NGHIÊN cứu VI KHUẨN điện hóa – hóa DƯỠNG vô cơ TRONG PIN NHIÊN LIỆU VI SINH vật được vận HÀNH với các NỒNG độ sắt KHÁC NHAU

20 Hình 6: Đồ thị thể hiện sự phát sinh dòng điện của các MFC trong giai đoạn làm giàu vi khuẩn điện hóa sử dụng FeII là chất cho điện tử .... Xuất phát từ mục đích phát hiện tại chỗ sự

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hà Nội – 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Cán bộ hướng dẫn: TS Phạm Thế Hải

Hà Nội – 2019

Trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp

đỡ và ủng hộ nhiệt tình của nhiều tập thể và cá nhân

Trước hết, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới TS Phạm Thế Hải – Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của ThS Nguyễn Thu Thủy và CN Vũ Hà Phương cùng các anh chị, các bạn thuộc phòng thí nghiệm GREENLAB – Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống và phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học trong suốt thời gian làm khóa luận

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô ở bộ môn Vi sinh vật học cũng như các thầy cô thuộc khoa Sinh học – trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQGHN đã tận tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức chuyên môn

và tạo điều kiện hết sức cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường

Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi cả về mặt thể chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản khóa luận này

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp

đỡ quý báu đó!

Hà Nội, tháng 5 năm 2019

Từ Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt

DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis Điện di gel biến tính

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC BẢNG BIỂU

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Pin nhiên liệu vi sinh vật (Microbial fuel cell - MFC) 2

1.1.1 Lịch sử phát triển của MFC 2

1.1.2 Cấu tạo và nguyên lí hoạt động của MFC 3

1.1.3 Ứng dụng của MFC 4

1.1.4 Vi khuẩn điện hóa- hóa dưỡng vô cơ trong khoang anode của pin nhiên liệu vi sinh vật 7

1.2 Vi khuẩn oxy hóa sắt 8

1.2.1 Đặc điểm vi khuẩn oxy hóa sắt 8

1.2.2 Phân bố vi khuẩn oxy hóa sắt 9

1.2.3 Phân loại vi khuẩn oxy hóa sắt 9

1.2.4 Ý nghĩa của việc nghiên cứu tính đa dạng và và sự biến đổi của quần xã vi sinh vật trong khoang anode của MFC 11

1.3 Các phương pháp nghiên cứu vi khuẩn điện hóa oxi hóa sắt 12

1.3.1 Phương pháp truyền thống 12

1.3.2.Phương pháp điện di trên gel biến tính gradient (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) 12

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14

2.1 Vật liệu 14

2.1.1.1 Hóa chất – vật liệu 14

2.1.1.2 Thiết bị và dụng cụ 15

2.1.2 Nguồn làm giàu vi khuẩn oxy hóa sắt 15

2.2 Phương pháp 16

2.2.2 Xây dựng và vận hành MFC 16

2.2.2.1 Cấu trúc MFC được sử dụng 16

2.2.2.2 Vận hành thiết bị 17

2.2.3 Phương pháp lấy mẫu từ MFC đã làm giàu 20

2.2.4 Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn oxy hóa sắt ở mẫu dịch anode và điện cực anode ở hai nồng độ sắt 1mM và 20mM 21

2.2.5 Phương pháp nuôi cấy và thu dịch đơn chủng để bổ sung vào MFC 22

2.2.6 Phương pháp nhuộm gram và quan sát dưới kính hiển vi 22

2.2.8 Phương pháp PCR 23

2.2.9 Phương pháp DGGE 25

2.2.10 Phương pháp giải và phân tích trình tự gen 16s rARN 26

2.2.11 Phương pháp đo đạc và xử lý số liệu 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

`3.1 Sự tăng sinh dòng điện ở các MFC – bước đầu làm giàu thành công quần xã vi sinh vật oxi hóa sắt 28

3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn sắt từ điện cực và dịch trong khoang anode của các MFC 28

3.3 Kết quả phân tích trình tự các đơn chủng thu được bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống 32

phương pháp PCR – DGGE 33

3.5 Thăm dò khả năng sinh điện của đơn chủng A1 36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

PHỤ LỤC 44

Hình 1: Cấu tạo phổ biến và nguyên lí của một pin nhiên liệu [5] 3

Hình 2: Đồ thị biểu diễn quan hệ giữa cường độ dòng điện với nồng độ Fe(II) trong dịch anode của MFC cảm biến sắt [20] 7

