Bước đầu nghiên cứu sự biến đổi hình thái hai dòng lan huệ lai in vitro (hippeastrum equestre)

264.1.1 Ảnh hưởng của nhóm chất cytokinine tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy 264.1.2 Ảnh hưởng của nhóm chất auxin tới sự phát triển hình thái của mô nuôi cấy 294.2 Nghiên cứu ả

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-

 -KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI

Bước đầu nghiên cứu sự biến đổi hình thái hai dòng

Lan Huệ lai in vitro (Hippeastrum equestre)

Sinh viên thực hiện : Phan Anh Tuấn

Giảng viên hướng

dẫn

: Ths Phí Thị Cẩm Miện Trường ĐHNN Hà Nội

“ Khóa luận/luận văn đệ trình khoa CNSH, Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội là một phần yêu cầu của

trình độ đại học/thạc sỹ ngành Công nghệ sinh học”

HÀ NỘI - 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Bài khóa luận tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu thực sựcủa cá nhân, được thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết, kiến thức chuyênngành, nghiên cứu khảo sát tình hình thực tiễn và dưới sự hướng dẫn khoa học của côgiáo Ths Phí Thị Cẩm Miện

Các số liệu, bảng biểu và những kết quả trong khóa luận là trung thực, các nhậnxét, phương hướng đưa ra xuất phát từ thực tiễn và kinh nghiệm hiện có

Một lần nữa tôi xin khẳng định về sự trung thực của lời cam đoan trên

Người thực hiện

Phan Anh Tuấn

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành bài báo cáo tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực cố gắng của bản thântôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình về mọi mặt của thầy cô giáo, các tập thể và cánhân

Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: cô giáo Ths PhíThị Cẩm Miện đã dành nhiều thời gian, tâm huyết chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quátrình thực tập

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các cô và anh chị làm việc tại Viện Sinh học Nôngnghiệp - Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡtôi hoàn thành khoá luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong trường Đại học nôngnghiệp Hà Nội đã tận tình dạy bảo tôi trong suốt 4 năm học qua

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới những người thân trong gia đình đãluôn ở bên tôi, chăm sóc, động viên tôi và toàn thể bạn bè đã giúp đỡ tôi trong suốtthời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày … tháng … năm 2013

Sinh viên PHAN ANH TUẤN

1.2.2 Yêu cầu 2

2.1 Giới thiệu chung về Hippeastrum equestre Herb 3

2.1.6 Sâu, bệnh hại Lan Huệ và cách phòng trừ6

2.1.7 Giá trị sử dụng của cây Lan Huệ 6

2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy 72.2.1 Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy 7

2.2.2 Ảnh hưởng của các thành phần hóa học 8

2.2.3 Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý 12

2.2.4 Ảnh hưởng của điều kiện ra cây 13

2.3 Quy trình sản xuất cây cấy mô 142.4 Tình hình nghiên cứu cây Lan Huệ ở trong nước và trên thế giới 15

2.4.1 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 15

2.4.2 Tình hình nghiên cứu cây trên thế giới 16

3.1 Đối tượng, vật liệu, điều kiện, địa điểm và thời gian nghiên cứu 183.1.1 Đối tượng 18

3.1.2 Vật liệu 18

3.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 18

3.2 Nội dung nghiên cứu 193.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến phát sinh hình thái của

mô nuôi cấy 19

3.2.1.1 Ảnh hưởng của nhóm chất cytokinine tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi

3.3.3 Phương pháp khử trùng mẫu cấy 23

3.3.4 Các chỉ tiêu theo dõi24

3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 25

4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến phát sinh hình thái của mô nuôicấy 264.1.1 Ảnh hưởng của nhóm chất cytokinine tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy 264.1.2 Ảnh hưởng của nhóm chất auxin tới sự phát triển hình thái của mô nuôi cấy 294.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp auxin và cytokinine tới sự phát sinh hình thái .334.2.1 Ảnh hưởng của sự phối hợp auxin và cytokinine tới hệ số nhân chồi từ vảy củ đôi

33

4.2.2 Ảnh hưởng của sự phối hợp auxin và cytokinine tới sự phát sinh chồi từ mô sẹo 36

4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường tới chất lượng chồi in vitro 40

4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của α – NAA và than hoạt tính tới khả năng ra rễ 42

5.1 Kết luận 465.2 Đề nghị 46

6.1 Tài liệu Tiếng Việt 476.2 Tài liệu tiếng nước ngoài 486.3 Tài liệu từ internet 48PHỤ LỤC 49

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của BA tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy sau 4tuần nuôi cấy 26Bảng 4.2 Ảnh hưởng của Kinetine tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấysau 4 tuần nuôi cấy 28Bảng 4.3 Ảnh hưởng của 2,4-D tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy sau 4tuần nuôi cấy 30Bảng 4.4 Ảnh hưởng của α-NAA tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy sau

4 tuần nuôi cấy 31Bảng 4.5 Ảnh hưởng của BA và 2,4-D tới hệ số nhân chồi từ vảy củ đôi sau 4tuần nuôi cấy 33Bảng 4.6 Ảnh hưởng của BA và α-NAA tới sự phát sinh hình thái của mô nuôicấy sau 4 tuần nuôi cấy 35Bảng 4.7 Ảnh hưởng của BA và 2,4-D tới sự phát sinh chồi từ mô sẹo sau 4tuần nuôi cấy 36

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của BA và α-NAANAA tới sự phát sinh chồi từ mô sẹo sau 4

tuần nuôi cấy 38

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in vitro sau 4

tuần nuôi cấy 40

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng chồi in vitro sau 4

tuần nuôi cấy 41Bảng 4.11 Ảnh hưởng của α - NAA tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ sau 4tuần nuôi cấy 43Bảng 4.12 Ảnh hưởng của than hoạt tính tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ sau

4 tuần nuôi cấy 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Hai chủng Lan huệ lai thuộc chi Hippeastrum 4Hình 2.2 Quả của Lan Huệ thuộc chi Hippeastrum 5Hình 3.1 Hai dòng Lan Huệ lai được sử dụng trong đề tài H3 (bên trái) và H5 (bên phải) 18Hình 4.1 So sánh ảnh hưởng của BA tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy sau 4 tuầnnuôi cấy 27Hình 4.2 Chồi phát sinh từ mô nuôi cấy sau 4 tuần nuôi cấy 27Hình 4.3 Mô sẹo được phát sinh từ mô nuôi cấy sau 4 tuần nuôi cấy 31

