Nghiên cứu nấm aspergillus sp hại hạt lúa, ngô, lạc, đậu tương ở vùng hà nội và phụ cận năm 2013

DANH MỤC ĐỒ THỊĐồ thị 4.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Aspergillus flavus và Aspergillus niger hại lúa trên môi trường PGA sau 7 ngày nuôi cấy...Error: Reference sou

Trang 1

LỜI CẢM ƠN!

Trong suốt khoảng thời gian thực hiện khóa luận này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, em còn nhận được sự quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất

từ phía các thầy cô để em hoàn thành đề tài.

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới thầy giáo PGS TS Đỗ Tấn Dũng đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian em thực hiện khóa luận này.

Em xin cảm ơn tới các thầy cô giáo và cán bộ, Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội đã quan tâm và tạo mọi điều kiện cho em thực hiện khóa luận này.

Cảm ơn các bạn, các anh, các chị và người thân đã động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt bài khóa luận.

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, Ngày 14 tháng 01 năm 2014

Sinh Viên

Lê Thị Hoài

Trang 2

MỤC LỤC

Trang 3

DANH MỤC BẢNG

Trang 4

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Aspergillus flavus

và Aspergillus niger hại lúa trên môi trường PGA sau 7 ngày nuôi cấy Error:

Reference source not found

Đồ thị 4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Aspergillus flavus

và Aspergillus niger hại ngô trên môi trường PGA sau 7 ngày nuôi cấy Error:

Đồ thị 4.3: Đồ thị thể hiện mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của

nấm Aspergillus flavus và Aspergillus niger hại lạc trên môi trường PGA sau 7

ngày nuôi cấy Error: Reference source not found

Đồ thị 4.4: Đồ thị thể hiện mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của

nấm Aspergillus flavus và Aspergillus niger hại đậu tương trên môi trường PGA

sau 7 ngày nuôi cấy Error: Reference source not found

Đồ thị 4.5: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm

Aspergillus flavus và Aspergillus niger hại lúa sau 7 ngày nuôi cấy Error:

Aspergillus flavus và Aspergillus niger hại ngô sau 7 ngày nuôi cấy Error:

Aspergillus flavus và Aspergillus niger hại lạc sau 7 ngày nuôi cấy Error:

Aspergillus flavus và Aspergillus niger hại đậu tương sau 7 ngày nuôi cấy Error:

Trang 5

Ảnh 4.5: Hạt ngô nhiễm nấm Aspergillus flavus Error: Reference source notfound

Ảnh 4.6: Cành bào tử phân sinh nấm Aspergillus flavus trên ngô Error:Reference source not found

Ảnh 4.7: Hạt ngô nhiễm nấm Aspergillus niger Error: Reference source notfound

Ảnh 4.8: Cành bào tử phân sinh nấm Aspergillus niger trên ngô.Error: Referencesource not found

Ảnh 4.9Hạt lạc nhiễm nấm Aspergillus flavus Error: Reference source not foundẢnh 4.10: Cành bào tử phân sinh nấm Aspergillus flavus trên lạc Error:Reference source not found

Ảnh 4.11: Hạt lạc nhiễm nấm Aspergillus niger Error: Reference source notfound

Ảnh 4.12: Cành bào tử phân sinh nấm Aspergillus niger trên lạc Error: Referencesource not found

Ảnh 4.13: Hạt lạc nhiễm nấm Aspergillus ficucum Error: Reference source notfound

Ảnh 4.14: Cành bào tử phân sinh nấm Aspergillus ficucum trên lạc Error:Reference source not found

Trang 6

Ảnh 4.15: Hạt đậu tương nhiễm nấm Aspergillus flavus .Error: Reference sourcenot found

Ảnh 4.16: Cành bào tử phân sinh nấm Aspergillus flavus trên đậu tương Error:Reference source not found

Ảnh 4.17: Hạt đậu tương nhiễm nấm Aspergillus niger Error: Reference sourcenot found

Ảnh 4.18: Cành bào tử phân sinh nấm Aspergillus niger trên đậu tương Error:Reference source not found

Ảnh 4.19: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Aspergillus flavushại đỗ 46Ảnh 4.20: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Aspergillus nigerhại đỗ tương trên môi trường PGA Error: Reference source not foundẢnh 4.21: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Aspergillus flavushại lúa trên môi trường PGA Error: Reference source not foundẢnh 4.22: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Aspergillus nigerhại lúa trên môi trường PGA Error: Reference source not foundẢnh 4.23: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấmAspergillus flavus và Aspergillus niger hại lạc Error: Reference source not foundẢnh 4.24: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấmAspergillus flavus và Aspergillus niger hại hạt ngô Error: Reference source notfound

Trang 7

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Trang 8

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Lúa, ngô, lạc, đậu tương là những loại cây trồng chính của ngành nôngnghiệp nước ta Chúng không chỉ là nguồn lương thực quan trọng trong đời sốngcon người mà chúng cũng là nguồn thức ăn quan trọng trong chăn nuôi gia súcgia cầm Ngoài các sản phẩm ở dạng thô đựơc xuất khẩu với số lượng lớn ranước ngoài và đưa lại nguồn thu nhập lớn góp phần nâng cao tổng GDP cho cảnước thì từ lúa, ngô, lạc, đỗ tương chúng ta còn sản xuất ra được các sản phẩmnhư bánh đa, bún phở, sữa, các loại bỏng…hiện đang rất được ưa chuộng ởtrong cũng như ngoài nước

Do ý nghĩa nhiều mặt của cây lúa, ngô, lạc, đậu tương nên chúng càngngày càng được quan tâm hơn Tuy nhiên các loại hạt này là nơi tiềm ẩn nhiềuloài nấm gây bệnh, đặc biệt là các loài nấm có nguồn gốc trong đất và truyền

qua hạt giống như Aspergillus sp, Sclerotium rolfsii chúng gây thiệt hại về

năng suất, làm chết cây con trên đồng ruộng và là nguyên nhân gây ra các bệnhnguy hiểm cho con người và vật nuôi

Trong những năm gần đây, sự gia tăng về diện tích trồng và việc áp dụngcác biện pháp kỹ thuật thâm canh làm phát sinh càng nhiều dịch hại nguy hiểm,đặc biệt là nhóm nấm gây bệnh héo rũ gây ra Nhóm nấm này phát sinh và gâyhại trong cả chu kỳ sống của cây trên đồng ruộng và trong kho bảo quản, ảnhhưởng đến chất lượng hạt giống Đây cũng là một trong những nguyên nhânchính dẫn đến sự giảm sút về năng suất và phẩm chất của hạt, ảnh hưởng đếnsức khỏe của con người

Ngoài ra, việc sản xuất lúa, ngô, lạc, đậu tương còn chịu ảnh hưởng củarất nhiều các yếu tố bất lợi như sự thay đổi khí hậu toàn cầu, sự nóng lên của vỏtrái đất, các thiên tai, dịch hại v.v nước ta cũng không phải là ngoại lệ đặc biệtvới khí hậu nhiệt đới nóng ẩm là điều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển.Các nông sản dạng hạt như lúa, ngô, lạc, đậu tương là nguồn cơ chất lý tưởng

Trang 9

cho sự phát triển của nấm mốc Nấm mốc phát triển không những làm giảm giátrị dinh dưỡng của hạt mà còn gây hại tới sức khỏe của người và động vật Đặcbiệt loài nấm gây hại nặng nề nhất trên hạt của cây trồng trong giai đoạn hiện

nay là nấm Aspergillus sp, loại nấm này không những làm ảnh hưởng đến dinh

dưỡng, sức nảy mầm của hạt mà còn sinh ra độc tố gây bệnh nghiêm trọng chosức khỏe của con người và gia súc gia cầm

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu nấm Aspergillus sp hại hạt lúa, ngô, lạc, đậu tương ở vùng Hà Nội và phụ cận năm 2013”.

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Nghiên cứu xác định thành phần và mức độ nhiễm Aspergillus sp hại hạt

lúa, ngô, đậu tương, lạc thu được tại vùng Hà Nội và phụ cận Thử nghiệm một

số biện pháp xử lý hạt lúa, ngô, lạc, đậu tương trong phòng trừ bệnh

1.2.2 Yêu cầu

- Thu thập các mẫu hạt lúa, ngô, lạc, đậu tương ở cũng Hà Nội và phụ cận

- Xác định thành phần của nấm Aspergillus sp và mức độ phổ biến của các

loài nấm này trên hạt thóc, ngô, đậu tương, lạc

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học của nấm Aspergillus sp hại hạt

lúa, ngô, lạc, đậu tương

- Nghiên cứu xử lý phòng trừ nấm Aspergillus sp hạt lúa, ngô, lạc, đậu tương bằng một số loại thuốc hóa học và nấm đối kháng Trichoderma viride.