Hình 3: Cây phát sinh của loài vi khuẩn oxi hóa[33] 11

Hình 4:Mô hình MFC sử dụng làm cảm biến sắt 17

Hình 5: Mô hình vận hành MFC được sử dụng 20

Hình 6: Đồ thị thể hiện sự phát sinh dòng điện của các MFC trong giai đoạn làm giàu vi khuẩn điện hóa sử dụng Fe(II) là chất cho điện tử 28

Hình 7: Hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn phân lập được trong các mẫu nghiên cứu 30

Hình 8: Thống kê tỷ lệ các chủng vi khuẩn phân lập được từ điện cực của các MFC vận hành với các nồng độ sắt khác nhau 30

Hình 9: Thống kê tỷ lệ các chủng vi khuẩn phân lập được từ dịch anode của các MFC vận hành với các nồng độ sắt khác nhau 31

Hình 10: Kết quả khuếch đại gen 16S rRNA với mồi p63F & p1378R 32

Hình 11: Kết quả khuếch đại 16S rDNA 34

Hình 12: Kết quả DGGE phân tích so sánh quần xã anode của các MFC vận hành với nồng độ sắt khác nhau 35

Hình 13: Đồ thị thể hiện sự phát sinh dòng điện khi bổ sung chủng A1 vào pin nhiên liệu vi sinh vật 37

Bảng 1:Một số MFC hoạt động với các chất cho điện tử là các chất vô cơ [23] 8

Bảng 2: Hỗn hợp vi lượng (Dung dịch Trace element) 18

Bảng 3: Môi trường M9 cải tiến cho khoang anode 19

Bảng 4: Dung dịch đệm cho khoang cathode 19

Bảng 5: Môi trường Winograsky 21

Bảng 6: Thành phần và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đoạn 1400bp 24

Bảng 7: Thành phần và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đoạn 550bp 25

Bảng 8: Thành phần dung dịch chất biến tính 0% và 60% 26

Bảng 9: Thành phần “Working solutions” 26

Bảng 10: Phân tích trình tự đoạn 16S rRNA từ các chủng phân lập được (sử dụng dữ liệu giải trình tự DNA trên NCBI) 32

1

MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam cũng như một số nước trên thế giới, nguồn nước sạch được khai thác chủ yếu từ nguồn nước ngầm Tuy nhiên, nguồn nước ngầm đang bị ô nhiễm bởi các chất thải công nghiệp và nước thải sinh hoạt không qua xử lí hoặc xử lí không đạt yêu cầu đã xả thẳng ra ngoài môi trường Hiện tượng này gặp phổ biến ở các khu vực đô thị và các khu công nghiệp Vì vậy, nguồn nước ngầm dễ bị ô nhiễm các kim loại nặng như sắt, asen, mangan, thủy ngân,… Những kim loại này theo chuỗi thức ăn thâm nhập vào cơ thể con người để lại những hậu quả nghiêm trọng

Xuất phát từ mục đích phát hiện tại chỗ sự có mặt của các kim loại này trong nước ngầm với chi phí không cao, pin nhiên liệu vi sinh vật(MFC) sử dụng làm cảm biến phát hiện sắt đã được nhóm nghiên cứu tại Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên chế tạo thành công và bước đầu thể hiện tiềm năng ứng dụng Để hướng tới có thể triển khai ứng dụng thiết bị này trong thực tế, cần có thêm những nghiên cứu cải tiến hiệu quả hoạt động của thiết bị, đặc biệt về vi sinh vật điện hóa trong thiết bị và khả năng hoạt động của chúng trong các điều kiện nồng độ sắt khác nhau

Với mục đích trên, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu vi khuẩn điện hóa – hóa dưỡng vô cơ trong pin nhiên liệu vi sinh vật được vận hành với các nồng độ sắt khác nhau ”

xử lí nước thải Năm 1911, những nghiên cứu đầu tiên về thiết bị này được

thực hiện bởi MC.Potter với ý tưởng sản xuất điện từ vi khuẩn E.coli Ông đã

phát hiện ra rằng, quá trình vi sinh vật phân hủy các hợp chất hữu cơ đã giải phóng ra năng lượng điện Hiệu điện thế tối đa được ghi lại (0,3V - 0,5V) và chưa có một nghiên cứu nào thu được một dòng điện như thế khi nghiên cứu với vi sinh vật[30]

