Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn bacillus thuringiensis phân lập tại thái nguyên

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ------TRẦN CHUNG DŨNG NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT SÂU TƠ TỪ VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DU

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

- -TRẦN CHUNG DŨNG

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT

SÂU TƠ TỪ VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS

PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

- -TRẦN CHUNG DŨNG

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT

SÂU TƠ TỪ VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS

PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Ma số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS Trương Phúc Hưng

Cơ quan: Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên

THÁI NGUYÊN - 2019

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, cho phép tôi được bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS.

Trương Phúc Hưng giáo viên hướng dẫn khoa học, người đã tạo điều kiện

và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ

sinh học đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện các thí nghiệm trong phạm vi luận

văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Di truyền vi sinh vật viện

Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi trong quá trình tôi thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo, cácđồng nghiệp, bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và chỉ dẫn cho tôi để tôihoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình đã luôn làchỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Học viên

Trần Chung Dũng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đã thực hiện toàn bộ công trình này dưới sự hướng

dẫn của TS Trương Phúc Hưng Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn

là trung thực và chưa từng được công bố trong một luận văn nào khác.Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những gì đã cam đoan ở trên

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 04 năm 2019

Tác giả

Trần Chung Dũng

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN h t t p : / / l r c t nu.edu v n

STT Viết tắt Viết đầy đủ

2 DNA Deoxyribonucleotide a xid

3 E.coli Escherichia coli

4 kDa Kilo Dalton

MỤC LỤC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN h t t p : / / l r c t nu.edu v n

Lời cảm ơn i Lời cam đoan ii Mục

lục iii

Danh mục các bảng vii

Danh mục các hình viii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề .1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

2.1 Tuyển chọn được một số chủng Bacillus thurigiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao tại Thái Nguyên 2

2.2 Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình lên men chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 2

2.3 Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

3.1 Phân lập và xác định đặc điểm hình thái của một số chủng vi khuẩn B thuringiensis từ các mẫu đất thu tại Thái Nguyên có khả năng diệt sâu 2

3.2 Sàng lọc các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao 2

3.3 Tối ưu điều kiện nuôi cấy và tạo chế phẩm sinh học từ loài vi khuẩn B thuringiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao 2

1.2.2 Đặc điểm hình thái 7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN h t t p : / / l r c t nu.edu v n

1.2.3 Phân biệt B.thuringiensis với các loài khác trong chi

Bacillus 8

1.2.4 Đặc điểm sinh hóa 9

1.2.5 Phân loại Bt 10

1.2.6 Đặc điểm loài phụ Bacillus thuringiensis var kurstaki 11

1.2.7 Tính chất nuôi cấy .12

1.3.1 Độc tố của Bt .13

1.3.2 Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng 15

II Tổng quan về sâu tơ (côn trùng thử nghiệm) 17

III Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học B thuringiensis .19

3.1 Phương pháp lên men bề mặt 20

3.2 Lên men chìm 20

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .23

2.1 Vật liệu .23

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .23

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu .24

2.2.1 Phương pháp phân lập Bacillus thuringiensis .24

2.2.2 Phân loại Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh miễn dịch 25

2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 25

3.3 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm Bt trong phòng thí

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN h t t p : / / l r c t nu.edu v n

2.5 28Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của chủng TC

2.5 29

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN h t t p : / / l r c t nu.edu v n

2Aa 13Hình 1.4 Cơ chế tác động của độctố 15Hình 1.5 Chu kỳ sống của sâu tơ Plutella xylostella

16

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus

thuringiensi 24

Hình 3.2 Hình ảnh tế bào sinh dưỡng, bào tử và tinh thể của vi khuẩn Bt quan

sát dưới kính hiển vi quang học 26Hình 3.3 Hình ảnh ngưng kết của chủng TC 2.5 (2) và chủng đối chứng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN h t t p : / / l r c t nu.edu v n

