Nghiên cứu xác định tên khoa học, quy trình nhân giống in vitro và hoạt tính sinh học của tinh dầu cây gừng bản địa ở bắc kạn (gừng đá) tt

Nhằm tạo cơ sở dữ liệu về đặc điểm sinh học phục vụ cho công tác định danh, bước đầu xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu thu được từ cây gừng bản địa ở Bắc Kạn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VŨ XUÂN DƯƠNG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC, QUY TRÌNH NHÂN GỐNG IN VITRO VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA TINH DẦU CÂY GỪNG BẢN ĐỊA Ở BẮC KẠN (GỪNG ĐÁ)

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Mã số : 9.42.02.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2019

Công trình được hoàn thành tại:

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn khoa học:

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ họp

tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

ngày….tháng….năm…

Có thể tìm kiếm luận án tại thư viện:

1 Thư viện Quốc gia Việt Nam

2 Thư viện của Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây gừng bản địa ở Bắc Kạn (Gừng đá) được xếp vào nhóm cây quý hiếm cần được bảo tồn theo Quyết định số 80/2005/QĐ-BNN ngày 05/12/2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Gừng đá là loài bản địa mang tính chất đặc sản của tỉnh Bắc Kạn, chúng được phân bố chủ yếu ở các xã Liêm Thủy, Xuân Dương thuộc huyện Na Rì, tỉnh Bắc Kạn Trong những năm gần đây, nhu cầu sử dụng Gừng đá của người dân địa phương và du khách khi đến Bắc Kạn tăng cao, đặc biệt vào các dịp lễ tết, giá thành thường dao động từ 600 nghìn đến một triệu đồng/ 1kg tươi Điều này dẫn đến việc khai thác ngày càng cạn kiệt nguồn gen Gừng đá mọc tự nhiên

Mặc dù hiệu quả kinh tế cao, nhưng hiện nay Gừng đá được trồng chủ yếu theo kinh nghiệm, diện tích manh mún, nhỏ lẻ, việc nhân và giữ giống vẫn theo kinh nghiệm của người dân, do vậy củ giống không đảm bảo về chất lượng, nhiễm bệnh nhiều và dần thoái hóa Hơn nữa, hiện nay tên khoa học của loài này chưa được xác định cụ thể Do đặc điểm hình

thái của cây có nhiều đặc điểm giống với cây gừng thường (Zingiber officinarum Roscoe) nên hiện được xếp vào chi Gừng (Zingiber), tên khoa học trong Quyết định số 80/2005/QĐ-BNN là “Zingiber sp.”

Nhằm tạo cơ sở dữ liệu về đặc điểm sinh học phục vụ cho công tác định danh, bước đầu xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu thu được từ cây gừng bản địa ở Bắc Kạn, đồng thời xây dựng quy trình nhân nhanh từ lát cắt chồi, áp dụng vào việc tạo nguồn giống sạch

bệnh cung cấp cho người dân, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu xác định tên khoa học, quy trình nhân giống in vitro và hoạt tính sinh học của tinh dầu cây gừng bản địa ở Bắc Kạn (Gừng đá)”

2 Mục tiêu của luận án

Xác định loài, đặc điểm sinh học, thành phần hóa học, hoạt tính sinh học tinh dầu và xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống bằng công

nghệ nuôi cấy mô từ lát cắt chồi góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen gừng bản địa Bắc Kạn

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Cung cấp các dẫn liệu khoa học về đặc điểm sinh học và khả năng nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô của loài gừng Bắc Kạn, là cơ sở

để bảo tồn và phát triển nguồn gen có giá trị;

Kết quả luận án là tà liệu tham khảo cho nghiên cứu và đào tạo

Cấu trúc của luận án: Luận án chính gồm 116 trang với 25 bảng

số liệu và 29 hình Luận án gồm 5 phần: Mở đầu (3 trang); Tổng quan tài liệu (32 trang); Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu (19 trang); Kết quả và thảo luận (60 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang)

Luận án tham khảo 118 tài liệu trong đó 35 tài liệu tiếng Việt và 83 tài liệu tiếng Anh

