phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật phân giải cellulose để xử lý nước thải nhà máy giấy

Giấy là một loại vật liệu được làm từ chất xơ dài từ vài mm cho đến vài cm, thường có nguồn gốc thực vật và thường được tạo thành mạng lưới bởi lực liên kết hidro không có chất kết dính. Thông thường giấy được sử dụng dưới dạng những lớp mỏng nhưng cũng có thể dùng để tạo hình các vật lớn. Trên nguyên tắc giấy được sản xuất từ bột gỗ hay bột giấy. Loại giấy quan trọng nhất về văn hóa là giấy viết. Bên cạnh đó giấy được sử dụng làm vật liệu bao bì, trong nội thất như giấy dán tường, giấy vệ sinh hay trong thủ công trang trí, đặc biệt là ở Nhật và Trung Quốc.Các nhà máy giấy và bột giấy sinh ra một lượng lớn nước thải và nếu không được xử lý thì có thể ảnh hưởng rất lớn đến môi trường.

 Nhóm 1: Giấy dùng cho in viết (giấy in báo, giấy in và viết, )

 Nhóm 2: Giấy dùng trong công nghiệp (giấy bao bì, giấy chứa chấtlỏng, )

 Nhóm 3: Giấy dùng trong gia đình(giấy ăn, giấy vệ sinh, )

 Nhóm 4: giấy dùng cho văn phòng (giấy fax, giấy in hóa đơn, )Hiện nay ở Việt Nam chỉ sản xuất được các loại sản phẩm như giấy in, giấy

in báo, giấy bao bì công nghiệp thông thường, giấy vàng mã, giấy vệ sinh chấtlượng thấp, giấy tissue chất lượng trung bình, còn các loại giấy kỹ thuật điện-điện tử, giấy sản xuất thuốc lá, giấy in tiền, giấy in tài liệu bảo mật vẫn chưađược sản xuất [báo cáo tóm tắt ngành giấy ]

1.1.2 Quy trình sản xuất giấy

Nguyên liệu thô được dùng trong sản xuất giấy và bột giấy ở Việt Nam gồmhai nguồn căn bản là từ rừng (tre và gỗ mềm) và giấy tái chế Bột giấy được dùng

để sản xuất các loại sản phẩm khác nhau như giấy viết, giấy bao bì, bìacactong, là khác nhau Tuy ngiên có thể pha trộn bột giấy được tạo ra từ nhữngnguyên liệu thô khác nhau để có được những đặc tính mong muốn cho thànhphẩm

 Quy trình sản xuất giấy:

Hình 1.1: Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất giấy và bột giấy kèm theo các dòngthải [ ]

a Chuẩn bị nguyên liệu thô

Nguyên liệu thô được sử dụng là tre, các loại gỗ mềm khác, giấy phế liệuhoặc tái chế, Trường hợp là gỗ thì sau khi đã cân trọng lượng, gỗ xếp thànhđống trong sân chứa và sau đó được mang đi cắt thành mảnh Với loại tre mỏngthì dùng máy cắt thành mảnh 3 lưỡi, còn với loại dày hơn thì dùng máy cắt có đĩadao 6 lưỡi Kích cỡ của mảnh được tạo ra từ 15 – 35mm Các mảnh quá to hayquá nhỏ sẽ bị loại ra Mảnh có khích cỡ phù hợp sau đó sẽ được chuyển đến khuvực sản xuất bột giấy để nấu.

Sau nấu, các chất năm trong nồi nấu được xả ra nhờ áp suất đi vào thápphóng Bột thường được chuyển qua các sàng để tách mấu trước khi rửa

 Rửa: Trong quá trình rửa, bột từ tháp phóng và sàng mấu được rửa

bằng nước Dịch đen loãng từ bột được loại bỏ trong quá trình rửa và đượcchuyển đến quá trình thu hồi hóa chất Bột tiếp tục rửa trong các bể rửa Quátrình rửa này kéo dài khoảng 5 – 6 giờ

 Tẩy trắng: công đoạn này được thực hiện nhằm tạo độ sáng và độ

trắng cho bột giấy Loại và lượng hẩy tra chất sử dụng phụ thuộc vào loại sảnphẩm sẽ được sản xuất từ bột giấy đó Có 3 bước tẩy trắng bột truyền thống là:Bước 1: Clo hóa bột giấy bằng khí clo, khí này sẽ phản ứng với lignin để tạo racác hợp chất tan trong nước hoặc tan trong môi trường kiềm