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Nhu cầu lương thực toàn cầu tăng nhanh trong những năm gần đây vàđược dự đoán tiếp tục tăng do sự gia tăng của dân số thế giới Một trongnhững giải pháp cho vấn đề lương thực toàn cầu là cải thiện năng suất mùamàng bằng cách cải tạo giống và tối ưu hoá các quy trình sản xuất trong nôngnghiệp Tuy nhiên, sản lượng nông nghiệp hàng năm giảm mạnh do sự tànphá của sâu hại với uớc tính khoảng 16-18% Thực tế thiệt hại có thể giảm bớtbằng cách kiểm soát côn trùng gây hại Trong các phương pháp kiểm soát dịchhại thì thuốc trừ sâu hoá học được sử dụng rộng rãi và phổ biến để bảo vệ mùamàng Tuy nhiên, có rất nhiều vấn đề liên quan đến việc sử dụng thuốc trừ sâuhoá học trong nông nghiệp Thuốc trừ sâu hoá học không chỉ làm giảm hiệuquả đối với côn trùng đích do hình thành sự kháng thuốc mà còn tiêu diệt cảnhững loại côn trùng có ích, qua đó làm mất cân bằng sinh thái Hơn nữa, việc

sử dụng thuốc trừ sâu hoá học trong thời gian dài dẫn đến chất độc tích lũytrong môi trường từ đó tác động xấu đến môi trường cũng như sức khỏe conngười Do đó, vấn đề cấp thiết là tìm ra một loại thuốc trừ sâu mới thân thiệnvới môi trường và không ảnh hưởng đến sức khỏe con người Thuốc trừ sâu

sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis được kỳ vọng có thể thay thế hoặc

sử dụng bổ sung cho thuốc hoá học bởi những ưu điểm của chúng như có tínhđặc hiệu cao đối với côn trùng đích, an toàn và đặc biệt thân thiện với môitrường

Bacillus thuringiensis là vi khuẩn đất, hiếu khí gram dương, mang các

gen cry sinh tổng hợp bào tử và protein tinh thể độc tố có hiệu quả tiêu diệtđối với nhiều loài côn trùng thuộc các bộ cánh vảy, cánh cứng và hai cánh

Thái Nguyên là một tỉnh miền núi trung du, nằm trong vùng trung du vàmiền núi Bắc Bộ, có diện tích tự nhiên là 3.562,82 km2 Với địa hình thấp dần

từ núi cao xuống núi thấp, trung du, đồng bằng theo hướng Bắc – Nam làmcho

khí hậu Thái Nguyên chia thành ba vùng rõ rệt trong mùa đông: vùng lạnh,vùng lạnh vừa, vùng ấm và hai mùa rõ rệt mùa mưa và mùa khô Do ảnhhưởng của địa hình, đất đai ở Thái Nguyên được phân hoá đa dạng Kết cấucủa đất, điều kiện khí hậu và đặc điểm về địa hình đã tạo ra cho Thái Nguyên

sự đa dạng về thực vật, động vật, cũng như các loài vi sinh vật trong đó có vi

khuẩn B.thuringiensis Theo một số nghiên cứu thì Thái Nguyên[4] là một trong những tỉnh có sự phân bố của nhiều chủng Bt có hoạt tính diệt sâu cao Chính vì vậy, việc tìm kiếm, sàng lọc các chủng Bt có hoạt tính cao tại Thái Nguyên từ đó sản xuất chế phẩm Bt là rất cần thiết Xuất phát từ thực tế đó,

chúng tôi thực hiện đề tài“ Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ

từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập tại Thái Nguyên”.

2 Mục tiêu nghiên cứu.

2.1 Tuyển chọn được một số chủng Bacillus thurigiensis có hoạt tính diệt sâu

tơ cao tại Thái Nguyên

2.2 Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình lên men chủng vi khuẩn

Bacillus thuringiensis.

2.3 Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn Bacillus

thuringiensis phân lập.

3 Nội dung nghiên cứu.

3.1 Phân lập và xác định đặc điểm hình thái của một số chủng vi khuẩn B.

thuringiensis từ các mẫu đất thu tại Thái Nguyên có khả năng diệt sâu.

