NGHIÊN cứu, SO SÁNH KHẢ NĂNG gây BỆNH TÍCH tế bào và một số đặc điểm SINH học PHÂN tử của VIRUS PRRS QUA các đời cấy CHUYỂN TRÊN môi TRƯỜNG tế bào MARC 145

Do đó, để hiểu rõ về các chủng virus PRRS, để tìm ra được các chủngvirus có đủ tiêu chuẩn để sản xuất vacxin thì việc nghiên cứu các đặc tính sinhhọc phân tử của virus PRRS qua các đời c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

Người hướng dẫn : PGS.TS Nguyễn Thị Lan Người thực hiện : Triệu Thị Ánh

HÀ NỘI - 2013

LỜI CẢM ƠN

Quá trình học tập và rèn luyện dưới mái trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội đã giúp tôi hòa thiện hơn về nhân cách và trình độ chuyên môn Tôi đã nhận được sự quan tâm, dạy dỗ tận tình của các Thầy, Cô giáo đặc biệt là các Thầy, Cô giáo công tác tại Khoa Thú y.

Nhân dịp hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Thú y cho phép tôi được bày tỏ sự biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến các Thầy,

Cô giáo – những người luôn dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi học tập tại Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội cũng như trong suốt quá trình tôi thực hiện khóa luận này.

Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Thị Lan, Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận Đồng thời tôi cũng xin bày tỏ sự biết ơn đến các Thầy, Cô giáo trong bộ môn Bệnh lý – Khoa Thú y – Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội, các anh chị công tác tại phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH – khoa Thú Y (B213 – B214) nơi tôi thực hiện đề tài, đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành đề tài tốt nhất.

Cuối cùng tôi xin được cản ơn gia đình, bạn bè những người đã luôn động viên, tạo điều kiện tốt nhất và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này.

Trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 05 tháng 12 năm 2013

Sinh viên Triệu Thị Ánh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài: 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Lịch sử và tình hình dịch bệnh PRRS ở lợn 3

2.1.1 Tình hình dịch PRRS trên thế giới 3

2.1.2 Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam 5

2.2 Hội chứng rối loạn hô hấp & sinh sản (PRRS) 10

2.2.1 Căn bệnh 10

2.2.2 Dịch tễ học 14

2.2.3 Triệu chứng và bệnh tích 17

2.2.4 Chẩn đoán và phòng trị 19

2.3 Nuôi cấy virus trên môi trường tế bào Marc-145 22

2.4 Các kĩ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu phân tích gen và hệ gen virus 22

2.4.1 Kĩ thuật PCR (Polymearase chain reaction) 22

2.4.2 Kĩ thuật điện di 24

2.4.3 Kĩ thuật giải trình tự Gen 25

Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

3.1 Đối tượng 28

3.2 Nội dung 28

3.3 Địa điểm thực tập 28

3.4 Nguyên liệu 28

3.4.1 Mẫu virus nghiên cứu 28

3.4.2 Dụng cụ, máy móc, thiết bị 28

3.4.3 Hóa chất môi trường 29

3.5 Phương pháp nghiên cứu 29

3.5.1 Phương pháp cấy chuyển virus PRRS trên tế bào Marc- 145 29

3.5.2 Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS 32

3.5.3 Phương pháp RT-PCR 33

3.5.4 Phương pháp giải trình tự Gen 35

3.5.5 Phương pháp đọc kết quả 36

Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Kết quả lựa chọn chủng virus PRRS cho nghiên cứu 37

4.2 Kết quả cấy chuyển virus qua các đời 45

4.3 Kết quả giải trình tự đoạn ORF5 của PRRSV qua các đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 46

4.3.1 Kết quả phản ứng RT – PCR 46

4.3.2 Kết quả giải trình tự gen ở các đời cấy chuyển 48

4.3.3 Kết quả so sánh trình tự nucleotide của virus PRRS ở các đời cấy chuyển 49

4.3.4 Sự tương đồng về nucleotide của đoạn gene ORF5 của các chủng PRRSV ở các đời nghiên cứu 54

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

5.1 Kết luận 56

5.2 Kiến Nghị 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Protein cấu trúc của PRRSV 11

Bảng 2.2 Sức đề kháng của PRRSV 13

Bảng 3.1 Thành phần và thể tích cho phản ứng RT-PCR 33

Bảng 3.2 Các cặp mồi cho phản ứng RT - PCR 33

Bảng 4.1 Hồ sơ mẫu các chủng virus PRRS lựa chọn nghiên cứu 37

Bảng 4.2 Khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus nghiên cứu 38

Bảng 4.3 Mức độ tương đồng về nucleotide của các chủng PRRS nghiên cứu 43

Bảng 4.4 Khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus qua các đời 46

Bảng 4.5 Mức độ tương đồng về nucleotide giữa các đời nghiên cứu của chủng 182 – NA 54

Bảng 4.6 Mức độ tương đồng về nucleotide giữa các đời nghiên cứu của chủng 227 – HY 54

Bảng 4.7 Mức độ tương đồng về nucleotide giữa các đời nghiên cứu của chủng 383 – HN 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Bản đồ tình hình dịch bệnh PRRS độc lực cao ở châu Á từ năm 2006

đến năm 2010 4

Hình 2.2 Dịch bệnh PRRS tại Việt Nam năm 2007 7

Hình 2.3 Hình thái virus PRRS 10

Hình 2.4 Cấu trúc bộ gen của PRRSV 11

Hình 2.5 Virus PRRS xâm nhập và phá hủy tế bào đại thực bào 16

Hình 2.6 Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR 23

Hình 4.1 Tế bào Marc-145 chưa gây nhiễm virus 40

Hình 4.2 Bệnh tích tế bào sau 36 giờ gây nhiễm 40

Hình 4.3 Bệnh tích tế bào sau 48 giờ gây nhiễm 40

Hình 4.4 Bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây nhiễm 40

Hình 4.5 So sánh trình tự gen của các chủng PRRSV nghiên cứu 41

Hình 4.6 Cây sinh học phân tử các chủng Virus PRRS đang nghiên cứu 44

Hình 4.7 Kết quả phản ứng RT – PCR với mồi ORF5 của chủng 182 –NA 47

Hình 4.8 Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide đoạn gen ORF5 của chủng 182 – NA ở đời cấy chuyển thứ 5 48

Hình 4.9a So sánh trình tự nucleotide của chủng 182- NA ở các đời cấy chuyền 50

Hình 4.9b So sánh trình tự nucleotide của chủng 227-HY ở các đời cấy chuyền 51

Hình 4.9c So sánh trình tự nucleotide của chủng 383 - HN ở các đời cấy chuyển 52

EVA : Equine virus

FCS : Fetal Calf Serum

IFA : Indirect Immunofluoresence Assay

kDa : Kilodalton

LDHV : Lactate Dehydlogenase – elevating virus

MA : Monkey kidney cell

OIE : Tổ chức thú y thế giới

ORF : Open reading frame (khung đọc mở)

PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory SyndromePRRSV : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virusRNA : Ribonucleic acid

SHFV : Simian hemorrhaghic fever virus

Phần 1

MỞ ĐẦU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài:

Đất nước ta đang trong quá trình hội nhập và phát triển, cùng với chiếnlược tăng cường phát triển công nghiệp và dịch vụ thì ngành nông nghiệp đặcbiệt là lĩnh vực chăn nuôi cũng được Nhà nước và toàn xã hội chú trọng đầu tư.Trong đó ngành chăn nuôi lợn ngày càng chiếm một vị trí quan trọng trong cơcấu kinh tế đất nước do hiệu quả kinh tế mà nó mang lại Tuy nhiên, ngành chănnuôi lợn của nước ta nói riêng cũng như thế giới nói chung luôn chịu sự đe dọacủa các dịch bệnh khác nhau

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn hay còn gọi là bệnh “Taixanh” (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS) là một bệnhtruyền nhiễm nguy hiểm trên lợn với mọi nòi giống, lứa tuổi và có những diễnbiến phức tạp, xảy ra nghiêm trọng gây ra nhiều thiệt hại nặng nề

PRRS tiến triển phức tạp, khó khống chế lại ít biểu hiện triệu chứng, tỷ lệmắc bệnh cao Bệnh gây sảy thai ở thời kỳ cuối, chậm động dục, gia tăng số thaichết và lợn con sơ sinh yếu, lợn con chết trước khi sinh, còi cọc, chậm lớn

bảo hộ cho đàn lợn của các sản phẩm vacxin PRRS thương mại Bên cạnh đó đã

có nhiều nghiên cứu cho thấy virus PRRS có sự đột biến cao, tạo ra nhiều chủng

có độc lực khác nhau, rất khó để kiểm soát dịch bệnh

Trong những năm gần đây, nước ta đã có nhiều loại vacin nhập ngoại tuynhiên dịch bệnh vẫn sảy ra.Vì vây, để chủ động đạt hiệu quả cao trong công tácphòng chống dịch PRRS, Việt Nam cần có vacin chể từ các chủng phân lậpđược

Do đó, để hiểu rõ về các chủng virus PRRS, để tìm ra được các chủngvirus có đủ tiêu chuẩn để sản xuất vacxin thì việc nghiên cứu các đặc tính sinhhọc phân tử của virus PRRS qua các đời cấy chuyển trên tế bào Marc-145, xácđịnh sự biến đổi hay không biến đổi hệ gen trong cấu trúc gen của virus PRRSsau các đời cấy chuyển trên tế bào Marc-145 sẽ là cơ sở khoa học cho việc lựachọn các chủng virus PRRS để chế tạo vacin phòng bệnh.

“Nghiên cứu, so sánh khả năng gây bệnh tích tế bào và một số đặc điểm sinh học phân tử của virus PRRS qua các đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145”.

1.2 Mục tiêu đề tài

Xác định mức độ ổn định về đặc tính sinh học phân tử của các chủngvirus PRRS sau nhiều đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Lịch sử và tình hình dịch bệnh PRRS ở lợn.

2.1.1 Tình hình dịch PRRS trên thế giới

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản của lợn (Porcine reproductive andrespiratory syndrome - PRRS) hay còn gọi là bệnh “Tai xanh” được ghi nhận lầnđầu tiên ở Mỹ tại vùng Bắc của bang California, bang Iowa và Minnesota vàonăm 1987 Bệnh đã lây lan nhanh sang các nước như Canada năm 1988 và cácnước Châu Âu cũng xuất hiện bệnh Ở Đức năm 1990, Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ,Anh năm 1991 và năm 1992 ở Pháp (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2011)

Năm 1998, bệnh được phát hiện ở châu Á như Hàn Quốc, Nhật Bản Thờigian đầu do chưa xác định được nguyên nhân nên có nhiều tên gọi: Bệnh bíhiểm ở lợn (Mistery swine disease – MDS); bệnh tai xanh (Blue Ear disease –BED); hội chứng hô hấp và sảy thai ở lợn (Porcine Endemic abortion andRespiratory syndrome – PEARS)…

Năm 1992, Hội nghị Quốc tế về hội chứng này được tổ chức tại Minesota(Mỹ), Tổ chức Thú y thế giới (OIE) đã thống nhất tên gọi là Hội chứng rối loạn hôhấp và sinh sản ở lợn (Porcine respiratory and reproductive syndrome - PRRS)

Theo Cục Thú y (2008), từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước và vùng lãnhthổ thuộc tất cả các châu lục trên thế giới đều có dịch PRRS lưu hành (trừ Châu

Úc và Newzeland) Có thể khẳng định rằng PRRS là nguyên nhân gây tổn thấtkinh tế cho ngành chăn nuôi lợn ở nhiều quốc gia trên thế giới (Nguyễn Bá Hiên

và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2007)

Hình 2.1 Bản đồ tình hình dịch bệnh PRRS độc lực cao ở châu Á

từ năm 2006 đến năm 2010

(2006 màu đỏ, 2007 màu hồng, 2009 màu xanh, 2010 màu xanh nhạt).

của Trung Quốc được phát hành vào tháng 12/2007, kể từ năm 2006, đàn lợncủa Trung Quốc đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi Hội chứng sốt cao ở lợn donhiều nguyên nhân, trong đó chủ yếu là virus PRRS và các loại mầm bệnh khácgồm: Virus Dịch tả lợn, PCV-2 chiếm 96,5% Trong vòng hơn 3 tháng của năm

2006, dịch đã lây lan ở hơn 10 tỉnh phía Nam làm hơn 2 triệu lợn ốm, trong đó

có hơn 400.000 lợn mắc bệnh đã chết (Kegong Tian, 2007) Những nguyên nhânnày làm hàng triệu lợn bị ốm, chết và phải tiêu huỷ Kết quả nghiên cứu toàndiện của Trung Quốc đã khẳng định chủng virus PRRS gây bệnh tại nước này làchủng độc lực cao, đặc biệt có sự biến đổi của virus (thiếu hụt 30 aa trong gen).Năm 2007, các tỉnh Anhui, Hunan, Guangdong, Shandong, Liaoning, Jilin vàmột số tỉnh khác bị ảnh hưởng nặng buộc Trung Quốc phải tiêu huỷ tới 20 triệulợn để ngăn chặn dịch lây lan