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Phần Tổng quan tà liệu trình bày khái quát chung về họ Gừng (Zingiberaceae Lindl.) Tình hình nghiên cứu đa dạng sinh học và phân loại cây họ Gừng, qua đó cho thấy việc nghiên cứu phân loại các loài trong họ Gừng tiếp tục phát hiện các loài mới cho khoa học hoặc ghi nhận sự phân bố của các loài ở các địa phương, các nước khác nhau Đây là cơ sở để tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện, sắp xếp hệ thống phân loại các loài trong họ Gừng, tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn, nhằm khai thác giá trị sử dụng và bảo tồn các loài có giá trị trong họ này Với cây gừng Bắc Kạn, hiện nay chưa có công trình nghiên cứu nào nhằm xác định chính xác tên khoa học của loài Do đó, cần thiết phải có nghiên cứu bài bản nhằm xác định tên khoa học của loài và vị trí phân loại của chúng trong họ Gừng dựa vào phân tích đặc điểm hình thái và ứng dụng công nghệ sinh học giải trình tự vùng ITS-rADN (Internal

transcribed spacer) và vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) Trong đó các nghiên cứu của Kress et al., (2002, 2005) được phân tích

làm cơ sở cho nghiên cứu này

Phân tích các kết quả đã đạt được trong việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống cây họ gừng trên Thế giới và ở Việt Nam Trong đó tập trung phân tích nghiên cứu của Trịnh Thị Thanh Hương và cộng sự (2014) là cơ sở để thực hiện nghiên cứu này

Phần tổng quan tài liệu cũng đề cập tới một số công trình nghiên cứu về thành phần hóa học tinh dầu của các cây thuộc họ gừng, qua đó cho thấy, các nghiên cứu về tinh dầu cây họ gừng còn chưa nhiều, đặc biệt đối với các loài phân bố trong tự nhiên và gần như chưa có nghiên cứu về thành phần hóa học tinh dầu cây nuôi cấy mô so với cây mọc tự

nhiên Do đó cần có các nghiên cứu một cách có hệ thống để đánh giá ảnh hưởng của việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy

mô đến thành phần hóa học trong tinh dầu, từ đó có các giải pháp nhằm khai thác và sử dụng cây có tinh dầu hiệu quả

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Cây gừng bản địa Bắc Kạn (Gừng đá)

- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện đối với các mẫu gừng thu thập tại tỉnh Bắc Kạn Đề tài tập trung xác định vị trí phân loại loài gừng Bắc Kạn bằng phân tích hình thái và chỉ thị phân tử trình tự

gen matK và ITS Phân tích thành phần hóa học, hoạt tính sinh học tinh

dầu và xây dựng quy trình nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô từ lát cắt chồi

2.2 Vật liệu nghiên cứu

- Mẫu vật là những cây mọc tự nhiên (mẫu hoang dã) được thu thập tại 02 xã Liêm Thủy và Xuân Dương thuộc huyện Na Rì tỉnh Bắc Kạn, độ cao từ 846 - 862m so với mực nước biển Tổng số mẫu được sử dụng để

phân tích hình thái và giải trình tự gen ITS và gen matK là 06 mẫu

- Vật liệu sử dụng để nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro là chồi

mới tái sinh từ cây mẹ khỏe mạnh, sạch bệnh Kích thước chồi từ 6 – 8cm

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Xác định loài gừng bản địa Bắc Kạn dựa vào phân

tích đặc điểm hình thái và giải trình tự đoạn gen ITS và gen matK

- Nội dung 2: Hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân giống cây gừng Bắc Kạn bằng công nghệ nuôi cấy lớp mỏng in vitro

- Nội dung 3: Đặc điểm nông sinh học cây gừng Bắc Kạn có nguồn gốc nuôi cấy mô

- Nội dung 4: Xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học tinh dầu gừng Bắc Kạn

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp phân loại dựa vào đặc điểm hình thái

Sử dụng phương pháp hình thái so sánh, tham khảo các chuyên khảo của Phạm Hoàng Hộ (2000) [20], Nguyễn Quốc Bình (2011) [6]

và Thực vật chí Trung Quốc [48]

