NGHIÊN CỨU TUYỂN CHON VI KHUẨN TÍA KHÔNG LƯU HUỲNH DỊ DƯỠNG ĐỂ ỨNG DỤNG CHUYỂN HÓA PHẾ THẢI HỮU CƠ THÀNH SINH KHỐI CÓ GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG CAO

Vi khuẩn tía không lưu huỳnh phát triển tốt nhất khi sinh trưởng trong điều kiện quang dị dưỡng, do đó sử dụng hàm lượng chất hữu cơ đậm đặc để làm nguồn carbon.. Vì vậy, với tinh thần k

KHOA SINH HỌC

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHON VI KHUẨN TÍA KHÔNG LƯU HUỲNH DỊ DƯỠNG ĐỂ ỨNG DỤNG CHUYỂN HÓA PHẾ THẢI HỮU CƠ THÀNH SINH

KHỐI CÓ GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG CAO

Khóa luận tốt nghiệp đại học chính quy

Ngành Sinh học (Chương trình đào tạo tài năng)

Hà Nội - 2019

KHOA SINH HỌC

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHON VI KHUẨN TÍA KHÔNG LƯU HUỲNH DỊ DƯỠNG ĐỂ ỨNG DỤNG CHUYỂN HÓA PHẾ THẢI HỮU CƠ THÀNH SINH

KHỐI CÓ GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG CAO

Khóa luận tốt nghiệp đại học chính quy

Ngành Sinh học (Chương trình đào tạo tài năng)

Cán bộ hướng dẫn: TS Phạm Thế Hải

Hà Nội - 2019

Trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và ủng hộ nhiệt tình của nhiều tập thể và cá nhân

Trước hết, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới TS Phạm Thế Hải –

Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp

đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình CN Vũ Hà Phương và

các bạn thuộc phòng thí nghiệm GREEN LAB – Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống và phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh vật học trong suốt thời gian làm khóa luận tốt nghiệp

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô ở bộ môn Vi sinh vật học cũng như các thầy cô thuộc khoa Sinh học – trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQGHN đã tận tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức chuyên môn và tạo điều kiện hết sức cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường

Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi cả về mặt thể chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!

Hà Nội, tháng 5 năm 2019

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

dNTP Nucleoside 5’ -triphosphates Nucleoside 5’ -triphosphates PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

COD Chemical oxygen demand Nhu câu oxy hóa học

VKQH Vi khuẩn quang hợp Vi khuẩn quang hợp

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN VỀ CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2

1.1 Tổng quan về vi khuẩn tía quang hợp không lưu huỳnh 2

1.1.1 Giới thiệu về vi khuẩn quang hợp 2

1.1.2 Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp tía 2

1.1.3 Vi khuẩn tía không lưu huỳnh 4

1.2 Chuyển hóa chất thải hữu cơ thành sinh khối vi khuẩn tía không lưu huỳnh giàu dinh dưỡng 8

1.2.1 Tình trạng xử lý chất thải chăn nuôi và chất thải chế biến thực phẩm ở Việt Nam 9 1.2.2 Việc sử dụng vi khuẩn tía không lưu huỳnh trong xử lý chất thải 10

1.3 Làm giàu vi khuẩn tía không lưu huỳnh 12

1.3.1 Tình hình nghiên cứu 12

1.3.2 Các điều kiện cơ bản 12

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14

2.1 Vật liệu 14

2.1.1 Mẫu nguồn VK tía không lưu huỳnh 14

2.1.2 Hóa chất 14

2.1.3 Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu 14

2.1.4 Thiết bị 15

2.1.5 Chọn lựa nguồn Carbon 15

2.1.6 Chọn lựa nguồn Nito 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Phương pháp làm giàu mẫu nước 15

2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn tía không lưu huỳnh 15

2.2.3 Phương pháp định danh các chủng vi khuẩn tía không lưu huỳnh 16 2.2.4 Phương pháp so sánh hàm lượng sinh khối giữa các chủng VK tía không lưu huỳnh 17

2.2.5 Phương pháp so sánh hàm lượng carotenoid giữa các chủng VK tía không lưu huỳnh 17

2.2.6 Phương pháp so sánh hàm lượng protein giữa các chủng VK tía không lưu huỳnh 18

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

3.1 Kết quả làm giàu và phân lập VK tía không lưu huỳnh 19

3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện làm giàu và phân lập VK tía không lưu huỳnh 19

3.1.2 Kết quả làm giàu VK tía không lưu huỳnh 20

3.2 Kết quả định danh VK tía không lưu huỳnh 20

3.2.1 Kết quả xét hình thái 21

3.2.2 Kết quả kiểm tra hóa sinh 24

3.2.3 Kết quả giải trình tự đoạn 16S rRNA 24

3.3 Kết quả so sánh khả năng sinh trưởng giữa các chủng VK tía không lưu huỳnh trên các nguồn Carbon khác nhau 25

3.3.1 Kết quả so sánh sinh khối 25

3.3.2 Kết quả so sánh hàm lượng carotenoid 26

3.3.3 Kết quả so sánh hàm lượng protein 28

3.4 Kết quả so sánh khả năng sinh trưởng giữa các chủng VK tía không lưu huỳnh trên các nguồn Nito khác nhau 30

3.4.1 Kết quả so sánh sinh khối 30

3.4.2 Kết quả so sánh hàm lượng carotenoid 31

3.4.3 Kết quả so sánh hàm lượng protein 32

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

PHỤ LỤC 38

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1: Sự xuất hiện của vi khuẩn tía không lưu huỳnh ở mương nước thải chăn nuôi11

Hình 2: Kết quả làm giàu VK tía không lưu huỳnh 20

Hình 3: Sản phẩm PCR colony đoạn 16S rRNA kích thước 1400bp của các chủng VK tía không lưu huỳnh 24