Trang 10

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 2.1 Những nghiên cứu ngoài nước

2.1.1 Những nghiên cứu nấm Aspergillus sp hại trên lúa, ngô, lạc, đậu tương

Bệnh héo rũ gốc mốc đen (Aspergillus niger) hại lạc được báo cáo chính thức

lần đầu tiên vào năm 1926 ở Sumatra và Java D.J Allen and J.M Lenne (1998)[1],N.Kokalis Burelle (1997)[2] Thực tế tác nhân gây bệnh đã được ghi nhận từ năm

1920, gây nên biến màu vỏ và hạt lạc Theo CAB International Press (2001)[3]: ởchâu Á bệnh được ghi nhận đầu tiên tại Andhara Pradesh 1980

Theo kết quả nghiên cứu của European Mycotoxin Awareness Network

(2004)[18], H David Thurson (1998)[19]: thiệt hại về năng suất lạc đã được ghi

nhận cụ thể ở Malawi, Senegal, Sudan, Niger v.v Ở Ấn Độ, bệnh héo rũ gốc mốcđen là một trong những nhân tố quan trọng gây ra năng suất thấp với tỉ lệ nhiễmkhoảng 5-10% Nếu nhiễm trong khoảng 50 ngày sau gieo sẽ gây thiệt hại nghiêmtrọng và có thể gây chết tới 40% số cây Ở Mỹ, bệnh héo rũ gốc mốc đen ngày càngtrở nên nghiêm trọng từ đầu những năm 1970 khi việc xử lý hạt bằng thuốc có chứathủy ngân bị cấm và nó trở thành một vấn đề ở Florida những năm 1980

Phòng trừ bệnh héo rũ gốc mốc đen hại lạc gặp rất nhiều khó khăn do nấmAs.niger là nấm bệnh hại hạt nhưng lại là nấm đất điển hình gây hại cây trồng.Theo kết quả nghiên cứu của Dharmaputra (2001)[6]: nấm As.niger có mặt100% số mẫu đất đem kiểm tra

Trong hệ thống các biện pháp phòng trừ bệnh héo rũ gốc mốc đen, biện phápdùng thuốc hóa học để xử lý hạt giống là biện pháp hữu hiệu nhất Theo những kếtquả của Amanda Huber (2002)[7]: bệnh héo rũ gốc mốc đen xuất hiện nhiều hơntrên hạt không xử lý so với hạt có xử lý Các kết luận của CAB International Press2001[3]; N Kokalis Burelle, D.M Porter, R Rodriguezz K.Bana, D.H Smith,P.Subrahmanyam eds (1997)[2]; U.S Environmental Protection Agency (1997)[7]đều cho rằng: dùng thuốc trừ nấm trên hạt có thể phòng trừ bệnh héo rũ gốc mốcđen hiệu quả nếu áp dụng đúng kỹ thuật khi xử lý hạt giống

Trang 11

Theo kết quả nghiên cứu của CAB International Press (2001)[3], D.J.Allen and J.M Lenne (1998)[1] : nhóm thuốc hóa học dùng xử lý hạt giốngkhuyến cáo nên dùng và thực tế đang được dùng hiện nay là thuốc Thiram,Carbendazim, hợp chất chứa hoạt chất benomyl và hỗn hợp của một vài loạitrong chúng Theo CAB International Press (2001)[3]: xử lý hạt bằng thuốcThiram thể hiện hiệu quả nhất, hỗn hợp thuốc Carbendazin trộn với thuốcThiram sử dụng ngay hoặc trong khoảng 20 ngày trước gieo phòng trừ nấm

As.niger rất hiệu quả trên hạt.

Theo Christensen (1990) các nấm mốc trong kho bảo quản lúa gồm 12

loài Aspergillus, trong đó có năm loài phổ biến Một số loài Penicillium, các loài riêng lẻ của Sporendonema và một số loài nấm men cũng có thể có ở giai đoạn

này Những loài này có khả năng phát triển ở các hạt lương thực có độ ẩm cânbằng với độ ẩm tương đối 70% - 90%.Các nấm mốc bảo quản phát triển nhanhtrên hạt ở khoảng 300 – 320C và tốc độ phát triển của chúng giảm khi nhiệt độ

giảm Một vài chủng của nhóm As.glaucus phát triển chậm ở nhiệt độ 100

C-150C Một vài loài Penicillium yêu cầu độ ẩm cao hơn Một vài loài Aspergillus

đề kháng với khô cạn, nó có thể phát triển ở vài độ dưới điểm đóng băng

Bệnh trên hạt ngô đã được các nước nghiên cứu từ nhiều năm nay theoDenis Mc.Gee (1998) trên hạt ngô có bệnh héo rũ gốc mốc đen rất quan trọng.Hiện nay 50 nước trên thế giới hạn chế nhập khẩu ngô từ các nước đã ghi nhận

có bệnh này (Annon,1983) Những bệnh này được phòng chống bằng nhiều cáchnhư chọn giống chống chịu, xử lý hạt giống, luân canh cây trồng tuy nhiênbiện pháp mang lại hiệu quả cao nhất vẫn là xử lý hạt

2.1.2 Những nghiên cứu chung về Aspergillus sp

Năm 1809, Link mô tả loài Aspergillus glaucus trên tiêu bản mẫu cây khô

Năm 1850, De Bary phát hiện giai đoạn bào tử trần của Euritium

herbariorum chính là Aspergillus flavus.

Trang 12

Đến cuối thế kỉ 19, nhiều công trình nghiên cứu cho biết sản phẩm lên

men của 1số loài thuộc Aspergillus sp là các acid hữu cơ như acid oxalic, và do

đó Aspergillus sp được bắt đầu chú ý nghiên cứu về nhiều mặt: sinh hóa, lên

men, phân loại học

Năm 1901, Wehmer đã có một chuyên luận về chi Aspergillus.

Nấm Aspergillus sp là một trong những nấm lâu đời nhất Đến năm 1926,

đã trở thành nhóm nấm mốc nổi tiếng và được nghiên cứu nhiều nhất Nấm

Aspergillus sp có thể lên đến 200 loài, trong đó có khoản 20 loài gây hại cho con

người

Năm 1926, Thom và Church đã nghiên cứu phân loại các loài đã được mô

tả của chi Aspergillus và đề nghị chấp nhận 69 tên loài và thứ trong tổng số 350

loài đã được tả và hai ông đã sắp xếp 69 tên loài đó vào 11 nhóm

Năm 1945, chuyên luận thứ hai của Thom và Raper ghi nhận chi

Aspergillus gồm 80 loài và 10 thứ, 80 loài này được tập hợp trong 14 nhóm.

Năm 1965, Raper và Fennell đã chấp nhận và mô tả được 132 loài và 18thứ, tập hợp trong 18 nhóm

Nấm Aspergillus sp có dạng hình sợi, phân nhánh, có vách ngăn, không

màu, màu nhạt hoặc trở nên nâu, nâu nhạt ở một số vùng nhất định của khuẩn lạc

Nấm Aspergillus sp rất đặc biệt do chúng có hệ bào tử phân sinh Bào tử

phát triển từ thành tế bào rất dày bên trong hệ sợi nấm gọi là tế bào chân Bộmáy mang bào tử trần được phát triển từ một tế bào có đường kính lớn hơn,màng dày hơn so với các tế bào lân cận của sợi nấm Giá bào tử trần phát triển

từ tế bào chân như là một nhánh của sợi nấm, giá bào tử thường mọc gần thẳnggóc với trục của tế bào chân và thường hướng lên trên bề mặt cơ chất, giá bào tửtrần không có nhánh, ít hoặc không có vách ngăn ngang, có phần đỉnh phù tothành bọng hình chùy, hình elip, hình bán nguyệt hoặc hình cầu Bọng hữu thụnày mang các thể bình Các thể bình này hoặc song song hoặc tập hợp thànhcụm ở phần đỉnh bọng hoặc xếp thành tia sát nhau trên toàn bộ bề mặt bọng Thể

Trang 13

bình có thể có một hoặc hai tầng Các bào tử trần tạo thành xếp nối tiếp nhautrong miệng thể bình, tạo thành chuỗi hướng gốc, không phân nhánh Bào tửtrần không ngăn vách, hình dạng, kích thước, màu sắc, dấu vết ở mặt ngoài thayđổi tùy từng loài Tất cả các bào tử trần được tạo thành từ các thể bình của mộtbọng đính giả hợp thành khối bào tử trần đỉnh bọng (conidial head).