Bước 2: Lignin đã oxi hóa được loại bỏ bằng cách hòa tan trong dung dịch kiềm.Bước 3: Tẩy trắng bằng dung dịch hypochlorite

c Chuẩn bị bột

Bột giấy tẩy trắng sẽ được trộn với các loại bột khác nhau từ giấy phế liệuhoặc bột nhập khẩu Sự pha trộn phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu và loại giấycần sản xuất Hỗn hợp bột được trộn với chất phụ gia và chất độn trong bồn trộn.Thông thường, các hóa chất dùng để trộn là nhựa thông, phèn, bột đá, thuốcnhuộm, chất tăng trắng quang học và chất kết dính, , gồm các bước sau:

 Trộn bột giấy và chất phụ gia để tạo ra dịch bột đồng nhất và liên tục

 Nghiền đĩa để tạo ra được chất lượng mong muốn cho loại giấy cầnsản xuất

 Hồ và tạo màu để đạt được thông số chất lượng như mong muốn

d Xeo giấy và hoàn thiện

Bột giấy đã trộn lại được làm sạch bằng phương pháp ly tâm để loại bỏ chấtphụ gia thừa và tạp chất, được cấp vào máy xeo thông qua hộp đầu Về tách nước

và xeo giấy thì máy xeo có 3 bước phân biệt:

 Bước tách nước tọng lực và chân không (phần lưới)

 Bước tách nước cơ học (phần cuốn ép)

 Bước sấy bằng nhiệt (các máy sấy hơi gián tiếp)

Cuối cùng là giấy được làm khô bằng máy sấy hơi gián tiếp đạt khoảng 94%

Bảng 1.1: Các nguồn nước thải từ các bộ phận và thiết bị khác nhau [SXSH]

Phần lớn nước thải phát sinh là nước dùng trong quá trình tiếp xúc vớinguyên liệu thô, với các sản phẩm và sản phẩm phụ và chất dư thừa

1.2.2 Thành phần và tình hình ô nhiễm của nước thải nhà máy giấy

Theo thống kê cả nước có gần 500 doanh nghiệp sản xuất giấy, trong đó chỉ

có khoảng 10% doanh nghiệp đạt tiêu chuẩn môi trường cho phép, còn hầu hếtcác nhà máy đều không có hệ thống xử lý nước thải hoặc có nhưng chưa đạt yêucầu, vì thế tình trạng gây ô nhiễm môi trường do sản xuất giấy cũng đang là vấn

đề được nhiều người quan tâm

So với nhiều ngành công nghiệp sản xuất khác, ngành giấy có mức độ ônhiễm cao và dễ gây ra tác động đến con người và môi trường xung quanh do ônhiễm từ nguồn nước thải xử lý không đạt yêu cầu

Công nghệ sản xuất giấy ở Việt Nam còn rất lạc hậu Để sản xuất ra 1 tấngiấy thành phẩm, các nhà máy phải sử dụng từ 3-10 m3 nước, trong khi các nhàmáy giấy hiện đại của thế giới chỉ sử dụng 7-15 m3/tấn giấy Sự lạc hậu này

không chỉ gây lãng phí nguồn nước ngọt, tăng chi phí xử lý nước thải mà còn đưa

ra sông, rạch lượng nước thải khổng lồ

Trong các cơ sở công nghiệp giấy và bột giấy, nước thải thường có độ pHtrung bình 9-11, chỉ số nhu cầu oxy sinh hóa (BOD), nhu cầu oxy hóa học (COD)cao, có thể lên đến 700 mg/l và 2500 mg/l Hàm lượng chất rắn lơ lửng cao gấpnhiều lần giới hạn cho phép Đặc biệt nước có chứa cả kim loại nặng, lignin (dịchđen), phẩm màu, xút, các chất đa vòng thơm clo hóa là những hợp chất có độctính sinh thái cao và có nguy cơ gây ung thư, rất khó phân hủy trong môi trường

Có những nhà máy giấy, lượng nước thải lên tới 4000-5000 m3/ngày, các chỉ tiêuBOD, COD gấp 10-18 lần tiêu chuẩn cho phép; lượng nước thải này không được

xử lý mà đổ trực tiếp vào sông

Ngoài ra trong công nghiệp xeo giấy, để tạo nên một sản phẩm đặc thùhoặc những tính năng đặc thù cho sản phẩm, người ta còn sử dụng nhiều hóa chất

và chất xúc tác Những chất này nếu không được thu hồi hoặc xử lý mà xả thẳng

ra sông ngòi thì vấn đề ô nhiễm là không tránh khỏi, làm mất cân bằng sinh tháitrong môi trường nước

