmica Ďược phổ biến rộng rãi trên khắp châu Âu và rải rác ở

Bắc Mỹ, Nga [29]

1.1.4 Đặc điểm hình thái

Rễ: Rễ chùm, phát triển theo chiều ngang, lan rộng chứ không ăn sâu

vào Ďất, rễ có màu trắng Ďục mọc từ các phần mấu của thân gần sát mặt Ďất

Thân: Thuộc cây thân thảo nhỏ, có nhiều Ďốt, có thể mọc Ďứng hoặc bò

trên mặt Ďất, cao khoảng 0,4 – 0,6 m

Lá: Lá Ďơn, không có lá kèm Lá nhỏ, mọc cách, có màu xanh Ďậm, có

răng lề lõm [27]

Hoa: Cụm hoa Ďầu trạng, lớn và phẳng bao gồm nhiều hoa nhỏ mọc ở

phía trên của thân cây, phát sinh từ các nách lá Hoa lưỡng tính, có màu trắng, Ďường kính hoa 8-16 mm, nở từ tháng 6 Ďến tháng 8

1.1.5 Điều kiện sinh thái

Cây Cỏ thi hắt hơi là cây ưa sáng, chịu khô hạn, không có yêu cầu Ďối với Ďất, chịu lạnh Nó Ďược phổ biến rộng rãi trên khắp Châu Âu và rải rác ở Bắc Mỹ, Nga [27],[30] Vì thế khi trồng ở Việt Nam cần chú ý Ďiều kiện về ánh sáng, nhiệt Ďộ và chế Ďộ tưới nước Nên trồng cây vào mùa Ďông vì

Achiilea ptarmica là cây chịu lạnh và hạn chế tưới nước Còn nếu trồng vào

mùa hè thì cần phải có lưới che cho Ďến khi cây bén rễ Ďể tránh cho cây không bị héo và chết do nhiệt Ďộ quá cao Trong mùa nóng, tưới ngày một lần vào sáng sớm hoặc chiều mát, giữ cho Ďất không bị Ďọng nước và luôn khô thoáng Khi cây trưởng thành nên bổ sung chất dinh dưỡng cho cây bằng cách tưới phân vi sinh hoặc phân lân NPK Ďể thúc Ďẩy sự ra hoa

1.3 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật trên thế giới và ở Việt Nam

Những năm 70 của thế kỷ XX là thập niên của sự bùng nổ công nghệ sinh học thực vật, Ďặc biệt là kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật Đây là công

cụ nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học.Trong vòng 30 năm trở lại Ďây, kỹ thuật này Ďã làm nên một cuộc cách mạng lớn trong nhân giống thực vật và hiện nay người ta Ďang hướng tới mục tiêu áp dụng kỹ thuật này Ďể sản xuất cây giống thương mại Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Ďã trở thành một phương pháp nhân giống chuẩn và phổ biến Ďối với nhiều loại cây trồng như: cây công nghiệp, cây lâm nghiệp, cây cảnh, cây dược liệu, cây ăn trái và rau xanh Những kiến thức về công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật ngày càng Ďược củng cố và có nhiều bước tiến rõ rệt Với phương pháp này người ta có

thể nhân giống rất nhiều loài cây từ các vùng khí hậu khác nhau trên thế giới

mà các phương pháp nhân giống truyền thống không thể thực hiện Ďược [31]

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro Ďều là thuật

ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào Ďơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, Ďường và các chất Ďiều hòa sinh trưởng thực vật trong Ďiều kiện vô trùng Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc Ďỉnh sinh trưởng Trước kia người ta dùng phương pháp này Ďể nghiên cứu các Ďặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, Ďặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất Ďối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy Hiện nay, các nhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật Ďể nghiên cứu tất cả các vấn Ďề có liên quan Ďến thực vật như sinh lý học, sinh hoá học, di truyền học và cấu trúc thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật cũng mở rộng tiềm năng nhân giống

vô tính Ďối với các loài cây trồng quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và thương mại trong Ďời sống hàng ngày của con người [31]

Năm 1902, nhà thông thái Haberlandt là người Ďầu tiên Ďưa ra ý tưởng cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể nhưng ông Ďã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không thành công [19] Năm 1934, White Ďã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua [26] Năm 1964, Ball là người Ďầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn [16] Ông Ďã thành công trong việc chuyển cây non của cây sen cạn từ môi trường nuôi cấy tối thiểu Tuy nhiên, việc nhân giống cây vẫn chưa hoàn chỉnh Sau Ďó nhiều nhà nghiên cứu Ďã khám phá ra những thành phần dinh dưỡng quan trọng cần thiết cho sự phát triển của các tế bào Ďược nuôi cấy Năm 1951, Skoog và Miller Ďã phát hiện ra các hợp chất có thể Ďiều khiển sự nhân chồi [31] Năm