Nấm Aspergillus sp sinh sản bằng hình thức vô tính đó là cách sinh sản

mẩu sợi – một đoạn sợi nấm rơi vào cơ chất gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển

hệ sợi nấm mới Ngoài ra, còn sinh sản bằng bào tử đính, đây là hình thức sinhsản phổ biến ở nấm mốc Khi đó các sợi nấm hình thành một dạng tế bào đặcbiệt hình chai và đầu các tế bào này sinh ra các bào tử gọi là bào tử phân sinh,màu sắc của các bào tử đặc trưng cho nấm mốc ở tuổi trưởng thành

Sự gây thương tổn của côn trùng cho ngô ở ngoài đồng cũng có thể đi

cùng hoặc tiếp theo sự nhiễm Aspergillus flavus và sự tạo aflatoxin trước thu

hoạch Theo ước tính của tổ chức Nông lương quốc tế (FAO) thì có khoảng 25%nông sản của thế giới chịu ảnh hưởng nghiêm trọng bởi mycotoxin, chủ yếu làaflatoxin Aflatoxin đã làm thiệt hại cho ngành trồng trọt và chăn nuôi rất lớn.Mặc dù aflatoxin được tìm thấy trong nhiều loại lương thực, thực phẩm khácnhau nhưng hầu hết sự nhiễm tập trung ở lạc, các hạt có dầu khác như bông,ngô, và các sản phẩm được chế biến từ chúng Hạt dẻ Braxin là thường nhiễmnhiều nhất Bên cạnh đó, lúa mạch ở Ấn Độ cũng bị nhiễm aflatoxin

Một số loài nấm mốc trong bảo quản như Aspergillus, Penicillium, không

những làm biến màu hạt mà còn sản sinh ra độc tố (Lizuka, 1958) Nhiều nghiêncứu cho rằng nấm trên hạt không những gây thiệt hại trên hạt lúa mà chúng còn

là nguồn lây nhiễm trên đồng ruộng và sự thiệt hại của chúng gây ra là rất lớn

như nấm Pyricularia oryzae, nấm Bipolaris oryzae, nấm Alternaria padwickii.

Nấm gây bệnh hại có thể phát triển và gây hại rất nhanh chóng trên cácloài cây trồng ở mọi giai đoạn, mọi nơi, mọi lúc Trên hạt, một số nấm gây bệnhphá huỷ axit béo, vitamin và tạo ra các hợp chất hoá học có thể gây nguy hại tới

Trang 14

Ocấy, đất mùn, hệ rễ cà chua, hoặc hệ rễ lúa mì Người ta còn coi nó là có thểnhanh chóng xâm nhập lại đất đã khử trùng bằng hơi nước Đất đai vùng nhiệtđới chứa nhiều loài này hơn nhiều so với đất đai vùng ôn đới Nó thường gặptrên lúa mì, bột, trên các chế phẩm bột sống, trong bánh mì.

Ngô gạo cũng như các sản phẩm từ ngô gạo thường chứa loài này Nó córất nhiều trên sợi bong và nhất là trên hạt bông, nó xâm nhập vào hạt qua cácđiểm hợp hoặc nhờ những chỗ hủy hoại do côn trùng gây ra… Ngoài ra người tacòn thấy nó trên hạt và khô dầu tương, cùi dừa, sắn, nhân hạt ca cao, quả cà phê,quả hồ đào Brazin, thuốc lá, hạt lúa miến, hạt hướng dương, hạt thông, kê, ớt,hạt tiêu đỏ, củ cải đường, quả lê, giăm bông, dồi thịt và nhiều thức ăn khác… Sự

có mặt của các loài này trong các thức ăn phức hợp của gia súc, ngay khi nuôikhông có ngô, lạc, trên cỏ khô gia súc cũng vậy Nếu có điều kiện thuận lợi, nósinh sôi nảy nở rất nhiều, trên lúa mì tồn trữ trong kho kín có độ ẩm 15,2% đến17% bào tử của nó chiếm từ 50-100% tổng số bào tử có mặt, nhiều đến nỗi trênmặt kho đóng vón lại thành một lớp vỏ cứng sâu tới 0.6 cm Nó cũng thường cómặt trên ngô bẹ khi độ ẩm vượt quá 15.5%

2.1.3 Nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh học của nấm As Niger

2.1.3.1 Phân bố và phạm vi kí chủ của Aspergillus flavus

Nấm As flavus có ở khắp mọi nơi: dưới đất, trên các chất hữu cơ, và các

loại hạt nhất là cá hạt có dầu Từ lâu người ta đã phát hiện sự có mặt của nó ởdưới đất, dù là trong rừng, ở vùng than bùn, vùng đất sa mạc Sahara, hoặc trongđất cày cấy, đất mùn, hệ rễ cà chua, hoặc hệ rễ lúa mì Người ta còn coi nó là cóthể nhanh chóng xâm nhập lại đất đã khử trùng bằng hơi nước Đất đai vùngnhiệt đới chứa nhiều loài này hơn nhiều so với đất đai vùng ôn đới Nó thườnggặp trên lúa mì, bột, trên các chế phẩm bột sống, trong bánh mì

Ngô gạo cũng như các sản phẩm từ ngô gạo thường chứa loài này Nó córất nhiều trên sợi bong và nhất là trên hạt bông, nó xâm nhập vào hạt qua cácđiểm hợp hoặc nhờ những chỗ hủy hoại do côn trùng gây ra… Ngoài ra người ta

Trang 15

còn thấy nó trên hạt và khô dầu tương, cùi dừa, sắn, nhân hạt ca cao, quả cà phê,quả hồ đào Brazin, thuốc lá, hạt lúa miến, hạt hướng dương, hạt thông, kê, ớt,hạt tiêu đỏ, củ cải đường, quả lê, giăm bông, dồi thịt và nhiều thức ăn khác… Sự

có mặt của các loài này trong các thức ăn phức hợp của gia súc, ngay khi nuôikhông có ngô, lạc, trên cỏ khô gia súc cũng vậy Nếu có điều kiện thuận lợi, nósinh sôi nảy nở rất nhiều, trên lúa mì tồn trữ trong kho kín có độ ẩm 15,2% đến17% bào tử của nó chiếm từ 50-100% tổng số bào tử có mặt, nhiều đến nỗi trênmặt kho đóng vón lại thành một lớp vỏ cứng sâu tới 0.6 cm Nó cũng thường cómặt trên ngô bẹ khi độ ẩm vượt quá 15.5%

2.1.3.2 Đặc điểm sinh học của nấm As flavus

Không giống với hầu hết các loại nấm, As flavus yêu ưa điều kiện khô

nóng Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là 370C, nhưng chúng dễ dàng phát triển

ở nhiệt độ 25- 420C nhưng ở nhiệt độ 120C chúng đã bắt đầu phát triển và dạt tớihạn ở nhiệt độ 480C Nhiệt độ tối ưu cao góp phần nâng cao khả năng gây bệnhcủa chúng đối với con người

2.1.3.3 Đặc điểm phát sinh phát triển của nấm As flavus

Bào tử của nấm As flavus có khả năng phát tán trong không khí, trong nước,

trong đất Đặc biệt khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát sinh phát triển trênlương thực, thực phẩm, hoa quả và thậm chí còn gây hại một số loài cây trồng Vìphạm vi kí chủ rộng, khả năng phát tán rất lớn nên phòng trừ nấm hại này thường

rất khó khăn Nấm As flavus có thể kí sinh, gây hại các loại lương thực, thực phẩm

như: lúa, ngô, sắn, trên một số loại hạt làm thực phẩm như: đỗ tương, lạc, vừng ,trên thực phẩm như: các sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, lạc, vừng, đậu đỗ và thậmchí trên hoa quả tươi bị dập như: thanh long, nhãn, xoài, vải Trong quá trình xâmnhiễm, sinh trưởng phát triển, chúng tiết ra độc tố Aflatoxin

2.1.3.4 Đặc điểm hình thái của nấm As flavus

Loài Aspergillus flavus có màu vàng hơi lục, có dạng ít nhiều vón cục của

tán Ở đỉnh các cuống bào tử đính mọc thẳng đứng có vách sần sùi, hình thành

Trang 16

những đầu mang bào tử đính có dạng gần hình cầu đến thuôn dài Các thể chaihoặc đính trực tiếp vào đầu mang bào tử đính (thể bình một lớp) hoặc qua mộtlớp thể bình trung gian( thể bình hai lớp) đôi khi cả hai kiểu đồng thời tồn tại.Các bào tử có kích thước khá lớn (đường kính từ 5-7µm) hình cầu màu vàng nâu

đến hơi lục, hơi sần sùi Đôi khi người ta coi As flavus là những loài nấm có

cuống bào tử đính xù xì và hai lớp thể bình

2.1.4 Nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh học của nấm As niger

2.1.4.1 Phân bố và phạm vi kí chủ

Nấm As niger phân bố rộng khắp thế giới Theo Compendium of Crop

Protection 2001[3], R.J Hillocks and J.M Waller, S.J Kolte (1997)[5]: nó xuấthiện ở trên 100 nước thuộc khắp các châu lục, đặc biệt là ở Australia, Iran, Ấn