Tại Hồng Kông và Đài Loan đã xác định có cả hai chủng Châu Âu và Bắc

Mỹ cùng lưu hành, đặc biệt trong cùng một con lợn ở Hồng Kông đã xác địnhnhiễm cả hai chủng nêu trên; dịch PRRS cũng được thông báo ở Thái Lan từ cácnăm 2000 – 2007 Thông báo cho biết, các virus gây bệnh PRRS được phân lập

từ nhiều địa phương thuộc nước này gồm cả chủng dòng Châu Âu và chủngdòng Bắc Mỹ Trong đó, số virus thuộc chủng dòng Châu Âu chiếm 66,42% còncác virus thuộc chủng dòng Bắc Mỹ chiếm 33,58% Phần lớn ở những quốc gianày hiện đang lưu hành virus gây bệnh PRRS chủng Châu Âu hoặc Bắc Mỹ lànhững chủng virus cổ điển độc lực thấp

Từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châulục trên thế giới đã báo cáo cho Tổ chức Thú y thế giới (OIE) đều có dịch PRRSlưu hành (trừ châu Úc và Newzeland)

Hiện nay, hội chứng này đã trở thành dịch địa phương ở nhiều nước trênthế giới, kể cả các nước có ngành chăn nuôi lợn phát triển như Mỹ, Hà Lan,Anh, Đan Mạch, Pháp, Đức… đã gây ra những tổn thất rất lớn về kinh tế chongười chăn nuôi lên đến hàng trăm triệu đôla Các nước trong khu vực có tỷ lệPRRS lưu hành rất cao như: Trung Quốc 80%, Đài Loan 94,7 – 76,4%,Philippin 90%, Thái Lan 97%, Malaysia 94%, Hàn Quốc 67,4 – 73,1%

2.1.2 Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam

Lần đầu tiên trong lịch sử vào năm 1997, PRRS được phát hiện trên đànlợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh miền Nam Kết quả kiểm tra 51 con cho thấy 10/51lợn giống nhập khẩu có huyết thanh dương tính với PRRSV Toàn bộ số lợn này

đã được xử lý ngay sau đó Những năm tiếp theo, các nghiên cứu về bệnh ở cáctrại lợn giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tínhvới bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29% (Hoàng Văn Năm, 2001)

Như vậy có thể thấy virus PRRS đã xuất hiện và lưu hành tại nước tatrong một thời gian dài Sự bùng phát dịch đầu tiên gây tổn thất cho ngành chănnuôi bắt đầu từ tháng 3/2007 (Chu Thị Thơm và cs, 2006)

Dịch xuất hiện từng đợt tại cả 3 miền Bắc, Trung, Nam gây thiệt hại đáng kểcho ngành chăn nuôi lợn, đặc biệt là ảnh hưởng đến phát triển đàn giống.

Năm 2007: Xảy ra 2 đợt dịch nghiêm trọng

+ Đợt dịch 1: Bắt đầu từ ngày 12/3/2007 khi hàng loạt đàn lợn tại Hải

Dương có những biểu hiện ốm khác thường rồi dịch bệnh bắt đầu bùng phátmạnh do lần đầu tiên dịch PRRS xuất hiện tại Việt Nam và do không quản lýđược việc buôn bán, vận chuyển lợn ốm, dịch PRRS đã lây lan nhanh và pháttriển mạnh tại 146 xã thuộc 25 huyện, thị xã của 7 tỉnh thành khác nhau thuộcĐồng bằng Sông Hồng gồm: Hải Dương, Hưng Yên, Bắc Ninh, Quảng Ninh,Thái Bình, Bắc Giang và Hải Phòng làm hàng ngàn con lợn mắc bệnh (NguyễnLương Hiền và cs) Tổng số con ốm và mắc bệnh ở đợt dịch này là 31.750 con,

số con chết và đem xử lý là 7.296 con

+ Đợt dịch thứ 2: Diễn ra từ ngày 25/6 đến 11/12/2007

Ngày 25/6/2007, dịch lại xuất hiện tại tỉnh Quảng Nam sau lan rộng ra

178 xã của 40 huyện, thị xã thuộc 14 tỉnh, thành trong cả nước: Cà Mau, Long

An, Bà Rịa – Vũng Tàu, Khánh Hòa, Bình Định, Quảng Ngãi, Quảng Nam, ĐàNẵng, Thừa Thiên Huế, Quảng Trị, Lạng Sơn, Hà Nội, Thái Bình và Hải Dươngvới tổng số con ốm là 38.827 con, số con chết và tiêu hủy là 20.366 con

Như vậy, trong cả hai đợt dịch bệnh PRRS đã có mặt khắp cả 3 miềmBắc, Trung, Nam với 324 xã, phường của 65 huyện, quận thuộc 18 tỉnh, thànhphố có dịch Số lợn mắc bệnh là 70.577 con (chiếm 0,26% tổng đàn, toàn quốc

có 26.560.651 con), số lợn chết và tiêu hủy là 20.366 (chiếm gần 0,08%) Tìnhhình dịch PRRS vẫn đang diễn biến phức tạp và không có chiều hướng lắngxuống

Cho đến 07/2008 tổng số lợn mắc bệnh là 16.677 con, số chết buộc phải tiêuhủy là 14.799 con Tình hình cho thấy virus gây bệnh đã phát tán rộng và có khảnăng bùng phát thành dịch lớn trên cả nước nếu không cí biện pháp ngăn chặn.

Bắc Giang Quảng Ninh Hải Phòng Thái Bình TT- Huế ( 13/07)

Đà Nẵng Quảng Ngãi

Năm 2009

Trong năm 2009, dịch PRRS xảy ra lẻ tẻ ở nhiều nơi Theo thống kê củaCục Thú y, dịch PRRS đã xảy ra tại 14 tỉnh, thành phố trong cả nước làm 7.030con lợn bị mắc bệnh và phải tiêu hủy 5.847 con

Năm 2010

+ Đợt 1: Tại miền Bắc

Dịch tai xanh xảy ra từ ngày 23/3/2010 tại tỉnh Hải Dương Tính đến hếttháng 6/2010, toàn quốc ghi nhận các ổ dịch lợn tai xanh tại 461 xã, phường, thịtrấn của 71 quận, huyện thuộc 16 tỉnh, thành phố gồm Hải Dương, Hưng Yên,Hải Phòng, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Hà Nội,Nam Định, Hà Nam, Nghệ An, Quảng Ninh, Hòa Bình, Cao Bằng và Sơn La.Tổng số lợn mắc bệnh là 146.051 con, trong đó số tiêu hủy là 65.911 con

+ Đợt 2: Tại miền Trung và miền Nam

Đợt dịch này bắt đầu từ ngày 01/6/2010 tại Sóc Trăng Sau đó dịch xuấthiện tại Tiền Giang (ngày 19/6), Bình Dương (ngày 27/6), Long An (ngày 15/7),Quảng Trị (ngày 01/7), Lào Cai (ngày 11/7)