Hình 4.5 Ảnh hưởng của BA và α-NAANAA tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy sau 4 tuần

nuôi cấy 35Hình 4.4 Ảnh hưởng của BA và 2,4-D tới hệ số nhân chồi từ vảy củ đôi sau 4tuần nuôi cấy 34Hình 4.6 Ảnh hưởng của BA và 2,4-D tới sự phát sinh chồi từ mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy .37

Hình 4.7 So sánh ảnh hưởng của BA và α-NAANAA tới sự phát sinh chồi từ mô sẹo sau 4 tuần

TÓM TẮT

Lan Huệ là cây hoa tuy chưa phổ biến tại Việt Nam nhưng đang dần được ngườidân ưa chuộng, và được đông y dùng làm thuốc chữa bệnh Ở Việt Nam, màu sắc vàgiống Lan Huệ còn nghèo nàn Do đó việc tạo ra các giống hoa Lan Huệ mới bằngphương pháp truyền thống đã mang lại hiệu quả đáng kể Tuy nhiên, việc duy trì vànhân nhanh các dòng lai trên còn nhiều hạn chế Do vậy em tiến hành đề tài “Bước đầu

nghiên cứu sự biến đổi hình thái hai dòng Lan Huệ lai in vitro (Hippeastrum equestre)” Tiến trình thực hiện qua nhiều nội dung: Nghiên cứu ảnh hưởng của các

chất điều tiết sinh trưởng tới mô nuôi cấy, tái sinh chồi từ mô sẹo và thành phần môitrường, các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau là khác nhau Bước đầu xác định môitrường hình thành callus, tái sinh chồi từ đế củ mang hai vảy củ và mô sẹo Xác địnhảnh hưởng của hàm lượng nước dừa và hàm lượng đường Môi trường tạo rễ phù hợp

là MS + 2 mg/l α-NAA và 0,7 g/l than hoạt tính

1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Hoa đóng vai trò quan trọng trong cuộc sống của con người, là sản phẩm vừamang giá trị tinh thần vừa mang giá trị kinh tế Trong những năm gần đây, nước ta đãđạt được kết quả khả quan về phát triển kinh tế - xã hội Đời sống của người dân đượccải thiện nên nhu cầu về hoa ngày càng tăng, ngày càng đa dạng và phong phú cả vềchủng loại và màu sắc Một trong những loài hoa ngày càng được nhiều người yêuthích hiện nay là Lan Huệ, được trồng trong chậu, trong cốc thủy tinh hoặc cắt cành

Lan Huệ có tên khoa học là Hippeastrum equestre (Aiton) Herb., tên tiếng Anh

là Valentine flower Nếu như ở các nước Châu Âu, loài hoa này đã được sử dụng phổbiến làm quà tặng nhân dịp “Valentine” với nhiều giống hoa có màu sắc đa dạng thì ởViệt Nam, Lan Huệ còn rất nghèo nàn về màu sắc (chủ yếu là màu đỏ), thời gian rahoa của chúng lại muộn hơn (khoảng từ giữa tháng 3 đến cuối tháng 5)

Bằng con đường thu thập nguồn gen, lai hữu tính và chọn lọc có thể làm phongphú bộ giống hoa Lan Huệ ở nước ta Những cá thể lai có đặc điểm ưu tú được chọnlọc cần phải nhân giống vô tính nhằm duy trì được tính trạng ban đầu

Để nhân giống vô tính cây Lan Huệ có thể sử dụng các phương pháp: Tách chồihoặc củ nhỏ từ cụm cây mẹ (Siddique và cs., 2007); kỹ thuật cắt lát (Chipping) hoặc sử

dụng phương pháp nhân giống in vitro (Husey, 1975; Seabrook và cs., 1976; De

Buruyn, 1992; Chieh Li Huang và cs., 2005,…) Mặc dù đơn giản nhưng hiệu quả khinhân giống bằng phương pháp truyền thống không cao do thời gian nhân giống dài, hệ

số nhân thấp, cây không đồng nhất Trong khi đó, phương pháp nhân giống in vitro có

rất nhiều ưu điểm như tạo được cây con sạch bệnh, thời gian nhân giống ngắn, hệ sốnhân giống cao, cây đồng nhất, do vậy đáp ứng được nhu cầu về số lượng giống cóchất lượng cao

Năm 2009, một số nhà khoa học đã “Bước đầu nghiên cứu quy trình nhân nhanh

in vitro cây hoa Loa kèn đỏ (H equestre)” và đã xác định được một số thông số kỹ

thuật Bên cạnh việc kế thừa một số kết quả “bước đầu” này cần phải có những nghiên

cứu tiếp theo nhằm bổ sung và hoàn thiện quy trình nhân in vitro cây hoa Lan Huệ.

Xuất phát từ những lý do nêu ở trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Bước đầu

nghiên cứu sự biến đổi hình thái hai dòng Lan Huệ lai in vitro (Hippeastrum

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về Hippeastrum equestre Herb

2.1.1 Nguồn gốc, phân bố

Trong tiếng Hy Lạp, “Hippestrum” có nghĩa là “ngôi sao Kỵ sĩ”, đã được đặt tên

từ năm 1837 bởi mục sư William Herbert Cây có nguồn gốc từ Nam Mỹ và một vàiloài được những người trồng hoa ở Hà Lan nhập khẩu về trồng Quá trình nhân giống

và lai tạo được diễn ra trong suốt thể kỷ 18, sau đó loài hoa này được chú ý đến ở Bắc

Mỹ vào đầu thể kỷ 19 Năm 1946, hai người trồng hoa ở Hà Lan mang cây hoa nàyđến Nam Phi và bắt đầu trồng tại đây Mặc dù hầu hết các cây hoa trong chiHippestrum đều xuất phát từ Hà Lan và Nam Phi nhưng ngày nay chúng lại phân bốnhiều ở vùng nhiệt đới châu Á, châu Mỹ

Tại Việt Nam, H equestre được biết đến với nhiều tên như Lan Huệ, Amaryllis,

Loa Kèn đỏ Hiện nay chưa có nhiều loài trong chi Hippestrum ở Việt Nam nhưng sựphân bố của chúng lại khá đa dạng Ở miền Nam thấy xuất hiện các loài hoa thuộc chinày nhiều hơn và việc trồng, nhân giống, mua bán cũng diễn ra phổ biến hơn so vớimiền Bắc