Độ, Sudan, Mỹ, v.v

Phạm vi kí chủ: nấm As.niger gây hại trên rất nhiều họ thực vật trong đó

khoảng trên 90 cây trồng và trên 11 kí chủ dại Kí chủ chính trên khoảng 10 họthực vật trên nhiều cây trồng trong đó đáng chú ý nhất phải kể đến lạc, ngô,hành tỏi, xoài, đậu đỗ, điều v.v

2.1.4.2 Đặc điểm sinh học của nấm As.niger

Theo European Mycotoxin Awareness Network (2004)[8], H David

Thurson (1998)[9] nhận định: nấm As.niger không phổ biến ở vùng khí hậu ôn

đới, bào tử của nó có nhiều trông không khí ở những vùng nóng như Ấn Độ.Theo Compendium of Crop Protection 2001[3]: sự gia tăng mầm bệnh nấm

As.niger khi có mưa kéo dài do sự tập trung bào tử nấm tăng trong thời kì khô

nóng và bị rửa trôi xuống theo nước mưa, tuy nhiên sức sống của mầm bệnh sẽ

giảm khi lượng mưa tăng Khi mầm bệnh trong không khí của nấm As.niger tiếp

xúc được với tán cây, tế bào cây cũng có thể bị nhiễm nếu điều kiện phù hợpxuất hiện như tế bào bị tổn thương, nhiệt độ và độ ẩm cao

Dù nước không bắt buộc cho sự nảy mầm của bào tử nấm As.niger nhưng

độ ẩm tới hạn là cần thiết Độ ẩm yêu cầu cho bào tử nảy mầm thay đổi theo

Trang 17

nhiệt độ nhưng độ ẩm thích hợp cho bào tử nảy mầm là 93% và nhiệt độ dưới

400C Nếu độ ẩm 100% thì sự nảy mầm thích hợp nhất ở 300C khi bào tử bắtđầu nảy mầm, chúng đặc biệt mẫn cảm với sự thay đổi sinh thái đặc biệt là yếu

tố nhiệt độ Tỷ lệ bào tử nảy mầm là rất quan trọng cho sự xâm nhiễm của bệnhlên cây sau này Vì vậy, theo D.J Allen and J.M Lenne (1998)[1], R.J Hillocksand J.M Waller, S.J Kolte (1997)[5]: ở những vùng khí hậu nóng ẩm như vùngnhiệt đới và cận nhiệt đới là thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử hơn là nhữngvùng khí hậu ôn đới

2.1.4.3 Đặc điểm phát sinh phát triển của nấm As niger

Nấm As niger phân bố rộng khắp trên thế giới Tốc độ sinh trưởng của

As niger nhanh, sự phát triển và hình thành bào tử của nấm thích hợp trong điều

kiện nóng ẩm do đó khi gặp điều kiện thuận lợi chỉ một lượng nhỏ nguồn lâynhiễm cũng có thể phát triển sự gây nhiễm nghiêm trọng Theo N Kokalis-Burelle, D M Porter, R Rodr›guez -K Bana, D H Smith,

P.Subrahmanyameds (1997)[2], R.J Hillocks and J.M Waller, S.J Kolte

(1997)[5]: mầm bệnh của As niger được tìm thấy ở đất ẩm nhiều hơn là ở đất

khô và nó có khả năng chịu được điều kiện đất có độ ẩm thấp Theo kết quả củaPrecision Agriculture (2004)[10]: đất ướt dễ dàng cho nấm gây thối hạt ở cuối

vụ trong khi điều kiện đất khô, khí hậu nóng tạo điều kiện thuận lợi cho thốimầm và thối sau giai đoạn mầm

Nấm As.niger là nấm gây hại trên hạt Theo Compendium of Crop Protection 2001[3]: As niger đã được tìm thấy trên rất nhiều loại hạt cây trồng

như ngô, lúa, cao lương, v.v nhưng được ghi nhận nhiều nhất là trên hạt lạc và

họ hành tỏi

2.1.4.4 Đặc điểm hình thái của nấm As niger

Theo D.J Allen and J.M Lenne (1998)[1]; N Kokalis-Burelle, D M.Porter, R Rodr›guez -K Bana, D H Smith, P.Subrahmanyam eds (1997)[2]:

đặc trưng của nấm As niger có đầu của bào tử phân sinh hình cầu đến hình tỏa

Trang 18

xòe dạng cột đường kính từ 700-800µ Cuống bào tử phân sinh thay đổi, đođược từ 1.5-1.3mm × 15-20µm Đầu cành phình to hình cầu, vách dày màu hơinâu có khả năng sinh sản trên toàn bộ bề mặt, đường kính từ 45-75µm tuy nhiên

có khi nhỏ hơn hoặc đạt tới 80µm Cuống đính bào tử có hai loại: nguyên sinh

và thứ sinh

Dạng nguyên sinh đạt kích thước từ 20-3 × 5-6µm khi non, đạt tới 60-70 × 8-10

µm khi thành thục Dạng thứ sinh đồng nhất hơn, kích thước đo được từ 7-10 ×3.0-3.5µm Khi nuôi cây trên môi trường Malt agar sinh ra tán nấm xốp màutrắng đến hơi vàng sau đó phát triển nhanh thành màu đen hay nâu do bào tửhình thành

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về bệnh hại hạt giống và khả năng truyềnlan của chúng hiện nay còn rất ít Một số nghiên cứu đi sâu về bệnh nấm trên hạtgiống lạc nhưng chỉ mới tập trung vào một số loài có khả năng gây nguy hiểmcho cả người và động vật

Kết quả điều tra của Viện BVTV năm 1967-1968[13] đã phát hiện loài

Aspergillus niger Tiegh Roger và tới năm 1977-1978[14] phát hiện ra loài Aspergillus flavus Link Roger thuộc chi Aspergillus sp gây bệnh cho cây trồng

ở Việt Nam

Ở nước ta từ những năm 1970 Nguyễn Phùng Tiến [11]và cộng sự đãnghiên cứu mức nhiễm nấm mốc trên thóc ở kho bảo quản lương thực miền BắcViệt Nam và một số lương thực như đậu, đỗ, lạc…Đặng Hồng Miên[8] cũng đãnghiên cứu sự nhiễm nấm mốc aflatoxin trên lạc

Ở Việt Nam, Nguyễn Phùng Tiến và cộng sự (1983)[15] đã nghiên cứu mức

độ nhiễm mốc trên ngô, kết quả là 38 mẫu bảo quản trong kho lương thực của thành

phố Thanh Hóa đã nhiễm nấm mốc thuộc các chi sau: Aspergillus, Cladosporium,

Penillium, Sporotrichuro, Saccharomycess, Trichooderme viride, Geotrichum Tuy

nhiên chưa có số liệu về mức nhiễm Mycotoxin trong công trình này

Trang 19

Đậu Ngọc Hào và cộng sự (1991) đã nghiên cứu mức nhiễm mốc vàaflatoxin trên ngô của các tỉnh Sơn La và Thanh Hóa Kết quả phân tích của 24

mẫu ngô hạt và 24 mẫu ngô bột cho thấy các mẫu này đã nhiễm nhiễm A.flavus với tỷ lệ từ 50-80% Các loài như Aspergillus glaucus, Aspergillus candidus cũng nhiễm với tỷ lệ khá cao Loài Aspergillus ochraceus đã phát hiện thấy ở tỷ

lệ thấp Các loài của chi Fusarium đã nhiễm với tỷ lệ 15% Kết quả nghiên cứu

mức nhiễm aflatoxin ở các mẫu ngô trên đã cho thấy là 33% mẫu ngô hạt đãnhiễm aflatoxin B1 từ 10- 40 ppb, 8.3% số mẫu nhiễm aflatoxin B2 từ 10 - 20ppb, 72% số mẫu ngô bột đã nhiễm aflatoxin B1 từ 25 – 250 ppb, 9.5% số mẫunhiễm aflatoxin B2 từ 10-20 ppb

Nguyễn Thụy Châu và cộng sự (1995)[1][7] đã nghiên cứu mức độ nhiễmnấm mốc và aflatoxin trên nông sản của Việt Nam Mức độ nhiễm aflatoxin trênngô và gạo ở một số địa phương cho thấy tần suất nhiễm aflatoxin trên ngô ởmiền Nam và miền Bắc Việt Nam là cao từ 73,3% - 95,8% trong đó hàm lượngaflatoxin trung bình cao nhất là 63,8ppb và hàm lượng aflatoxin trung bình thấpnhất là 16,25ppb đối với các tỉnh khác nhau

Ở Việt Nam qua kết quả điều tra từ năm 1995 đến nay cho thấy tất cả cácnấm gây bệnh và hầu hết các bệnh gây hại đến năng suất chất lượng lúa trênđồng ruộng đều là các bệnh có khả năng tồn tại và truyền qua hạt giống Nấm