Hình 4: Biểu đồ so sánh sinh khối giữa các chủng VK tía không lưu huỳnh 26

Hình 5: Biểu đồ so sánh hàm lượng carotenoid với nguồn Carbon là Glucose 27

Hình 6: Biểu đồ so sánh hàm lượng carotenoid với nguồn Carbon là Maltose 27

Hình 7: Biểu đồ so sánh hàm lượng carotenoid với nguồn Carbon là Tinh bột 28

Hình 8: Biểu đồ so sánh hàm lượng protein với nguồn Carbon là Glucose 29

Hình 9: Biểu đồ so sánh hàm lượng protein với nguồn Carbon là Maltose 29

Hình 10: Biểu đồ so sánh hàm lượng protein với nguồn Carbon là Tinh bột 30

Hình 11: Biểu đồ so sánh sinh khối giữa các chủng VK tía không lưu huỳnh 30

Hình 12: Biểu đồ so sánh hàm lượng carotenoid với nguồn Nito là Amoni clorua 31

Hình 13: Biểu đồ so sánh hàm lượng carotenoid với nguồn Nito là Ure 31

Hình 14: Biểu đồ so sánh hàm lượng carotenoid với nguồn Nito là Peptone 32

Hình 15: Biểu đồ so sánh hàm lượng protein với nguồn Nito là Amoni clorua 32

Hình 16: Biểu đồ so sánh hàm lượng protein với nguồn Nito là Ure 33

Hình 17: Biểu đồ so sánh hàm lượng protein với nguồn Nito là Peptone 33

Hình 18: Kết quả xét tính động 38

Hình 19: Kết quả xét khả năng sử dụng acetate làm nguồn Carbon 38

Hình 20: Kết quả xét khả năng sử dụng glucose làm nguồn Carbon 39

Hình 21: Đường chuẩn protein với trường hợp so sánh hàm lượng protein giữa các nguồn Carbon 39

Hình 22: Đường chuẩn protein với trường hợp so sánh hàm lượng protein giữa các nguồn Nito 40

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.Một số đặc điểm chung của vi khuẩn quang hợp tía [21] 2

Bảng 2: Đặc điểm hình thái của vi khuẩn tía không lưu huỳnh 5

Bảng 3: Ước tính lượng nước thải phát sinh từ hoạt động chăn nuôi trâu, bò, lợn giai đoạn 2012 – 2016 9

Bảng 4: Thành phần phản ứng PCR 17

Bảng 5: So sánh các điều kiện làm giàu và phân lập VK tía không lưu huỳnh 19

Bảng 6: Kết quả xét hình thái 21

Bảng 7: Kết quả kiểm tra hóa sinh 24

Bảng 8: Kết quả phân tích các trình tự 16S rRNA của các đơn chủng 25

MỞ ĐẦU

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp hiệu quả để xử lý hầu hết các chất hữu cơ gây độc có trong chất thải chăn nuôi và chất thải chế biến thực phẩm Tuy nhiên, khác với chất thải công nghiệp nặng, những nguồn chất thải này chứa hàm lượng chất hữu cơ giàu protein, cacbonhydrat và chất béo vì có nguồn gốc từ thực vật, động vật Vì thế, các nhà khoa học đang quan tâm đến vấn đề tái sử dụng nguồn chất hữu cơ này Một trong những phương pháp đó là sử dụng vi khuẩn tía không lưu huỳnh – là một loại vi khuẩn quang hợp

Vi khuẩn tía không lưu huỳnh phát triển tốt nhất khi sinh trưởng trong điều kiện quang dị dưỡng, do đó sử dụng hàm lượng chất hữu cơ đậm đặc để làm nguồn carbon Chất hữu cơ được chuyển hóa trực tiếp thành sinh khối có nhiều giá trị dinh dưỡng (giàu protein, sắc tố, vitamin và một số chất có hoạt tính sinh học cao), hứa hẹn nhiều tiềm năng ứng dụng trong xử lý môi trường, chăn nuôi hoặc nuôi trồng thủy sản Cho đến thời điểm hiện tại, tuy đã có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn tía không lưu huỳnh nhưng vẫn chưa có những công bố cụ thể cho điều kiện làm giàu tối ưu hay nguồn phế thải phù hợp

để vi khuẩn này sinh trưởng đạt hiệu suất cao nhất

Vì vậy, với tinh thần kế thừa việc nghiên cứu và phát triển thêm các biện pháp tối

ưu hóa, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn tía không lưu huỳnh dị dưỡng để ứng dụng chuyển hoá phế thải hữu cơ thành sinh khối có giá trị dinh dưỡng cao”

Chương 1: TỔNG QUAN VỀ CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Tổng quan về vi khuẩn tía quang hợp không lưu huỳnh

1.1.1 Giới thiệu về vi khuẩn quang hợp

Vi khuẩn quang hợp có khả năng chuyển hóa năng lượng mặt trời thành năng lượng hóa học nhờ chứa chlorophyll hoặc bacteriochlorophyll (sắc tố quang hợp vi khuẩn) Bacteriochlorophyll ở vi khuẩn khác với chlorophyll ở thực vật VKQH được chia làm hai nhóm chính là VKQH hiếu khí và VKQH kị khí

Đối với nhóm VKQH hiếu khí có đại diện là vi khuẩn lam VK lam sử dụng chlorophyll là sắc tố quang hợp, sử dụng nước làm nguồn điện tử giống như cơ chế của thực vật Chúng tạo ra oxy nên được là VK hiếu khí