Năm 1931, Barnet Cohen đã thu hút nhiều sự chú ý hơn khi ông tạo ra một số pin nhiên liệu bán vi sinh vật mà khi mắc nối tiếp với nhau có khả năng sản sinh trên 35 vol mặc dù chỉ với dòng điện 2 miliamp [39]

Đến những năm 1980, xuất phát từ ý tưởng mong muốn cung cấp nguồn năng lượng giá rẻ và chất lượng cho các nước đang phát triển MJ Allen

và H.Peter Bennetto đã thực hiện một cuộc cách mạng thiết kế pin nhiên liệu

vi sinh đầu tiên Với những sự hiểu biết về chuỗi vận chuyển điện tử và tiến

bộ trong công nghệ Allen và Bennetoo đã tạo ra thiết kế cơ bản về MFC mà vẫn được sử dụng cho tới ngày nay[4]

Làm thế nào để các electron từ chuỗi vận chuyển electron của vi sinh vật đến được cực âm (anode)? Đây là một câu hỏi lớn đối với các nhà nghiên cứu về MFC Khi nghiên cứu những vấn đề này, vào những năm 1990 B-H Kim – một nhà nghiên cứu thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Hàn Quốc đã phát hiện ra rằng một số loài vi khuẩn hoạt động điện hóa không cần sử dụng chất trung gian để vận chuyển điện tử đến các điện cực [30] Như vậy, pin nhiên liệu vi sinh vật mới được tạo ra không cần sử dụng đến các chất trung gian tốn kém và có khi độc hại

4

Cấu tạo MFC điển hình bao gồm hai khoang: khoang anode (cực âm)

và khoang cathode (cực dương) Hai khoang này được ngăn cách với nhau bởi một màng có khả năng trao đổi ion Màng ngăn cách sẽ thực hiện nhiệm vụ chỉ cho các ion đặc biệt đi qua (H+ hoặc OH-) đồng thời ngăn cách các phản ứng sinh học và hóa học xảy ra trong anode – nơi vi khuẩn phát triển và cathode – nơi các electron phản ứng với các chất nhận điện tử Hai cực này sẽ được nối với nhau thông qua một bộ góp điện bao gồm dây điện và điện trở

có giá trị nhất định để tạo thành một mạch điện khép kín Electron được tạo trong anode sẽ qua điện trở ngoài và sang cathode Tại cathode, electron sẽ được nhận bởi các chất nhận điện tử cuối cùng để hoàn thành quá trình tạo điện sinh học Các chất nhận điện tử cuối cùng thường được dùng như oxi, sulfate, nitrate… nhưng hiệu quả và rẻ tiền nhất vẫn là oxi bởi vì thế oxy hóa khử của cặp O2/H2O (+820mV) có giá trị cao nhất so với các cặp oxy hóa khử khác được dùng để nhận điện tử trong MFC

1.1.3 Ứng dụng của MFC

Trong những năm gần đây, hoạt động nghiên cứu và phát triển mạnh

mẽ của các nhà nghiên cứu khoa học đã đưa MFC ngày càng trở nên hoàn thiện hơn – mang lại nhiều tiềm năng và ứng dụng trong các lĩnh vực công nghệ [7] Với những đặc tính độc đáo của nó, công nghệ MFC có những ứng dụng chính như: sản xuất điện năng, sản xuất hydro sinh học, xử lí nước thải

và cảm biến sinh học … [8] Nhiều ứng dụng đã bắt đầu được thử nghiệm và

có thể đi vào sử dụng rộng rãi trong tương lai không xa

Xử lí nước thải và tái tạo năng lượng: MFC được đưa vào để xử lí

nước thải vào đầu năm 1991[9] Nước thải chứa vô số các hợp chất hữu cơ có thể làm nhiên liệu đầu vào cho MFC Các MFC sau khi làm giàu có thể loại

bỏ tới 80% các hợp chất hữu cơ trong nước thải[10] Nước thải nhà máy bia

và các nhà máy sản xuất thực phẩm có lẽ là hợp lí nhất để xử lí bằng MFC vì những loại nước thải này rất giàu các hợp chất hữu cơ cho các vi sinh vật Đặc biệt nước thải nhà máy bia rất lí tưởng cho việc xử lí bằng MFC bởi các thành