2.1.2 Vị trí phân loại

Lan huệ, có tên khoa học là Hippeastrum equestre (Aiton) Herb thuộc Bộ Hoa

Loa Kèn (Liliales), Họ Amaryllidaceae, và thuộc chi Hippeastrum Chi này có khoảng

90 loài và 600 dạng lai, phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á, châu Mỹ

2.1.3 Đặc điểm thực vật học

Hippeastrum là một trong những chi có tiềm năng phát triển của bộ Lilliales Chinày rất đa dạng, phong phú về hình thái, màu sắc hoa, rất thích hợp để sử dụng làmhoa cắt cành Các chủng lai tạo có hoa màu sắc khác nhau như:

 H equestre var alba: Hoa màu trắng.

 H equestre var splendes: Hoa màu đỏ, cuống dái.

 H equestre var fulgidum: Hoa màu vàng cam tươi, mép cánh có viền trắng.

 H equestre var major: Hoa lớn màu vàng cam tươi, gốc cánh hoa màu xanh.

H equestre var major H equestre var splendes

Hình 2.1 Hai chủng Lan huệ lai thuộc chi Hippeastrum.

Trong củ của các loài thuộc chi này có chứa các biệt dược giá trị như các loạialkaloids, các lectins có hoạt tính chống siêu vi trùng, chống sưng viêm, chống ungthư, chữa bệnh Alzheimer, cầm máu và chữa vết thương

Lan Huệ là cây thân hành, hình cầu, có áo mỏng bao ở ngoài Lá tập trung ởgốc gần như thành 2 dãy, phiến lá hình dải, hình kiếm hoặc hình dải mác, hơi khumthành hình máng, dai và cứng Lá có nhiều gân sọc song song và gân phụ ngang songsong Lá bắc mỏng tổng bao 2, dạng mo, gồm 2 cái

Cụm hoa tán, nhiều hoa, trên một cuống hoa chung có hình trụ, thẳng đứng vàrỗng Hoa to đều có màu sắc sặc sỡ, lưỡng tính và có cuống Bao hoa hình phễu, nằmngang hoặc rủ xuống, 6 mảnh, dạng tràng, phần dưới dính nhau thành ống, ngắn, họng

có 1 vòng vảy ngắn hoặc 1 vòng tràng phụ cụp vào trong, phần trên 6 thùy, xếp 2vòng, các thùy bằng nhau hoặc các thùy vòng trong hẹp hơn Gồm có 6 nhị, chỉ nhị rờinhau, đính ở họng ống bao hoa; bao phấn 2 ô, đính lưng , hướng trong, mở bằng khedọc Bầu Lan Huệ thuộc dạng bầu hạ, 3 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn; vòinhụy dài, mảnh; đầu nhụy dạng đầu hoặc 3 thùy

Hình 2.2 Quả của Lan Huệ thuộc chi Hippeastrum

Quả nang, hình cầu hoặc hình thuôn, mở ở khe lưng ô thành 3 mảnh Hạt nhiều,dẹp, màu đen nội nhũ nạc bao lấy phôi nhỏ

Cây ra hoa vào mùa xuân - hè Cây mọc tự nhiên ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ,được nhập vào Việt Nam, trồng trong vườn hoa, trong chậu

2.1.4 Yêu cầu ngoại cảnh

a.Nhiệt độ và ánh sáng

Lan Huệ là cây ưa điều kiện ấm, ẩm, bán râm, không chịu được rét Vì vậy, vàothời kỳ ngủ đông cần chuyển cây vào trong nhà kính qua đông Cây Lan Huệ thích hợpvới khí hậu nóng ẩm và những nơi đủ ánh sang

Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp là 180C - 250C

b.Nhu cầu nước và giá thể trồng

Cây cần có đủ độ ẩm quanh năm mới ra hoa được, do đó cần tưới nước thườngxuyên khu vực trồng cây suốt những tháng hè Trong thời kỳ ngủ đông, chỉ cần tưới ítnước để đảm bảo cho củ không bị khô héo, nếu không thân lá sẽ sinh trưởng, cản trởđến việc ngủ đông của cây, ảnh hưởng đến thời gian ra hoa Lan Huệ thích hợp trồngtrong cát nhiều mùn, giàu dinh dưỡng và thoát nước tốt

2.1.5 Kỹ thuật trồng và chăm sóc

Khi trồng Lan Huệ nên cố gắng chọn những cây không có dấu hiệu mọc rễ mới.Nhưng nếu cây vừa bắt đầu tăng trưởng, thì cần kiểm tra xem điểm tăng trưởng có

cứng cáp và khỏe mạnh hay không Cây khỏe mạnh là cây phải cứng cáp, không cómảng mốc, vết bẩn, hay dấu hiệu sâu bọ cắn phá bề mặt và vỏ ngoài phải nguyên vẹn.Lan Huệ là cây không chịu được rét nên trồng chúng trong rổ Khi nhiệt độ giảmxuống, đào rổ cây lên rồi cất vào nhà kho hay gara thoáng mát và không có chuột bọphá hoại trong suốt mùa đông Khi trồng cần để hở ngọn lên trên mặt đất Nếu trồngtrong chậu, cần đưa cây vào chỗ bán râm, tránh ánh nắng trực tiếp Trong thời giansinh trưởng và ra hoa, 2 tuần bón thúc 1 lần, nước phân đặc một chút Vào mùa thumát mẻ cần giảm lượng nước tưới, để tránh cây bị lốp

2.1.6 Sâu, bệnh hại Lan Huệ và cách phòng trừ

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, Lan Huệ thường có những dấuhiệu hư tổn như khi vào mùa hè thường bị nhện đỏ tấn công, hay bị các bệnh do nhiễm

vi khuẩn, nấm và virus HiMV (Hippeastrum mosaic virus) gây nên hiện tượng bị thốinhũn, vết khảm trên lá… Có thể phòng trừ bằng cách hòa Phoxim pha với 1.200 lầnnước để diệt nhện đỏ, hoặc đợi đến cuối thu mới đem trồng lại để tránh bị bệnh nấmcây