Hiện nay, ở các khu vực có cơ sở sản xuất giấy đang phải chịu sức épnặng nề về ô nhiễm môi trường, để sản xuất mỗi tấn bột giấy phải thải ra 10 tấndịch đen Riêng khu vực sông Cầu, chỉ với 3500 m3 nước xả mỗi ngày, nhưngngành giấy đã là thủ phạm số một gây ô nhiễm nặng cho dòng sông này, trong đónhà máy giấy Hoàng Văn Thụ đứng đầu bảng

Ở Bắc Ninh, mỗi ngày Phong Khê thải ra sông 4500 m3 nước thải và theothống kê của Sở Tài Nguyên và Môi Trường, các chỉ số BOD, COD, coliformđều cao hơn mức cho phép 4-6 lần Khói và bụi giấy đã làm cho bầu không khí ởPhong Khê bị ô nhiễm trầm trọng Chính lượng nước thải đã làm cho nhiều diệntích sản xuất nông nghiệp thành đất chết

Điều đặc biệt là việc đặt các nhà máy ở thượng nguồn sông Hậu như: Khucông nghiệp Trà Nóc II hay Thốt Nốt, Ô Môn, đã gây ô nhiễm nguồn nước trầmtrọng, làm ảnh hưởng đến nuôi trồng thủy sản

Dưới đây là bảng thành phần nước thải của một số nhà máy sản xuất giấy vàbột giấy với nguyên liệu là gỗ và giấy thải theo cục Môi trường thống kê được.Bảng 1.2: Thành phần nước thải của một số nhà máy sản xuất giấy và bộtgiấy với nguyên liệu là gỗ và giấy thải

Dựa vào bảng 1.2 trên ta thấy nồng độ COD, BOD5 khá cao, vượt nhiều lần

so với TCCP Vậy nên cần có những biện pháp xử lý phù hợp để cải thiện chấtlượng môi trường nước trước khi thải ra sông, suối,

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ NƯỚC THẢI NHÀ MÁY SẢN XUẤT GIẤY VÀ BỘT GIẤY

1.3.1 Phương pháp cơ học

Phương pháp này được dùng để loại bỏ các vật rắn kích thước lớn bao gồmnhững chất lơ lửng và các chất lắng đọng có bản chất vô cơ hoặc hữu cơ Để táchcác hạt lơ lửng ra khỏi nước thải, thường người ta sử dụng các quá trình thủy cơ(gián đoạn hay liên tục), lọc qua song chắn hoặc lưới, lắng dưới tác dụng của lựctrọng trường hoặc lực li tâm hay lọc

• Lọc: nước thải qua song chắn hoặc lưới chắn: đây là bước xử lí sơ bộnhằm khử tất cả các tạp chất có thể gây ra sự cố trong quá trình vận hành hệthống xử lí nước thải như làm tắc bơm, đường ống hay kênh dẫn

• Lắng: quá trình này được dùng để loại bỏ các tạp chất dạng huyền phù thô

ra khỏi nước Sự lắng của các hạt xảy ra dưới tác dụng của trọng lực Để tiếnhành quá trình này người ta thường dùng các loại bể lắng khác nhau như: bể lắngcát (cấp I) – có nhiệm vụ tách các chất rắn hữu cơ và các chất rắn khác và bể lắngtrong (cấp II) – có nhiệm vụ tách bùn sinh học ra khỏi nước thải

• Tuyển nổi: phương pháp tuyển nổi được sử dụng để tách các tạp chất phântán không tan, sự lắng kém ra khỏi pha lỏng Trong một số trường hợp, quá trìnhnày dùng để tách các chất hòa tan như các chất hoạt động bề mặt Về nguyên tắc,phương pháp tuyển nổi được sử dụng để khử các chất lơ lửng và làm đặc bùnsinh học Quá trình tuyển nổi được thực hiện bằng cách sục các bọt khí vào phalỏng Các bọt khí đó dính bám với các hạt và khi lực nổi của tập hợp bóng khí vàhạt đủ lớn sẽ kéo hạt nổi lên trên bề mặt sau đó chúng tập hợp lại với nhau thànhlớp bọt chứa hàm lượng các hạt cao