Trong đợt dịch này, toàn quốc ghi nhận các ổ dịch lợn tai xanh tại 42.080

hộ chăn nuôi của 1.517 xã, phường, thị trấn thuộc 215 quận, huyện của 36 tỉnh,thành phố: Sóc Trăng, Quảng Trị, Tiền Giang, Long An, Bình Dương, Bạc Liêu,Quảng Nam, Đồng Nai, Bình Phước, Đà Nẵng, Vĩnh Long, Khánh Hòa, ĐắkLắc, Hậu Giang, Bà Rịa – Vũng Tàu, Lâm Đồng, Tây Ninh, An Giang, ĐồngTháp, Cần Thơ, Bến Tre, Kiên Giang, Kon Tum, Cà Mau, Đắc Nông, Gia Lai,Trà Vinh, Bình Thuận, Ninh Thuận, Phú Yên, Lào Cai, Sơn La, Nam Định,Thanh Hóa, Hà Tĩnh và Quảng Ninh

Tổng số lợn trong đàn mắc bệnh là 970.857con, số mắc bệnh là 717.830con, trong đó số chết và tiêu hủy là 413.540 con

Năm 2011

Dịch được ghi nhận nổ ra đầu tiên khi tỉnh Quảng Trị công bố dịch vàongày 25/3/2011 Sau đó Nghệ An công bố dịch vào ngày 16/4/2011 tiếp đó cáctỉnh Thái Bình, Hải Dương, Hà Tĩnh, Bắc Ninh đồng loạt công bố Tổng số lợnmắc bệnh là 14.704 con, số con chết và tiêu hủy là 13.831 con

Theo thống kê của Cục thú y riêng tỉnh Nghệ An có 11.858 con mắc bệnhchiếm tỷ lệ 80.64% so với cả nước Tổng số con chết và tiêu hủy là 11.816 conchiếm tỷ lệ 99.64% so với tổng số con mắc của tỉnh và chiếm tỷ lệ 85.43% tổng

số lợn tiêu hủy của cả nước tính đến cùng thời điểm Sáu tháng cuối năm khôngphát sinh thêm ổ dịch mới

Năm 2012

Dịch tai xanh bắt đầu xảy ra từ 11/01 tại tỉnh Lào Cai; đến những thángcuối năm toàn quốc đã ghi nhận 14 tỉnh có dịch lợn tai xanh là Điện Biên, YênBái, Nam Định, Phú Thọ, Lào Cai, Lai Châu, Bắc Ninh, Quảng Ninh, Hòa Bình,Lạng Sơn, Bạc Liêu, Đồng Nai, Nghệ An, Bình Dương Cục Thú y cũng nhậnđịnh dịch tai xanh năm 2012 có diễn biến bất thường hơn so với năm 2011, tốc

độ lây lan rất nhanh, số lượng heo mắc bệnh phải tiêu hủy cao gấp 2,5 lần socùng kỳ năm 2011 Tính đến cuối năm 2012 còn 6 tỉnh: Đăk Lăk, Quảng Nam,Phú Yên, Khánh Hòa, Thái Bình và Long An có dịch tai xanh chưa qua 21 ngàyvới tổng số lợn mắc bệnh là gần 6000 con

Năm 2013: Tính từ đầu năm 2013 đến 1/11/2013.

Đầu năm 2013 đến nay tình hình dịch bệnh tai xanh diễn ra khá phức tạp,

Tỉ lệ lợn chết và lợn tiêu hủy đã lên đến 6000 con, bùng phát mạnh thành dịch ở

6 tỉnh (Thanh Hóa, Ngệ An, Hà Tĩnh, Nam Định, Bắc Ninh, Thái Bình)

Tuy nhiên đến thời điểm hiện tại thì tình hình dịch bệnh có xu hướng ổnđịnh hơn, không có phát hiện thêm ổ dịch mới và cả nước không có tỉnh nào códịch Tai xanh.( theo Cục Thú y)

2.2 Hội chứng rối loạn hô hấp & sinh sản (PRRS)

2.2.1 Căn bệnh.

a Hình thái và cấu trúc của virus PRRS

Virus PRRS là một virus ARN chuỗi đơn dương, virus được xếp vào bộ

Nidovirales, họ Arteriviridae, chi Arterivirus (Collins JE, 1992) Virus có cấu

trúc gần giống với virus gây viêm khớp ở Ngựa (EAV), Lactic dehydrogennase

virus của chuột (LDHV) và virus gây xuất huyết trên khỉ (SHFV) (Rossow KD

và cs, 1998)

Quan sát virus dưới kính hiển vi điện tử thấy virus có dạng hình cầu, có

vỏ bọc, trên bề mặt có nhiều gai nhô ra, kích thước 45nm – 80nm và chứa nhânnucleocapxit kích thước 25nm – 35nm (William T.Christianson, 2000)

Hình 2.3. Hình thái virus PRRS

Đây là ARN virus với bộ

gen là một phân tử ARN sợi

đơn dương Sợi ARN này có

kích thước khoảng 15

kilobase, có 9 khung đọc mở

(ORF − open reading frame)

mã hoá cho 9 protein cấu

trúc

Hình 2.4 Cấu trúc bộ gen của PRRSV

Tuy nhiên trong cấu trúc của virus PRRS, có 6 phân tử protein chính cókhả năng trung hoà kháng thể bao gồm 4 phân tử glycoprotein, 1 phân tử proteinmàng (M) và 1 protein vỏ nhân virus (N) Nhưng hoạt động trung hoà xảy ramạnh với các protein có khối lượng phân tử 45, 31 và 25 KD (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Protein cấu trúc của PRRSV

Là protein liên kết vỏ bọc kếthợp glycogen có tính bám dính

b Phân loại Virus PRRS.