3.2 Sàng lọc các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao 3.3 Tối ưu điều kiện nuôi cấy và tạo chế phẩm sinh học từ loài vi khuẩn B.

thuringiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I Tổng quan về vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt)

1.1 Lược sử nghiên cứu va ứng dụng Bt

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu va ứng dụng của Bt trên thế giới

Thuốc trừ sâu sinh học Bt có tiềm năng để thay thế thuốc trừ sâu hoá

học nhờ vào những đặc điểm ưu việt như thân thiện với môi trường và không

gây hại cho sức khoẻ con người Bt được sử dụng một cách có hiệu quả trong

nông nghiệp, quản lý rừng, kiểm soát muỗi và diệt sâu hại

Lịch sử của Bt bắt đầu từ khi Loius Pasteur phát hiện ra 1 loài vi khuẩn

có khả năng gây bệnh cho tằm ông đặt tên là Bacillus bombyces Năm 1901 nhà khoa học nhật bản Sigetane Ishiwata phát hiện ra Bt khi ông nghiên cứu bệnh dâu tằm, bệnh này gọi là bệnh “sotto” Ông quan sát thấy tằm chết trước

khi vi khuẩn này phát triển và cho rằng tằm chết là do độc tố chứ không phải

do nhiễm khuẩn, đó là những quan sát sớm nhất về tính gây bệnh của loài vi

khuẩn này và đặt tên là Bacillus sotto Năm 1911, nhà khoa học Đức, E.

Berliner phân lập được loài vi khuẩn tương tự từ xác ấu trùng bướm phấn Địa

Trung Hải, Anagasta kuehniella Đến năm 1915, vi khuẩn này chính thức được mang tên Bacillus thuringiensis do được phân lập từ nhà máy bột vùng

Thuringien của Đức [3].

Chế phẩm Bt được sử dụng từ những năm 1950 [26] Một trong những ứng dụng thành công nhất của chế phẩm Bt kiểm soát Lepidoptera tại những khu rừng phía nam nước Mỹ sử dụng chủng HD-1, hoặc Bt subsp Kurstaki sản xuất độc tố Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac and Cry2A Qua đó, giảm rõ rệt sử

dụng thuốc trừ sâu hóa học [26], [27], [28], [29]

Chế phẩm Bt đã được thương mại bởi nhiều công ty để bảo vệ cây trồng trong nông nghiệp tiêu diệt một số sâu hại cây trồng như Lymantria dispar,

Choristoneura fumiferana Giữa những năm 1970 và 1990, B thuringiensis

subsp aizawai mà đặc hiệu đối với ấu trùng của một số loài sâu hại như

Spodoptera spp , và các dưới loài khác như tenebrionis and san-diego [30],

có tác dụng tiêu diệt bọ cánh cứng đã được thương mại hoá Sau đó các chủng

Bt với những độc tố khác nhau đã được giới thiệu Ví dụ: 4 chủng Bt mới có

tên LMG P-12592, LMG P-12593, LMG P-12594, and LMG P-13493 đượcchứng minh là có tác dụng tiêu diệt sâu hại thuộc bộ cánh vảy

Công nghệ sinh học đã phát hiện các chủng vi khuẩn mang gen tái tổ

hợp để biểu hiện gen mã hoá protein Cry Các thao tác về gen đã làm đơn giản

hoá và cải thiện kiểm soát sâu hại chính trong nông nghiệp Như đề cập ở trên,

thuốc trừ sâu Bt rất hữu dụng để tiêu diệt côn trùng gây hại Tuy nhiên nhiều nghiên cứu đã công bố sự phát triển của tính kháng độc tố Bt của Bacillus

thuringiensis dẫn đến làm giảm hiệu quả của độc tố Bt đối với côn trùng gây

hại Mặt khác chế phẩm Bt chỉ có tác dụng tiêu diệt sâu sinh sống trên bề mặt

cây trồng mà không thể diệt được các loại sâu đục thân Hơn nữa, chế phẩm

Bt dễ bị mất hoạt tính dưới tác động của các yếu tố của môi trường như ánh

sáng mặt trời Chính vì vậy cây trồng chuyển gen đã được phát triển và được

sử dụng rộng rãi trên thế giới Cây trồng chuyển gen đầu tiên là cây thuốc láđược sản suất trong năm