1.3.3 Phương pháp hóa học

Các phương pháp hóa học dùng trong xử lý nước thải gồm có: trung hòa, oxyhóa và khử Tất cả các phương pháp này đều dùng các tác nhân hóa học nên là

phương pháp đắt tiền người ta sử dụng phương pháp này để khử các chất hòa tantròn các hệ thống cấp nước khép kín Đôi khi các phương pháp này được dùng để

xử lý sơ bộ trước xử lý sinh học hay sau công đoạn này như là một phương pháp

xử lý nước thải lần cuối để thải vào nguồn nước

1.3.4 Phương pháp sinh học

Trong nhiều biện pháp xử lý ô nhiễm, biện pháp sinh học được mọi ngườiđặc biệt quan tâm sử dụng So với các biện pháp vật lý, hoá học, biện pháp sinhhọc chiếm vai trò quan trọng về quy mô cũng như giá thành đâu tư, do chi phínăng lượng cho một đơn vị khối lượng chất khử là ít nhất Đặc biệt xử lý bằngbiện pháp sinh học sẽ không gây tái ô nhiễm môi trường - một nhược điểm màbiện pháp hoá học hay mắc phải Biện pháp sinh học sử dụng một đặc điểm rấtquý của vi sinh vật , đặc điểm đã thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu và cácnhà sản xuất là khả năng đồng hoá được rất nhiều nguồn cơ chất khác nhau của

vi sinh vật, từ tinh bột, cellulose, cả nguồn dầu mỏ và dẫn xuất của nó đến cáchợp chất cao phân tử khác như protein, lipid, cùng các kim loại nặng như chì,thuỷ ngân Thực chất của phương pháp này là nhờ hoạt động sống của vi sinhvật (sử dụng các hợp chất hữu cơ và một số chất khoáng có trong nước thải làmnguồn dinh dưỡng và năng lượng) để biến đổi các hợp chất hữu cơ cao phân tử

có trong nước thải thành các hợp chất đơn giản hơn Trong quá trình dinh dưỡngnày vi sinh vật sẽ nhận được các chất làm vật liệu để xây dựng tế bào, sinhtrưởng và sinh sản, nên sinh khối được tăng lên

Hàm lượng các chất hữu cơ được phân rã bởi vi sinh vật được đánh giá theochỉ số "tiêu thụ sinh học oxy" BOD Đấy là số lượng oxy cần cho vi sinh vật đểoxy-hoá vật liệu hữu cơ trong quá trình hô hấp Thí dụ BOD5 có nghĩa là sốlượng oxy (mg) cần cho vi sinh vật trong quá trình phân rã các chất hữu cơ thờigian 5 ngày Chỉ số "tiêu thụ hóa học oxy" (COD) biểu thị số lượng oxy cầntrong quá trình oxy hóa hóa học hoàn toàn các chất nói trên đến CO2 và H2O.Quá trình xử lý sinh học gồm các bước sau:

- Chuyển hóa các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc cacbon ở dạng keo vàdạng hòa tan thành thể khí và thành các vỏ tế bào vi sinh

- Tạo ra các bông cặn sinh học gồm các tế bào vi sinh vật và các chất keo

vô cơ có trong nước thải

- Loại các bông cặn sinh học ra khỏi nước thải bằng phương pháp lắngtrọng lực

Do vi sinh vật đóng vai trò chủ yếu trong quá trình xử lý sinh học nên tùythuộc vào tính chất hoạt động của chúng, phương pháp xử lý sinh học có thể chiathành hai loại: phương pháp xử lý kị khí và phương pháp xử lý hiếu khí Ngoài ratrong một số trường hợp, người ta cũng sử dụng kết hợp cả hai quá trình khị khí

và hiếu khí

- Phương pháp xử lý kị khí: sử dụng nhóm vi sinh vật kị khí, quá trình xử lý

diễn ra trong điều kiện không có oxy

Quá trình phân hủy kị khí các chất hữu cơ là các quá trình sinh học phức tạptạo ra hàng trăm sản phẩm trung gian và phản ứng trung gian Tuy nhiên, phươngtrình phản ứng sinh hóa trong điều kiện kị khí có thể biểu diễn đơn giản như sau:Chất hữu cơ vi sinh vật CH4 + CO2 + H2 + NH3 + H2S + Tế bào mớiMột cách tổng quát, quá trình phân hủy kị khí xảy ra theo 4 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: thủy phân, cắt mạch các hợp chất cao phân tử