1962, Murashige và Skoog Ďã cải tiến môi trường nuôi cấy Ďánh dấu một

bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô Môi trường của họ Ďã Ďược dùng làm

cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn Ďược sử dụng rộng rãi cho Ďến nay [25] Năm 1960 – 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy Ďỉnh sinh trưởng Từ kết quả Ďó, lan Ďược xem là cây nuôi cấy

mô Ďầu tiên Ďược thương mại hóa Từ Ďó Ďến nay, công nghệ nuôi cấy mô và

tế bào thực vật Ďã Ďược phát triển với tốc Ďộ nhanh trên nhiều cây khác và Ďược ứng dụng thương mại hóa [22] [23] [24]

Trong thực tiễn sản xuất Ďể bảo quản và nhân nhanh các giống cây quý,

có giá trị kinh tế cao người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy mô Hiện nay, phương pháp này Ďược coi là tối ưu nhất trong công tác giống cây trồng Bằng phương pháp nuôi cấy mô, có thể tạo Ďược một lượng sinh khối lớn trong một thời gian ngắn Sinh khối Ďược tạo ra vẫn giữ nguyên Ďược thuộc tính, nghĩa

là vẫn giữ Ďược khả năng tổ hợp các chất thứ cấp như alkaloid, glycosid, các steroid dùng trong y học, chất dính dùng trong công nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm sinh trưởng của vi khuẩn trong nông nghiệp [31]

Trên thế giới hiện có trên 700 công ty giống cây trồng áp dụng công nghệ nuôi cấy mô, cơ quan và tế bào thực vật Ďể sản xuất hàng trăm triệu cây giống sạch bệnh mỗi năm, bao gồm cây dược liệu, cây ăn quả, cây lương thực, cây hoa, cây cảnh, cây lâm nghiệp Công nghệ nuôi cấy mô mang lại hiệu quả kinh tế cao so với các phương pháp truyền thống, góp phần bảo vệ

an ninh lương thực và chống biến Ďổi khí hậu toàn cầu

Việt Nam có trên 100 phòng thí nghiệm nuôi cấy mô [28] Riêng tỉnh Lâm Đồng Ďã có trên 50 xưởng sản xuất cây giống bằng nuôi cấy mô do các doanh nghiệp tự Ďầu tư Nhà nước cũng Ďầu tư hai phòng thí nghiệm trọng Ďiểm về công nghệ tế bào thực vật tại Viện Di truyền nông nghiệp và Viện Sinh học nhiệt Ďới TPHCM Để phục vụ các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô

Ďã Ďược xây dựng, Bộ KH&CN triển khai nhiều dự án chuyển giao công nghệ

về nhân giống in vitro (vi nhân giống thực vật trong Ďiều kiện vô trùng) cho

các Ďịa phương Nhiều công nghệ Ďã Ďược chuyển giao thành công sau khi các viện, trường Ďại học nghiên cứu, hoàn thiện Thông qua các chương trình nghiên cứu ở các viện, các trường, Ďã có nhiều cán bộ Ďược Ďào tạo nâng cao tay nghề về công nghệ tế bào thực vật ở trong và ngoài nước Đến nay, Việt

Nam Ďã có một Ďội ngũ thành thạo về nhân giống in vitro Quy trình nhân

giống cho nhiều loại cây cảnh quan trọng Ďã Ďược xây dựng và ứng dụng trực tiếp trong sản xuất ở quy mô lớn như hoa cúc, hoa hồng, hoa Ďồng tiền,… Các quy trình này Ďã Ďược Bộ KH & CN công nhận là tiến bộ kỹ thuật

và cho áp dụng sản xuất rộng rãi Ví dụ, quy trình công nghệ vi nhân giống cây hoa hồng và hoa cúc ở Đà Lạt

Achillea ptarmica là loài hoa Ďược ưa chuộng với vẻ Ďẹp trong sáng,

thuần khiết, nó không chỉ Ďem lại giá trị về mặt kinh tế mà còn Ďem lại giá trị

về mặt tinh thần Trên thế giới chi Achillea nói chung và loài Achillea ptarmica nói riêng Ďược Linnaeus công bố 1753 [21] Tuy nhiên, thông tin Ďã

Ďược công bố rất hạn chế và hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu trên thế giới

về quy trình nhân nhanh loài A ptarmica [17] cũng như các loài Achillea spp

[14] Hầu hết nghiên cứu tập trung vào phân tích thành phần và xác Ďịnh tính chất của các hoạt chất trong cây [15]

Ở Việt Nam chi Achillea còn chưa Ďược nghiên cứu nhiều Mới chỉ có loài Achillea millefolium có thể tìm thấy thông tin trong Thực vật chí Việt

Nam và Từ Ďiển thực vật thông dụng

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Hạt cây Cỏ thi hắt hơi ( Achillea ptarmica) Ďược

nhập nội từ viện nghiên cứu cây công nghiệp Vavilop – Nga (Vavilop Research Institute of plant Industry)