2.4.2 Phương pháp phân loại thực vật dựa trên trình tự gen

2.4.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

2.4.2.2 Điện di kiểm tra kết quả tách chiết DNA tổng số

2.4.2.3 Kiểm tra chất lượng DNA trên gel agarose

2.4.2.4 Kiểm tra chất lượng DNA bằng máy đo quang phổ

2.4.2.5 Khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR

2.4.2.6 Giải trình tự sản phẩm PCR

2.4.2.7 Hiệu chỉnh trình tự

2.4.2.8 Xây dựng cây phát sinh loài

2.4.3 Phương pháp nuôi cấy mô

2.4.3.1 Nghiên cứu tạo mẫu sạch in vitro

2.4.3.2 Nghiên cứu tạo callus

2.4.3.3 Nghiên cứu tái sinh chồi từ callus

2.4.3.4 Nghiên cứu nhân nhanh chồi

2.4.3.5 Nghiên cứu tạo cây con hoàn chỉnh

2.4.3.6 Nghiên cứu chế độ luyện cây và giá thể ra ngôi

2.4.3.7 Nghiên cứu biến đổi sinh lý, hóa sinh cây in vitro giai đoạn ra ngôi

2.4.4 Đặc điểm sinh trưởng phát triển cây có nguồn gốc in vitro

2.4.5 Phương pháp phân tích sinh hóa

Chưng cất thu tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước Việc phân tích định tính được thực hiện trên hệ thống thiết bị sắc ký khí và phổ ký liên hợp GC/MS của hãng Agilent Technologies HP 6890N

2.4.6 Phương pháp phân tích hoạt tính kháng vi sinh vật

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá khả năng kháng sinh của các mẫu chiết được thực hiện trên phiến vi lượng 96 giếng theo phương pháp của Vander Bergher và Vlietlinck (1991) và McKane & Kandel (1996)

2.5 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Các nghiên cứu về phân tích đặc điểm hình thái được thực hiện tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam – 18 Hoàng Quốc Việt – Hà Nội Các mẫu tiêu bản được gửi kiểm tra tại Viện Hàn lâm Khoa học Trung Quốc, Quảng Châu, Trung Quốc Thời gian thực hiện: từ 2/2016 - 6/2017

Các nghiên cứu về giải trình tự đoạn gen đặc trưng được thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học -Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Thời gian thực hiện: từ 01/2017 - 7/2017

Các nghiên cứu về nhân giống in vitro được thực hiện tại Viện Di

truyền Nông nghiệp – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam; Trường Đại học Hùng Vương – Thành phố Việt Trì – Tỉnh Phú Thọ Thời gian thực hiện: từ 2/2016 - 6/2017

Các nghiên cứu về phân tích hóa sinh, hoạt tính kháng sinh được thực hiện tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Thời gian thực hiện: từ 7/2017 - 8/2018

Các nghiên cứu về đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của cây gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô được thực hiện tại tỉnh Phú Thọ và Huyện Na Rì – tỉnh Bắc Kạn Thời gian thực hiện: từ 4/2016 - 8/2018

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Vị trí phân loại cây gừng Bắc Kạn

3.1.1 Đặc điểm sinh học của cây gừng Bắc Kạn

3.1.1.1 Một số đặc điểm hình thái nông học

Bảng 3.1: Một số tính trạng đặc trưng của gừng Bắc Kạn

3.1.2 Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái

3.1.2.1 Phân loại đến bậc chi

Kết quả mô tả hình thái so sánh với khóa phân loại của Nguyễn Quốc Bình (2011), cây gừng Bắc Kạn với các đặc điểm cây có cụm hoa trên ngọn, thân có lá, nhị lép hình dùi, quả hình cầu, đây là các đặc điểm của

các loài cây thuộc chi Riềng (Alpinia) để phân biệt với các loài trong các

chi khác thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) [6] Trên cơ sở đó chúng tôi xác

định loài cây có tên là Gừng đá ở Bắc Kạn thuộc chi Riềng (Alpinia), đây

là một trong những phát hiện mới có giá trị vì trước đó chúng được người dân gọi tên thông thường là “Gừng đá” và được hiểu là cây thuộc chi Gừng

(Zingiber)