- Giai đoạn 2: axit hóa

- Giai đoạn 3: acetat hóa

- Giai đoạn 4: methane hóa

Các hợp chất hữu cơ chứa nhiều hợp chất cao phân tử như: protein, chất béo,cacbonhydrate, cellulose, lignin, trong giai đoạn thủy phân sẽ cắt chuyển hóathành các phân tử đơn giản, dễ thủy phân hơn Các phản ứng thủy phân sẽchuyển hóa protein thành các amino acid, cacbonhydrate thành đường đơn vàchất béo thành acid béo Trong giai đoạn acid hóa, các chất hữu cơ đơn giản lạitiếp tục được chuyển hóa thành acid acetic, H2, CO2 Vi khuẩn methane chỉ có thểphân hủy một số loại cơ chất nhất định như là CO2 + H2, formate, acetate,methanol, methyl amine và CO Các phương trình phản ứng diễn ra như sau:4H2 + CO2 CH4 + 2H2O

4HCOOH CH4 + 3CO2 + 2H2O

CxHyOz + O2 + NH3 enzym Tế bào vi khuẩn (C5H7O2N) + CO2 + H2O – Q

- Phân hủy nội bào:

C5H7O2N + O2 5CO2 + H2O + NH3 + Q

Các quá trình xử lý sinh học bằng phương pháp kị khí và hiếu khí có thể xảy

ra ở điều kiện tự nhiên hoặc nhân tạo Trong các công trình xử lý nhân tạo, người

ta ra điều kiện tối ưu cho quá trình oxy hóa nên quá trình xử lý có tốc độ và hiệusuất cao hơn xử lý sinh học tự nhiên

1.4 CELLULOSE VÀ CẤU TRÚC

Cellulose là thành phần chủ yếu của tổ chức thực vật (chiếm khoảng 50% trọng lượng khô của xác thực vật) và đặc biệt là ở rễ Ở tế bào thực vật vàmột số tế bào vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi Cellulose là một polymer hữu

35-cơ phổ biến nhất trong tự nhiên Hằng năm một lượng lớn sinh khối cellulose(1,5 x 1012tấn) được tạo thành chủ yếu từ quá trình quá trình quang hợp

Hình 1.2: Cấu trúc không gian của phân tử cellulose

Cellulose là 1 polysaccharide gồm nhiều polymer được cấu thành từ các tiểuđơn vị monosaccharide glucose Cellulose là hợp chất cao phân tử cấu tạo từcác liên kết mắt xích β – D – Glucose, có công thức cấu tạo là(C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000 –

14000 Đây là thành phần chủ yếu tạo nên vách tế bào thực vật, chúng liên kếtchặt chẽ với các thành phần khác như hemicellulose, lignin tạo nên các phức hệbền vững Cellulose không có trong tế bào động vật Chúng là một homopolimermạch thẳng, được cấu tạo bởi các β – D – glucose – pyranose Các gốcglucose trong cellulose thường lệch nhau một góc 180o và có dạng như mộtchiếc ghế bành Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường và được cấutạo như hình 1.2

Cellulose là chất màu trắng, không mùi, không vị, không tan trong nước vàcác dung môi thông thường Tan trong một số dung dịch axit vô cơ mạnh nhưHCl, HNO3, và bị thủy phân bởi enzyme cellulase [9] Cellulose cấu tạo dạngsợi, có cấu trúc phân tử là một polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là mộtdisaccharide gọi là cellubiose, cellubiose được cấu trúc từ hai phân tử D -glucose Cellulose có cấu trúc bâc 2 và bậc 3 rất phức tạp, tạo thành cấutrúc dạng lớp gắn với nhau bằng lực liên kết Hydro trùng hợp nhiều lần nên rấtbền vững, ngoài ra còn có lực Vander Wall tạo ta mạng lưới gồm các sợi songsong hoặc đan chéo nhau có độ bền cao

Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy Người và hầu hết động vật không có khả năng phân hủy cellulose Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải cácsản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rácthải hữu cơ Tuy nhiên nhiều chủng vi sinh vật bao gồm nấm, xạ khuẩn và vikhuẩn có khả năng phân hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủynhờ enzyme cellulase [11]

1.5 ENZYME CELLULASE VÀ VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP CELLULASE

1.5.1 Giới thiệu về enzym cellulase

Các chất thải có nguồn gốc cellulose được vi sinh vật phân hủy bằng nhiềuenzyme khác nhau Cellulase thủy phân cellulose (liên kết 1,4 – β- D –glucoside) tạo ra sản phẩm chính là glucose, cellobiose và cello-oligosaccharides

Có 3 loại enzyme cellulose chính:

- Cellobiohydrolase (CBH hoặc 1,4-β-D-glucan cellobioydrolase, EC3.2.1.91): Enzym này cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thànhcellobiose Khối lượng phân tử của các enzyme thuộc nhóm này trong khoảng 53