Đối với nhóm VKQH kị khí thì không sử dụng nước làm nguồn hidro như thực vật và không tạo ra sản phẩm cuối cùng là oxi, chúng sử dụng nguồn hidro là sunfit thiosunfat, hidro tự do, chất hữu cơ và sản sinh ra nhiều sản phẩm phụ dạng oxi hóa VKQH kị khí bao gồm: vi khuẩn lục, vi khuẩn tía lưu huỳnh và vi khuẩn tía không lưu huỳnh

1.1.2 Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp tía

1.1.2.1 Đặc điểm chung

VKQH tía là các tế bào gram âm, đơn bào, có các dạng cầu, xoắn, hình que ngắn, hình phẩy… đứng riêng rẽ hoặc thành chuỗi Các loài vi khuẩn này có khả năng chuyển hóa năng lượng mặt trời thành năng lượng hóa học bởi quá trình quang hợp kị khí VKQH tía thường có màu hồng đến màu đỏ tía, sắc tố quang hợp là bacteriochlorophyll và carotenoid Chúng có thể phát triển dị dưỡng với CO2 là nguồn carbon [21]

Bảng 1.Một số đặc điểm chung của vi khuẩn quang hợp tía [21]

Nhóm/ loài -Vi khuẩn tía lưu huỳnh (gammproteobacteria)

-Vi khuẩn tía không lưu huỳnh (alpha- hoặc betaproteobacteria)

Một số loài chính Allochromatium vinosum và Thiocapsa roseopersicina (vi

khuẩn tía lưu huỳnh); Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter

sphaeroides, Rhodospirillum rubrum và Rhodopseudomonas palustris (vi khuẩn tía không lưu huỳnh

Sắc tố/ màu sắc của

huyền phù tế bào

- BChl a hoặc b; carotenoid chính: spirilloxanthin, spheroidene,

lycopene, rhodopsin và dẫn xuất của chúng

- Màu sắc huyền phù tế bào: tía, tía đỏ, tía tím, đỏ, cam, nâu, nâu vàng (với những loài chứa BChl a), xanh hoặc vàng (với những loài chứa BChl b)

- Nếu S0 được hình thành từ quá trình oxy hóa sulfide thì S0

được tích lũy bên trong tế bào, và điều này chỉ xảy ra ở loài vi khuẩn tía lưu huỳnh

Quang tự dưỡng/

hô hấp tối

- Vi khuẩn tía lưu huỳnh bị hạn chế về số lượng

- Vi khuẩn tía không lưu huỳnh đa dạng về số lượng

1.1.2.2 Phân loại của VKQH tía

Năm 1907, Molisch là người đầu tiên phát hiện ra các vi khuẩn có sắc tố màu đỏ

và có khả năng quang hợp nên ông gọi chung nhóm vi khuẩn này là Rhdobacteria Nhóm

vi khuẩn này bao gồm hai họ Thiorhodaeceae (là những vi khuẩn tía có khả năng hình thành giọt “S” bên trong tế bào) và Athiorhodaceae (là những vi khuẩn tía không có khả

năng hình thành giọt “S” bên trong tế bào) [13]

Theo khóa phân loại của Bergey (1989) VKQH được chia làm ba nhóm: vi khuẩn tía quang hợp, vi khuẩn xanh quang hợp và nhóm vi khuẩn hiếu khí chứa bacteriochlorophyll (nhưng không xếp vào hai nhóm trên) Riêng nhóm VKQH tía được chia làm ba họ:

- Họ Chromatiaceae: gồm tất cả các vi khuẩn lưu huỳnh tía có khả năng hình

thành giọt lưu huỳnh bên trong tế bào

- Họ Ectothiorhodospiraceae: gồm tất cả các vi khuẩn lưu huỳnh tía có khả năng

hình thành giọt lưu huỳnh bên ngoài tế bào

- Họ Rhodospirilaceae: gồm tất cả các VKQH tía không tích lũy giọt lưu huỳnh

Tuy nhiên, theo hệ thống phân loại của Bergey (2001) dựa vào thành phần acid béo, quinone, trình tự và kích thước của cytochrome c, VKQH tía lại được xếp vào ba phân lớp:

- Alphaproteobacteria: gồm VKQH tía không lưu huỳnh và VKQH tía hiếu khí

- Betaproteobacteria: cũng gôm VKQH tía không lưu huỳnh

- Gammaproteobacteria: gồm hai họ Chromatiaceae và Ectothiorhodospriraceae

Gần đây, sự phân loại VKQH không chỉ dựa vào các phân tích về hình thái tế bào, đặc tính sinh lý sinh hóa mà còn dựa trên các thông tin về di truyền và nguồn gốc phát sinh Một trong những thông tin di truyền quan trọng được dùng trong phân loại các vi khuẩn là thông tin về trình tự gen 16S rDNA Đây là một gen có tính bảo thủ cao trong quá trình tiến hóa của sinh vật, có kích thước đủ lớn để xác định thông tin di truyên với mức độ tin cậy cao [18] Do đó, trong khóa phân loại của Bergey năm 1994 và hệ thống phân loại của Bergey năm 2001, mối quan hệ di truyền giữa các vi khuẩn đã được thiế lập dựa vào phân tích trình tự gen 16S rDNA

1.1.3 Vi khuẩn tía không lưu huỳnh

1.1.3.1 Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học

Hiện tại có khoảng 20 loài VK tía không lưu huỳnh được tìm thấy (bảng 2), trong

đó 2 loài Rhodobacter và Rhodopseudomonas được sử dụng nhiều nhất để nghiên cứu

về quang hợp kị khí Bảng 2 cho thấy các VK tía không lưu huỳnh đều là VK proteobacteria và các dạng hình thái đặc trưng của tế bào VK tía không lưu huỳnh [21]