1983 sử dụng Agrobacterium tumefaciens [31] Vài năm sau, gen Cry mã hoá

protein có tác dụng bảo vệ cây cà chua, thuốc lá và bông được biểu hiện trongcây trồng [32]

Trong năm 1995, Cây cà chua sản xuất protein Cry3A để kiểm soát sâu hại lần đầu tiên được thương mại hóa ở Mỹ Ngô và bông sản xuất Cry 1A có

tác dụng tiêu diệt côn trùng cánh vảy cũng được trồng trong những năm tiếptheo Sau đó, nhiều loại cây trồng như lúa, ngô, bông, cà chua đã được chuyển

gen Cry từ vi khuẩn Bt có tác dụng tiêu diệt nhiều loại côn trùng gây hại quan trọng [32], [33], [34] Ví dụ, gen của vi khuẩn Bt (Cry1Ac, Cry1Ab, Cry2Ab, and Cry1F) của cây bông được biểu hiện và thương mại hoá tại 11 quốc gia trong năm 2009 [35] Năm 2009, ngô Bt biểu hiện nhiều gen (Cry1Ab, Cry1F,

Cry3Bb1, VIP3A, ry34Ab1/Cry35Ab, Cry2Ab) được thương mại hoá tại

nhiều quốc gia

Trong năm 2010, diện tích trồng bông chuyển gen Bt toàn cầu là 19,6

triệu hecta tăng 4,6 triệu hecta so với năm 2009 Bốn quốc gia là Mỹ,

Argentina, Ấn Độ và Canada có diện tích trồng cây chuyển gen Bt chiếm 90% diện tích cây trồng chuyển gen Bt toàn cầu [35].

Cuối năm 2013, cây trồng chuyển gen được trồng trên 28,8 triệu hecta

Từ năm 1996 đến 2012, giá trị của cây trồng chuyển gen Bt ước tính đạt 68,9

tỷ USD, chiếm 60% giá trị của cây trồng chuyển gen toàn cầu Tính riêngnăm

2012, giá trị cây trồng chuyển gen đạt khoảng 12 tỷ USD so với 18,7 tỷ USDcủa giá trị cây trồng chuyển gen toàn cầu [36]

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu va ứng dụng của Bt tại Việt Nam

Ở Việt Nam thuốc trừ sâu vi sinh Bt đã được ứng dụng đầu tiên tại Viện

Bảo vệ Thực vật năm 1971 Nguyễn Công Bình, Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình

Bính là những người đầu tiên mở đường nghiên cứu Bt tại Việt Nam Năm

1973, Viện Sinh vật đã tiến hành sản xuất Bt bằng phương pháp thủ công và bán công nghiệp trong phòng thí nghiệm Năm 1973-1976, Bt đã được sản

xuất chủ yếu trên môi trường đặc với giá thể là agar tự chế tạo từ rong câu vàcác nguyên liệu khác như: bã khô lạc, bột đậu tương, bột cá Các chế phẩmnày đã được sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và đã thu được các kết

quả tốt đẹp Năm 1975, chế phẩm Bt đã được sản xuất theo phương pháp lên

men chìm trong nồi lên men tự tạo tại Phòng Sinh học thực nghiệm thuộcphân viện Viện Khoa học đóng tại thành phố Hồ Chí Minh Năm 1982, Viện

Công nghệ thực phẩm cũng sản xuất chế phẩm Bt theo phương pháp lên men

chìm với dung tích nồi lên men là 5m3.Trong thời kỳ này đã bắt đầu sản xuất

và áp dụng thành công chế phẩm Bt đã khiến cho các nghiên cứu Bt mở đầu

khá thuận lợi và tốt đẹp [ 3]

Trong những năm trở lại đây, việc ứng dụng Bt được mở rộng hơn Hiện đã có rất nhiều cơ quan đi sâu vào nghiên cứu Bt như: Viện Công nghệ

Sinh

học, Viện Bảo vệ Thực vật, Viện Công nghệ Sau Thu hoạch, Viện Côngnghiệp Thực phẩm Tuy vậy cho tới nay ở nước ta vẫn chưa có cơ sở sản

xuất thuốc trừ sâu Bt trên quy mô công nghiệp.

Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gen có trong các chủng

Bt phân lập tại Việt Nam, Ngô Đình Bính và cộng sự đã tách dòng và biểu

hiện gen mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu khoang trong E.

coli từ các chủng Bt aizaiwai phân lập từ các mẫu đất của Hà Nội và Hà Tĩnh,

các protein tái tổ hợp thu được đã cho hiệu quả diệt sâu cao hơn so với đốichứng Năm 2000, Võ Thị Thứ và cộng sự đã tách dòng và biểu hiện gen mã

hóa protein cry4A diệt ấu trùng muỗi Năm 2003, Lê Thị Thu Hiền đã thiết kế thành công vectơ chuyển gen cry1A vào cây bông [1].

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gen kháng côn trùngvào cây trồng để tạo ra các cây có khả năng kháng các sâu bệnh mới đã đượcbắt đầu từ cuối thế kỷ 20 Trong đó, đã có rất nhiều nghiên cứu chuyển gen

cry1A kháng sâu vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để tạo ra các giống cây trồng mới có khả năng kháng sâu như:

cây đậu xanh, cây cải bông [ 9], [10] Năm 2003, Phan Đình Pháp và cộng sự

đã chuyển gen cry1B vào cây lúa thông qua phương pháp sử dụng súng bắn

gen, đến năm

2005, gen kháng sâu trên được chuyển vào cây cà tím thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens [11].

1.2 Đại cương về vi khuẩn Bt

1.2.1 Sự phân bô của Bt

Bacillus thuringiensis tồn tại ở khắp mọi nơi trong đất và trên bề mặt lá,

ở đất rừng, thảo nguyên, sa mạc hay ở môi trường có điều kiện thuận lợi chosâu bọ phát triển như bụi hạt từ các nhà máy xay lúa mì, trong các kho bảo

quản ngũ cốc…Sự phân bố của Bt là không liên quan đến sự phân bố của côn trùng đích Tuy nhiên, Bt thường có xu hướng tồn tại nhiều trong môi trường

có nhiều sâu bọ phát triển và giàu dinh dưỡng Bt được xem như là loài vi khuẩn bản địa tồn tại trong rất nhiều môi trường khác nhau Meadows phân

chia ra 3 ổ sinh

thái phổ biến của Bt trong môi trường tự nhiên là côn trùng, thực vật và đất [13] Bt dễ dàng phát triển trong môi trường thí nghiệm chỉ với một lượng tối thiểu chất dinh dưỡng Mặc dù bào tử Bt tồn tại trong nhiều năm, nhưng chúng

không nảy mầm và nhân lên như các tế bào sinh dưỡng trong đất tự nhiên

1.2.2 Đặc điểm hình thái

Bt là thành viên của nhóm 1, chi Bacillus, là khuẩn gram dương, tế bào

dạng hình que, kích thước 3-6μm, có thể đứng riêng rẽ hoặc tạo thành chuỗi

Vi khuẩn hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng di độngnhờ có tiêm mao mọc trên bề mặt tế bào

Là một loài thuộc chi Bacillus nên khi gặp điều kiện không thuận lợi như thiếu dinh dưỡng, nhiệt độ cao, khô hạn Bt có khả năng sinh nội bào tử

để chống lại những điều kiện bất lợi

Quá trình sống của Bt chia thành 3 giai đoạn:

* Thể dinh dưỡng: Hình que, 2 đầu tù, thường đứng riêng hoặc có thểtạo thành chuỗi Sinh sản bằng cách phân chia theo chiều ngang

* Nang bào tử: Tế bào trưởng thành, dạng hình trứng dài, to hơn thểdinh dưỡng, một đầu hình thành bào tử hình tròn (bầu dục), đầu kia hình thànhtinh

3-15 lớp, chủ yếu là protein sừng Áo bào tử có sức đề kháng cao với lizozim,

proteinaza, các chất hoạt động bề mặt, có tính thẩm thấu kém với các cation.