5

phần nước thải, lưu lượng nước thải luôn giống nhau, sự liên tục đó tạo điều kiện cho vi khuẩn thích nghi và hoạt động hiệu quả hơn[4] Quá trình xử lí nước thải bằng MFC là một phương pháp tiên tiến có giá cả phải chăng, phù hợp với các nước đang phát triển và công nghiệp hóa[11]

Hơn nữa, vi sinh vật oxi hóa các chất hữu cơ trong chất thải có thể tạo

ra điện năng với một nguồn điện ổn định[7] Sản xuất điện năng bằng MFC đã mang lại nhiều ưu điểm vượt trội so với các công nghệ sản xuất điện khác như: hiệu suất chuyển hóa cao, năng lượng điện thu từ MFC ổn định và thân thiện với môi trường[7, 12, 13]

Sản xuất hydro sinh học: các MFC có thể được dùng để tạo ra khí

hydro để sử dụng như một nguồn nhiên liệu thay thế Khi được sử dụng dùng

để sản xuất hydro, MFC cần được bổ sung nguồn năng lượng bên ngoài để chuyển hóa tất cả các vật liệu hữu cơ thành carbon dioxide và khí hydro MFC tiêu chuẩn được thay đổi để sản xuất hydro bằng cách giữ cho cả hai khoang anode, cathode đều kỵ khí và cấp cho MFC một nguồn điện 0,25 volt Các bóng khí hydro tạo ra ở cực âm được thu lại và sử dụng như một nguồn nhiên liệu [14]

Phương pháp sản xuất hydro này rất hiệu quả, vì hơn 90% các proton

và electron do vi khuẩn được chuyển thành khí hydro.Trong khi sản xuất hydro thông thường đòi hỏi năng lượng cao gấp 10 lần so với sản xuất bằng MFC Bên cạnh đó, sử dụng MFC rất thân thiện với môi trường Tuy nhiên, việc tinh sạch khí hydro sinh ra vẫn còn là một vấn đề đáng quan tâm [14]

Cảm biến sinh học: Ngoài những ứng dụng nói trên, một ứng dụng

khác - ứng dụng tiềm năng của công nghệ MFC là sử dụng nó như một cảm biển sinh học để phân tích chất ô nhiễm, giám sát và kiểm soát quá trình tại chỗ [15, 16]

 Cảm biến sinh học đo chỉ số BOD (BODsensor): Đề xuất sử dụng MFC như một thiết bị cảm biến sinh học được đưa ra lần đầu tiên bởi Kim và cộng

sự [17] Nhu cầu oxy sinh học( BOD) là lượng oxy hòa tan cần thiết để đáp

có thể duy trì hoạt động trong hơn 5 năm mà không cần bảo trì thêm, thời gian

sử dụng lâu hơn nhiều so với các loại cảm biến BOD khác [18] Tại Hàn Quốc, MFC đã được nghiên cứu và thử nghiệm để làm cảm biến sinh đánh giá chỉ số BOD (BOD sensor) từ đó đánh giá chất lượng nước thải [17]

 Cảm biến phát hiện sắt: Ở nhiều vùng nông thôn Việt Nam, vì không

có điều kiện sử dụng nước sạch, người dân phải dựa vào các nguồn nước ngầm mà phần nhiều bị ô nhiễm bởi các kim loại như sắt, man-gan và a-sen Hiện tại, việc phát hiện các kim loại này trong các mẫu nước cần thực hiện trong phòng thí nghiệm và khá mất thời gian hoặc tốn kém Vì vậy, dựa trên những lợi thế của MFC một thiết bị cảm biến sinh học có thể dùng nhiều lần

và có thể phát hiện tại chỗ sự có mặt của các kim loại này trong nước ngầm, Phạm Thế Hải và cộng sự đã nghiên cứu và phát triển thành công MFC sử dụng làm cảm biến phát hiện sự có mặt của sắt trong môi trường nước Trong nghiên cứu này, các MFC có thể tạo ra điện khi sử dụng Fe(II) như chất cho điện tử và cường độ dòng điện sinh ra tỉ lệ thuận với nồng độ Fe(II) trong môi trường đầu vào theo quan hệ tuyến tính.(Hình 2) [19]