VK tía không lưu huỳnh là nhóm vi khuẩn linh hoạt về mặt sinh lý, có thể phát

triển được ở điều kiện quang dưỡng hoặc trong tối Ví dụ Rhodobacter capsulatus (R.capsulatus) với điều kiện quang dưỡng thì sẽ phát triển bằng tự dưỡng hoặc quang dị

dưỡng, với điều kiện trong tối là hô hấp, lên men hoặc hóa dưỡng [20]

Bảng 2: Đặc điểm hình thái của vi khuẩn tía không lưu huỳnh

Phân loại Loài Tên viết tắt Đặc điểm hình

thái Alphaproteobacteria Rhodobaca Rca Cầu hoặc que

ngắn

Betaproteobacteria Rhodocyclus Rcy Phẩy xoắn

1.3.1.1.1 Quang dị dưỡng

Ở điều kiện có ánh sáng, kị khí, phần lớn VK tía không lưu huỳnh có thể phát triển quang tự dưỡng với H2 hoặc lượng thấp sulfide làm nguồn điện tử, một số loài có thể dùng S2O32- hoặc Fe2+ [7, 9] Tuy nhiên, phần lớn VK tía không lưu huỳnh phát triển tốt nhất ở điều kiện quang dị dưỡng với môi trường chứa nguồn chất hữu cơ phù hợp như malate hoặc succinate làm nguồn Carbon và ammonia làm nguồn Nito [29] Phương trình tổng quát của phản ứng quang hợp được viết như sau

CO2 + 2H2A + hv → [CH2O]n + 2A + H2O Chú thích: Ở tảo và thực vật bậc cao: H2A là H2O Ở VK tía: H2A có thể là chất hữu cơ đơn giản, các hợp chất khử của lưu huỳnh hoặc hydro phân tử

Sắc tố quang hợp chính ở vi khuẩn quang hợp là bacteriochlorophyll (Bchl) Hiện nay bacteriochlorophyll được chia thành 5 nhóm a, b, c, d và e theo sự khác nhau về cấu

trúc phân tử và cực đại của phổ hấp thụ trong vùng ánh sáng đỏ Ngoài Bchl, VK tía không lưu huỳnh còn chứa các carotenoid Sự phân biệt màu sắc của các chủng và các loài trong tự nhiên là do sự khác nhau về thành phần Bchl, carotenoid và tỉ lệ hàm lượng của chúng có trong tế bào

1.3.1.1.2 Sinh trưởng và trao đổi chất trong điều kiện không có ánh sáng

Nhiều chất hữu cơ tương tự được dùng trong quang dưỡng có thể được dùng làm chất cho điện tử và nguồn Carbon cho sự sinh trưởng dựa trên hô hấp trong tối Một số

VK tía không lưu huỳnh có thể phát triển trong điều kiện tối kị khí bằng cách lên men hoặc hô hấp yếm khí Ví dụ, pyruvate [10, 31]và một số loại đường nhất định [19, 27]

hỗ trợ sự phát triển lên men của một số VK tía không lưu huỳnh Ngoài ra, sinh trưởng trong điều kiện hóa dưỡng cũng được một số loài VK tía không lưu huỳnh sử dụng với

H2 hoặc S2O32- là nguồn cho điện tử [20]

1.1.3.2 Môi trường sống

VK tía không lưu huỳnh phát triển dày đặc ở những nơi có hàm lượng sulfide thấp hoặc không có VK tía không lưu huỳnh phát triển ít ở môi trường sống của VK tía lưu huỳnh do chúng nhạy cảm với sulfide

VK tía không lưu huỳnh được tìm thấy nhiều trong nước thải [11, 28], những khu vực chất thải có hàm lượng chất hữu cơ đậm đặc – là nguồn Carbon cho sự phát triển dị dưỡng của chúng Trong nghiên cứu của Sifert và cộng sự năm 1978 [28] đã chỉ ra rằng

số lượng trung bình của VK tía không lưu huỳnh trong nước thải nhà máy ở Göttingen,

Đức trong giai đoạn xử lý bùn hoạt tính là cao nhất, được xác định trong khoảng 105 đến

106 tế bào trong 1ml

1.1.3.3 Các nhân tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn tía không lưu huỳnh

1.1.3.3.1 pH

Quang hợp của VK tía không lưu huỳnh có thể xảy ra trong môi trường pH 3 –

11 [12] Tuy nhiên, chúng sinh trưởng và phát triển ở pH tối ưu khoảng 6 -7

1.1.3.3.2 Cường độ ánh sáng

VK tía không lưu huỳnh sử dụng ánh sáng để quang hợp, phát triển mạnh ở môi trường có ánh sáng đỏ, vàng Ngoài phát triển ngoài sáng, chúng có thể phát triển trong bóng tối [12]

cơ chất 4-C với 2 nhóm carboxyl (như malate, succinate) so với khi sinh trưởng trên các nguồn cơ chất khác [29]

1.1.3.3.5 Nguồn Nito

Tất cả các loài VK tía không lưu huỳnh đều có thể sử dụng một số nguồn nito

vô cơ hoặc hữu cơ như amoni, nitrate, glutamate, asparagin, alanine… trong đó amoni

là nguồn nito ưu thích nhất đối với loài vi khuẩn này [14]

1.1.3.3.6 Các yếu tố khác

Nhiều loài VK tía không lưu huỳnh có thể sinh trưởng quang dưỡng với sulfide như là chất cho điện tử với nồng độ nhỏ hơn 2mN (tương đương 64mgS2-/L) Nếu trong môi trường sống với nồng độ sulfide quá cao sẽ ức chế sự sinh trưởng của chúng [12] Ngoài ra nồng độ NaCl trong môi trường cũng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của VK tía không lưu huỳnh