Dưới áo bào tử là lớp vỏ bào tử.Vỏ bào tử chứa một lượng lớn peptidoglycan đặc biệt, ít liên kết chéo, ngoài ra còn có 7-10 % dipicolinat canxi không chứa

axit teicoic Áp suất thẩm thấu của lớp vỏ bào tử cao tới 20 atm, lượng chưa

nước là 70 % Dưới lớp vỏ bào tử là lõi bào tử còn gọi là thể chất nguyên sinhcấu tạo bởi 4 thành phần: thành bào tử, nang bào tử, bào tử chất và vùng nhân

Hình 1.1A Chủng Bt mang bào tử

Tinh thể là một loại protein có kích thước khoảng 0,6 x 0,02 µm chiếm

khoảng 25% khối lượng khô của tế bào và có hình dạng rất đa dạng: hình tháp,ovan, lập phương hoặc hình dạng không xác định… Khi ở trong tế bào sinhdưỡng thì bào tử và tinh thể thường nằm kề nhau, khi tế bào tan thì bào tử vàtinh thể cùng thoát ra ngoài [3],[13]

1.2.3 Phân biệt B.thuringiensis với các loài khác trong chi Bacillus

Các loài thuộc chi B cereus gồm B cereus, B thuringiensis, B.

anthracis, B mycoides, B megaterium Gần đây có phát hiện thêm 2 loài B weihenstephanensis và B pseudomycoides [2], [3]

Việc sinh ra protein tinh thể là một đặc tính để phân biệt Bacillus

thuringiensis, tuy nhiên đó chỉ là một chỉ tiêu dùng trong mục đích phân loại

bào tử tinh thể

Bảng 1.1 Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus

1.2.4 Đặc điểm sinh hóa

Bt không lên men trên môi trường arrabinoza, xylose, manitol nhưng tạo

axit trong môi trường có chứa glucose, có khả năng thủy phân tinh bột, khửnitrat thành nitrit, phát triển được ở môi trường có chứa 0,001 % lysozyme, 7

% NaCl với pH =

5.7, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà Không sử dụng axit citric, không khử muối

sunphat

Bt có khả năng sinh trưởng phát triển tốt ở nhiệt độ dao động từ 15 –

45ºC Nhiệt độ tối ưu là 20-30°C

Bt không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối ưu cho sự phát triển của là

pH = 7 Bt có khả năng oxy hóa hydrocacbon đến axit hữu cơ và dioxit cacbon theo chu trình Embden – Meyerhoff – Panas [3].

 Khả năng hình thành enzyme leucitinase

 Cấu trúc tinh thể và khả năng gây bệnh cho côn trùng

 Đặc tính huyết thanh học

 Phản ứng ngưng kết của các tế bào sinh dưỡng với các huyết thanh tương

Cho đến nay, khoá phân loại vi khuẩn Bt theo phương pháp huyết

thanh được De Barjac và Bonnefoi đề nghị vào năm 1962, sau đó đượcLauren và Thyery cải tiến năm 1996, được sử dụng phổ biến và là phương

pháp đáng tin cậy được trung tâm quốc tế Bt đặt tại viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm nghiên cứu Bt trên thế

giới từ năm 1982 [2], [3]

Nguyên lí: Khi kháng nguyên lông roi kết hợp với kháng thể xảy raphản ứng ngưng kết Kết quả của phản ứng là tạo cặn lắng màu trắng xuốngđáy ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường Dưới kính hiển vi đối phahoặc kính hiển vi quang học có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lạikhông chuyển động được Đến năm 2003, người ta đã phát hiện được 69 typ

huyết thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh khác của Bt [3], [13].