Nguyên tắc của cảm biến phát hiện sắt: sắt có thể được phát hiện dựa trên đặc tính đặc biệt của vi khuẩn oxi hóa sắt Vi khuẩn oxi hóa sắt đa số thuộc nhóm vi khuẩn hóa dưỡng vô cơ, có khả năng thu năng lượng cho hoạt động sống và trao đổi chất của chúng thông qua việc oxi hóa ion Fe(II) thành Fe(III) [20] Dựa trên nguyên tắc này, nhóm nghiên cứu Phạm Thế Hải và cộng sự đã bước đầu làm giàu thành công vi khuẩn sắt trong thiết bị pin nhiên liệu vi sinh vật Thiết bị bước đầu đã thể hiện đặc điểm của một cảm biến sinh học phát hiện nhanh Fe(II) có mặt trong mẫu dịch anode [1]

7

Hình 2: Đồ thị biểu diễn quan hệ giữa cường độ dòng điện với nồng độ Fe(II) trong dịch anode của MFC cảm biến sắt [1]

1.1.4 Vi khuẩn điện hóa- hóa dưỡng vô cơ trong khoang anode của pin

nhiên liệu vi sinh vật

Nguyên tắc hoạt động của MFC dựa trên quá trình trao đổi chất của vi sinh vật nên quần xã vi sinh vật trong khoang anode là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt động của MFC Các nghiên cứu gần đây cho thấy, nhiều

vi sinh vật có khả năng truyền điện tử đến anode thông qua chuyển hóa chất

vô cơ và hữu cơ trong trầm tích biển, đất, nước thải,…[21] Vi khuẩn điện hóa – hóa dưỡng vô cơ sử dụng các hợp chất cô vơ làm chất cho điện tử để sinh trưởng Nhóm này bao gồm các vi khuẩn oxi hóa sulfide, lưu huỳnh, kim loại, amoni và nitrit [22]

8

Bảng 1:Một số MFC hoạt động với các chất cho điện tử là các chất vô cơ [23]

Dạng MFC Chất cho điện tử Các nghiên cứu

Loại bỏ sulfide Sulfide kết hợp với

để phát hiện sắt và mangan trong nước[27]

Nhiều nghiên cứu đã sàng lọc và định danh những vi sinh vật trong quần xã ở khoang anode MFC có khả năng tạo ra dòng điện dựa trên chuyển hóa các chất vô cơ [28] Trong trường hợp MFC vận hành với chất điện tử là Fe(II) bằng phương pháp phân tích DNA và phân tích lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) Phạm Thế Hải và cộng sự đã chứng minh rằng quần xã vi khuẩn oxy

hóa sắt có liên quan đến quá trình vận hành MFC Geobacter sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp là những loài chiếm ưu thế trong quần xã vi sinh vật trong

khoang anode, là nhân tố chính trong hoạt động điện hóa của hệ thống [23] Đối với chất nhận điện tử là nitrat bằng phương pháp phân lập nhóm nghiên cứu Đại học Ghent – Bỉ đã chỉ ra rằng sự tham gia của vi khuẩn trong anode

liên quan đến các vi sinh vật oxi hóa sulfide Các loài Paracoccus đóng vai

trò quan trọng trong hệ thống điện hóa này [24]

1.2 Vi khuẩn oxy hóa sắt

1.2.1 Đặc điểm vi khuẩn oxy hóa sắt

9

Vi khuẩn oxy hóa sắt (iron bacteria) thuộc nhóm sinh vật nhân sơ đầu tiên được quan sát và ghi lại bởi nhà vi sinh vật Ehrenberg và Winogradsky vào thể kỉ XIX và vẫn được tiếp tục nghiên cứu cho đến nay

Vi khuẩn oxi hóa sắt là nhóm vi khuẩn có khả năng oxi hóa ion sắt (II) hoặc mangan có số oxi hóa thấp trong môi trường như một phần thiết yếu trong chức năng trao đổi chất của chúng [29]

Vi khuẩn oxi hóa sắt là nhân tố sinh học xúc tác cho quá trình oxi hóa sắt(II) ( Fe2+,ferrous iron) thành sắt(III) (Fe3+, ferric iron) thông qua sản sinh enzyme xúc tác cho phản ứng oxi hóa Fe2+ thành Fe3+ hoặc tương tác tương tự với Mn có số oxi hóa thấp thành Mn số oxi hóa cao theo phản ứng