1.1.3.4 Ứng dụng

Nhóm VK tía không lưu huỳnh có các khả năng trao đổi chất rất linh hoạt tùy thuộc vào điều kiện môi trường sống nên chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên Những ứng dụng nổi bật của VK tía không lưu huỳnh là xử lý nước thải, cải thiện môi trường, sản xuất hydro phân tử, sinh khối

1.1.3.4.1 Sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cao

Tế bào VK tía không lưu huỳnh có khả năng tổng hợp một số chất có hoạt tính sinh học cao như Ubiquinone, hormone sinh trưởng thực vật, các chất kháng sinh…Ví

dụ như Ubiquinone 10 (Q10) ở tế bào VK tía không lưu huỳnh có hàm lượng cao hơn các loài vi sinh vật khác Q10 có giá trị về dược liệu, có tác dụng kích thích cơ tim được

sử dụng trong điều trị các bệnh về phổi và còn có thể sử dụng như một chất chống oxy hóa trong sản xuất dược phẩm [25]

1.1.3.4.2 Sản xuất phân bón sinh học

VK tía không lưu huỳnh được làm nguồn phân bón sinh học cho các đối tượng hoa màu và các loại cây ăn quả như cam chanh, khoai tây… đã rất thành công [15, 26]

Bên cạnh đó, người ta còn áp dụng phân bón này trên ruộng lúa ở các nước thuộc khu vực châu Á bởi đảm bảo được nhu cầu về ánh sáng, nguồn cơ chất (hữu cơ hoặc vô cơ) và môi trường ngập nước cũng như không có oxy Đây là điều kiện thuận lợi cho sinh trưởng của VK tía không lưu huỳnh [26]

1.1.3.5 Giá trị dinh dưỡng và khả năng sử dụng sinh khối vi khuẩn tía không lưu huỳnh như thành phần bổ sung vào thức ăn chăn nuôi – thủy sản

Ở tế bào VK tía không lưu huỳnh, hàm lượng protein thường chiếm khoảng 70%; thành phần cũng như hàm lượng các amino acid không thay thế của chúng có thể tương tự như ở đậu tương, thịt và trứng gà Hơn nữa, chúng còn có các hàm lượng cao các vitamin nhóm B (B1, B2, B6 và B12), vitamin E, niacin, acid folic, acid pantothenic

60-và carotenoid Do đó, chúng là những đối tượng lý tưởng trong sản xuất thức ăn cho gia súc, gia cầm và thủy hải sản Ở Việt Nam, các nhà khoa học đã tuyển chọn các chủng

VK tía không lưu huỳnh có khả năng sinh trưởng và loại bỏ hoạt tính sulfide cao nhất để cung cấp thức ăn tại trại giống hải sản cơ sở (Giao Xuân, Giao Thủy, Nam Định và trại giống thủy sản Xuân Đán, Cát Bà, Hải Phòng) với quy mô 300-500 l/ngày, mật độ 109-

1010 TB/ml [1]

1.2 Chuyển hóa chất thải hữu cơ thành sinh khối vi khuẩn tía không lưu huỳnh giàu dinh dưỡng

1.2.1 Tình trạng xử lý chất thải chăn nuôi và chất thải chế biến thực phẩm ở Việt Nam

1.2.1.1 Tình hình xử lý chất thải ở Việt Nam

Những năm gần đây, ngành chăn nuôi tại Việt Nam có xu hướng chuyển dịch từ quy mô hộ gia đình sang chăn nuôi tập trung trên quy mô lớn Ô nhiễm môi trường chăn nuôi tại các vùng nông thôn ngày càng trở nên nghiêm trọng Nguyên nhân chính là do chất thải không được kiểm soát xả thải ra môi trường Khảo sát thực tế tại các trang trại, mặc dù có áp dụng biện pháp xử lý môi trường, nhưng một số cơ sở vẫn gây ô nhiễm do công tác quản lý chưa chặt chẽ và áp dụng công nghệ chưa phù hợp

Theo thống kê, lượng nước thải chăn nuôi phát sinh được ước tính trên số lượng gia súc, gia cầm và hệ số phát sinh nước thải Theo một số nghiên cứu ở Việt Nam, hệ

số phát sinh nước thải trung bình từ họat động chăn nuôi như sau: trâu, bò khoảng 12.5 L/ ngày, lợn khoảng 20 L/ngày với tổng lượng nước thải phát sinh ước tính lên tới trên

Tương tự với nước thải nuôi trồng thủy sản cũng có hàm lượng chất hữu cơ cao (BOD 12 – 35mg/L, COD 20 – 50mg/L), các chất dinh dưỡng (photpho, nito), chất rắn

lơ lửng (12 – 70mg/L) …

Bên cạnh đó, nước thải từ quá trình chế biến lương thực, thực phẩm, chăn nuôi

và giết mổ, đặc biệt là nước thải từ khâu lọc tách bã, ví dụ như tách bột đen của quá trình sản xuất tinh bột từ sắn, dong riềng cũng gây nên ảnh hưởng ô nhiễm hữu cơ nặng nề

Đặc điểm chung của các loại chất thải này là có lưu lượng tương đối lớn và ổn định; chứa các hợp chất hữu cơ (thường ít độc) có nguồn gốc từ động vật và thực vật (chất thải hữu cơ có nguồn gốc từ thực vật chủ yếu là cacbonhydrat, chất thải có nguồn gốc động vật có thành phần đa phần là protein và chất béo); có các thông số ô nhiễm đặc trưng như hàm lượng TSS, BOD5, COD khá cao (cao gấp 10 – 20 lần quy chuẩn), vi khuẩn gây hại; chứa hàm lượng Nito, Photpho khá cao, một số nước thải có hàm lượng muối cũng rất cao