2.2 Địa điểm tiến hành nghiên cứu

- Thí nghiệm Ďược tiến hành tại Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, Khoa Sinh-KTNN, Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

- Vườn thực nghiệm Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

2.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

2.3.1 Thiết bị

Các thiết bị sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật: Cân kĩ thuật (Sartorius, Đức), tủ lạnh sâu (FRIGO), máy Ďo pH (HM30G/TOA, ĐỨC), nồi hấp khử trùng (HV – 110/HIRAYAMA, Nhật), tủ lạnh, máy nước cất 2 lần, buồng cấy

vô trùng (AV – 110/TELSTAR), máy khuấy từ ra nhiệt, cân phân tích, tủ ấm, Micropipet Jinson

- Các chất Ďiều hòa sinh trưởng Ďược sử dụng: BAP (6 – Benzyl amino purin); NAA ( - Napthlacetic acid)

- Nước dừa

- Các thành phần khác: Đường saccarose 30g/l, agar 7g/l

2.5 Điều kiện nuôi cấy

Các thí nghiệm Ďều Ďược thực hiện trong Ďiều kiện nhân tạo

- Ánh sáng: các mẫu Ďều Ďược nuôi cấy với cường Ďộ chiếu sáng 2000lux

- Quang kì: 10 giờ/ngày

- Nhiệt Ďộ phòng: 25C - 27C

- Độ ẩm trung bình: 70% - 74%

2.6 Phương pháp nghiên cứu

2.6.1 Tạo vật liệu in vitro từ hạt cây hoa Cỏ thi hắt hơi

- Xử lí sơ bộ hạt cây Cỏ thi hắt hơi bằng cách lắc mẫu trong cồn 70% (v/v)/10 giây + nước cất khử trùng 2-3 lần, tiếp Ďến khử trùng bằng dung dịch Javen 5% trong 5-20 phút theo bảng 2.1

- Cuối cùng hạt Ďược rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng (Mỗi lần khoảng 1phút) trước khi Ďưa vào môi trường cơ bản MS có 30g/l saccarose, 7g/l agar

- Đánh giá thí nghiệm sau 2 tuần theo dõi dựa trên tỉ lệ mẫu nhiễm, tỉ lệ mẫu sống và tỉ lệ mẫu chết ở từng công thức

Lưu ý: Tất cả các thao tác đều được thực hiện trong buồng vô trùng

- Chỉ têu theo dõi:

+ Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = (tổng số mẫu nhiễm / tổng số mẫu cấy vào) x 100 + Tỷ lệ mẫu sống (%) = (tổng số mẫu sống / tổng số mẫu cấy vào) x 100 + Tỷ lệ mẫu chết (%) = (tổng số mẫu chết / tổng số mẫu cấy vào) x 100

Bảng 2.1: Các công thức thí nghiệm xác định hiệu quả của chất khử

trùng

Công thức Chất xử lí/ thời gian CT1 (ĐC) Xử lí sơ bộ

CT2 Xử lí sơ bộ + Javen 5%(v/v)/ 5 phút CT3 Xử lí sơ bộ + Javen 5%(v/v)/ 10 phút CT4 Xử lí sơ bộ + Javen 5%(v/v)/ 15 phút CT5 Xử lí sơ bộ + Javen 5%(v/v)/ 20 phút

2.6.2 Nhân nhanh chồi in vitro

Các thí nghiệm nhân nhanh chồi in vitro Ďều sử dụng môi trường dinh

dưỡng cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) [25]: MS + 30g/l Ďường Saccarose + 7g/l agar bổ sung các chất Ďiều hòa sinh trưởng BAP, nước dừa với các nồng Ďộ khác nhau gồm 2 thí nghiệm sau:

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi

in vitro của cây Cỏ thi hắt hơi ở các nồng độ 0,1mg/l; 0,3mg/l; 0,5mg/l;

0,7mg/l; 0,9mg/l

Bảng 2.2: Công thức ảnh hưởng của BAP lên quá trình nhân nhanh

chồi in vitro

Công thức Thành phần môi trường CT1 MS (Ďối chứng)

CT2 MS + 0,1 mg/1l BAP CT3 MS + 0,3 mg/1l BAP CT4 MS + 0,5 mg/1l BAP CT5 MS + 0,7 mg/1l BAP CT6 MS + 0,9 mg/1l BAP

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân nhanh

chồi in vitro của cây cỏ thi hắt hơi ở các nồng độ 5%/l, 10%/l, 15%/l

Bảng 2.3: Công thức ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình nhân nhanh

2.6.3 Ra rễ - tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Các chồi Ďơn hữu hiệu có chiều cao ≥ 2 cm Ďược tách ra khỏi cụm chồi

và cấy chuyển vào môi trường kích thích ra rễ Khả năng tạo rễ Ďược Ďánh giá trên công thức môi trường MS bổ sung 0,1 0,7 mg/l 1-Naphthaleneacetic