Virus PRRS có hai chủng nguyên mẫu (prototype), chủng Châu Âu (VirusLeLysad-LV) và chủng Bắc Mỹ (VR-2332) Ngoài sự khác biệt giữa các lầnphân lập người ta đã chứng minh được có sự biến dị di truyền mạnh trong cả haityp phân lập, được khẳng định qua phân tích trình tự nucleotide và axit amin củacác khung đọc mở (ORFs) của LV và VR-2332 Trình tự axit amin của VR-2332

so với LV là 76% (ORF2), 72% (ORF3), 80% (ORF4&5), 91% (ORF6) và 74%

nhiên và tái tổ hợp trong gen Các chủng virus này gây bệnh trên động vật cảmthụ với bệnh cảnh giống nhau

Những nghiên cứu gần đây cho thấy có sự khác biệt trong tính di truyềncủa các virus được phân lập từ các vùng địa lý khác nhau Bản thân các virustrong cùng một nhóm cũng có sự thay đổi về chuỗi nucleotide khá cao đến 20%.Chủng Bắc Mỹ có 3 subtype: VR-2332, Taiwan và 807/94 phân lập ở Canada.Chủng Châu Âu có 2 subtype: I10 phân lập tại Hà Lan và Oloot tại Tây BanNha Chính sự khác biệt về tính đa dạng và tính kháng nguyên, khả năng biếnđổi cấu trúc kháng nguyên của virus đã làm tăng khó khăn cho việc sản xuấtvaccine chống lại chúng

c Khả năng gây bệnh và sức đề kháng của virus PRRS

* Khả năng gây bệnh:

PRRSV chỉ gây bệnh cho lợn Lợn tất cả các lứa tuổi đều cảm nhiễm,nhưng lợn con và lợn nái mang thai thường mẫn cảm hơn cả Loài lợn rừng cũngmắc bệnh, đây có thể coi là nguồn dịch bệnh thiên nhiên

Về mặt độc lực người ta thấy PRRS tồn tại dưới 2 dạng:

+ Dạng cổ điển: Có độc lực thấp, ở dạng này khi mắc bệnh thì có tỷ lệchết thấp, chỉ từ 1-5% trong tổng đàn

+ Dạng biến thể độc lực cao: Gây nhiễm và chết nhiều lợn

Thông thường virus chỉ gây bệnh cho lợn, không gây bệnh cho người vàđộng vật khác Tuy nhiên, một số loài thủy cầm chân màng, vịt trời đã đượcchứng minh là rất mẫn cảm với virus PRRS, và virus có thể nhân lên ở loài vịtnày, do đó vấn đề phát tán virus ra diện rộng là khó tránh khỏi (Zimmerman vàcs.1997).

Virus trong huyết thanh

Các chất sát trùng thông thường và môi trường có pH axit dễ dàng tiêudiệt virus Ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng

d Đặc tính nuôi cấy virus PRRS.

PRRSV có thể nhân lên trên hai loại môi trường tế bào là đại thực bào phế

nang (PAM - Pulmnary alveolar macrophage) và tế bào dòng của thận khỉ Châu Phi (MA - Monkey kidney cell).

PAM là môi trường tốt nhất cho phân lập virus vì nó có độ nhạy cao nhất,virus có thể nhân lên với số lượng lớn và có thể nuôi cấy tất cả các chủng virusPRRS trên thế giới Nhưng nhược điểm của nó là phải chuẩn bị môi trường từnhững con lợn khỏe mạnh và PAM không phải là tế bào dòng nên sự nhân lêncủa tế bào là có giới hạn do đó không thể lưu giữ virus trong thời gian lâu dài(Kim và cs, 1993).

Với môi trường là các tế bào dòng như: MA-104, Marc-145, CL-2621hiện đang được sử dụng nhiều hơn và khắc phục được nhược điểm của tế bàoPAM MA-104 chỉ có thể phân lập được các chủng virus của Bắc Mỹ CL-2621

có thể phân lập virus PRRS chủng châu Âu nhưng hiệu quả phân lập của chúngthấp hơn so với PAM (Elida và cs, 1993) Marc-145 có thể phân lập được 11dòng virus của cả 2 chủng châu Âu và Bắc Mỹ hơn nữa thời gian và mức độ gâybệnh tích tế bào, số lượng virus thu được sau khi phân lập đều đảm bảo yêu cầunên dòng tế bào này đang được ứng dụng nhiều cho chẩn đoán và nghiên cứu(Kim và cs, 1993) Đối với chủng virus PRRS thể độc lực cao của Việt Nam vàTrung Quốc thì môi trường Marc-145 là môi trường nuôi cấy được sử dụngnhiều nhất hiện nay vì khả năng thích ứng rất cao và gây bệnh tích tế bào điểnhình của virus

2.2.2 Dịch tễ học.

2.2.2.1 Loài vật mắc bệnh, lứa tuổi mắc bệnh.

PRRSV chỉ gây bệnh cho loài lợn Lợn ở tất cả các lứa tuổi đều cảmnhiễm, nhưng lợn con và lợn nái mang thai thường mẫn cảm hơn cả Loài lợnrừng cũng mắc bệnh

Một số loài thủy cầm chân màng, vịt trời (mallard duck) đã được chứngminh là cũng mẫn cảm với PRRSV, và virus có thể nhân lên ở loài vịt này, do đóvấn đề phát tán virus ra diện rộng là khó trách khỏi (Zimmerman và cs, 1997)

2.2.2.2.Chất chứa mầm bệnh và quá trình truyền lây.

* Chất chứa mầm bệnh:

Virus có trong dịch mũi, nước bọt, phân và nước tiểu của lợn mắc bệnhhoặc lợn mang trùng và phát tán ra môi trường, tinh dịch của lợn đực giống nhiễmvirus cũng là nguồn lây lan bệnh

Ở lợn bệnh hoặc lợn mang trùng, virus tập trung chủ yếu ở phổi, hạch phổi,hạch amidan, hạch lympho, lách, tuyến ức và ở huyết thanh Đây là những bệnhphẩm cần được lấy để gửi đi chẩn đoán, xét nghiệm trong phòng thí nghiệm Ở lợnnái mang thai, virus có thể từ mẹ xâm nhiễm sang bào thai và gây bệnh

* Phương thức truyền lây:

Bệnh có thể lây trực tiếp thông qua sự tiếp xúc giữa lợn mắc bệnh, lợnmang trùng với lợn khoẻ và có thể lây gián tiếp qua các nhân tố trung gian bịnhiễm virus như phân, thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi

Bệnh lây chủ yếu qua đường hô hấp, qua thụ tinh nhân tạo, tiếp xúc trựctiếp Ở lợn mẹ mang trùng virus có thể lây nhiễm cho bào thai ở giai đoạn kỳgiữa trở đi và virus cũng được bài xuất qua nước bọt và sữa Lợn trưởng thành

có thể bài xuất virus trong vòng 14 ngày trong khi đó lợn con và lợn choai bàixuất virus trong thời gian 1 − 2 tháng

Virus có thể được phát tán thông qua con đường vận chuyển lợn mangtrùng theo gió có thể đi xa tới 3km, bụi, bọt nước, dụng cụ chăn nuôi, dụng cụbảo hộ lao động nhiễm trùng, thụ tinh nhân tạo và có thể phát tán nhờ một sốloài chim hoang dã

2.2.2.3 Cơ chế sinh bệnh.

”Giống cơ chế của virus HIV”

Sau khi xâm nhập, đích tấn công của virus là các đại thực bào Đây là tếbào duy nhất có receptor phù hợp với cấu trúc hạt virus, vì thế virus hấp thụ vàthực hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bào này và phá huỷ nó Một tỷ lệ lớn tếbào đại thực bào trong nang phổi bị virus xâm nhiễm rất sớm

Trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, đại thực bào đóng vai trò vô cùng quantrọng trong đáp ứng miễn dịch kể cả đặc hiệu và không đặc hiệu, đây là loại tế bàotrình diện kháng nguyên thiết yếu, mở đầu cho quá trình đáp ứng miễn dịch đặchiệu Khi tế bào đại thực bào bị virus phá huỷ, các phản ứng miễn dịch không xảy

ra được, lợn nhiễm bệnh rơi vào trạng thái suy giảm miễn dịch và dễ dàng mắc cácbệnh nhiễm trùng thứ phát

Hình 2.5 Virus PRRS xâm nhập và phá hủy tế bào đại thực bào

Nguyễn Hữu Nam, Nguyễn Thị Lan (2007) trong nghiên cứu về PRRScho rằng, phổi chắc đặc chính là nguyên nhân gây khó thở dẫn đến thiếu oxytrong máu và các mô bào Do suy giảm sự trao đổi khí tại phổi làm máu của giasúc bệnh có màu sẫm, màu này có thể nhìn được từ bên ngoài tại các vùng damỏng, các vùng da có nhiều mạch quản như vùng tai, bẹn, bụng Vì vậy mà cótriệu chứng tai xanh

Do thiếu oxy nên gây rối loạn chuyển hóa của thai, thai bị suy dinh dưỡng

và gây chết thai, sảy thai Lợn chửa kì cuối thì nhu cầu oxy tăng cao vì phải nuôithai, ở thời kì cuối thai tăng trưởng rất nhanh nên nhu cầu về oxy tăng gấp bội vìvậy lượng thiếu hụt oxy càng nghiêm trọng nên hay bị sảy thai

Sau sảy thai tế bào nội mạc tử cung bị thoái hóa, hoại tử nên làm chậm các quátrình sinh lý khác.

Chính do cơ chế tác động là tấn công vào hệ thống miễn dịch, gây suygiảm miễn dịch đã mở cửa cho các loại vi sinh vật gây bệnh khác xâm nhập vàgây bệnh

Tác nhân chủ yếu liên quan đến nhiễm trùng kế phát là vi khuẩn:

Haemophilus parasuis, Streptococcus suis, Salmonella cholerasuis, Pasteurella multocida và Actinobacillus, Pneuropneumoniae

2.2.3 Triệu chứng và bệnh tích

2.2.3.1 Triệu chứng của PRRS

Biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố:chủng virus, tuổi, giới tính, điều kiện môi trường và sự kế phát của một số visinh vật khác

Triệu chứng lâm sàng được thể hiện rất khác nhau, theo ước tính cứ 3 đànlần đầu tiếp xúc với mầm bệnh thì một đàn không có biểu hiện, một đàn có biểuhiện mức độ vừa và một đàn biểu hiện ở mức độ nặng Lý do của việc này đếnnay vẫn chưa có lời giải thích Tuy nhiên, với những đàn khoẻ mạnh thì mức độbệnh cũng giảm nhẹ hơn và cũng có thể virus tạo nhiều biến chủng với độc lựckhác nhau Thực tế, nhiều đàn có huyết thanh dương tính nhưng không có dấuhiệu lâm sàng (Nguyễn Văn Thanh, 2007)

 Ở lợn nái

Trong tháng đầu tiên khi bị nhiễm bệnh lợn biếng ăn, sốt 40-410C, một sốcon tai chuyển màu tím trong thời gian ngắn, tím đuôi, tím âm hộ, sảy thai ở giaiđoạn đầu Lợn nái trong giai đoạn nuôi con thường biếng ăn, lười uống nước,viêm vú, mất sữa, động dục lẫn lộn (5-10 ngày sau khi sinh) nái chậm lên giốngnếu bệnh kéo dài sẽ kế phát nhiều bệnh ghép và dẫn đến tử vong (Murakami Y,1994) Đỉnh cao của bệnh là hiện tượng sảy thai, đẻ non, thai chết lưu, thai gỗhàng loạt Lợn con đẻ ra yếu ớt tỷ lệ tử vong cao có thể lên tới 70%

 Lợn đực giống

Khi bị nhiễm bệnh lợn thường bỏ ăn, sốt cao, đờ đẫn hoặc hôn mê, một

số con có hiện tượng tai chuyển thành màu tím Đặc biệt xuất hiện hiện tượngviêm dịch hoàn, giảm hưng phấn hoặc mất tính dục, lượng tinh dịch ít, chấtlượng tinh kém Lợn đực giống rất lâu mới hồi phục được khả năng sinh sản

 Lợn con cai sữa và lợn choai

Lợn sốt cao, bỏ ăn, lông xơ xác, có biểu hiện ho nhẹ Đối với lợn con caisữa có triệu chứng táo bón, mẩn đỏ da, chảy nước mũi, tím tái…Còn đối với lợnchoai thì triệu chứng điển hình là chảy nước mũi, tím tai và ho (Nguyễn ThịLan,Dương Thị Minh Huyền, 2012) Trong những trường hợp ghép với bệnhkhác có thể thấy viêm phổi cấp tính, hình thành nhiều ổ áp xe, thể trạng gầy yếu,

da xanh, tiêu chảy, hắt hơi, thở nhanh, chảy nước mắt, tỷ lệ chết khoảng 15%

2.2.3.2 Bệnh tích của bệnh PRRS

 Lợn nái chửa

Trường hợp đẻ non thì thấy có nhiều thai đã chết, trên cơ thể chúng cónhiều đám thối rữa (thai chết lưu) Trường hợp đẻ muộn thì số thai chết lưu íthơn nhiều so với đẻ non song số lợn con sinh ra rất yếu, nhiều con chết trong lúc

đẻ do thời gian đẻ kéo dài

Mổ khám thấy bệnh tích tập trung ở phổi, phổi bị phù nề, viêm hoại tử vàtích nước, cắt miếng phổi bỏ vào bát nước thấy phổi chìm

Bệnh tích tập trung ở phổi Các ổ viêm thường gặp ở thuỳ đỉnh, song cũngthấy ở các thuỳ khác nhưng hầu như không xuất hiện đối xứng Các ổ viêm, áp

xe thường có màu xám đỏ, rắn, chắc Mô phổi lồi ra và có màu đỏ xám loang lổnhư tuyến ức hay như đá granito Cắt miếng phổi nhỏ bỏ vào nước thấy miếngphổi chìm, chứng tỏ phổi đã bị phù nề tích nước nặng

Tim, gan, lách có màu thẫm hơn so với bình thường, bệnh tích không đặctrưng tuỳ thuộc vào sự kế phát các bệnh khác

Những lợn bị táo bón thì ruột chứa nhiều phân cục rắn chắc, niêm mạcruột bị viêm nhưng ở những lợn bị tiêu chảy thì thành ruột mỏng trên bề mặt cóphủ một lớp nhầy màu nâu

+ Triệu chứng đường sinh sản: Trong giai đoạn đầu của dịch PRRS, có

thể thấy có hiện tượng sảy thai ở giai đoạn cuối thời kỳ mang thai và đẻ non cóthai yếu, thai chết lưu, đồng thời có thai gỗ, lợn con yếu, chết trước khi cai sữa

+ Triệu chứng đường hô hấp: Viêm phổi ở lợn con và lợn vỗ béo.