1.2.1.2 Các phương pháp xử lý phế thải

1.2.1.2.1 Phương pháp hóa lý

Phương pháp hóa lý dùng trong xử lý nước thải gồm có: trung hòa, oxy hóa và khử bằng cách sử dụng các chất oxy hóa mạnh như khí oxy, Cl2, potassium ferricyanide, quinone, manganese dioxide…[2, 4] Phương pháp này dùng để loại bỏ các chất hòa tan, trong hệ thống nước khép kín và hiệu quả cao Tuy nhiên, các thiết bị sử dụng để xử lý cần có như: thiết bị sục khí, thiết bị gia nhiệt, máy khuấy… dẫn đến giá thành cao vì nó đòi hỏi phải bổ sung thêm hóa chất Mặt khác, có thể còn gây ra ô nhiễm môi trường thứ cấp do lượng hóa chất bị dư thừa

1.2.1.2.2 Phương pháp sinh học

Phương pháp sinh học được ứng dụng để xử lý nước thải sinh hoạt và nước thải công nghiệp khỏi nhiều chất hữu cơ hòa tan và một số chất vô cơ (H2S, các sunfua, NH3, các nitric…) Quá trình xử lí dựa trên khả năng của vi sinh sử dụng các chất này làm chất dinh dưỡng trong hoạt động sống Các chất hữu cơ đối với vi sinh là nguồn carbon Theo

Buisman và cộng sự (1990), xử lý nước thải bằng phương pháp có những ưu điểm sau:

- Không sử dụng chất xúc tác và chất oxy hóa vì vậy mang hiệu quả kinh tế cao

- Không có hóa chất tồn dư trong bùn nên không gây ô nhiễm thứ cấp cho môi trường nuôi

- Bùn sinh học tạo ra ít

- Tiêu thụ năng lượng ở mức thấp

- Hiệu quả xử lý cao

1.2.2 Việc sử dụng vi khuẩn tía không lưu huỳnh trong xử lý chất thải

Các phương pháp xử lý chất thải chăn nuôi, chất thải chế biến thực phẩm hiện nay đều có ưu điểm là hiệu quả cao, xử lý được các chất hữu cơ hòa tan trong nước Tuy nhiên, đa số đều chưa tái sử dụng được nguồn carbon này Hiện nay, nhiều nhà khoa học đang nghiên cứu các phương pháp, đặc biệt là phương pháp sinh học để tái sử dụng được nguồn carbon này Thông thường, khi lựa chọn đối tượng nghiên cứu thì người ta chọn VKQH nhiều hơn vì trong những nguồn chất thải này thường chứa nhiều chất hữu cơ và hàm lượng oxy hòa tan thấp [16] Đây chính là môi trường tối ưu cho VKQH phát triển, đặc biệt VK tía không lưu huỳnh Tác giả Okubo và cộng sự (2006) đã quan sát thấy VK tía không lưu huỳnh tạo thành một tấm thảm màu đỏ trong kênh chứa nước thải chăn

nuôi và chủ yếu là do các chi Rhodobacter và Rhodopseudomonas tạo nên [24]

Hình 1: Sự xuất hiện của vi khuẩn tía không lưu huỳnh ở mương nước thải chăn

nuôi

Do vậy, để xử lý chất thải đồng thời tái sử dụng, chuyển hóa chất thải thành sinh khối giàu dinh dưỡng, nhiều tác giả đã chọn VK tía không lưu huỳnh vì hiệu quả mang lại tương đối cao: hàm lượng chất hữu cơ trong chất thải được loại bỏ nhờ quá trình sinh trưởng dị dưỡng của nó VK tía không lưu huỳnh có thể sử dụng đa dạng các nguồn carbon với mức độ sinh trưởng cao, đồng thời, tỉ lệ chất hữu cơ được chuyển hóa thành sinh khối giàu dinh dưỡng của VK tía không lưu huỳnh trong quá trình phát triển quang

dị dưỡng cũng cao cao hơn khi so sánh với các vi sinh vật dị dưỡng khác [23] Bên cạnh

đó, VK tía không lưu huỳnh có khả năng sử dụng năng lượng ánh sáng mặt trời trong quá trình xử lý nên giảm bớt chi phí vận hành [17]

1.3 Làm giàu vi khuẩn tía không lưu huỳnh

1.3.1 Tình hình nghiên cứu

Với khả năng ứng dụng hấp dẫn như trên, việc nghiên cứu làm giàu vi khuẩn tía không lưu huỳnh để sử dụng trong chuyển hóa phế thải hữu cơ thành sinh khối đang nhận được nhiều sự quan tâm Vi khuẩn tía không lưu huỳnh sinh trưởng tốt nhất trong điều kiện quang dị dưỡng Môi trường làm giàu VK tía không lưu huỳnh là môi trường cần thiết đáp ứng để chúng sinh trưởng tốt nhất Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc thay đổi từng điều kiện trong môi trường làm giàu như nguồn carbon, nồng độ NaCl, pH đều gây ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng cũng như sắc tố sinh ra Ví dụ, với pH khoảng 9,

nồng độ NaCl 1%, loài Rhodobacter và Rhodovulum có sắc tố vàng hoặc vàng nâu [22]

Đến nay, các nghiên cứu cho điều kiện làm giàu VK tía không lưu huỳnh đều tập trung chú trọng vào các hướng như nguồn chất hữu cơ, nhiệt độ, khoảng pH và hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật khác

1.3.2 Các điều kiện cơ bản

1.3.2.1 Nguồn chất hữu cơ

VK tía không lưu huỳnh có thể dùng đa dạng các nguồn chất hữu cơ để làm nguồn cho điện tử như acid béo, các hợp chất rượu đơn, rượu đa, carbonhydrates hoặc hợp chất vòng thơm Tuy nhiên, phần lớn VK tía không lưu huỳnh dùng những chất hữu cơ dễ sử dụng như malate, pyruvate hoặc succinate làm nguồn carbon và ammonia làm nguồn nito cho sinh trưởng quang dị dưỡng của nó [29]