Cây dễ bị mắc bệnh héo lá, cần tránh trồng quá dày, chăm sóc hợp lý, khôngđược để nhiệt đô chênh lệch giữa ban ngày và ban đêm quá lớn

2.1.7 Giá trị sử dụng của cây Lan Huệ

Ngoài việc trồng trong chậu kiểng, cây có thể trồng nhiều trong bồn hoa, côngviên, ven đường, vách núi và ven hồ Thân hành có thể dùng làm thuốc, có tác dụnghoạt huyết, giải độc, giảm sưng Theo Đông dược thì củ Lan Huệ có vị ngọt cay, tính

ấm có độc, có tác động tán ứ, tiêu thũng Thân hành được dùng giã nát đắp cầm máu

và trị tổn thương khi té ngã Các alkaloids trong Lan Huệ đang được nghiên cứu vềmột số tác động dược học

Trong số các alkaloids, Lycorine (tên cũ Narcissine) là chất được chú ýnhất Lycorine là một alkaloid loại isoquinolone (chuyển hóa từ phena thridine), cóphân tử lượng 287.32 có tác dụng ức chế hoạt tính sinh học của menAcetylcholinesterase Lycorine có hoạt tính ức chế hoạt động tái lập của siêu vi trùng

HIV-1, khi thử trên dòng tế bào MT4.(Planta Medica Số 70-2004) Lycorine ức chế sựphát triển của siêu vi trùng Coronavirus gây bệnh SARS (Severe Acute RespiratorySyndrome) ở liều EC50 (Effective Concentration) = 15.7 +/- 1.2 nM và đang đượcnghiên cứu thêm để làm thuốc trị SARS (Antiviral Research Số 67-2005) Lycorine ứcchế sự sản xuất TNF-alpha (Tumor necrosis factor), ức chế tiến trình sinh tổng hợpproteins Vì TNF-alpha là một chất cytokinine căn bản điều hòa tiến trình sưng viêmnên Lycorine có triển vọng được dùng làm thuốc chống sưng, trị thấp khớp(PMID :11218731) Hơn nữa, hai alkaloids là Acetylcaranine và Ambelline, ly trích từcăn hành Amaryllis belladonna có hoạt tính diệt tế bào ung thư Leukemia khi thử trêndòng tế bào P-388 lymphocytic leukemia (Journal of Natunral Products Số 47-1984)

2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy

2.2.1 Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy

Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là một vấn đề cần thiết, vì mẫucấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang rất nhiều vi khuẩn,nấm… Nhưng do mức độ nhiễm của mỗi loại mẫu là khác nhau và đặc điểm của từngloại mẫu cũng khác nhau nên cần có sự thử nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thuđược lượng mẫu vô trùng nhiều mà tốn ít nhiên liệu ban đầu

Khả năng tiêu diệt nấm và khuẩn của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng

độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của

mô cấy

Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng loạidung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy Với hypoclorite, người tathường khử trùng trong thời gian 15-30 phút, HgCl2 thường có thời gian ít hơn Thờigian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể gây chết mẫu, thời gianquá ngắn sẽ không loại bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu dễ bị nhiễm

Sau khi khử trùng, mẫu cây được đặt vào các môi trường nuôi cấy, từ đây giai

đoạn nuôi cấy in vitro bắt đầu Thành phần của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng

quyết định tới nuôi cấy

2.2.2 Ảnh hưởng của các thành phần hóa học

Trong nuôi cấy in vitro, cả yếu tố hóa học và yếu tố vật lý của cây trong các

bình nuôi đều phải được cung cấp đầy đủ Môi trường dinh dưỡng phải cung cấp tất cảcác ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ sung như amino acid và vitamin,nguồn cacbon cố định, và một thành phần cần cho sự sống cũng phải được cung cấp đó

là nước Các nhân tố vật lý như nhiệt độ, pH, môi trường khí, ánh sáng và áp lực thẩmthấu, cũng phải được duy trì trong giới hạn chấp nhận

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều môi trường được sử dụng như môi trườngMurashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974),môi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann…Trong đó môi trường MS đượcđánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều loại cây trồng, bao gồm cả cây hai lá mầm

và cây một lá mầm Thông thường trong một môi trường nuôi cấy phải đảm bảo cácthành phần hóa học sau:

• Nguyên tố vi lượng: Được cung cấp với lượng rất thấp cho thực vật sinhtrưởng, phát triển và có nhiều vai trò khác nhau Mangan, iốt, đồng, coban, Bo, Mo,sắt và kẽm là các nguyên tố vi lượng, ngoài ra niken và nhôm cũng được tìm thấytrong một số công thức Nguyên tố vi lượng thường có mặt trong thành phần của một

số coenzyme, vitamin; tham gia vào các phản ứng trao đổi điện tử, sinh tổng hợp diệplục,…

Chất hữu cơ bổ sung

• Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactortrong nhiều phản ứng sinh hóa (Vũ Văn Vụ, 2006) Các loại vitamin B1, B6, PP và

myoinositol là cần thiết cho nuôi cấy tế bào thực vật in vitro Tuy nhiên, vì lý do lịch

sử các loại vitamin khác nhau cũng được thêm vào để nuôi cấy

• Các amino acid có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái, aminoacid, alanine, glutamic acid, glutamine và proline cũng được sử dụng nhưng trongnhiều trường hợp là không cần thiết

Nguồn cacbon

Các mô và tế bào thực vật nuôi cấy nói chung, không thể tự quang hợp hoặcquang hợp yếu do thiếu clorophin và các điều kiện khác…do đó phải bổ sung thêmcacbon Saccarose thường được sử dụng làm nguồn cacbon do đó những đặc tính như

rẻ, dễ kiếm, đồng hóa triệt để và tương đối ổn định Ngoài ra, các loại đường khác nhưglucose, maltose, galactose và sobitol cũng có thể được sử dụng và trong những trườnghợp đặc biệt có thể cung cấp tốt hơn đường Saccarose

Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời còn thamgia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường Đường đóng góp khoảng 50-70 %vào khả năng thẩm thấu của môi trường (Trigiano and Gray, 2000) Thông thườngđường Saccarose được sử dụng ở nồng độ 0,2-0,3 %, nhưng nồng độ này có sự thayđổi ở từng đối tượng khác nhau và mục đích nuôi cấy khác nhau, có khi xuống tới 0,2