Ta có thể dùng phương pháp chẩn đoán lâm sàng nghi vấn để chẩn đoánxác định bệnh trong các trường hợp sau:

Sảy thai muộn > 20%

Chết khi sinh > 5%

Chết trước lúc cai sữa > 25%

Tuy nhiên, do tính đa dạng của bệnh nên việc chẩn đoán rất khó, dễ nhầmvới một số bệnh khác (bệnh phổi, bệnh sinh sản khác) Ngoài ra việc phân lậpvirus cũng rất khó

* Chẩn đoán huyết thanh học

+ Phương pháp xác định kháng nguyên

- Phương pháp RT-PCR phân tích mẫu máu (được lấy trong giai đoạnđầu của pha cấp tính) để xác định sự có mặt của virus, đây là phản ứng tươngđối nhạy và chính xác

- Phương pháp miễn dịch huỳnh quang (FA - Immunofluorescentantibody staining)

- Phương pháp hóa mô miễn dịch (IHC − Immuno histochemistry)

+ Phương pháp xác định kháng thể

- IPMA (Immussnoperoxidase monolayer assay): Phương pháp miễn dịch

có gắn enzym trên thảm tế bào một lớp Phân lập virus trên một số loại tế bàonhư tế bào đại thực bào phế nang lợn (PAM), tế bào MA-104, tế bào Marc-145,

tế bào CL-2621 và tế bào CRL-11171

- Phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA)

- Phản ứng trung hòa huyết thanh (SN − Serum Neutralization)

- Phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immuno sorbent Assay): Phát hiệnkháng thể 3 tuần sau khi tiếp xúc với PRRSV

Với PRRS thì dùng các loại vacxin phù hợp, nhập lợn từ cơ sở chăn nuôi sạchbệnh, lợn mới mua thì nuôi cách ly 3 − 4 tuần lễ, kiểm dịch chặt chẽ.

Khi có dịch thì phải công bố dịch Cơ sở chăn nuôi phải thống kê sốlợn ốm, lợn chết, báo cáo cho chính quyền và thú y địa phương để xử lý theohướng dẫn phòng chống bệnh tai xanh của Cục thú y

- Phòng bệnh bằng vacxin

Hiện nay trên thị trường có rất nhiều vacxin phòng PRRS như:

+ Vacxin BSL-PS 100: Vacxin PRRS nhược độc đông khô thế hệ mới có

nguồn gốc từ chủng JKL-100 thuộc dòng châu Mỹ Một liều chứa ít nhất

105.0TCID50 Có độ an toàn rất cao, vacxin an toàn dù chủng cao gấp 20 liều

+ Vacxin BSK-PS100: Vacxin vô hoạt chứa chủng virus PRRS dòng châu

Âu Một liều vacxin chứa ít nhất 107.5TCID50 Vacxin có độ an toàn rất cao, thửnghiệm đã chứng minh BSK-PS100 an toàn dù chủng cao gấp 10 liều Vacxin

an toàn với vật mang thai

+ Vacxin Amervac-PRRS: Vacxin nhược độc dạng đông khô, chứa virus

PRRS dòng châu Âu VP046BIS, mỗi liều chứa ít nhất 103.5TCID50

Hiệu quả: VP046BIS có khả năng bảo vệ tất cả các chủng châu Âu khác

và châu Mỹ Đây là chủng an toàn nhất trong các chủng châu Âu và hoàn toànkhông gây hoàn nguyên độc lực

+ Vacxin JXA1-R: Vacxin nhược độc đông khô, chứa chủng virus PRRS

cường độc tại Trung Quốc, thuộc dòng Bắc Mỹ

Theo kết luận của Cục Thú y vacxin nhược độc JXA1-R phòng bệnh cóhiệu quả rất cao Hiện nay, đây là loại vacxin duy nhất Cục Thú y có văn bảnhướng dẫn sử dụng và khuyến cáo người chăn nuôi dùng để tiêm phòng bệnh taixanh (Phòng Dịch tễ - Chi cục Thú y Bến Tre)

* Trị bệnh

Hiện chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, điều trị chủ yếu theo hướng nângcao sức đề kháng cho vật nuôi, chữa các triệu chứng lâm sàng và tập trung vào

điều trị các bệnh kế phát Vì thế nên khi phát hiện bệnh người ta có thể diệtngay, tiêu độc cơ sở có lợn bệnh, hạn chế lây lan trong đàn lợn.

2.3 Nuôi cấy virus trên môi trường tế bào Marc-145

Các mẫu bệnh phẩm gồm: Mẫu máu, phổi, hạch phổi, tim, gan, lách, thận

từ các lợn đã chẩn đoán chính xác mắc bệnh do PRRS gây ra đã được sử dụng

để phân lập virus nuôi cấy trên dòng tế bào Marc-145 Tế bào Marc-145 là tếbào thích hợp để phân lập virus PRRS, virus nhân lên nhanh trong tế bào và gâybệnh tích điển hình là các tế bào co cụm lại với nhau chồi lên khỏi đáy bình

Bệnh tích tế bào (CPE - Cyto Pathogenic Effect) xuất hiện sớm ở sau 36 giờ gây

nhiễm, sau 84 giờ đến 108 giờ gây nhiễm các tế bào đều bong tróc khỏi bề mặtnuôi cấy Lượng virus phân lập được trong tế bào liên tục tăng mạnh sau 48 giờgây nhiễm, đạt mức độ cao nhất sau 72 giờ gây nhiễm

2.4 Các kĩ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu phân tích gen và hệ gen virus.

2.4.1 Kĩ thuật PCR (Polymearase chain reaction)

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) cho phép nhân bản một đoạnDNA mong muốn từ hệ gen DNA của cơ thể sinh vật thành nhiều bản sao, đượcKary mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985 Kỹ thuật này tiếp tục đượchoàn thiện, phát triển thông qua sự phân lập và sản xuất thành công enzyme tổnghợp DNA chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus aquaticus và sự thiết kế thành côngcác máy chu kỳ nhiệt cho phép thay đổi nhanh chóng và chính xác nhiệt độ chotừng giai đoạn phản ứng và trong PCR thông thường sau 20 – 30 vòng có tớihàng triệu phân tử được copy từ một phân tử DNA (1 đoạn gen)

* Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction):

Trước khi tiến hành PCR thông thường RNA cần được chuyển thànhcDNA nhờ enzyme Reverse Transcriptase (enzym sao mã ngược)

Hình 2.6 Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR

Tuy nhiên khác với sự tổng hợp trong cơ thể, việc mở xoắn kép vốn đượcthực hiện nhờ enzyme Helicase nay được thay thế bằng xử lý nhiệt độ cao kếthợp cho từng giai đoạn phản ứng với những giai đoạn mồi được thiết kế hoàntoàn chủ động, dẫn đến sự tạo thành số lượng sản phẩm (đoạn DNA được nhân)rất lớn trong khoảng thời gian thực hiện ngắn và phục vụ hiệu quả mục đích củacon người (Lê Thanh Hòa, 2002)

* Các bước tiến hành phản ứng PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ được lặp đi lặp lại mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

Bước 1: Phân tử DNA được biến tính ở 94 - 950C trong khoảng thời gian

từ 30 giây đến 1 phút, trong quá trình biến tính DNA sợi kép được giãn xoắn

thành 2 đoạn DNA mạch đơn

Bước 2: Là giai đoạn mồi bắt cặp bổ sung với DNA sợi khuôn hay còn

gọi là giai đoạn lai Nhiệt độ để mồi bắt cặp bổ sung với DNA sợi khuôn thường

từ 400C – 700C, giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến 1 phút tuỳ thuộc vào mồi

và DNA sợi khuôn tương ứng

Bước 3: Giai đoạn tổng hợp nên đoạn DNA mới Ở giai đoạn này nhiệt độ

động để tổng hợp nên sợi ADN mới trên cơ sở mồi đã được bắt cặp bổ sung vớiDNA sợi khuôn Thời gian cho bước này có thể kéo dài từ 30 giây cho tới nhiềuphút tuỳ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại

Bước 4: Hoàn thiện sản phẩm DNA dưới dạng sợi đôi.

Có 2 phương pháp điện di acid nucleic là điện di trên gel agarose vàpolyacrylamide, khả năng phân tách của 2 phương pháp là khác nhau Thạchagar được dùng để thực hiện điện di trong máy điện di, gel polyacrylamidethường được dùng để phân tách các phân tử acid nucleic có kích thước nhỏ trong

Điện di được thực hiện bằng cách đưa các mẫu acid nucleic có trộn chấtchỉ thị màu xanh Bromphenol vào các lỗ giếng của bản thạch và đặt một điện ápvào đó Các acid nucleic ở trên thạch thường hiển thị khi nhuộm bằng EthidiumBromide và được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại (UV) Các acid nucleic hiện lên ởdạng băng màu trắng, có thể chụp ảnh và ghi nhận lại được Kích thước các băngđược so sánh với chỉ thị di truyền (DNA marker) DNA marker thường được dùngnhất là DNA của thực khuẩn thể Lamda, có chiều dài 43kb, được cắt bằngenzyme giới hạn HindIII, tạo 8 phân đoạn với các chiều dài bao gồm 23,1kb;9,4kb; 6,5kb; 4,3kb; 2,3kb; 2,0kb; 0,564kb; 0,125kb Nhờ chỉ thị này mà có thểxác định được độ dài của đoạn acid nucleic cần phân tích (Lê Thanh Hòa, 2002).

2.4.3 Kĩ thuật giải trình tự Gen

Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắpxếp các nucleotide trong phân tử DNA Giải trình tự bộ gen người, động vật và

vi sinh vật giúp chẩn đoán bệnh tật và nhiều ứng dụng trong thực tiễn sản xuất,phục vụ lợi ích con người Có 3 nhóm phương pháp giải trình gen chủ yếu:Phương pháp Maxam và Gilbert, phương pháp Dideoxy (còn gọi là phươngpháp Sanger) và phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động

a Giải trình tự Gen theo phương pháp Maxam và Gilbert

* Nguyên lý:

Năm 1977 Alan Maxam và Walter Gilbert phát minh phương pháp giảitrình tự theo phương pháp hóa học Tạo mạch khuôn DNA theo cơ sở đánh dấu

không tự xoắn lại với nhau Các mạch đơn đã đánh dấu phóng xạ được phân vàoống nghiệm khác nhau, thực hiện kỹ thuật xử lý hóa học đặc hiệu để phân cắtcác mạch đơn thành các đoạn ngắn hơn kém nhau 1 nucleotide Cuối cùng điện

di sản phẩm phân giải DNA thu được trong gel polyacrylamide Di động của cácđoạn DNA trong điện trường phụ thuộc vào độ dài của chúng nhờ đó xác địnhđược trình tự nucleotide

Phương pháp này hầu như không được sử dụng do độ chuẩn xác kém, cầnphải thực hiện nhiều lần và loại bỏ các sai sót để chọn một kết quả gần đúng nhấtnhưng nó là tiền đề cho các phương pháp giải trình tự khác.

b Phương pháp Dideoxy (còn gọi là phương pháp Sanger)

* Nguyên lý:

Xác định trình tự gen theo phương pháp dideoxy do Frederick Sanger,Smith và Coulson thực hiện năm 1977, dựa trên cơ chế tổng hợp DNA trong cơthể sinh vật F.Sanger đã giải trình tự hoàn chỉnh bộ gen của thực khuẩn thểX174 kí sinh vi khuẩn E.Coli (1977), là bộ gen đầu tiên được xác định trình tự

Trong phương pháp này tác giả sử dụng các nhân tố kết thúc đặc hiệu quátrình kéo dài DNA khi tổng hợp Nhân tố này là 2,3 dideoxynucleosidtriphosphat (ddNTP) Các phân tử này (ddNTP) có thể kết hợp vào chuỗi DNAđang tổng hợp một cách bình thường qua nhóm 5 triphosphat nhưng lại khôngtiếp tục kết hợp được với phân tử deoxynucleosid triphosphat (dNTP) tiếp theo

Như vậy khi trộn một lượng nhỏ ddNTP với 4 loại dNTP rồi tiến hànhtổng hợp DNA nhờ enzym polymerase Kết quả sẽ cho một loạt các đoạn DNAđược kết thúc một cách đặc hiệu bởi gốc dideoxynucleotide và sẽ thu được cácđoạn DNA có kích thước hơn kém nhau 1 nucleotide Chạy điện di các đoạn cóthể xác định được trình tự đoạn DNA nghiên cứu

Phương pháp giải trình tự gen do F.Sanger và cộng sự phát minh có độchính xác tương đối cao, là cơ sở của các máy giải trình tự gen tự động

c Giải trình tự Gen bằng máy tự động