- 75 kDa Các enzyme này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh

mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng

- Endo-β-1,4-cellulase (EG hoặc endo-1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase,

EC 3.2.14) có khối lượng phân tử trong khoảng 42 – 49 kDa Chúng hoạt động ởnhiệt độ khá cao và tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucosid trong cellulosetrong lichenin và β-D-glucan Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin,cellobiose, và glucose

- β-glucosidase (BG-EC 3.2.1.21): có khả năng hoạt động ở pH rất rộng(pH 4,4 – 4,8), khối lượng phân tử trong khoảng 50 – 98 kDa, pI = 8,4 và có thểhoạt động ở nhiệt độ cao β-glucosidase tham gia phân hủy cellobiose, tạo thànhglucose (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Enzyme thủy phân cellulose có thể được tách thành nhiều thành phần, chẳnghạn như enzyme cellulase của vi sinh vật có thể bao gồm một hoặc nhiều CBH,một hoặc nhiều EG và có thể có β-glucosidase Hệ thống hoàn chỉnh bao gồmCBH celulase, EG và BG phối hợp để chuyển đổi cellulose thành glucose Cácenzyme exo-cellobiohydrolases và endocellulases cùng hoạt động để thủy phâncellulose thành các đoạn ngắn oligosaccharides Các oligosaccharides (chủ yếu làcellobiose) sau đó được thủy phân để tạo ra glucose bằng β-glucosidase [14]

Hình 1.3: Mô hình enzyme cellulase

Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là axit amin, cácaxit amin được nối với nhau bởi liên kết peptid –CO-NH- Ngoài ra, trongcấu trúc còn có những phần phụ khác, cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzymenhóm EG và CBH giống nhau trong hệ cellulase của nấm sợi, gồm một trungtâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xác tác

và được gắn thêm vùng glycosil hóa, cuối đuôi là vùng gắn kết vớicellulose (CBD: cellulose binding domain) Vùng này có vai trò tạo liên kết vớicellulose tinh thể

Hình 1.4: Ba loại phản ứng xúc tác bởi cellulase

Thủy phân cellulose phải có sự tham gia của cả ba loại enzyme cellulasenhư endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase Thiếu một trong ba loạienzyme trên thì không thể thủy phân phân tử cellulose đến cùng Từ nhữngnghiên cứu riêng rẽ đối với từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp

của cả ba loại enzyme cellulase, nhiều nhà khoa học đều đưa ra kết luận chung

là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạothành sản phẩm cuối cùng là glucose Có nhiều cách giải thích khác nhau về cơchế tác động của cellulase, cụ thể cơ chế tác động hiệp đồng của 3 loại cellulasenhư sau: đầu tiên EG tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắtliên kết β-1,4-glucosid và tạo ra các đầu mạch tự do Tiếp đó CBH tấn công cắt

ra từng đoạn cellobiose từ đầu mạch được tạo thành Kết quả tác động của

EG và CBH tạo ra các celloligosaccharit mạch ngắn, cellobiose, glucose

BG thủy phân tiếp và tạo thành glucose Các loài vi sinh vật có khả năngsinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tácđộng nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loàilại phát triển yếu Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiếnhành không đồng bộ, xảy ra rất chậm

Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủycellulose bằng enzyme, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, lượng enzyme…, một yếu tố hết sức quan trọng là tính đồng bộcủa hệ enzyme cellulase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau Quá trìnhthủy phân cellulose chỉ có thể được tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sửdụng đồng bộ ba loại enzyme cellulase Cellulase có thể được tổng hợp từ rấtnhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ visinh vật như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm men Do ưu điểm

về thời gian sinh trưởng, kích thước, hiệu suất sản sinh enzyme nên vi sinh vậtthường được sử dụng để sản xuất các chế phẩm enzyme Enzyme cellulase đãđược nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới Đây là enzyme được ứng dụng rất rộngrãi, chỉ đứng sau protease và amylase