% (tạo dòng), có khi tăng lên đến 12 % (gây cảm ứng stress nước)

Sự hình thành rễ đòi hỏi một lượng đường được cung cấp từ quang hợp hoặcngoại sinh Theo George (1993) hầu hết các loại thực vật khi ra rễ thích hợp với lượngđường 20-30 g/lít Tuy nhiên, cũng có loài yêu cầu nguồn carbohydrate ngoại sinh cao

hơn Ví dụ theo Sharma (1993) cây Gentiana kurroo chỉ có thể ra rễ tốt khi bổ sung 60

g/lít Saccarose trong môi trường

Thí nghiệm áp dụng phương pháp quang tự dưỡng cho thấy các cây in vitro đã

phát triển tốt trên môi trường không có đường và vitamin, độ thoáng khí cao Tỷ lệnhiễm nấm giảm đáng kể Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của lá theo quy

luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường Trong khi đó cây nuôicấy theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khổng

luôn luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro ra vườn

ươm Tỷ lệ sống 95-100 % sau một tháng ở vườn ươm đối với cây nuôi cấy trên môitrường không có đường, trái lại chỉ từ 70-80 % theo phương pháp truyền thống(Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự, 2005)

Chất điều tiết sinh trưởng

Chất điều tiết sinh trưởng thực vật là thành phần môi trường khắt khe trong việcxác định con đường phát triển của tế bào thực vật Các chất điều tiết sinh trưởng được

sử dụng thông thường là các hormone thực vật hoặc các chất tổng hợp tương tự chúng,phổ biến là auxin và cytokinine, gibberellins, abscisic acid, ethylene Trong đó auxin

và cytokinine là hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất

• Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử Trong

nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hóa sự phân chia và giãn

nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh

sự phân hóa của rễ, chồi…(Bhojwani and Razdan, 1983)

Các auxin được sử dụng với nồng độ thấp từ 10-6 – 10-1 M tùy theo từng chất,mục đích và đối tượng nghiên cứu Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ,hàm lượng cao kích thích hình thành mô sẹo

Auxin được chia thành hai nhóm có nguồn gốc khác nhau: trong các auxin tựnhiên, quan trọng nhất là IAA Nhưng IAA chỉ được dùng trong một số môi trườngnuôi cấy do có đặc tính không ổn định với nhiệt độ và ánh sáng Vì vậy, các aminoacid kết hợp với IAA ổn định hơn được sử dụng phổ biến hơn làm giảm bớt liên kếtkhi sử dụng IAA Nhóm auxin tổng hợp tương tự IAA được sử dụng rộng rãi hơntrong các môi trường nuôi cấy như 2,4-D, IBA, α-NAA

• Cytokinine kích thích sự phân chia và ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của tếbào, cảm ứng hình thành chồi phụ và loại bỏ ưu thế ngọn (Nguyễn Như Khanh, 2002).Trong nuôi cấy mô thực vật cytokinine được dùng để kích thích sự phát sinh chồi, sửdụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào Nồng độ cytokinine cao kìm hãm

sự hình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994) Trong các cytokinine tựnhiên có hai nhóm được sử dụng trong môi trường nuôi cấy, đó là zeatine và 2iP (2-isopentyl adenine) Nhưng chúng không được dùng phổ biến vì rất đắt (đặc biệt làzeatin) và không ổn định Các chất tổng hợp tương tự như kinetin và BAP được sửdụng phổ biến hơn Các chất hóa học không có based purin và thay thế bằngphenylureas, cũng được sử dụng như cytokinine trong môi trường nuôi cấy tế bào thựcvật.

Trong cây có sự cân bằng nội hormone (Vũ Văn Vụ, 2007) Do vậy, khi sửdụng các chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy cần đặc biệt lưu ý để sử dụng nồng

độ thích hợp đạt hiệu quả cao Nhiều tác giả đã tổng kết, tỷ lệ auxin/cytokinine nếunghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ; nghiêng về phía cytokinine sẽ thúcđẩy hình thành chồi; ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành mô sẹo

Than hoạt tính

Than hoạt tính ban đầu được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cố gắng môphỏng điều kiện trồng trọt, sau đó nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều môi trườngnuôi cấy Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng của than hoạt tính trong môi trườngnuôi cấy mô thực vật Đó là: sự hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sảnphẩm trao đổi thứ cấp, ảnh hưởng tới pH, xúc tác bẻ gãy đường Saccarose trong khửtrùng (S.C Van Winkle et al, 1995) Ngoài ra than cũng hút các chất hữu cơ nhưphytohormone, vitamin, sắt, kẽm, … (Nissen & Sutter, 1990)

Điều tra tác dụng của than hoạt tính, sự khử trùng, và môi trường nuôi cấy trongthủy phân đường cho thấy, sự thủy phân của đường trong môi trường nuôi cấy phụthuộc vào cả ion H+ và sự khử trùng và thành phần than hoạt tính Sau khử trùng, ởmôi trường MS + 5 % Saccarose bổ sung than hoạt tính cho tỷ lệ đường thủy phân là

70 %, tỷ lệ tương ứng ở môi trường Gamborg là 56 %, còn ở môi trường không cóthan hoạt tính là 20 % (Pan and Staden, 1999)

Như vậy than hoạt tính có ảnh hưởng rõ ràng tới môi trường nuôi cấy, nhiều

nghiên cứu đã cho thấy tác dụng kích thích của mô in vitro như kích thích tạo củ của

hoa Lili (Nhut et al, 2001), tác dụng hình thành rễ ở Pawlownia (Lê Thị Kim Đào,2001)…

Các chất hữu cơ bổ sung

Ngoài các thành phần dinh dưỡng bắt buộc kể trên trong môi trường nuôi cấy

mô tế bào thực vật in vitro, người ta còn bổ sung thêm một số thành phần hỗn hợp tự

nhiên khác như nước dừa, dịch chiết nấm men, nước ép cà chua, khoai tây, chuối…Các thành phần này thường chứa nguồn dinh dưỡng và chất điều hòa sinh trưởng đadạng như amino acid, đường, vitamin, nucleic acid, auxin, cytokinin

Nước dừa là thành phần khá phổ biến trong nhiều môi trường nuôi cấy Tất cảphân tích thành phần của nước dừa từ non tới già của Tulecke et al.,(1961) cho thấytrong nước dừa có: amino acid, acid hữu cơ, đường, RNA, DNA, Inositol, auxin,cytokinin,… Hàm lượng sử dụng của nước dừa từ 10-20 %