3.1.2.2 Phân loại đến bậc loài

Sau khi xác định nguồn gen gừng Bắc Kạn thuộc chi Riềng

(Alpinia), chúng tôi sử dụng khóa phân loại đến loài trong chi Riềng (Alpinia) ở Việt Nam [8] Tuy nhiên, mô tả đặc điểm cho thấy loài này

không giống bất cứ loài nào đã công bố tại Việt Nam Trên cơ sở đó chúng tôi tiếp tục rà soát các khu vực lân cận (thuộc Trung Quốc), sử dụng danh mục các loài thực vật và khóa định loại các loài trong chi

Riềng (Alpinia) của Trung Quốc [48] và so sánh với các loài gần, kết quả đã xác định được loài gừng Bắc Kạn có tên khoa học là Alpinia coriandriodora D.Fang với các đặc điểm đặc trưng là: có mùi thơm đặc

trưng, rụng lá bắc Đây là một loài bổ sung cho hệ thực vật Việt Nam,

nâng tổng số loài hiện biết của chi Alpinia Roxb ở Việt Nam lên 34 loài

[18] Loài cây này đã được D Fang công bố trong tạp chí Acta Phytotax Sin 16 (4): 79 năm 1978 [57]

3.1.3 Phân loại gừng Bắc Kạn dựa trên trình tự gen ITS và gen matK

3.1.3.1 Tách chiết DNA tổng số

Đã tách chiết được DNA của 6 mẫu nghiên cứu Kết quả cho thấy

chỉ số A260/A280 của tất cả các mẫu đều dao động trong khoảng 2,0, chứng tỏ DNA tổng số thu được đảm bảo cho việc làm các thí nghiệm sau này

1,8-3.1.3.2 Phân tích các sản phẩm khuếch đại

Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR của cặp mồi matK có kích

thước khoảng 900bp, sản phẩm PCR của cặp mồi ITS có kích thước khoảng 800bp phù hợp với kích thước lý thuyết

3.1.3.3 Phân loại gừng Bắc Kạn dựa trên trình tự gen ITS

3.1.3.3.1 Kết quả giải trình tự gen ITS

Đã giải trình tự thành công 06 trình tự ITS mới và đăng ký trên Genbank với các mã số: MN227653, MN227654, MN227655, MN227656, MN227657 và MN227658 (Phụ lục 3)

Sau khi chỉnh sửa và loại bỏ tất cả các vị trí trống vùng gen ITS, các mẫu gừng thu được có trình tự nucleotit vùng gen ITS tương đồng từ 99 - 100% và có chiều dài 698bp Xuất hiện 02 vị trí nucleotit có sự sai khác giữa các mẫu, vị trí nu số 597 trong khi các mẫu GD01LT, GD02LT và GD01XD là nu loại T thì các mẫu còn lại GD03LT, GD02XD, GD03XD lại là nu loại C; vị trí nu số 605 trong mẫu GD03LT là nu loại T thì các mẫu còn lại là nu loại C Sự sai khác giữa các nu ở các vị trí trên có thể cho thấy có sự đa dạng về mặt di truyền giữa các cá thể gừng Bắc Kạn, đây là

cơ sở rất quan trọng để phục vụ cho nghiên cứu chọn dòng trội, lai tạo, chọn giống có năng suất chất lượng cao

Sáu trình tự gen ITS của các mẫu nghiên cứu được so sánh với các

trình tự ITS của chi Alpinia (taxid:94326) công bố trên NCBI bằng công cụ

Blast nucleotit Kết quả cho thấy, các loài có trình tự ITS ở mức độ tương

đồng cao nhất với trình tự ITS của mẫu gừng Bắc Kạn bao gồm: Alpinia chinensis (EU909426.1), Alpinia japonica (EU909427.1), Alpinia officinarum (EU909422.1), Alpinia pumila , Alpinia nieuwenhuizii

3.1.3.3.2 Xây dựng cây phân loại bằng trình tự gen ITS

Cây phân loại mẫu gừng Bắc Kạn bằng chỉ thị gen ITS (Hình 3.7) được xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood với giá trị boostrap 1000, kết quả cho thấy 06 mẫu gừng Bắc Kạn được xếp cùng

nhóm với các loài: Alpinia coriacea, A pumila, A japonica, A polyantha, A intermedia, A stachyodes, A maclurei, A suishaensis, A guangdongensis Kết quả này khá phù hợp vì trong thực tế vì các loài trên đều có cùng khu vực phân bố với loài A coriandriodora thuộc khu vực phía Nam Trung Quốc