1.5.2 Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase

Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp cellulase chủ yếu là phân giảicarbohydrate thường không sử dụng protein hay lipid làm nguồn năng lượng cho

sự sinh trưởng [22] Môi trường được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vậtsinh tổng hợp cellulase có chứa các nguồn cellulose khác nhau [15,16] Trong

số các vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase đáng chú ý nhất là vi khuẩn,Cellulomonas cytophaga (xạ khuẩn) Hầu hết các loại nấm có thể sử dụngnhiều carbohydrate khác ngoài cellulose [25], trong khi ở các loài sống trongđiều kiện kỵ khí thì có sự lựa chọn về nguồn carbohydrate, cellulose Khảnăng tiết protein ngoại bào lớn là đặc trưng của một số loại nấm, đặc điểm nàyđược khai thác để sản xuất các cellulase ngoại bào ở quy mô lớn NấmTrichoderma reesei đã được sử dụng phổ biến để sản xuất cellulase ngoạibào Hầu hết các nghiên cứu về sinh vật phân giải cellulose tập trung vàocác loài nấm (Trichoderma, Humicola, Penicilium, Aspergillus,Actinomucor), vi khuẩn Pseudomonas, Cellulomonas, Actinomycetes vàStreptomyces).

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng enzyme cellulase – một hệ enzyme phức tạpđược sinh ra bởi nhiều vi sinh vật, phổ biến là nấm và vi khuẩn [18] Mặc dùnhững loài nấm sợi thì tỏ ra phân hủy rất tốt các cellulose tự nhiên, thế nhưng

vi khuẩn lại có tốc độ sinh trưởng cao hơn so với nấm nên có tiềm năng lớn đểđược dùng trong việc sản xuất cellulase Tuy nhiên, việc nghiên cứu khảnăng sinh enzyme cellulase của các dòng vi khuẩn nhìn chung vẫn còn khiêmtốn so với nghiên cứu trên nấm Dù vậy, đặc điểm phân giải cellulose củavài giống vi khuẩn như Cellulomonas, Cellovibrio, Pseudomonas,Sporosphytophaga, Bacillus và Micrococcus đã được nghiên cứu và báo cáo trênthế giới [18]

Đặc biệt, với các chủng Bacillus được chú ý hơn cả về khả năng sinh tổnghợp nhiều loại enzyme như cellulase, amylase , protease và PGA có ứng dụngrất nhiều trong đời sống của con người

Theo Peter (1985), trong nhóm vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase thì các loài thuộc chi Baccillus luôn chiếm ưu thế (đến 87%) Howard và cộng sự cũng chỉ rarằng có nhiều chủng vi sinh vật thuộc chi Baccillus đã được phân lập và địnhtên đến loài, bao gồm B subtilis, B macerans, B licheniformis, B.sphaericus [17] Hiện nay các chủng vi khuẩn được quan tâm nghiên cứu

và ứng dụng do vi khuẩn có nhiều ưu việt so với các nhóm nấm vì vi khuẩn có

tốc độ sinh trưởng nhanh và tạo được nhiều sinh khối hơn so với nấm mốc haynấm sợi do đó giá thành khi sản xuất chế phẩm sẽ rẻ hơn [12;20].

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu được lấy từ nước thải tại nhà máy sản xuất giấy

2.1.2 Dụng cụ

Các dụng cụ, thiết bị của phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh – Hóa sinh –Sinh học phân tử, khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trườngĐại học Bách Khoa Hà Nội

Thiết bị bao gồm: tủ lạnh - SANYO, nồi hấp thanh trùng – HIRAYAMA(Nhật Bản); máy đo pH, cân phân tích - Mettle Tolendo (Thụy Sỹ); lò vi sóng -Sam Sung (Hàn Quốc); box cấy; tủ bảo ôn SHELLAB, máy lắc VBEG –ML02; Máy vortex VELP (Đức), Máy đo quang phổ Ultrospec 2000;Micropipet 100 – 1000μL, 10 – 200μL, 0,1 – 10μL Genex Beta (Anh).L, 10 – 200μL, 10 – 200μL, 0,1 – 10μL Genex Beta (Anh).L, 0,1 – 10μL, 10 – 200μL, 0,1 – 10μL Genex Beta (Anh).L Genex Beta (Anh)

2.1.3 Hóa chất

Pepton, cao thịt, CMC, NaCl, NaOH, HCl (Trung Quốc), Agar (ViệtNam), côngo red (Đức), axit citric (Trung Quốc),

2.2 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

2.2.1 Môi trường phân lập vi khuẩn phân giải cellulose

Thuốc thử congo đỏ

Tất cả các môi trường được điều chỉnh về pH= 7, thanh trùng ở thanh trùng121°C trong 15 phút

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulase

Mục đích: Tách riêng từng tế bào vi khuẩn trong dịch nước thải để được dòngthuần

Các bước tiến hành:

- Lấy 50ml mẫu nước thải cho vào bình tam giác điều chỉnh pH (3 – 4),đem nuôi ở tủ lắc với tốc độ 150 vòng/phút, ở 37oC trong 2 ngày, sau