A.niger và As.flavus gây hại phổ biến trên hạt giống lúa, ngô, lạc, đậu đỗ …

không những làm ảnh hưởng trực tiếp đến sức nảy mầm mà còn sinh ra độc tốaflatoxin gây ảnh hưởng nguy hại đến đời sống con người

Nguyễn Thụy Châu và cộng sự (1997)[2] đã nghiên cứu công nghệ khửnhiễm aflatoxin trên ngô, lạc bằng một số hóa chất như NH3, foocmanđehit,Ca(OH)2 kết quả cho thấy rằng NH3 và Ca(OH)2 có tác dụng khử rõ rệt aflatoxin

B1 trên ngô và cho hiệu quả đạt 90%

Theo Đường Hồng Dật (1997)[3] khi nuôi cấy nấm As.niger trên môi trường

PGA cho tốc độ phát triển nhanh, đường kính nấm sau cấy 72 h là 25 – 30 mm, bào

tử phân sinh hình tròn không màu đến màu đen nâu, bề mặt ghồ ghề

Trang 20

Một số công trình của Đậu Ngọc Hào về sự nhiễm nấm mốc và aflatoxintrên thức ăn gia súc và các biện pháp khử độc tố aflatoxin B1 bằng NH4OH cũng

đã được nghiên cứu và công bố

Trong những số nấm bệnh trên thóc gạo có những loài nấm Aspergillus

sp là những loài nguy hiểm, chúng gây hại và tồn tại trên nông sản và các sản

phẩm chế biến từ nông sản, sinh độc tố gây nguy hiểm đến sức khỏe người và

nhiều gia súc gia cầm Theo Trần Minh Tường: nhóm các loài nấm Aspergillus

sp còn là một trong những loài nấm gây viêm xoang mũi ở người Trên thóc

gạo, ngô, lạc sau thu hoạch, trong những điều kiện nhất định một số loài nấm

Aspergillus flavus, Aspergillus niger… có khả năng sản sinh ra độc tố cho người

và gia súc, gia cầm Đặc biệt độc tố afatoxin do As flavus sản sinh là một trong

những chất gây ung thư ở người Những độc tố này không tan trong dầu, chúngnằm lại trong khô dầu Nếu dùng khô dầu này làm thức ăn cho gia súc thì tùylượng mà gia súc có thế ngộ độc, chậm phát triển thậm chí có thể chết (ĐặngTrần Phú và ctv, 1997)

Nấm As.niger là nấm đất phổ biến cũng là nấm hạt trên hạt điển hình Theo Lê Lương Tề (1977)[10] bệnh do nấm As.niger gây ra trên lạc được gọi là

bệnh héo rũ gốc mốc đen, một số tác giả khác thì gọi là bệnh thối đen cổ rễ hay bệnh

thối cổ rễ Là nấm hoại sinh, nấm As niger ngoài tồn tại trên củ, hạt, trong đất, trên

tàn dư cây trồng và còn tồn tại cả trong điều kiện không khí nhiều bụi bặm

Theo kết quả giám định bệnh hại hạt giống nhập nội tại Trung tâm kiểmdịch thực vật sau nhập khẩu I năm 1999 [12] tần suất xuất hiện của các loài nấm

Aspergillus sp trên các mẫu hạt giống lạc đã kiểm tra là 100%.

Theo Ngô Bích Hảo, 2004[6]: Giám định nấm As niger trên hạt giống lạc

sau 7 ngày đặt ẩm thấy nấm phát triển ở từng phần hoặc trên toàn bộ hạt Cành bào

tử phân sinh không màu, mọc đơn hoặc tập trung thành từng nhóm nhỏ, trên đỉnhcành phình to hình tròn mang cụm bào tử đâm tia tròn, xốp màu nâu hoặc màu đen.Bào tử phân sinh có đường kính 4 -5 µm, hình cầu, bề mặt sần sùi màu nâu tối

Trang 21

Kết quả nghiên cứu của Ngô Bích Hảo (2004)[6] về bệnh hại hạt cho biếttrong một số loại hạt giống như ngô, lạc, đậu tương thì tỉ lệ hạt giống lạc nhiễm

As flavus là cao nhất với 30.12% trong khi tác giả Nguyễn Thị Ly, Phan Bích

Thu (1993)[9]đã xác định có khoảng 33% - 85% số mẫu lạc kiểm tra có khảnăng sản sinh độc tố aflatoxin Kết quả điều tra thành phần bệnh chết héo lạc ởmiền Bắc Việt Nam đã xác định được 10 loài vi sinh vật gây bệnh héo, trong đó

có 2 loài nấm gây bệnh xuất hiện phổ biến thuộc nhóm loài Aspergilllus sp là

As flavus và As niger.

Trang 22

PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, địa điểm, vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Các mẫu hạt lúa thương phẩm, các mẫu ngô giống, lạc giống và hạtgiống đậu tương thu thập được ở vùng Hà Nội và phụ cận

- Nấm Aspergilllus sp gây hại trên hạt lúa, ngô, lạc, đậu tương.

3.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Đề tài được thực hiện tại phòng thực tập bộ môn Bệnh cây - Trường Đạihọc Nông nghiệp Hà Nội

- Điều tra thu thập các mẫu hạt lúa, ngô, lạc, đậu tương ở vùng Hà Nội vàphụ cận

- Thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu là tháng 7/2013 đến tháng12/2013

3.1.3 Vật liệu nghiên cứu

- Các loại hạt lúa, ngô, lạc, đậu tương ở vùng Hà Nội và phụ cận

- Mẫu nấm bệnh Aspergillus sp gây hại trên hạt lúa, ngô, lạc, đậu tương.

- Hóa chất: Agar, khoai tây, đường glucose, cồn, nước cất, javel

- Giấy đặt ẩm

- Thuốc hóa học: Daconil 75WP, Vicarben 50WP, Trichoderma viride

- Dụng cụ thí nghiệm: Máy đo độ ẩm, kính hiển vi, tủ sấy, nồi hấp, tủđịnh ôn, tủ lạnh, buồng cấy vô trùng, lọ thủy tinh, đĩa petri , lamen, đĩa peptrinhựa, đèn cồn…

- Môi trường phân lập nuôi cấy nấm: Môi trường PGA, PCA, WA để nuôi cấy,phân lập mẫu, làm thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường, nhiệt độ,… đến nấm

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Thu mẫu, nghiên cứu xác định thành phần và mức độ phổ biến của cácloài nấm hại trên hạt lúa, ngô, lạc, đậu tương ở vùng Hà Nội và phụ cận

Trang 23

- Điều tra xác định tình hình nhiễm nấm Aspergillus sp.trên các mẫu hạt

thu được

-Đánh giá thành phần loài nấm Aspergillus sp.trên các mẫu hạt thu được.

- Phân lập và nuôi cấy nấm Aspergillus sp.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, nhiệt độ đến sự phát

triển của nấm Aspergillus sp.

- Nghiên cứu xử lý phòng trừ nấm Aspergillus sp hạt lúa, ngô, lạc, đậu tương bằng nước Javel, thuốc hóa học và nấm đối kháng T viride.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp thu thập mẫu hạt

Lấy mẫu theo vùng sinh thái, ở mỗi vùng sẽ chọn đại diện là các tỉnh,huyện, xã Mỗi xã thu mẫu ở 3 xóm đại diện, và mỗi xóm sẽ lấy mẫu tại 5 nông

hộ, mỗi nông hộ lấy 1giống Mẫu thu được sẽ trộn theo xã, theo giống của từng

xã thành mẫu tổng hợp, lấy mẫu phân tích từ mẫu tổng hợp, mỗi mẫu phân tích

400 hạt Mẫu thu xong ghi tên giống, địa điểm và thời gian thu mẫu.Mẫu đượcgói kín và bảo quản tại tủ 40C tại phòng thực tập

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiêm

3.3.2.1 Phương pháp giám định nấm bệnh trên hạt

Sử dụng phương pháp giấy thấm:

Theo phương thức của ISTA (International Seed Testing Association, 1996)Lấy mẫu hạt đã thu thập đổ ra khay vuông, dàn đều hạt trong khay, vạch ra 5điểm chéo góc trên khay, tại 5 điểm đó ta dùng pank gắp ngẫu nhiên ra 400 hạt

+ Từ 400 hạt ta chia thành 16 phần, mỗi phần 25 hạt đối với lúa còn đốivới lạc, ngô, đỗ tương thì chia thành 40 phần, mỗi phần 10 hạt

+ Chuẩn bị đĩa petri và giấy thấm (Blotter paper) đường kính 90mm, lấy

16 đĩa/ mẫu

+ Lấy 3 tờ giấy thấm nhúng vào nước cất sao cho toàn bộ giấy thấm đượcthấm ướt đều, sau đó đặt vào hộp petri (3 tờ/ hộp)

Trang 24

+ Cách đặt hạt:

- Đối với lúa: Đặt 25 hạt/ đĩa petri, đặt thành 2 vòng Vòng ngoài 15 hạt,vòng giữa 9 hạt, và 1 hạt trung tâm của đĩa, khoảng cách giữa các hạt và cácvòng bằng nhau

- Đối với ngô, lạc, đỗ tương: Đặt 10 hạt/ đĩa petri, đặt thành 2 vòng Vòngngoài 9 hạt, vòng trong 1 hạt, khoảng cách giữa các hạt và các vòng bằng nhau.Sau khi đặt xong ghi mã số hoặc tên mẫu giống, ngày đặt và ngày kiểm tra trên mặtđĩa Để mẫu hạt trong điều kiện nhiệt độ thích hợp 250C, thời gian 6 – 7 ngày

+ Sau 7 ngày đem kiểm tra hạt dưới kính hiển vi soi nổi và đếm tổng số

hạt bị nhiễm bệnh của nấm Aspergillus niger và Aspergillus flavus, tính % số hạt

bị nhiễm từng loại Aspergillus.