3.1.3.4 Phân loại gừng Bắc Kạn dựa trên trình tự gen matK

3.1.3.4.1 Kết quả giải trình tự gen matK

Đã giải trình tự thành công cho 06 trình tự gen matK mới và đăng

ký trên Genbank với các mã số: MN335320, MN335321, MN335322, MN335323, MN335324, MN335325 (Phụ lục 4) Sau khi chỉnh sửa và

loại bỏ tất cả các vị trí trống vùng gen matK, các mẫu gừng thu được

(GD01LT, GD02LT, GD03LT, GD01XD, GD02XD, GD03XD) có trình

tự nucleotide tương đồng 100% và có chiều dài 700bp

Sáu trình tự gen matK của các mẫu nghiên cứu được so sánh với các trình tự matK của chi Alpinia (taxid:94326) công bố trên NCBI bằng công

cụ Blast nucleotit (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Kết quả cho thấy: Các loài có trình tự matK ở mức độ tương đồng cao nhất với trình

tự matK của mẫu gừng Bắc Kạn bao gồm: Alpinia zerumbet, A mutica,

A kwangsiensis, A hainanensis, A uraiensis, A uraiensis, A shimadae,

A formosana, A japonica, A japonica, A chinensis, A calcarata, A oxyphylla

3.1.3.4.2 Xây dựng cây phân loại bằng trình tự gen matK

Dựa trên trình tự gen matK thu được từ các mẫu gừng Bắc Kạn và cơ

sở dữ liệu trình tự gen matK của các loài trong chi Alpinia đã được công

bố, chúng tôi đã xây dựng được sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền

giữa loài A coriandriodora và các loài trong chi Alpinia dựa trên khối dữ liệu kết hợp của vùng gen matK bằng phương pháp Maximum Likelihood

(hình 3.9) Sơ đồ hình cây cho thấy, các mẫu gừng Bắc Kạn cùng nhóm

với các loài: A guinaensis, A zerumbet, A mutica, A polyantha, A mutan, A blepharocalyx, A rugosa, A.calcarata, A macrlure, A guangdongensis và A.japonica

3.1.3.5 Phân loại gừng Bắc Kạn dựa trên trình tự kết hợp gen ITS và matK

Kết quả phát sinh loài từ cây phát sinh được xây dựng bằng khối

dữ liệu đơn như matK và ITS là tương đồng nhau, tuy nhiên chúng thể

hiện rằng kết quả từ khối dữ liệu đơn là không rõ ràng và mức ủng hộ thấp Do đó chúng tôi sử dụng cây phát sinh loài từ khối dữ liệu kết hợp

matK và ITS để xác định mối quan hệ phát sinh loài của chi Alpinia và

vị trí của loài Alpinia coriandriodora (Hình 3.10)

Kết quả phân tích dữ liệu phân tử kết hợp bằng phương pháp maximum likelihood (ML) and Bayesian Inference (BI) đều ủng hộ

mạnh mẽ rằng Alpinia không phải là nhóm đơn phát sinh

(nonmonophyletic group) với chỉ số ủng hộ rất cao (BS: 100%, PP: 1.0)

(Hình 3.10) Cây phân loại đã phân biệt 06 nhánh riêng biệt của Alpinia, kết quả này hoàn toàn tương đồng với nghiên cứu của Kress et al., (2005) [77] Trong đó loài gừng Bắc Kạn (Alpinia coriandriodora) được ghi nhận là một thành viên của chi Alpinia với vị trí phát sinh loài thuộc

nhánh thứ VI (Hình 3.10)

Kết quả phân tích cũng thể hiện rằng loài gừng Bắc Kạn (Alpinia coriandriodora) có mối quan hệ rất gần gũi với một số thành viên Alpinia ở nam Trung Quốc (Quảng Tây, Vân Nam, Quảng Đồng, Hải Nam) như A japonica, A coriacea và A guangdongensis… Kết quả này thể hiện rằng A coriandriodora có sự tương đồng về di truyền với