đó đem ổn nhiệt ở 70oC trong 10 phút

- Tiến hành pha loãng: Chuẩn bị một dãy các ống nghiệm có chứa sẵn9ml nước cất đã vô trùng dùng để pha loãng mẫu Lấy 1ml dịch mẫucho vào ống nghiệm đầu có chứa 9ml nước thanh trùng và lắc đều.Lặp lại bước trên đến khi đạt nồng độ pha loãng 10-6÷ 10-7

- Với các nồng độ pha loãng khác nhau, ta dùng pipet hút 100µL dịchpha loãng chuyển vào đĩa petri chứa môi trường phân lập đã vô trùng’

- Dùng que trang, dàn đều giọt dịch lên bề mặt đĩa petri đến khi mặt đĩakhô ráo

- Nuôi trong tủ ấm tại 35 - 37°C trong thời gian 24 giờ

Sau thời gian nuôi cấy thu được các khuẩn lạc riêng rẽ, ta tiến hành cấy từngkhuẩn lạc trên hộp petri môi trường phân lập Nhuộm đĩa thạch đã nuôi cấy bằngthuốc thử congo đỏ, khuẩn lạc nào cho vòng phân giải chứng tỏ có hoạttính cellulase Ta tiếp tục sử dụng phương pháp vết cấy cạn dần để cấy khuẩnlạc có hoạt tính trên hộp petri môi trường phân lập 2 – 3 lần nữa để thu đượckhuẩn lạc thuần khiết Giữ giống trong ống thạch nghiêng, bảo quản trong tủlạnh

2.3.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao

Mục đích: Tìm chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase caonhất Từ các chủng đã phân lập được tiến hành thử hoạt tính và tuyển chọnchủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase cao nhất

2.3.2.1 Phương pháp cấy chấm điểm

Nguyên tắc phương pháp: enzym cellulase thuỷ phân CMC trong môitrường sẽ tạo vòng thủy phân không màu khi nhỏ thuốc thử congo đỏ Từcác khuẩn lạc riêng rẽ thu được tiến hành kiểm tra khả năng sinh enzymcellulase bằng phương pháp cấy chấm điểm trên đĩa thạch Chủng có khả năngsinh cellulase sẽ tạo ra xung quanh khuẩn lạc vòng không màu với thuốc thửcongo đỏ Tuyển chọn chủng có tỉ lệ giữa đường kính vòng phân giải (D)

và đường kính khuẩn lạc (d) lớn nhất

Các bước tiến hành:

- Pha môi trường thử hoạt tính CMC đặc, thanh trùng

- Đổ môi trường vào các hộp peptri có độ dày như nhau 3 – 5 mm

- Dùng que cấy đầu nhọn vô trùng, lấy một ít khuẩn lạc chấm một điểm lên đĩa thạch

- Cho vào tủ ấm nuôi ở 35 – 37°C trong ba ngày

- Nhuộm đĩa thạch bằng congo đỏ, đo kích thước vòng thủy phân và khuẩnlạc

Hoạt tính thủy phân CMC được hiển thị bằng tỉ số giữa đường kính vòng phân giải D và đường kính khuẩn lạc d

2.3.2.2 Phương pháp đục lỗ thạch

Nuôi lỏng các chủng cần tuyển chọn ở cùng một điều kiện, sau đó lấy canh trường ly tâm loại sinh khối thu được dịch trong Đĩa thạch có chứa CMC được đục các giếng có cùng kích thước đường kính 8 mm Tiếp đó nhỏ dịch trong củamỗi chủng với thể tích bằng nhau vào mỗi giếng 100µl Giữ trong tủ lạnh 2 –4h để enzym có thể khuếch tán đều vào thạch Ủ đĩa thạch ở 37°C trong vòng

20 –24h Sau đó tiến hành nhỏ thuốc thử congo đỏ so sánh kích thước vòng phân

giải

2.3.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme cellulase

Hoạt độ cellulase được xác định chính xác dựa vào lượng đường khử tạo

thành sau phản ứng bằng phương pháp đo quang phổ theo Miller (1959) [23]

Xây dựng đồ thị đường chuẩn:

Sau đó lấy mỗi ống 300 ul glucose trên đem phản ứng với 600 ul DNS ở 95 –

100oC trong 5 phút Đo quang phổ ở bước sóng 540 nm Từ giá trị đo được ta

xây dựng đường chuẩn, trong đó trục tung là giá trị OD540, trục hoành là hàm

lượng glucose (ul)