1.2.2 Phân bố vi khuẩn oxy hóa sắt

Vi khuẩn sắt có ở hầu hết mọi nơi trên Trái Đất Nơi đâu có nước, oxi

và sắt đều là nơi tiềm năng cho vi khuẩn oxi hóa sắt phát triển, mỗi loài vi khuẩn oxi hóa sắt có môi trường sống đặc trưng riêng [2]

1.2.3 Phân loại vi khuẩn oxy hóa sắt

Sự đa dạng và phân bố của nhóm vi khuẩn oxi hóa sắt bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi pH và O2 Ở điều kiện có O2 và pH >7 quá trình oxi hóa Fe2+ tạo thành các kết tủa không tan, nhưng trong điều kiện thiếu O2 hoặc kị khí và pH

<4 thì quá trình oxi hóa sắt hòa tan đơn giản hơn Dựa trên các đặc điểm sinh

lí cơ bản các vi khuẩn oxi hóa sắt có thể chia thành bốn nhóm:

10

 Vi khuẩn hiếu khí oxi hóa sắt ưa axit

Loại vi khuẩn này thường có nhiều trong nước thoát ra ở mỏ axit được tạo

ra từ các mỏ than, mỏ sắt và khu vực núi lửa,… Trong các môi trường này, lưu huỳnh thường có mặt cùng Fe2+

.Vì vậy, nhiều vi khuẩn oxi hóa sắt hiếu khí ưa axit có khả năng oxi hóa cả S và Fe2+

Các loài có thể tự dưỡng hoặc dị

dưỡng và các chi phổ biến bao gồm Acidithiobacillus (Gammaprotebacteria), Leptospirillum (Nitrospirae) và Ferroplasma (Euryachaeota) [31]

 Vi khuẩn hiếu khí oxi hóa sắt trung tính

Chi phổ biển là Proteobacteria [31] Trong nhóm này không thể không kể đến một số Pseudomonas sp Năm 2009, Sudek và cộng sự đã báo cáo Pseudomonas/Pseudoaltermonas cũng có thể xúc tác trong quá trình oxi hóa

sắt(II) trong điều kiện vi hiếu khí [32]

 Vi khuẩn oxi hóa sắt kị khí quang dưỡng

Nhóm này gặp phổ biến ở một số loài vi khuẩn tía không lưu huỳnh của

Alphaproteobacteria [20] Nhóm này sử dụng Fe2+ để khử CO2 nên nhóm vi khuẩn này được coi là nhóm góp phần hình thành các lớp trầm tích trong lòng đất trước kỉ Cambri khi các hành tinh vẫn chưa có oxi [33]

 Vi khuẩn oxi hóa sắt kị khí hóa dưỡng

Các vi khuẩn nhóm này có khả năng kết hợp với quá trình oxi hóa Fe2+thành khử nitrat tạo thành khí NO2

hoặc N2 ( khử nitrat) Các loài vi khuẩn

đặc trưng của nhóm này như Marinobacter aquaeolei và Thiobacillus denitrificans [31]

Các nhóm vi khuẩn oxi hóa sắt có mối quan hệ với nhau, thể hiện qua cây phát sinh loài (Hình 3)

1.3 Các phương pháp nghiên cứu vi khuẩn điện hóa oxi hóa sắt

Để nghiên cứu thành phần quần xã vi sinh vật có rất nhiều phương pháp Tuy nhiên có hai phương pháp sau thường sử dụng khi nghiên cứu quần

xã vi khuẩn oxi hóa sắt trong MFC: phương pháp truyền thống dựa trên nuôi cấy và phương pháp điện di trên gel biến tính gradient [2]

1.3.1 Phương pháp truyền thống

Việc sử dụng các phương pháp truyền thống để nghiên cứu một quần

xã vi sinh vật bao gồm thu mẫu, nuôi cấy làm giàu, phân lập, đếm vi khuẩn (bằng cách đếm trực tiếp qua kính hiển vi), đếm khuẩn lạc, đếm bằng phương pháp giá trị xác suất cực đại (phương pháp MPN),…và phân tích các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi sinh vật

Tuy nhiên, các phương pháp truyền thống chỉ có thể xác định được sự

có mặt và số lượng của những vi sinh vật có thể nuôi cấy được, mà đa số vi sinh vật trong tự nhiên hiện nay chưa thể nuôi được trong phòng thí nghiệm (Pace, 1996) – số lượng các vi sinh vật có thể nuôi cấy được có thể chỉ đạt 1% tổng số vi sinh vật có trong tự nhiên [36] Vì vậy, để nghiên cứu hệ vi sinh vật chính xác và hiệu quả, ngoài các phương pháp truyền thống cần phải sử dụng các phương pháp sinh học phân tử

1.3.2.Phương pháp điện di trên gel biến tính gradient (denaturing

gradient gel electrophoresis, DGGE)

Điện di gel gradient biến tính (DGGE) là một phương pháp sử dụng phổ biến trong sinh học phân tử và trở thành kỹ thuật chính trong nghiên cứu

13

đặc điểm và thành phần quần xã vi sinh vật trong môi trường [37] Đây là phương pháp kỹ thuật không quá phức tạp và cho kết quả phân tích khá hiệu quả

Kỹ thuật DGGE là một dạng kỹ thuật “ dấu vân tay” (fingerprinting) phân tử cho phép phân biệt các trình tự DNA khác nhau dựa trên sự khác nhau về tỉ lệ (G+C)/(A+T) giữa các trình tự, được Myuzer là người đầu tiên

sử dụng trong nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật [38] Một hỗn hợp là sản phẩm của phản ứng PCR bao gồm các đoạn DNA có chiều dài bằng nhau được điện di trên một gel acryamide không đồng nhất về thành phần hóa học,

có chứa chất làm biến tính DNA (chất biến tính là một hỗn hợp ure và formamit) với gradient nồng độ tăng dần từ thấp đến cao [38] Khi điện di, các phân tử DNA có tỉ lệ GC thấp hơn sẽ dừng lại trước, phân tử DNA có tỉ lệ

GC cao sẽ tiếp tục di chuyển và dừng lại ở vị trí có nồng độ chất làm biến tính cao hơn trên gel DNA sợi đôi có thể di chuyển dễ dàng trên gel acrymide còn các phân tử DNA biến tính sẽ di chuyển chậm và dừng lại trên gel nhờ có GC-clamp (kẹp GC) Do đó, các đoạn DNA có trình tự khác nhau có thể được tách ra ở các vị trí khác nhau trên gel acryamide [3] Vì vậy, vị trí khác nhau trên điện di DGGE phản ánh sự khác nhau về trình tự của các đoạn DNA được phân tích Trong từng trường hợp cụ thể, mỗi vị trí có thể đặc trưng cho một trình tự DNA và phản ánh sự có mặt của một loài hay cá thể trong quần

xã được phân tích DGGE tỏ ra hiệu quả khi sử dụng để phân tích so sánh trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn [40] Đặc điểm của đoạn gen này giúp nó thường được lựa chọn trong DGGE là: có mặt ở tất cả các loài vi khuẩn, có tính bảo thủ cao, không có sự trao đổi giữa các loài và mang tính đặc trưng cho loài

2.1.1.1 Hóa chất – vật liệu

 Hóa chất sử dụng làm giàu, nuôi cấy và phân lập vi khuẩn:

FeCl2.4H2O, KH2PO4, K2HPO4, NaCl, MgSO4.7H2O, CaCl4, NaHCO3, FeSO4.7H2O, ZnCl2, MnCl2.4H2O, H3BO3, CaCl2.6H2O, CuCl2.2H2O, NiCl2.6H2O, Na2MO4, CoCl2.6H2O, NaNO3, NH4NO3, FeC6H5O7NH4OH, thạch agar Các hóa chất trên đều được mua từ các hãng đảm bảo tin cậy như Affymetrix (Hoa Kỳ) hoặc Xilong (Trung Quốc)

 Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm sinh học phân tử:

Bộ hóa chất sử dụng tách DNA (Glycogen 20mg/l, Ethanol 100%, Amonium acetate); phản ứng PCR (USB Tag PCR Master Mix 2x); điện di kiểm tra sản phẩm PCR ( HydraGreen Safe AND Stain 20 000x, Loading Dye 6x, Gene Ruler 1kb AND Ladder), tinh sạch sản phẩm PCR (ExoSAP-IT PCR Product Cleanup) Tất cả được cung cấp bới Affymetrix USB, Merck và Fermentas (Mỹ)

 Hóa chất sử dụng cho phương pháp điện di gel biến tính DGGE:

Acryamide, Bis-AA, 50x TAE buffer, Formamide, TEMED (tetramethyl ethylenediamine), APS (Amonium Persulfate) do hãng Affymetric (USB, Mỹ) cung cấp