Tác nhân làm đặc môi trường

Tùy thuộc vào loại sinh trưởng, môi trường nuôi cấy cần được sử dụng ở dạnglỏng hoặc đặc, nhiều loại môi trường nuôi cấy đòi hỏi tế bào hoặc mô thực vật phảisinh trưởng trên bề mặt, agar là tác nhân làm đặc môi trường được sử dụng phổ biếnnhất Agar được sản xuất từ tảo biển, loại tinh khiết hay agarose có thể cũng được sửdụng, nhưng có thể khác nhau về độ đặc

2.2.3 Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý

Các yếu tố vật lý chính là ánh sáng, nhiệt độ, độ pH, trạng thái môi trường,…

Ánh sáng

Trong môi trường nuôi cấy, quang tổng hợp không phải là một hoạt động cầnthiết do sự có mặt của đường trong môi trường, nhưng ánh sáng cần thiết để điều hòamột số quá trình liên quan tới phát sinh hình thái của cây Tùy từng loại nuôi cấy, yêucầu cường độ cũng như thời gian chiếu sáng khác nhau, ví dụ như khi nuôi cấy môsẹo, thường không cần ánh sáng Ánh sáng còn ảnh hưởng tới sinh trưởng của mô nuôicấy thông qua tác động nên trạng thái và cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởng

cũng như dinh dưỡng khoáng Thông thường trong phòng nuôi cấy người ta sử dụngánh sáng huỳnh quang chiếu sáng 14-15 giờ/ ngày với cường độ 2000 lux.

Nhiệt độ

Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy mô thường được điều chỉnh ổn định từ 220C đến

250C Tuy nhiên tùy từng loại nuôi cấy và đối tượng nuôi cấy mà có sự điều chỉnhnhiệt độ phù hợp Theo nhiều nghiên cứu trong nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào vớimục đích sản xuất các hợp chất thứ sinh thì sự điều chỉnh nhiệt độ rất có ý nghĩa, cảmứng cho tế bào sinh trưởng, phân chia và tiết các hợp chất thứ sinh Nhiệt độ còn ảnhhưởng tới nuôi cấy thông qua tác động tới cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởngnhư IAA, GA3,…

pH môi trường

pH của môi trường cũng là một yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng tới trạng thái

lý hóa của các chất trong môi trường, do đó ảnh hưởng tới khả năng điện ly của cácmuối, sự thủy phân hóa các chất… Thông thường pH được điều chỉnh ở mức 5,5 - 5,8

Trạng thái môi trường

Sự phát triển của mô có thể bị thay đổi hoàn toàn nếu chúng nuôi cấy trên mộtmôi trường đặc, lỏng hoặc nửa lỏng Các mô nuôi cấy thường sinh trưởng tốt hơntrong môi trường lỏng, tuy nhiên môi trường lỏng cũng gây ra hiện tượng thủy tinhhóa, các mô nuôi cấy bị mọng nước gây khó khăn cho cấy chuyển và ra cây

2.2.4 Ảnh hưởng của điều kiện ra cây

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình sản xuất một cây giống in vitro Mục đích của giai đoạn này nhằm đưa cây giống in vitro trong phòng nuôi ra ngoài tự

nhiên; huấn luyện cây thích nghi với các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng tự nhiên

và chuyển từ chế độ dị dưỡng sang chế độ tự dưỡng

Mỗi loài cây có đặc điểm khác nhau, do đó để đạt tỷ lệ cây sống cao cần nghiêncứu để tìm giá thể phù hợp cho cây Giá thể trồng cây có thể là cát, đất mùn hoặc cáchỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển…

Cây nuôi cấy in vitro có đặc điểm là các khí khổng luôn mở Vì vậy, khi chuyển

cây ra vườn ươm, cây thường bị mất nước rất nhanh, do đó cần phải che phủ cẩn thận

và cung cấp đủ độ ẩm cho cây bằng cách phun sương Cần cung cấp cho cây lượngnước vừa đủ, lượng nước quá ít hoặc quá nhiều đều có ảnh hưởng không tốt cho cây

Ngoài ra, ở giai đoạn đầu đưa ra ngoài vườn ươm, bộ rễ của cây nuôi cấy in vitro thường chưa có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng từ giá thể Để tăng chất

lượng của cây giống, có thể sử dụng các dung dịch dinh dưỡng để tưới cho cây

2.3 Quy trình sản xuất cây cấy mô

Theo Debergh (1991) thì quy trình nhân giống được chia làm 5 giai đoạn:

a) Lấy mẫu và xử lý mẫu

Đây là giai đoạn đầu tiên trong quy trình, cần đặc biệt chú ý vì những đặc tínhcủa mẫu cấy sẽ được duy trì và nhân lên ở tất cả các cây giống sau này Cần chọn lọccây mẹ ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao; trên cây mẹ tiến hành chọn cơ quan, mô đểlấy mẫu, thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non…

Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý mẫu và điềukiện khử trùng Mỗi loài cây có ngưỡng nhiệt độ và độ ẩm phù hợp khi bảo quản và xử

lý mẫu Với các cây cận nhiệt đới và nhiệt đới thì nhiệt độ 250C, độ ẩm 75 % là điềukiện giữ mẫu thích hợp, tỷ lệ nhiễm bệnh thấp (Deborgh and Zimmerman, 1991)

b) Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuôi cấy Khả năngthành công của nuôi cấy mô tế bào thực vật phụ thuộc vào trạng thái tuổi của tế bàomẫu nuôi cấy, càng gần trạng thái phôi sinh thì khả năng tái sinh càng lớn Sau mộtthời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan(chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính

c) Nhân nhanh chồi

Cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy, vì vậy thànhphần và điều kiện môi trường phải được tối ưu nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh.Môi trường ở giai đoạn này cần bổ sung các hormone sinh trưởng (cytokinine, auxin),

tăng thời gian chiếu sáng lên từ 16 giờ/ ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu là 1000 lux,nhiệt độ thích hợp là từ 20 - 300C.