3.3.2.2 Phương chế tạo môi trường nhân tạo nuôi cấy nấm

* Phương phấp chế tạo môi trường nhân tạo nuôi cấy nấm

Chuẩn bị các môi trường nuôi cấy nấm bao gồm môi trường: PGA, PCA,WA

- Môi trường PGA (Potato Glucose Agar)

- Môi trường WA (Water agar )

+ Thành phần: Agar : 20g

+ Nước cất : 1000ml

Trang 25

+ Điều chế : Cho 1000ml nước cất đun sôi sau đó cho agar vào đun đénkhi sôi + Sau đó đem hấp ở 1210C (1.5 atm) trong vòng 45 phút Để nguội trong

550C – 600C trước khi rót

- Môi trường PCA:

+ Khoai tây : 20 gram

+ Cà rốt : 20 gram

+ Agar : 20 gram

+ Nước cất: 1000 ml

3.3.2.3 Phương pháp phân lập nấm Aspergillus sp

Nhằm xác định các loài Aspergillus sp hiện diện trên lúa, ngô, lạc, đậu

tương tách riêng các loài nấm mốc từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuầnchủng, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình quan sát hình thái bào tử phân sinhcủa nấm, nhờ đó giúp cho việc định tên chúng chính xác hơn

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Môi trường PGA và WA được chuẩn bị, thanh trùng dụng cụ các đĩa petriđặt tự nhiên trên mặt phẳng ngang

ngờ là Aspergillus sp (dựa trên hình thái và màu sắc bào tử nấm mốc) cấy trên

môi trường PGA trong đĩa petri

Thao tác cấy được thực hiện nhiều lần cho đến khi mẫu hoàn toàn thuầnchủng, không có lẫn sợi nấm lạ

Quan sát bằng kính hiển vi soi nổi và quan sát qua kính hiển vi điện tử sau

đó đưa ra nhận xét về đặc điểm hình thái, màu sắc sợi nấm Khi đã có nấm, tảnnấm và bào tử phân sinh, cành bào tử và các cấu trúc của nấm Khi đã có nấm

Trang 26

thuần khiết tiến hành các thí nghiệm trong phòng.

Tiến hành định danh các loài Aspergillus sp đã phân lập được.

Dựa trên kết quả thu nhận được tra khoa phân loại, xác định tên loàitương ứng

3.3.2.4 Đánh giá hiệu lực phòng trừ nấm Aspergillus sp hại hạt lúa, ngô, lạc,

đậu tương khi xử lý bằng nước javel 3%

+ Trên lúa (hạt thương phẩm) các giống: BC15, TK97, nếp tẻ, nếp Hà Nội.Thí nghiệm gồm 2 công thức, mỗi công thức 400 hạt/ 1giống, 100 hạt cho

1 lần nhắc lại

CT 1: đối chứng

CT 2: xử lý hạt lúa bằng nước javel 3%

Cả 2 công thức trên được tiến hành cùng thời điểm, tại cùng một địa điểm

và ở cùng nhiệt độ; thời gian ngấm là 8 phút

Sau khi ngâm xong gạt bỏ nước và dùng pank gắp hạt đặt vào các đĩapeptri nhựa

Tiến hành các bước tương tự như khi đặt ẩm

+ Trên lúa (thương phẩm): các giống BC15, TK97, nếp tẻ, nếp Hà Nội.Thí nghiệm gồm 2 công thức, mỗi công thức 400 hạt/ 1giống, 100 hạt cho

+ Trên ngô (hạt giống): các giống ngô nếp trắng, ngô nếp tím F1, ngô ngọt F1.Thí nghiệm gồm 2 công thức, mỗi công thức 400 hạt/ 1giống, 100 hạt cho

Trang 27

1 lần nhắc lại.

+ Trên lạc (hạt giống): các giống L12, L26, LD, MD7, S12

Thí nghiệm gồm 2 công thức, mỗi công thức 400 hạt/ 1giống, 100 hạt cho

+ Trên đậu tương (hạt giống): các giống DT12, DT84, DT96

Thí nghiệm gồm 2 công thức, mỗi công thức 400 hạt/ 1giống, 100 hạt cho

Trang 28

Sau khi kiểm tra dưới kính hiển vi soi nổi đếm tổng số hạt bị nhiễm nấm

As.flavus và As.niger ghi vào sổ và tính % số hạt bị nhiễm của từng loại Aspergillus sp khi xử lý hạt bằng nước javel, so sánh với khi đặt ẩm hạt bằng

nước cất

Chỉ tiêu theo dõi và phương pháp tính toán

Tổng số hạt nhiễm nấm Aspergillus sp ở mỗi công thức

TLHN (%) = x 100 Tổng số hạt ở mỗi công thức thí nghiệm

Tỷ lệ hạt nhiễm ở CTĐC – Tỷ lệ hạt nhiễm ở CTXL

HLPT (%) = x 100

Tỷ lệ hạt nhiễm ở CTĐC

3.3.2.5 Đánh giá hiệu lực phòng trừ Aspergillus sp của một số loại thuốc hóa

học, chế phẩm sinh học khi dùng xử lý trên hạt lúa, ngô, lạc, đậu tương

Chuẩn bị các thuốc: Daconil 75WP, Vicarben 50WP, Trichoderma viride

Chuẩn bị các dung dịch thuốc: Daconil 75WP 1%, Vicarben 50WP 1%, T viride 1%.

Lấy mỗi loại hạt lạc( ngô, đậu tương) Mỗi loại hạt chia làm bốn phần mỗiphần ứng với một công thức

CT1: ngâm trong nước cất làm đối chứng

CT 2: ngâm trong dung dịch Daconil 75WP 1%

CT 3: ngâm trong dung dịch Vicarben 50WP 1%

CT 4: ngâm trong dung dịch T viride

Đối với hạt ngô ngâm trong vòng 15 phút trở lại còn lạc và đỗ tương thìtối đa 10 phút Các bước tiếp theo làm giống lúc đặt ẩm

Sau khi kiểm tra đếm tổng số hạt bị nhiễm bệnh của nấm Aspergillus sp ghi vào sổ và tính % số hạt bị nhiễm từng loại Aspergillus sp và rút ra nhận xét.

Chỉ tiêu theo dõi và phương pháp tính toán

Tổng số hạt nhiễm nấm Aspergillus sp ở mỗi công thức

TLHN(%) = x 100

Trang 29

Tổng số hạt ở mỗi công thức thí nghiệm

lúa, ngô, lạc, đậu tương

Các isolate phân lập được: As flavus lúa, As flavus ngô, As flavus lạc,

As flavus đậu tương, As niger lúa, As niger ngô, As niger lạc, As niger đậu

tương

Từ nguồn nấm Aspergillus sp đã thuần,cấy nấm lên môi trường PCA và

PGA để ở điều kiện nhiệt độ phòng, mỗi thí nghiệm là một isolate và nhắc lại 3lần, mỗi lần 2 đĩa

Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi sự phát triển của nấm ở trên môi trường PGA

và PCA sau 7 ngày nuôi cấy về: kích thước tản nấm, màu sắc hình dạng của

nấm Aspergillus flavus và Aspergillus niger trên môi trường.

3.3.2.7 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Aspergillus sp

Các isolate phân lập được: As flavus lúa, As flavus ngô, As flavus lạc, As.

flavus đậu tương, As niger lúa, As niger ngô, As niger lạc, As niger đậu tương.

Từ nguồn nấm Aspergillus sp đã thuần,cấy nấm lên môi trường PGA và

đặt ở 3 mức nhiệt độ 14.50C,24.50C, 28.50C Mỗi thí nghiệm là một isolate vànhắc lại 3 lần, mỗi lần 3 đĩa

Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi sự phát triển của nấm ở các ngưỡng nhiệt độkhác nhau sau 7 ngày, đo kích thước tản nấm, màu sắc và hình dạng của nấm

Aspergillus flavus và Aspergillus niger.

3.4 Công thức tính toán số liệu

Số hạt nhiễm Aspergillus sp trên mỗi giống lúa

– TLHNlúa (%) = x100

Trang 30

Tổng số hạt của mỗi giống lúa làm thí nghiệm

Số hạt nhiễm Aspergillus sp trên mỗi giống ngô

– TLHNngô (%) = x100 Tổng số hạt của mỗi giống lúa làm thí nghiệm

Số hạt nhiễm Aspergillus sp trên mỗi giống đỗ tương

–TLHNđỗ tương(%)= x 100 Tổng số hạt của mỗi giống đỗ tương làm thí nghiệm

Số hạt bị nhiễm từng loại sp trên mỗi giống lạc

– TLHNlạc (%) = x100 Tổng số hạt của mỗi giống lạc làm thí nghiệm

Trang 31

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

4.1 Nghiên cứu xác định thành phần nấm và mức độ gây hại trên hạt lúa, ngô, lạc, đậu tương ở vùng Hà Nội và phụ cận

4.4.1 Danh sách các mẫu hạt lúa, ngô, lạc, đậu tương thu thập được ở vùng

Hà Nội và phụ cận năm 2013

Các hạt nông sản từ lúa, ngô, lạc, đậu tương là nguồn lương thực có ý nghĩa

vô cùng quan trọng trong việc đảm bảo an toàn, an ninh lương thực Trong quá trìnhbảo quản dự trữ, hạt lúa, ngô, lạc, đậu tương là đối tượng cho các vi sinh vật, chuột,mọt tấn công và gây hại làm giảm năng suất cũng như chất lượng Hơn nữa, các visinh vật như nấm mốc trong bảo quản không những làm biến màu hạt mà còn có thểsản sinh ra các độc tố có thể gây ngộ độc cho con người

Để hạn chế các thiệt hại do các bệnh nấm gây ra cũng như đảm bảo antoàn vệ sinh thì việc giám định các bệnh hại hạt lúa, ngô, lạc, đậu tương trongquá trình bảo quản và đánh giá mức độ gây hại của chúng trên hạt là hết sức cầnthiết Trên cơ sở đó chúng tôi đã tiến hành thu thập mẫu hạt lúa, ngô, lạc, đậutương ở vùng Hà Nội và phụ cận theo phương pháp: Lấy mẫu theo vùng sinhthái, ở mỗi vùng sẽ chọn đại diện là các tỉnh, huyện, xã Mỗi xã thu mẫu ở 3xóm đại diện, và mỗi xóm sẽ lấy mẫu tại 5 nông hộ Mẫu nông hộ có lấy 1giống.Mẫu thu được sẽ trộn theo xã, theo giống của từng xã thành mẫu tổng hợp, lấymẫu phân tích từ mẫu tổng hợp, mỗi mẫu phân tích 400hạt Mẫu thu xong ghitên giống,mùa vụ địa điểm và thời gian thu mẫu.Mẫu được gói kín và bảo quảntại tủ 40C tại phòng thực tập

Danh sách các mẫu hạt lúa, ngô, lạc, đậu tương thu thập ở vùng Hà Nội vàphụ cận được thể hiện ở bảng 4.1 và 4.2

Trang 32

Bảng 4.1 Danh lục các mẫu hạt lúa thu thập được ở vùng Hà Nội và phụ cận.

Nếp hoa vàng Thanh Đa – Phúc Thọ - Hà Nội 07/2013Nếp TK97 Thanh Đa – Phúc Thọ - Hà Nội 07/2013

Trang 33

Bảng 4.2 Danh lục các mẫu hạt ngô, lạc, đậu tương thu thập được ở vùng

L12 Kho hạt giống - Phòng thực hành bộ môn câyCông nghiệp – Trường ĐHNN Hà Nội 07/2013

LD Kho hạt giống - Phòng thực hành bộ môn câyCông nghiệp – Trường ĐHNN Hà Nội 07/2013MD7 Kho hạt giống - Phòng thực hành bộ môn câyCông nghiệp – Trường ĐHNN Hà Nội 07/2013S12 Kho hạt giống - Phòng thực hành bộ môn câyCông nghiệp – Trường ĐHNN Hà Nội 07/2013

Đỗ

tương

DT96 Trâu Quỳ - Gia Lâm – Hà Nội 07/2013

4.1.2 Nghiên cứu xác định thành phần và mức độ phổ biến của các loài nấm hại hạt lúa ở vùng Hà Nội và phụ cận

Tiến hành kiểm tra, giám định thành phần nấm bệnh truyền qua hạt lúabằng phương pháp giấy thấm của ISTA Kết quả thu được trình bày ở bảng 4.3

Trang 34

Bảng 4.3 Thành phần và mức độ phổ biến của các loài nấm gây hại trên hạt

lúa ở vùng Hà Nội và phụ cận.

Ghi chú: +: tỷ lệ hạt nhiễm bệnh <5%

++: tỷ lệ hạt nhiễm bệnh 5– 10%

+++: Tỷ lệ hạt nhiễm bệnh 10- 25%

++++: Tỷ lệ hạt nhiễm bệnh > 25%

Từ bảng 4.3 cho ta thấy thành phần nấm hại hạt lúa khá phong phú gồm

có 6 loài nấm thuộc 3 họ, 3 bộ Trong đó có loài gây hại chính là Aspergillus

flavus Ngoài ra, các loài nấm Alternaria padwickii, Aspergillus niger cũng xuất

hiện và gây hại đáng kể trên các giống lúa Các loài nấm Curvularia lunata,

Fusarium moniliforme, Bipolaris oryzae xuất hiện ít và gây hại không đáng kể.

4.1.3 Nghiên cứu xác định thành phần và mức độ phổ biến của các loài nấm hại hạt ngô ở vùng Hà Nội và phụ cận

Tiến hành kiểm tra, giám định thành phần nấm bệnh truyền qua hạt ngôbằng phương pháp giấy thấm của ISTA Kết quả thu được trình bày ở bảng 4.4

ngô ở vùng Hà Nội và phụ cận.

Trang 35

++++: Tỷ lệ hạt nhiễm bệnh > 25%.

Từ bảng 4.4 cho ta thấy thành phần nấm hại hạt ngô gồm có 5 loài nấm

thuộc 4 họ, 4 bộ Trong đó có loài gây hại chính là Aspergillus flavus Ngoài ra, thì nấm Aspergillus niger, Rhizopus sp cũng xuất hiện và gây hại đáng kể trên hạt ngô Các loài nấm Fusarium moniliforme, Bipolaris maydis, xuất hiện ít và

gây hại không đáng kể

4.1.4 Nghiên cứu xác định thành phần và mức độ phổ biến của các loài nấm hại hạt lạc ở vùng Hà Nội và phụ cận

Tiến hành kiểm tra, giám định thành phần nấm bệnh truyền qua hạt lạcbằng phương pháp giấy thấm của ISTA Kết quả thu được trình bày ở bảng 4.5

lạc ở vùng Hà Nội và phụ cận.

Từ bảng 4.5 cho ta thấy thành phần nấm hại hạt lạc gồm có 6 loài nấm

thuộc 4 bộ Trong đó có loài gây hại chính là Aspergillus flavus và Aspergillus

niger Ngoài ra, thì nấm Fusarium oxysporum và Rhizopus sp cũng xuất hiện và

gây hại đáng kể trên hạt ngô Các loài nấm Fusarium oxysporum, Rhizoctonia

solani, Alternaria altermata xuất hiện ít và gây hại không đáng kể.

4.1.5 Nghiên cứu xác định thành phần và mức độ phổ biến của các loài nấm

Trang 36

hại hạt đậu tương ở vùng Hà Nội và phụ cận

Tiến hành kiểm tra, giám định thành phần nấm bệnh truyền qua hạt đỗ tươngbằng phương pháp giấy thấm của ISTA Kết quả thu được trình bày ở bảng 4.6

đậu tương ở vùng Hà Nội và phụ cận.

Ghi chú: +: tỷ lệ hạt nhiễm bệnh <5%

++: tỷ lệ hạt nhiễm bệnh 5– 10%

+++: Tỷ lệ hạt nhiễm bệnh 10- 25%

++++: Tỷ lệ hạt nhiễm bệnh > 25%

Từ bảng 4.6 cho ta thấy thành phần nấm hại hạt đậu tương gồm có 6 loài

nấm thuộc 4 bộ Trong đó có loài gây hại chính là Aspergillus flavus và

Aspergillus niger Ngoài ra, thì nấm Alternaria solani và Rhizoctonia solani

cũng xuất hiện và gây hại đáng kể trên hạt ngô Các loài nấm Fusarium

moniliforme, Sclerotium rolfsii xuất hiện ít và gây hại không đáng kể.

4.1.6 Mức độ nhiễm nấm Aspergillus sp trên các mẫu hạt lúa, ngô, lạc, đậu tương thu thập ở vùng Hà Nội và phụ cận

4.1.6.1 Mức độ nhiễm nấm Aspergillus sp trên các mẫu hạt lúa thu thập ở vùng

Hà Nội và phụ cận

Tiến hành kiểm tra, giám định thành phần nấm Aspergillus sp hại hạt lúa

bằng phương pháp giấy thấm của ISTA Kết quả thu được trình bày ở bảng 4.7

Bảng 4.7 Mức độ nhiễm nấm Aspergillus sp trên các mẫu hạt lúa thu thập ở

vùng Hà Nội và phụ cận.

Trang 37

Tên giống Tỉ lệ % hạt nhiễm nấm

Qua bảng 4.7 cho ta thấy, mức độ nhiễm nấm Aspergillus sp trên các

giống khác nhau là khác nhau Tất cả các mẫu hạt lúa kiểm tra đều nhiễm 2 loài

nấm là Aspergillus niger, Aspergillus flavus và mức độ gây nhiễm trên mỗi giống

là khác nhau

Nấm Aspergillus niger gây hại nặng trên giống Nếp Hoa Vàng với tỷ lệ

nhiễm 11,75%, tỷ lệ nhiễm thấp nhất là 2% trên giống Tám thơm.

Nấm Aspergillus flavus gây hại nặng trên giống TK97 với tỷ lệ nhiễm

22% và tỷ lệ nhiễm nhẹ nhất trên giống Bắc thơm với tỷ lệ 12%

4.1.6.2 Mức độ nhiễm nấm Aspergillus sp trên các mẫu hạt ngô, lạc, đậu tương

thu thập ở vùng Hà Nội và phụ cận

Tiến hành kiểm tra, giám định thành phần nấm Aspergillus sp hại hạt ngô,

lạc, đỗ tương bằng phương pháp giấy thấm của ISTA Kết quả thu được trìnhbày ở bảng 4.8

Bảng 4.8 Mức độ nhiễm nấm Aspergillus sp trên các mẫu hạt ngô, lạc, đậu

tương thu thập ở vùng Hà Nội và phụ cận.

Trang 38

tượng As flavus As niger

Qua bảng 4.8 cho ta thấy: mức độ nhiễm nấm Aspergillus sp trên các

giống khác nhau của cùng một loại cây là khác nhau

- Với ngô: Tất cả các mẫu hạt ngô kiểm tra đều nhiễm 2 loài nấm là

Aspergillus niger, Aspergillus flavus và mức độ gây nhiễm trên mỗi giống là

khác nhau Nấm Aspergillus niger gây hại nặng trên giống ngô nếp trắng với tỷ

lệ nhiễm 24,25%, tỷ lệ nhiễm thấp nhất là 20% trên giống ngô ngọt F1 Nấm

Aspergillus flavus gây hại nặng trên giống ngô ngọt F1 với tỷ lệ nhiễm 45,25%

và tỷ lệ nhiễm nhẹ nhất trên giống ngô nếp trắng với tỷ lệ 40,25%

- Với lạc: Tất cả các mẫu hạt lạc kiểm tra đều nhiễm 2 loài nấm là

Aspergillus niger, Aspergillus flavus Mức độ nhiễm Aspergillus flavus trên mỗi

giống là khác nhau còn mức độ nhiễm Aspergillus niger trên các giống là tương đương Nấm Aspergillus niger gây hại nặng trên giống S12 với tỷ lệ nhiễm

41,25%, tỷ lệ nhiễm thấp nhất là 39,25% trên giống LD và MD7 Nấm

Aspergillus flavus gây hại nặng trên giống L12 với tỷ lệ nhiễm 63,25% và tỷ lệ

nhiễm nhẹ nhất trên giống L26 với tỷ lệ 49%

- Với đậu tương: Tất cả các mẫu hạt đậu tương kiểm tra đều nhiễm 2 loài

nấm là Aspergillus niger, Aspergillus flavus và mức độ gây nhiễm trên mỗi giống

là khác nhau Nấm Aspergillus niger gây hại nặng trên giống DT84 với tỷ lệ

Trang 39

nhiễm 32,5%, tỷ lệ nhiễm thấp nhất là 29,75% trên giống DT96.

Nấm Aspergillus flavus gây hại nặng trên giống DT12 với tỷ lệ nhiễm 48,5% và

tỷ lệ nhiễm nhẹ nhất trên giống DT96 với tỷ lệ 40,75%

4.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học của nấm Aspergillus sp gây hại

trên hạt lúa, ngô, lạc, đậu tương

* Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học của nấm Aspergillus sp gây hại

trên hạt lúa

Quan sát những mẫu hạt lúa bị nhiễm nấm Aspergillus sp dưới kính hiển

vi soi nổi cho thấy nấm phát triển trên hạt như sau:

Với As flavus: Trên bề mặt hạt phủ một lớp nấm màu xanh lá cây đến xanh

vàng Các cụm bào tử tròn, hình đầu màu trắng khi còn non và xanh lá cây khitrưởng thành Bào tử phân sinh tròn hoặc hơi tròn hơi sần sùi, màu xanh vàng

Với As niger: Trên bề mặt hạt phủ một lớp nấm màu đen Cụm bào tử

phân sinh màu đen Bào tử phân sinh màu nâu tối, trên bề mặt có gai

* Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học của nấm Aspergillus flavus và

Aspergillus niger gây hại trên hạt ngô

Quan sát những mẫu hạt bị nhiễm nấm Aspergillus flavus dưới kính hiển

Với As flavus: Trên bề mặt hạt phủ một lớp màu xanh đến xanh vàng.

Các cụm bào tử tròn hình đầu mầu trắng khi còn non và có màu kem đến xanh lácây khi trưởng thành Bào tử phân sinh tròn hoặc hơi tròn, sần sùi, màu xanhvàng Bề mặt cuống hơi xù xì giống gai

Với As niger: Trên bề mặt hạt phủ một lớp màu đen hoặc nâu Cành bào

tử phân sinh mọc đơn lẻ hoặc nhóm có màu đen

Aspergillus niger gây hại trên hạt lạc

Với As flavus: trên bề mặt hạt phủ một lớp màu xanh đến xanh vàng Các

Trang 40

cụm bào tử tròn hình đầu mầu trắng khi còn non và có màu kem đến xanh lá câykhi trưởng thành Bào tử phân sinh tròn hoặc hơi tròn, sần sùi, màu xanh vàng.

Bề mặt cuống hơi xù xì giống gai

Với As niger: trên bề mặt hạt phủ một lớp màu đen hoặc nâu Các đầu

cành của bào tử phân sinh hình cầu đến hình tỏa xòe dạng cột đường kính từ 700

- 800µm, cuống bào tử phân sinh thay đổi, đo được từ 1.5 - 1.3mm × 15 - 20µm.Bào tử phân sinh hình cầu khi trưởng thành, có gai, màu nâu tối đến đen, đườngkính từ 4.0 – 5.0µm

Ngoài ra trong quá trình đặt ẩm và nuôi cấy tôi đã thấy có một loại

Aspergillus có có tản nấm màu nâu trên hạt Bào tử có màu nâu, bề mặt bào tử

nhẵn, hình cầu Sau khi tiến hành phân lập nuôi cấy trên môi trường, tiến hành

so sánh đối chiếu với nấm Aspergillus niger và Aspergillus flavus về hình dạng

của tản nấm cũng như bào tử, cuống bào tử thấy có sự khác biệt; đặc biệt khi cấy

đồng thời loại này với Aspergillus niger và Aspergillus flavus trên cùng một đĩa

môi trường thì các tản nấm hoàn toàn không lan vào nhau chứng tỏ 3 loại này là

3 isolate khác nhau

Sau khi tìm hiểu tham khảo trên các trang mạng, tham khảo hình ảnh tản

nấm, bào tử tôi nhận định isolate trên là Aspergillus ficucum.

Aspergillus niger gây hại trên hạt đậu tương.

Với As flavus: Trên bề mặt hạt phủ một lớp màu xanh đến xanh vàng Các

cụm bào tử tròn hình đầu mầu trắng khi còn non và có màu kem đến xanh lá cây khitrưởng thành Bào tử phân sinh tròn hoặc hơi tròn, sần sùi, màu xanh vàng

Với As niger: Trên bề mặt hạt phủ một lớp màu đen hoặc nâu Cành bào

tử phân sinh mọc đơn lẻ hoặc nhóm có màu đen

Định dạng
Số trang	87
Dung lượng	17,19 MB