1.3.2.2 pH

VK tía không lưu huỳnh có thể sinh trưởng trong dải pH rộng nhưng để đạt hiệu suất tối đa thì môi trường làm giàu nên ở mức pH trung tính (mức pH dưới 6 và trên 8 không có lợi cho sự sinh trưởng) [32]

1.3.2.3 Hạn chế sự sinh trưởng của tảo lục

Đôi khi, chủng cấy ban đầu chứa lượng lớn các loài tảo lục, như Euglena hoặc Chlamydomonas, từ đó gây khó khăn cho việc làm giàu VK tía không lưu huỳnh Thành phần môi trường làm giàu nếu sử dụng tartrate hoặc malonate làm nguồn carbon [32] là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến việc sinh trưởng của VK tía không lưu huỳnh chậm hơn so với tảo lục do khả năng tạo oxy nhanh chóng của tảo lục sẽ làm mất đi điều

kiện kị khí cho môi trường làm giàu Ngoài ra, việc sử dụng ánh sáng hồng ngoại cũng hạn chế sự sinh trưởng của tảo lục vì chúng không sinh trưởng được dưới bước sóng trên 750nm [5, 6]

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

2.1.1 Mẫu nguồn VK tía không lưu huỳnh

Mẫu nguồn được lấy từ các nguồn nước thải sinh hoạt: Triều Khúc (Thanh Xuân), Định Công (Hoàng Mai), nước ao hồ: hồ Thành Công (Thành Công) và nước thải từ làng bún Phú Đô (Mỹ Đình)

2.1.2 Hóa chất

Hóa chất sử dụng làm giàu, phân lập VK tía không lưu huỳnh: KH2PO4,

MgSO4.H2O, NaCl, NH4Cl, CaCl2, (CH2COOH)2, cao nấm men, H3BO3, CoCl2.H2O, MnCl2.4H2O, NiCl2.6H2O, Na2MoO4.2H2O, ZnCl2, FeSO4.7H2O, CuCl2 Các hóa chất trên đều được mua từ các hãng đảm bảo tin cậy như Affymetric (Mỹ) hoặc Xilong (Trung Quốc)

Hóa chất sử dụng cho các kiểm tra hóa sinh: acetate, peptone, dextrose, NaCl, phenol red, agarose, meat extract, tinh bột Các hóa chất trên đều được mua từ các hãng đảm bảo tin cậy như Affymetric (Mỹ) hoặc Xilong (Trung Quốc)

Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm sinh học phân tử: Bộ hóa chất sử dụng tách DNA (Glycogen 20mg/l, Ethanol 100%, Amonium acetate); phản ứng PCR (USB Tag PCR Master Mix 2x); điện di kiểm tra sản phẩm PCR ( HydraGreen Safe AND Stain 20 000x, Loading Dye 6x, Gene Ruler 1kb AND Ladder), tinh sạch sản phẩm PCR (ExoSAP-IT PCR Product Cleanup) Tất cả được cung cấp bới Affymetric USB, Merck

và Fermentas (Mỹ)

2.1.3 Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu

Môi trường cơ bản làm giàu VK tía không lưu huỳnh (g/l): KH2PO4-0.33, MgSO4.H2O-0.33, NaCl-0.33, NH4Cl-0.5, CaCl2-0.0377, (CH2COOH)2-1, cao nấm men-0.02, pH=7

Môi trường vi lượng bổ sung vào môi trường cơ bản (g/l): H3BO3-0.02, CaCl20.152, CoCl2.H2O-0.34, MnCl2.4H2O-0.2, NiCl2.6H2O-0.52, NaCl-2, Na2MoO4.2H2O-0.02, ZnCl2-0.2, FeSO4.7H2O-2.2, CuCl2-0.04, pH=3-4

-Môi trường phân lập VK tía không lưu huỳnh (g/l): KH2PO4-0.33, MgSO4.H20.33, NaCl-0.33, NH4Cl-0.5, CaCl2-0.0377, (CH2COOH)2-1.5, cao nấm men-1.02, agar-

O-15, pH=7

Môi trường bán rắn (semi-solid) để kiểm tra tính động (g/l): Peptone-10, NaCl-5, agar-4, cao thịt-3, pH=7

Môi trường acetate differental agar (g/l): NH4H2PO4-1, CH3COONa-2, NaCl-5,

K2HPO4-1, MgSO4.7H2O-0.2, agar-20, Bromothymol blue-0.08, pH=7

Môi trường the phenol red dextrose broth (g/l): Peptone-10, dextrose-5, NaCl-5,

đỏ phenol-0.18, agar-1, pH=7

2.1.4 Thiết bị

Bình kị khí, máy lắc vortex IKA 3 (Đức), máy Thermo Scientific BioMate 3 UV/VIS Spectrophotometer (USA), máy ly tâm KUBOTA 5900, máy ly tâm g65471R (Eppendord Đức), máy Elisa, kính hiển vi quang học (Zeiss, Đức), thiết bị phản ứng nhiệt HACH DRB200 (Trung Quốc)

2.1.5 Chọn lựa nguồn Carbon

Sử dụng Glucose, Maltose và Tinh bột làm 3 nguồn Carbon để so sánh khả năng sinh sinh khối, sinh carotenoid và protein của các chủng VK tía không lưu huỳnh

2.1.6 Chọn lựa nguồn Nito

Sử dụng Ammoni, Ure và Peptone làm 3 nguồn Nito để so sánh khả năng sinh sinh khối, sinh carotenoid và protein của các chủng VK tía không lưu huỳnh