Quy trình cấy chuyển nhân nhanh chồi thông thường diễn ra trong khoảng 1-2tháng tùy từng loại cây Tỷ lệ nhân nhanh sau mỗi lần cấy chuyển đạt khoảng 2 – 8lần/1 lần cấy chuyển Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nênkéo dài quá lâu để tránh biến dị soma Ví dụ từ một chồi cây chuối chọn lọc ban đầungười ta chỉ nên nhân lên khoảng 2000 – 3000 chồi cây sau 7 - 8 lần cấy chuyển, đốivới các cây khác như mía, cúc, hoa phong Lan sau một năm có thể nhân được trên 1triệu chồi từ một cây mẹ ban đầu

e) Chuyển cây ra vườn ươm

Các cây nuôi cấy in vitro sau khi đã tái sinh hoàn chỉnh sẽ được chuyển ra

ngoài vườn ươm Cây chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng Vì vậy, cần huấnluyện cho cây thích nghi với sự thay đổi của môi trường

2.4 Tình hình nghiên cứu cây Lan Huệ ở trong nước và trên thế giới

2.4.1 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở nước ta chỉ có hai loài thuộc chi Hippeastrum Loài Hippeastrum equestre

(Aiton) Herb., là cây nguyên sản ở Nam Mỹ, tên Việt Nam gọi là Lan Huệ hay Loa

Kèn đỏ Loài thứ hai là Hippeastrum reticulatum (Aiton) Herb., là cây nguyên sản ở

Brazil, tên Việt Nam còn gọi là Lan Huệ mạng Cả hai loài lan Huệ được nhập trồnglàm cảnh ở nhiều nơi của nước ta Hoa rất đẹp, thường nở vào mùa xuân hè, tuy nhiênchưa thấy chúng hình thành quả Người ta thường trồng chúng trong vườn, trong chậu

và nhân giống bằng thân hành con

Loài Hippeastrum equestre (Aiton) Herb., còn có tên tiếng Anh là Valentineflower Ở Việt Nam, mùa hoa của loài này từ tháng 3 đến tháng 5, nên muốn có hoa nởđẹp vào ngày 14/2, người trồng hoa phải biết hãm củ từ mùa hoa năm trước

Cùng chi Hippeastrum có nhiều giống cho màu hoa khác nhau, ngoài màu đỏ còn

có màu trắng, màu vàng, màu hồng sọc đỏ Thân hành có thể tồn tại, nở hoa hàng năm.Ngoài công dụng làm cảnh còn dùng củ giã nát làm thuốc đắp chữa vết thương phầnmềm, chống đau nhức, phù nề

Năm 2008 và 2009, TS Nguyễn Hạnh Hoa và cộng sự đã thu thập được tậpđoàn gồm 10 dòng giống cây hoa thuộc chi Hippeastrum Tác giả đã tiến hành nghiêncứu đặc điểm nông sinh học và chọn lọc các loài hoa thuộc chi Hippeastrum Kết quả

đã chọn được 4 dòng giống là: Đỏ nhung (ĐN), trắng (Tr), trắng ngà sọc hồng(TNSH), Trắng sọc đỏ thụy điển (TSĐTĐ) có hoa to, cánh dày, màu sắc đẹp, hoa cụmhoa có độ bền lâu Cũng trong đề tài này, các tác giả đã xây dựng quy trình nhân nhanh

in vitro 2 loài Lan Huệ thuộc chi Hippeastrum

Năm 2010 và 2011, tác giả Chu Thị Yến đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả

năng lai hữu tính cây hoa Lan Huệ Hippeastrum equestre” Kết quả cho thấy khi cho

tự thụ nhân tạo và lai cùng dòng hoa Lan Huệ thì cho đậu quả mà cho tự thụ tự nhiên

thì không thấy đậu quả Tác giả kết luận loài Hippeastrum equestre không phải là loài

tự bất hợp là do không có môi giới truyền phấn Thời gian từ khi lai cho đến khi đậuquả là 25-31 ngày Tỷ lệ hạt chắc từ 8,68-76,5% Tỷ lệ nảy mầm của hạt lai từ23,41%-94-46%

Năm 2011 và 2012, TS Phạm Thị Minh Phượng và cộng sự đã thực hiện đề tài:

“Đánh giá đa dạng di truyền của chi Lan Huệ Hippeastrum Herb.” ở Việt nam bằng

chỉ thị phân tử

2.4.2 Tình hình nghiên cứu cây trên thế giới

Theo Traub (1934), Bell (1973), Carge (1978), Shields (1979), những giống lai

chủ yếu được tạo ra từ một vài loài hoa lan Huệ như H vittatum Herbert, H leopoldii

Dombrain, H.pardium (Hook.f) Lemaire, H.reginae Herbert, H.puniceum (Larmark) Voss và H.aulium Herbert.

Loài Lan Huệ lai qua nhiều đời nhất là H.vittatum Harrisnianum do ông William Harrison đưa từ Brazil vào châu Âu, ông cũng là người đã đưa loài H.aulicum vào châu Âu từ dãy núi Organ Loài H.vittatum có hoa rất to, màu trắng tinh khiết với hai

sọc đỏ Hoa của chúng rất đẹp và có mùi rất thơm

John D.Fellers (1998) cho biết loài H.papilio dùng để lai giống rất lý tưởng vì cóđặc điểm là lớn rất nhanh Ngày nay một số giống được bán trên thị trường là được lai

từ H Papilio

Morris cho rằng hoa lai giữa H.aulicum và H.calyptratum là đẹp nhất Hoa chủ

yếu màu xanh sọc cam nhẹ Hoa của cây này luôn nở vào mùa thu và đến mùa hèkhông có lá, đi vào ngủ nghỉ, đó là đặc điểm có được từ cây bố mẹ

Loài Lan Huệ đỏ được trồng nhiều nhất ở các khu vườn tại các bang miền Nam

nước Anh là loài lai giữa H.reginae và H.vittatum do ông Johnson, một nhà sản xuất

đồng hồ ở Lancashiere nước Anh trồng vào năm 1810

Khi lai các giống cây thuộc chi Hippeastrum có thể có được cây con ra hoa sau2-3 năm, hoặc lâu hơn là từ 4-7 năm Những nghiên cứu cơ bản đã được tiến hành giúpxác định được NST đơn bội của các loài trong chi Hippeastrum là n=11 Hầu hết cácloài đều có bộ NST lưỡng bội 2n=22, tuy nhiên người ta cũng bắt gặp một số loài có

bộ NST tam bội, tứ bội, thậm chí là ngũ bội

3 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, vật liệu, điều kiện, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng

Đề tài được tiến hành trên hai dòng Lan Huệ lai Hippeastrum equestre Herb.