Tuy nhiên việc phân loại chỉ dựa trên typ huyết thanh vẫn chưa phảnánh được mối liên hệ giữa chủng giống và hoạt lực diệt côn trùng Việc phân

lập và tuyển chọn các chủng Bt có giá trị vẫn gặp khó khăn Chính vì vậy, gần

đây một số nhà khoa học đã đề nghị đưa ra phương pháp phân loại mới dựatrên kết quả xác định typ huyết thanh, hình dạng tinh thể, hoạt lực diệt côn

trùng, gen Cry và thành phần protein tinh thể, hình dạng tinh thể và hoạt lực

diệt côn trùng

đặc hiệu.

Phản ứng ngưng kết.

Hình 1.2 Phản ứng ngưng kết của vi khuẩn Bt với kháng nguyên lông roi H

1.2.6 Đặc điểm loai phụ Bacillus thuringiensis var kurstaki

Bacillus thuringiensis var kurstaki được phát hiện lần đầu tiên năm

1901, Tuy vậy tiềm năng thương mại của nó đã bị lãng quên cho đến mãi năm1951

Trong các thập kỷ gần đây, Bt var kurstaki đã trở thành phương tiện

chủ yếu để kiểm soát sâu hại cây vân sam tại Canada Đến năm 1986, việc sử

dụng Bt var kurstaki tăng một cách đáng kể, khoảng 74% rừng được phun đối

với sâu hại cây vân sam

Ở các nước khác, Bt var kurstaki được sử dụng để trừ sâu bướm, bướm

đêm, sâu thuốc lá và đặc biệt là sâu tơ hại bắp cải, sinh sản nhanh, thời gian

sống ngắn nhưng mức độ phá hoại cao Bacillus thuringiensis var kurstaki là một trong số 82 dưới loài của vi khuẩn B thuringiensis và chiếm tỉ lệ cao

nhất Theo các tài liệu công bố, thì trong số 83,5% số chủng kiểm tra ngưng

kết với các typ huyết thanh đã có thì Bacillus thuringiensis var kurstaki ngưng kết với typ H3a,3b,3c chiếm 27,6%, sau là B thuringiensis var.

azawai ngưng kết với typ H7 chiếm 15%, B thuringiensis var morrisoni ngưng

tinh thể hình lưỡng tháp, hình lập phương và hình cầu trong đó hình lưỡng

tháp là chủ yếu cà có hoạt tính với côn trùng bộ cánh vẩy (Lepidoptera), và một số côn trùng bộ hai cánh (Diptera) Các tinh thể có trọng lương phân tử

130 – 140kDa được mã hóa bởi 130 gen cry1 khác nhau từ cry1A – cry1F Dưới đây là bảng phân loại độc tố Cry1 ở Bacillus thuringiensis var kurstaki

và côn trùng [3]

Bảng1.2: Phân loại độc tố Cry1 ở Bt var kurstaki và côn trùng đích

Độc tô Trọng lượng

Cry 1Aa 132,2 Mandacasexta, Bomby mori, Pieris brassiace, Plutella

xylostella, Ostri nianubilalis Cry 1Ab 131 Heliothis vires cens, Mandacasexta, Pieris brassiace Cry 1 Ac 133,3 Tricho plusiani, Ostrinia nianubilalis, Heliothis

virescens, Manduca sexta, Pieris brassiace Cry 1 B 138 Pieris brassiace

Cry 1 C 134,8 Spodoptera littoralis, Pieris brassiace, Spodoptera

exigua, Mamestra brassicae Cry 1D 132,5 Manduca sexta, Spodoptera exgua

Cry 1E 130 Manduca sexta, Spodoptera exgua, Spodoptera littoralis Cry 1 F 133,6 Ostrinia nianubilalis, Heliothis virescens, Spodoptera

exgua

1.2.7 Tính chất nuôi cấy

Tính chất nuôi cấy của các loài Bt khác nhau là khác nhau, đồng thời

phụ thuộc vào thành phần môi trường, thời gian và nhiệt độ nuôi cấy

Khuẩn lạc nuôi cấy trên môi trường MPA của dưới loài Bt var kurstaki

ở 30ºC trong 72 giờ có đa số có hình tròn, màu trắng sữa có mép nhăn Đườngkính có thể đạt tới 8 -10 mm [3], [4]