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp làm giàu mẫu nước

Mẫu nước thu được làm giàu trong môi trường cơ bản, đặt trong bình kị khí So sánh khả năng sinh trưởng dưới 2 điều kiện: ánh sáng (ánh sáng có màu vàng và ánh sáng có màu trắng) và nhiệt độ (25oC và 30-35oC)

2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn tía không lưu huỳnh

Pha loãng dịch làm giàu ra các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 Hút 100µL dịch đã pha loãng, nhỏ lên đĩa petri chứa môi trường cơ bản Dùng que trang khửng gạt đều dịch trên bề mặt đĩa cho đến khi mặt thạch khô Đặt đĩa trong chuông kị khí (đốt đèn trong chuông để loại bỏ không khí) Sau khoảng 3 ngày, quan sát trên đĩa xuất hiện khuẩn lạc màu từ đỏ, hồng nâu hoặc tím, tiến hành đánh dấu những khuẩn lạc có hình thái khác nhau (đường kính, hình dạng, màu sắc )

Tinh sạch những khuẩn lạc đã chọn lọc bằng cách dung que cấy khử trùng ria 3 pha trên đĩa petri chứa môi trường cơ bản Đặt đĩa trong điều kiện như trên

2.2.3 Phương pháp định danh các chủng vi khuẩn tía không lưu huỳnh

2.2.3.1 Phương pháp định danh bằng xét hình thái

Phương pháp nhuộm gram: Nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng lên lam kính Nhặt một khuẩn lạc Bacillus/ Ecoli và 1 khuẩn lạc vi khuẩn tía không lưu huỳnh rồi hòa tan vào giọt nước cất, đợi khô Tiếp đó nhỏ tím kết tinh, để 1 phút rồi rửa bằng nước cất, đợi khô Sau đó nhỏ Lugol, để 1 phút rồi rửa bằng ethanol 95% trong 30 giây, đợi khô Cuối cùng nhỏ Safranin, để 1 phút rồi rửa bằng nước cất, đợi khô Soi mẫu dưới kính hiển vi

ở 10X, 40X, 100X

2.2.3.2 Phương pháp định danh bằng kiểm tra hóa sinh

Kiểm tra tính động: chuẩn bị môi trường semi-solid 0,2% agar trong ống nghiệm Dùng que cấy khử trùng chấm 1 khuẩn lạc, chọc thẳng xuống thạch Đậy kín nắp, bọc parafin, đặt trong bình kị khí, chiếu sáng liên tục trong 3 ngày Nếu các chủng mọc lan sang hai bên đường cấy là chủng đó có tính động

Kiểm tra khả năng sử dụng acetate làm nguồn Carbon: chuẩn bị các ống thạch

nghiêng môi trường acetate differential agar Dùng que cấy khử trùng chấm khuẩn lạc

VK tía không lưu huỳnh rồi ria trên bề mặt thạch nghiêng Đặt các ống trong bình kị khí, chiếu sáng liên tục trong 3 ngày Dùng Ecoli làm đối chứng dương Nếu sau 3 ngày, môi trường chuyển từ màu xanh dương sang xanh lục thì chủng VK tía không lưu huỳnh có

sử dụng acetate làm nguồn carbon

Kiểm tra khả năng sử dụng glucose làm nguồn Carbon: chuẩn bị các ống chứa

môi trường bán lỏng the phenol red dextrose broth Dùng que cấy khử trùng chấm khuẩn lạc VK tía không lưu huỳnh rồi hòa đều vào môi trường Đặt các ống trong bình kị khí, chiếu sáng liên tục trong 3 ngày Dùng Ecoli làm đối chứng dương Nếu sau 3 ngày, môi trường chuyển từ màu đỏ sang vàng thì chủng VK tía không lưu huỳnh có sử dụng glucpse làm nguồn carbon

2.2.3.3 Phương pháp định danh bằng sinh học phân tử

Phương pháp PCR colony: Hòa tan 1 khuẩn lạc vào 200 µL nước PCR Sốc nhiệt

ở 100 độ trong 5 phút Sau đó, ly tâm, hút dịch trên, dịch đó là template cho phản ứng PCR Thành phần cho phản ứng PCR:

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel Agarose 1%, nhuộm băng bằng dung dịch HydraGreen Safe AND Strain 20000x và soi trên máy Geldoc

2.2.4 Phương pháp so sánh hàm lượng sinh khối giữa các chủng VK tía không lưu huỳnh

Lấy 1 khuẩn lạc đem nuôi trong dịch môi trường cơ bản nhưng thay thế nguồn Carbon succinate thành glucose, maltose, tinh bột với lượng tương ứng (500mgC/l) và Nito là ammoni thành ure, peptone với lượng tương ứng (500mgN/l) Dịch nuôi sau đó

ly tâm 5000 vòng, 4oC trong 20 phút Thu và lọc tủa qua giấy lọc Sấy khô, thu được sinh khối khô của VK tía không lưu huỳnh

2.2.5 Phương pháp so sánh hàm lượng carotenoid giữa các chủng VK tía không lưu huỳnh

Pha loãng 5ml dịch nuôi ở 2.2.4 với 5ml nước cất Ly tâm 5000 vòng, 4oC trong

20 phút Bỏ dịch nổi, thu cặn Hòa cặn tế bào với 0.2ml nước cất, 9.8ml acetone: methanol Vortex hỗn hợp bọc bằng giấy bạc để tránh ánh sáng, bảo quản ở 5 độ C trong

30 phút Ly tâm ở 5000rpm trong 20 phút ở 4 độ C, thu lấy dịch nổi, đo quang phổ ở bước sóng 480nm Sử dụng dung dịch acetone: methanol làm blank