Hình 3.1 Hai dòng Lan Huệ lai được sử dụng trong đề tài H3 (bên trái) và H5(bên phải)

3.1.2 Vật liệu

Vật liệu dùng để nuôi cấy là đế củ mang 2 vảy củ

Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) và các chất điều tiết sinh trưởng,than hoạt tính và nước dừa với các hàm lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm Giá trị

pH của môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trước khi khử trùng là 5,6 – 5.8

Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở 1210C, áp suất 1,4 atm trong 20 phút

3.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại Viện Sinh học Nông nghiệp, TrườngĐại học Nông nghiệp – Hà Nội

Thời gian: từ tháng 6/2013 – tháng 12/2013

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến phát sinh hình thái của mô nuôi cấy

3.2.1.1 Ảnh hưởng của nhóm chất cytokinine tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy

Thí nghiệm 1 Ảnh hưởng của BA tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy

 MTTH: Công thức cho kết quả tốt nhất ở thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2

3.2.1.2 Ảnh hưởng của nhóm chất auxin tới sự phát triển hình thái của mô nuôi cấy

Thí nghiệm 3 Ảnh hưởng của 2,4-D tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy

Thí nghiệm 4 Ảnh hưởng của α-NAA tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy

CT1(ĐC): MS + 0 mg/l α-NAA + 30 g/l Saccarose + 5,8 g/l agar

CT2: MS + 1,0 mg/l α-NAA + 30 g/l Saccarose + 5,8 g/l agar

CT3: MS + 2,0 mg/l α-NAA + 30 g/l Saccarose + 5,8 g/l agar.

CT4: MS + 3,0 mg/l α-NAA + 30 g/l Saccarose + 5,8 g/l agar

CT5: MS + 4,0 mg/l α-NAA + 30 g/l Saccarose + 5,8 g/l agar

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp auxin và cytokinine tới sự phát sinh hình thái

3.2.2.1 Ảnh hưởng của sự phối hợp auxin và cytokinine tới sự hệ số nhân chồi từ vảy củ đôi

Thí nghiệm 5 Ảnh hưởng của BA và 2,4-D tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy

3.2.2.2 Ảnh hưởng của sự phối hợp auxin và cytokinine tới sự hệ

số nhân chồi từ mô sẹo

Thí nghiệm 7 Ảnh hưởng của BA và 2,4-D tới sự phát sinh chồi từ mô sẹo

Thí nghiệm 10 Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng chồi in vitro.

Thí nghiệm 11 Ảnh hưởng của α - NAA tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ

CT1(ĐC): MS + 0 mg/l α-NAA + 30 g/l Saccarose + 5,8 g/l agar

CT2: MS + 0,5 mg/l α-NAA + 30 g/l Saccarose + 5,8 g/l agar

CT3: MS + 1,0 mg/l α-NAA + 30 g/l Saccarose + 5,8 g/l agar

CT4: MS + 1,5 mg/l α-NAA + 30 g/l Saccarose + 5,8 g/l agar

CT5: MS + 2,0 mg/l α-NAA + 30 g/l Saccarose + 5,8 g/l agar

Thí nghiệm 12 Ảnh hưởng của than hoạt tính tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ

CT1(ĐC): MS + 0 g/l than hoạt tính + 30 g/l Saccarose + 5,8 g/l agar

CT2: MS + 0,1 g/l than hoạt tính + 30 g/l Saccarose + 5,8 g/l agar

CT3: MS + 0,3 g/l than hoạt tính + 30 g/l Saccarose + 5,8 g/l agar

CT4: MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 30 g/l Saccarose + 5,8 g/l agar

CT5: MS + 0,7 g/l than hoạt tính + 30 g/l Saccarose + 5,8 g/l agar

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp nuôi cấy mô in vitro

Thí nghiệm sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật hiện hành

Sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường cơ bản MS (Murahige &

Skoog, 1962), pH môi trường 5,6 – 5,8; thể tích dung dịch trong mỗi bình nuôi cấy là 40 –

50 ml

Môi trường nuôi cấy hấp khử trùng ở 1200C trong 20 phút ở áp suất 1,4 atm.

Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm tiến hành trong điều kiện nhân tạo, ánhsáng, nhiệt độ, độ ẩm luôn được giữ ổn định:

Các chỉ tiêu theo dõi được quan sát và đo đếm sau 4 tuần nuôi cấy

3.3.3 Phương pháp khử trùng mẫu cấy

Củ Lan Huệ được làm sạch bề mặt dưới vòi nước chảy mạnh Sau đó được rửasạch bằng xà phòng trong 10 phút và rửa sạch dưới vòi nước trong 5 phút Trongbuồng cấy vô trùng, ngâm trong cồn 700 trong 30 giây, sau đó tráng lại bằng nước cất

vô trùng 1-2 lần, mỗi lần trong 1 phút Tiếp theo ngâm trong dung dịch HgCl2 0,1%trong 12 phút, rửa lại 4-5 lần bằng nước cất vô trùng, mỗi lần 1 phút Sau đó cắt mẫucấy vào môi trường vào mẫu cơ bản là MS + 30 g/l Saccarose + 5.8 g/l agar

3.3.4 Các chỉ tiêu theo dõi

Tỷ lệ hình thành callus (%) = ∑ Số mẫu tạo callus x 100

∑ Số mẫu ban đầu

Tỷ lệ hình thành rễ (%) = ∑ Số mẫu tạo rễ x 100

∑ Số mẫu ban đầu

Tỷ lệ hình thành chồi (%) = ∑ Số mẫu tạo chồi x 100

∑ Số mẫu ban đầu

Số chồi (chồi/mẫu) = ∑ Số chồi thu được

∑ Số mẫu ban đầu

Chiều cao chồi (cm) = ∑ Chiều cao các chồi

∑ Số chồi theo dõi

∑ Số cây ban đầu

Đường kính củ (mm) = ∑ Đường kính các củ

∑ Số cây ban đầu

∑ Số mẫu ban đầu

Chiều dài rễ (cm) = ∑ Chiều dài các rễ

∑ Số rễ thu được

Hình thái callus, chồi và rễ: