Phân lập, chọn lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu carbon dioxide và định hướng làm giảm hiệu ứng nhà kính

Đề tài chủ yếu nghiên cứu điều kiện tăng trưởng tối ưu của vi khuẩn quang hợp tía, khả năng sản sinh sinh khối trong các yếu tố khácnhau, định hướng xử lý nước thải môi trường, [4] 3.. −

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS HOÀNG QUỐC KHÁNH

HVCH NGÔ ĐỨC DUYSinh viên thực hiện

MSSV: 1411100262

: CHÂU TUẤN VĂNLớp: 14DSH01

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướngdẫn thầy Ngô Đức Duy, thực hiện tại Viện Sinh học Nhiệt đới Những số liệu và kếtquả phân tích trong đề tài này hoàn toàn trung thực, không sao chép từ bất kì nguồn tàiliệu tham khảo nào khác dưới bất kỳ hình thức nào Một số nội dung trong đồ án tốtnghiệp có tham khảo và sử dụng dữ liệu trích dẫn được công bố công khai trên các bàibáo khoa học, website, tác phẩm theo danh mục tài liệu tham khảo của đồ án.

Nếu có bất cứ sự sao chép và không trung thực trong bài báo này, người thựchiện đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Viện Khoa học ứng dụng Hutech vàtrước ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Ngày … tháng … năm 2018Sinh viên thực hiện

Châu Tuấn Văn

Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp ở Viện Sinh Học Nhiệt Đới ThủĐức, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy cô, các anh chị và các bạn , em đã hoànthành tốt báo cáo này Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

TS Hoàng Quốc Khánh, Trưởng phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh HọcNhiệt Đới, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Thầy đã tạo điều kiệncho em được làm đề tài

Thầy Ngô Đức Duy, TS Nguyễn Hoàng Dũng và chị Loan phòng Vi Sinh ứngdụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đãtận tình chỉ bảo, giảng dạy và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án tốtnghiệp

Các bạn lớp 14DSH01 đã luôn đồng hành, chia sẻ và giúp đỡ em trong suốt thời gianhọc tập và thực hiện đề tài

Cuối cùng, con xin cám ơn Ba Mẹ, đã nuôi nấng, chăm sóc và tạo mọi điều kiệncho con ăn học thành người có ích cho xã hội

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT i

DANH MỤC HÌNH ẢNH ii

DANH MỤC BẢNG iii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2

3 Mục tiêu đề tài 3

4 Nội dung nghiên cứu 3

5 Phương pháp nghiên cứu 3

6 Các kết quả đạt được của đề tài 4

7 Kết cấu của đề tài 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Tổng quan về khí CO2 (Carbon dioxide) 5

1.1.1 Khái niệm và nguồn gốc khí CO2 5

1.1.2 Lợi ích của khí CO2 5

1.1.3 Tác hại của khí CO2 6

1.1.4 Tình hình phát thải khí CO2 trên thế giới và Việt Nam 8

1.1.5 Các biện pháp giảm thiểu khí thải CO2 10

1.2 Tổng quan về vi khuẩn quang hợp 12

1.2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp 12

1.2.2 Nguyên lý chung quá trình quang hợp và khả năng cố định CO2 14

1.2.3 Ảnh hưởng các nhân tố hóa lý đến sinh trưởng vi khuẩn quang hợp 16

1.2.4 Ứng dụng của vi khuẩn quang hợp 16

1.3 Phương pháp định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử……….18

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

2.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu 19

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 19

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 19

2.1.3 Đối tưởng nghiên cứu 19

2.1.4 Nguồn mẫu 19

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 20

2.2.1 Hóa chất 20

2.2.2 Dụng cụ 21

2.2.3 Thiết bị 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu 21

2.3.2 Quy trình phân lập và định danh 23

2.3.3 Phương pháp tăng sinh mẫu 23

2.3.4 Phương pháp phân lập mẫu 23

2.3.5 Phương pháp, kỹ thuật nhuộm Gram 23

2.3.6 Phương pháp khảo sát sự tăng trưởng vi khuẩn ở các nồng độ muối khác nhau……… 24

2.3.7 Phương pháp khảo sát sự tăng trưởng và sử dụng nguồn CO2 của vi khuẩn quang hợp……….24

2.3.8 Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn……… ……….25

2.3.9 Khuyếch tán DNA bằng phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR)……… 26

2.3.10 Gỉai trình tự DNA và định danh……… ………….….27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN……….28

3.1 Kết quả thu mẫu……….….33

3.2 Kết quả tăng sinh mẫu 33

3.3 Kết quả phân lập và đặc điểm hình thái 36

3.4 Kết quả quan sát hình thái vi khuẩn 38

3.5 Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn 41

3.6 Kết quả khảo sát khả năng hấp thụ CO2 ………46

3.7 Định danh 49

3.8.2 Thiết lập cây phát sinh loài……….….52

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

4.1 Kết luận 53

4.2 Kiến nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC HÌNH ẢNH 56

BIM : Basic Isolation Media

LHQ : Liên Hợp Quốc

NCBI : National Center for Biotechnology Information

PCR : Polymerase Chain Reaction

rDNA : Ribosomal Deoxyribo Nucleic Acid

rRNA : Ribosomal Ribonucleic Acid

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 1.1 Sơ đồ về chu trình Calvin……… 15

Hình 2.1 Mô phỏng vị trí lấy mẫu tại Đức Hòa (A) và Ngọc Hiển (B)………19

Hình 2.2 Quy trình phân lập và định danh vi khuẩn quang hợp……… 22

Hình 2.3 Mô hình thí nghiệm thổi khí vào môi trường lỏng……….25

Hình 2.4 Chu trình phản ứng PCR 16S rRNA……… 27

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn đã được phân lập và làm thuần trên môi trường BIM agar……… 38

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái của một số chủng vi khuẩn được quan sát dưới ống kính hiển vi với vật kính 100X……… 40

Hình 3.3 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 5‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày 41

Hình 3.4 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 10‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày 42

Hình 3.5 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 15‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày 42

Hình 3.6 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 20‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày 43

Hình 3.7 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 25‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày 43

Hình 3.8 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 30‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày 44

Hình 3.9 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 35‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày 44

Hình 3.10 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 40‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày.45 Hình 3.11 Kết quả ly trích DNA của 5 chủng CM24.1, CM23.1, CM34.3, RL1, RL8 trên gel agarose 1% 49

Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm PCR của 5 chủng CM24.1, CM23.1, CM34.3, RL1 trên gel agarose 1% 49

Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm PCR sau khi tinh sạch bằng bộ kit của 5 chủng CM24.1, CM23.1, CM34.3, RL1 trên gel agarose 1% 50

Hình 3.14 Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gene……….……52

DANH MỤC CÁC BẢNG

TrangBảng 1.1 Khí thải CO2 toàn cầu, giai đoạn 2000 – 2017……….……9Bảng 1.2 Một số đặc điểm của vi khuẩn tía lưu huỳnh và không lưu huỳnh ……….13Bảng 2.1 Các thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy……….21Bảng 3.1 Danh sách các nguồn mẫu từ Long An và Cà Mau……….… 29Bảng 3.2 Danh sách mẫu tăng sinh từ các nguồn mẫu Long An và Cà Mau…… ….33Bảng 3.3 Hình ảnh một số ống mẫu tăng sinh có sự thay đổi màu rõ rệt……… … 34Bảng 3.4 Danh sách các chủng đã được phân lập từ 38 ống mẫu tăng sinh…….… 36Bảng 3.5 Kết quả đặc điểm hình thái vi khuẩn……… 38Bảng 3.6 Giá trị OD660nm của các chủng cao hơn 0,3 ở nồng độ 4% sau 7 ngày….…46Bảng 3.7 Giá trị OD660nm, khả năng hấp thụ CO2 của các chủng vi khuẩn ngày 1… 46Bảng 3.8 Giá trị OD660nm, khả năng hấp thụ CO2 của các chủng vi khuẩn ngày 3… 47Bảng 3.9 Giá trị OD660nm, khả năng hấp thụ CO2 của các chủng vi khuẩn ngày 5… 48

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Sự nóng lên toàn cầu (Global Warming) đã và đang là một trong những vấn đềnguy hại có tầm ảnh hưởng to lớn trên toàn thế giới Nóng lên toàn cầu là hiện tượngnhiệt độ trung bình của bề mặt Trái đất tăng lên, dẫn đến tình trạng biến đổi khí hậu.Những nhân tố có thể làm cho sự biến đổi khí hậu xuất hiện là thay đổi bức xạ khíquyển, bao gồm các quá trình như biến đổi bức xạ mặt trời, độ lệch quỹ đạo của TráiĐất, quá trình kiến tạo núi, kiến tạo trôi dạt lục địa và sự thay đổi nồng độ khí nhàkính Khí thải CO2 có lẽ là một trong những nhân tố chính dẫn đến hiện tượng trên là

do sự phát thải đáng kể của khí thải này từ các hoạt động đốt cháy nhiên liệu hóa thạchcùng các loại khí thải khác, khiến lượng nhiệt bị giữ lại trong bầu khí quyển, do đó dẫnđến nhiệt độ Trái đất tăng lên

Biến đổi khí hậu không còn là một thuật ngữ, giả thuyết mơ hồ được nghiên cứubởi những nhà khí tượng học đưa ra, hiện tượng này dần trở thành một mối đe dọahàng đầu đối với nhân loại và sự sống trên trái đất Việt Nam được đánh giá là mộttrong những quốc gia bị ảnh hưởng nặng nề của biến đổi khí hậu do có bờ biển dài Cụthể là, thời tiết ở Việt Nam những năm gần đây ngày càng bất thường có thể kể đếnnhư hạn hán, ngập lụt, sạt lở, giông tố, bão lũ có diễn biến phức tạp, ảnh hưởngnghiêm trọng đến nền kinh tế phụ thuộc nhiều vào sản xuất nông nghiệp của nước ta.Trước sự thách thức trên, Công ước Khung của Liên Hợp Quốc về biến đổi khíhậu (United Nations Framework Convention on Climate Change) được thành lập cùngvới sự tham gia của 155 quốc gia trong đó có Việt Nam nhằm chung tay góp sức cảithiện môi trường bằng cách hạn chế sự phát thải tối đa và duy trì sự ổn định khí nhàkính trong khí quyển ở mức có thể ngăn ngừa sự can thiệp nguy hiểm của con ngườiđối với hệ thống khí hậu Những biện pháp để giảm thiểu khí thải CO2 hiệu quả thôngqua những hành động hằng ngày như là: chuyển dần sang đi bộ, đạp xe đạp,chạy xe

có triển vọng, những công nghệ, chế phẩm bắt nguồn từ vi sinh vật được sử dụng trong

xử lý môi trường có hiệu quả suốt thập kỷ qua Cho nên con đường tìm kiếm vi sinhvật cụ thể là các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng cố định CO2 là một bước đimới nhằm giải quyết vấn đề cấp bách trên

Các chủng vi khuẩn quang hợp, đặc biệt là quang dị dưỡng có khả năng sử dụng

CO2 là nguồn carbon để duy trì sự sống thông qua nhiều con đường cố định carbonkhác nhau Trong đó có thể kể đến chu trình Calvin là chu trình quan trong nhất trongquá trình cố định CO2 Việt Nam là một đất nước được đánh giá cao về tính đa dạngsinh học, có triển vọng tốt cho việc nghiên cứu và phân lập các chủng vi khuẩn có khảnăng trên, đóng vai trò quan trọng trong việc giải quyết khí thải nói riêng và sự nónglên toàn cầu nó chung, là bước đệm để triển khai cho những đề tài nghiên cứu mới vềsau

Chính vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Phân lập, chọn lọc

và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu Carbon dioxide

và định hướng làm giảm hiệu ứng nhà kính”

2 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước

• Nghiên cứu trong nước

− Nghiên cứu nhân nuôi và sử dụng vi khuẩn Rhodobacter để sử lý chất hữu cơ vàSulfide trong nước nuôi trồng thủy hải sản của Thạc sĩ Mỵ Trần Hương Trà đượccông bố vào năm 2015 Khả năng xử lý chất hữu cơ trong môi trường nước thảinuôi trồng thủy hải sản giả định của chủng vi sinh vật này khá cao, với hiệu suất

xử lý từ 58 – 87% Hiệu suất xử lý Sulfide trong môi trường nước thải nuôi trồngthủy sản giả định của chủng vi sinh vật này sau 7 là từ 86.7-100%, gần như loại bỏhoàn toàn Sulfide [1]

− Phân lập, đánh giá các đặc điểm sinh học và định danh phân tử các chủng vi khuẩnquang hợp tía phục vụ chế tạo chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu của Nguyễn ThịHương Giang được công bố vào năm 2012 Đề tài nghiên cứu đặc điểm và khảnăng tăng trưởng từ những môi trường nước khác nhau, từ đó tiến hành thu nhậnsinh khối, ứng dụng và sản xuất chế phẩm vi sinh hữu hiệu trong xử lý nước thảimôi trường [2]

• Nghiên cứu ngoài nước

− Phân lập và định danh vi khuẩn quang hợp sản xuất coenzyme Q10 của Fang LC,Huang XF, Du ZH, Yuan J, Wei H, Cheng HH, Liu Y được công bố vào năm

2005 Trong đề tài này, 13 chủng vi khuẩn quang hợp tía được phân lập và xácđịnh hàm lượng sản sinh coenzyme Q10 cao nhất, định hướng và ứng dụng trong yhọc và sức khỏe [3]

− Phân lập, định danh và tối ưu hóa điều kiện sinh trưởng vi khuẩn quang hợp từ hảisản nhằm muc đích xử lý nước thải của Prasertsan P, Choorit W, Suwanno S

Đuọc công bố vào năm 1993 Đề tài chủ yếu nghiên cứu điều kiện tăng trưởng tối

ưu của vi khuẩn quang hợp tía, khả năng sản sinh sinh khối trong các yếu tố khácnhau, định hướng xử lý nước thải môi trường, [4]

3 Mục tiêu đề tài

Xây dựng bộ sưu tập vi khuẩn quang hợp và định danh tới mức các loài vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thụ CO2

4 Nội dung nghiên cứu

− Phân lập vi khuẩn quang hợp, gram âm, hiếu hoặc kị khí, hóa tự dưỡng hoặc dị dưỡng từ nguồn nước trồng lúa thuộc các tỉnh Long An, Cà Mau

− Kiểm tra hình thái , các đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập được

− Chọn lọc các dòng vi khuẩn có khả năng cố đinh CO2 bằng cách khảo sát sự tăng trưởng của chúng trong điều kiện dinh dưỡng có sục khí CO2

− Định danh đến loài các chủng bằng phương pháp giải trình tự DNA mã hóa cho ribosome 16S

− Bảo quản giống bằng phương pháp lạnh sâu có bổ sung 15% glycerol

− Ly trích DNA và khuyếch đại đoạn gene các chủng mong muốn bằng phương phápPCR Định danh tới loài bằng phương pháp giải trình tự rDNA 16S, phân tích trình

tự và xây dựng cây phát sinh loài

− Phương pháp khảo sát khả năng chịu mặn của vi khuẩn bằng phương pháp đo

OD660

− Phương pháp khảo sát khả năng hấp thu CO2

− Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gen DNA

− Phương pháp PCR dựa trên đoạn mồi 27F và 1492R

− Phương pháp sinh tin học dựa trên các phần mềm (ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0)

6 Các kết quả đạt được của đề tài

− Kết quả phân lập và làm thuần đuọc các chủng vi khuẩn quang hợp chịu mặn cao

và có khả năng hấp thu CO2

− Kết quả thu nhận được bộ gene DNA

− Kết quả khuyếch đại đoạn gene bằng phương pháp PCR

6 Kết cấu của đề tài

Đề tài bao gồm 4 chương

Chương 1: tổng quan tài liệu

Chương 2: vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: kết quả và biện luận

Chương 4: kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về khí CO2 (Carbon dioxide)

1.1.1 Khái niệm và nguồn gốc khí CO2

Carbon dioxide, có công thức hóa học là CO2, hay còn đuọc biết đến tên gọi khác

là Carbonic anhydride, carbonic acid Carbon dioxide là một loại khí không màu nặnghơn hơn không khí Carbon dioxide không cháy Ở nồng độ thấp, khí carbon dioxidekhông có mùi Ở nồng độ cao, nó có độ sắc nét, có tính axit mùi Ở nhiệt độ bìnhthường, carbon dioxide không phản ứng với nhiều vật liệu khác Carbon dioxide hòatan trong nước để tạo thành cacbonic axit Nó có thể dễ dàng và an toàn hóa lỏng, kiên

cố hóa, xử lý và lưu trữ.[5]

Carbon dioxide thu được từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm cả khí thoát ra từ các

núi lửa, sản phẩm cháy của các hợp chất hữu cơ và hoạt động hô hấp của các sinh vậtsống hiếu khí Nó cũng được một số vi sinh vật sản xuất từ sự lên men và sự hôhấpcủa tế bào

Khí carbon dioxide thải vào khí quyển do việc sử dụng nhiên liệu hóa thạch

"chiếm 99,4% lượng khí thải CO2 trong năm 2013" [6] Carbon dioxide là khí nhàkính lâu đời quan trọng nhất trong khí quyển Trái đất Kể từ khi cuộc cách mạng côngnghiệp phát thải nhân loại - chủ yếu từ việc sử dụng nhiên liệu hóa thạch và phá rừng -

đã nhanh chóng tăng nồng độ của nó trong khí quyển, dẫn đến sự nóng lên toàn cầu.Carbon dioxide cũng gây ra acid hóa đại dương bởi vì nó hòa tan trong nước để tạothành carbonic acid [7]

1.1.2 Lợi ích của khí CO 2

Ngày nay, tác hại khí thải CO2 là một trong những đề tài xôn xao và nhức nhốitrong xã hội hiện nay Nhưng chúng ta không thể phủ nhận rằng, ngay từ đầu khí thảinhà kính này là một nhân tố vô cùng quan trọng và ý nghĩa cho sự sống muôn loài trên

Trong cái nhìn thực tế hơn, khí CO2 giúp ích cho cây cối phát triển và hữu dụngtrong nền Công nghiệp, thực phẩm,y học và các hoạt động đời sống thường ngày Cụthể là, Trong công nghệ thực phẩm, CO2 được sử dụng để tạo gas cho nhiều thức uống,lưu trữu và vận chuyển thực phẩm đông lạnh,…Trong công nghiệp, khí CO2 đượcdùng để vận hành các hệ thống khí nén trong nhà máy, làm giảm độ ẩm trong hệ thốnggiúp kéo dài tuổi thọ, và ít tốn chi phí bảo trì Không những thế, CO2 còn là khí bơm

và lựa chọn trong phẫu thuật nội sôi vì chúng không màu, không dễ cháy

Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng, mặc dù CO2 là khí thải độc hại, nhưng xét về kinh

tế, hóa chất này vẫn có thể biến thành nguyên liệu thân thiện với môi trường trongngành công nghiệp hóa chất Chúng ta hiện đang sản xuất nhiều loại hóa chất cần thiết

từ CO2 như thuốc bảo vệ thực vật, nhựa, thuốc trừ sâu, phân bón, salicylic acid, nhiênliệu và các nguyên liệu khác

1.1.3 Tác hại của khí CO 2

Khi trái đất ấm lên nhờ có khí thải CO2 từ thiên nhiên để cân bằng sự sống, thấyđược lợi ích từ khí thải này, con người đã lạm dụng chúng quá mức thông qua nhữnghoạt động trực tiếp và gián tiếp, sự biến đổi khí hậu một lần nữa đã và đang thay đổikhiến cho trái đất nóng dần lên, thuật ngữ “Sự Nóng lên toàn cầu” bắt đầu được đề cậptới để miêu tả vấn đề trên

Lượng khí CO2 tồn tại trong bầu khí quyển vẫn đang ngày một tăng lên mức báođộng Những tác hại có thể được kể đến như: ô nhiễm môi trường ảnh hưởng đến chấtlượng cuộc sống và sức khỏe con người và sinh vật khác; khởi tạo ra các thiên tai nhưhạn hán, ngập lụt, sạt lở, giông tố, bão lũ; làm băng tan chảy nước biển dâng cao; pháhủy hệ sinh thái; gây ra hiệu ứng nhà kính, biến đổi khí hậu,

Trái đất đang ngày càng nóng lên và con người nhận ra những tác hại rõ ràng từ sựnóng lên toàn cầu này: nền nông nghiệp rối loạn, cơ sở hạ tầng xuống cấp cùng vớinguồn năng lượng dần cạn kiệt…5 tác hại kinh hoàng của sự nóng lên toàn cầu có thểđược đề cập đến là:

1 Thiếu lương thực, thực phẩm

Chỉ theo tính toán riêng ở Mỹ, năng suất cây trồng của ngô, lúa mì hay bông ở vùng thung lũng trung tâm California sẽ giảm đến 30% trong vài thập kỉ tới

Nguyên nhân được cho là do sự tăng lượng carbon trong không khí, sự sụt giảm về

số lượng loài ong dẫn đến quá trình thụ phấn bất thành…

Ngoài ra, biến đổi khí hậu cũng sẽ ảnh hưởng đến giá thành chế biến, lưu trữ vàvận chuyển lương thực, đẩy giá lương thực tăng cao do tăng nhu cầu về nguồn nước vànăng lượng Điều này gây ảnh hưởng không nhỏ đến nền kinh tế cũng như người tiêudùng.[8]

2 Khủng hoảng năng lượng

Nhu cầu năng lượng ngày càng tăng tạo nên một vòng luẩn quẩn của biến đổi khíhậu Từ năm 1970, nhu cầu sưởi ấm của toàn cầu đã giảm trong khi nhu cầu làm máttăng vọt

Nhiệt độ sẽ ngày càng tăng lên trong các thập kỉ tới, sự gia tăng nhanh chóng củadân số toàn cầu cũng kéo theo nhu cầu sử dụng năng lượng ngày một tăng Điều nàygóp phần thúc đẩy sự phát triển trong việc xây dựng các nhà máy – nguyên nhân gây

ra biến đổi khí hậu

Trong khi đó, lượng mưa được dự báo sẽ giảm đến 40% ở một số nơi, làm giảmlượng nước – một thành phần quan trọng trong sản xuất thủy điện Do đó, khủnghoảng năng lượng sẽ là một cơn ác mộng thực sự.[8]

3 Phá hỏng cơ sở hạ tầng

Cơ sở hạ tầng giao thông vận tải đã “lão hóa” sẽ không thể chống chọi tốt trướckhí hậu khắc nghiệt Càng ngày, thiên nhiên càng trở nên hung dữ và đáng sợ hơn vớinhững cơn bão hàng năm được nhận xét là vô cùng mạnh

Theo thống kê, siêu bão Sandy tàn phá nước Mỹ năm ngoái đã cướp đi hơn 90mạng người và gây thiệt hại gần 50 tỷ USD (hơn 1 triệu tỷ VNĐ) đối với nền kinh tếhàng đầu thế giới này

Chính sự xuống cấp, “lão hóa” của cơ sở vật chất theo năm tháng cũng như trảiqua các thiên tai sẽ là một bất lợi lớn khi cần vận chuyển các mặt hàng thiết yếu nhưthực phẩm, nhiên liệu, nước đến nơi cần trợ giúp.[8]

Nạn hạn hán hoành hành ở nhiều nơi và ngày càng tồi tệ hơn Nguy cơ hạn hánkéo dài rất dễ xảy ra, điều này gây nguy hiểm đến sự phát triển của nền nông nghiệpcũng như các ngành công nghiệp phụ thuộc vào nước.[8]

5 Không khí ngày càng bị ô nhiễm nặng

Sự ấm lên của Trái đất cũng kéo theo tình trạng ô nhiễm không khí Tình trạng ônhiễm khói bụi dài hạn cũng ảnh hưởng tới quá trình hình thành mây và lượng mưa,khiến các điều kiện thời tiết khắc nghiệt trầm trọng thêm

Sự gia tăng lượng ozon trong khí quyển dẫn đến việc nhiều người mắc bệnh vềphổi và theo tính toán, số lượng bệnh nhân hen suyễn dự kiến sẽ tăng đến 10% tại các

đô thị lớn

Các nhà khoa học cho rằng, lượng khí carbon ngày một dày đặc sẽ gây ảnh hưởnglớn đến các bệnh nhân bị dị ứng.[8]

1.1.4 Tình hình phát thải khí CO 2 trên thế giới và Việt Nam

Khí thải CO2 liên quan đến năng lượng toàn cầu đã tăng 1,4% trong năm 2017,tăng 460 triệu tấn (Mt), và đạt mức cao lịch sử 32,5 Gt Sự tăng trưởng của năm ngoái

là sau ba năm phát thải bằng phẳng và tương phản với mức giảm mạnh cần thiết để đápứng các mục tiêu của Hiệp định Paris về biến đổi khí hậu Sự gia tăng lượng khí thảicarbon, tương đương với lượng phát thải 170 triệu xe, là kết quả của tăng trưởng kinh

tế toàn cầu mạnh mẽ 3,7%, giá nhiên liệu hóa thạch thấp hơn và nỗ lực tiết kiệm nănglượng yếu hơn Ba yếu tố này đã góp phần thúc đẩy nhu cầu năng lượng toàn cầu tăng2,1% vào năm 2017 Tuy nhiên, xu hướng phát triển khí thải ngày càng không phổbiến Trong khi hầu hết các nền kinh tế lớn nhìn thấy sự gia tăng phát thải carbon, một

số nền kinh tế khác lại suy giảm, chẳng hạn như Hoa Kỳ, Anh, Mexico và Nhật Bản

Sự suy giảm lớn nhất đến từ Hoa Kỳ, nơi mà lượng khí thải giảm 0,5%, hoặc 25 Mt,xuống còn 4810 Mt CO2, đánh dấu năm thứ ba liên tiếp suy giảm Trong khi chuyểnđổi từ than sang khí đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm phát thải trong nhữngnăm trước, năm ngoái, sự suy giảm là kết quả của việc sản xuất điện dựa trên nănglượng tái tạo cao hơn và sự suy giảm nhu cầu điện Tỷ trọng tái tạo trong sản xuất điệnđạt mức kỷ lục 17%, trong khi tỷ trọng điện hạt nhân giữ ổn định ở mức 20%.[9]

Bảng 1.1 Khí thải CO2 toàn cầu, giai đoạn 2000 - 2017

(Nguồn trích từ International Energy Agency, 2017)Trên lộ trình phấn đầu thành một nước công nghiệp, những năm qua, Việt Nam đãđạt được những bước tiến đáng kể trong công tác giảm nghèo và nâng cao phúc lợi xãhội Tuy nhiên, chính sự phát triển này cũng là một trong những nguyên nhân làm tăngnhanh lượng phát thải khí CO2

Mặc dù chưa có nghĩa vụ phải cắt giảm phát thải khí nhà kính nhưng lượng khínhà kính của Việt Nam rất đáng báo động, đặc biệt mức phát thải đang liên tục tăng, từ

thải khí nhà kính nhiều nhất với 141.171 triệu tấn chiếm 53,1% tổng phát thải, tiếptheo là lĩnh vực nông nghiệp với 88.355 triệu tấn chiếm 33,2% tổng phát thải [10]

Sự tăng nhanh về phát thải khí nhà kính đã góp phần không nhỏ đến việc làm trầmtrọng hơn thời tiết cực đoan của Việt Nam Thống kê cho thấy, trong vòng 10 năm trởlại đây, các loại thiên tai như: Bão, lũ, lụt, lũ quét, sạt lở đất, úng, hạn hán, xâm nhậpmặn và các thiên tai khác đã làm chết và mất tích hơn 9.000 người, giá trị thiệt hại vềtài sản ước chiếm khoảng 1,5% GDP/năm Ðiều đáng lo ngại, những biến động bất

1.1.5 Các biện pháp giảm thiểu khí thải CO 2

một trong những vấn đề nhức nhói Những biện pháp đề xuất phải phù hợp với ngânsách và đồng thời hiệu quả cao

Một số các biện pháp hóa học, vật lý để giảm thiểu khi nhà kính có thể kể đến như:

− Phương pháp xử lý khí CO2Hấp thụ bằng dung dịch etanolamin

− Phương pháp xử lý khí CO2Hấp thụ bằng dung dịch amoniac

Hạn chế sử dụng lò sưởi và điều hòa nhiệt độ

Hãy làm cho ngôi nhà, căn phòng của bạn được kín kẽ bằng cách sử dụng các loạicửa cách âm, cách nhiệ có thể làm giảm chi phí sưởi ấm, làm mát của bạn hơn 25%.Bạn chỉ cần cài đặt nhiệt lớn cao 2 độ vào mua đông và thấp hơn 2 độ vào mùa hè cóthể tiết kiệm khoảng 2 tấn CO2 mỗi năm.[10]

Lái xe thông minh và hạn chế sử dụng xe cá nhân

Ít xe cá nhân có nghĩa là lượng khí thải ít hơn Đi bộ và đi xe đạp để tiêt kiệm nănglượng và là hình thức tuyệt vời để tập thể dục, khám phá hệ thống giao thông cộngđồng của bạn hoặc bạn có thể đi chung xe làm hoặc đi học

Khi bạn lái xe, để đảm bảo xe của bạn chạy một cách hiệu quả Hãy giữ lốp xeluôn căng, như vậy có thể cải thiện hơn 3% lượng xăng của bạn, không chỉ giúp bạntiết kiệm ngân sách mà còn giúp giảm 20 kg CO2 trong khí quyển [10]

Mua những sản phầm tiết kiệm năng lượng hiệu quả

Hãy mua một chiếc xe tiết kiệm nhiên liệu tốt Thiết bị gia dụng hiện nay có mộtloạt các sản phẩm tiết kiệm năng lượng, và bóng đèn huỳnh quang nhỏ gọn được thiết

kế để cung cấp ánh sáng trông tự nhiên hơn trong khi sử dụng ít năng lượng hơn so vớibóng đèn sợi đốt

Tránh các sản phẩm đi kèm như bao bì dư thừa , đặc biệt là các bao bì mà khôngthể tái chế được Nếu bạn giảm rác thải hộ gia đình của bạn bằng 10 phần trăm, bạn cóthể tiết kiệm 500 tấn CO2 mỗi năm [10]

Sử dụng ít nước nóng

Đặt bình đun nước nóng ở nhiệt độ vùa phải, và bọc nó trong một tấm chăn cáchnhiệt nếu nếu đã sử dụng được 5 năm Mua vòi hoa sen chảy chậm để tiết kiệm nướcnóng và giảm khoảng 350 kg CO2 mỗi năm Giặt quần áo và rửa mọi thứ bằng nướclạnh, sự thay đổi đó của một mình bạn có thể tiết kiệm ít nhất 500 kg CO2 mỗi năm.[10]

Tiết kiện điện.

Tiết kiệm điện và giảm sự nóng lên toàn cầu bằng cách tắt đèn khi ra khỏi phòng

Và hãy nhớ tắt ti vi và máy tính của bạn khi bạn không sử dụng chúng Tắt nước khibạn không sử dụng nó Trong khi đánh răng hay rửa xe, tắt nước cho đến khi bạn thực

sự cần nó để rửa Bạn sẽ làm giảm hóa đơn tiền nước của bạn và giúp bảo tồn mộtnguồn tài nguyên quan trọng.[10]

1.2 Tổng quan về vi khuẩn quang hợp

1.2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp (VKQH)

Nhóm vi khuẩn quang hợp nhờ có sắc tố diệp lục Chất diệp lục vi khuẩn khác vớichất diệp lục của thực vật và không tạo ra sản phẩm cuối cùng là oxi Chúng sử dụngnguồn hidro là sunfit thiosunfat, hidro tự do, chất hữu cơ và sản sinh ra nhiều sảnphẩm phụ dạng oxi hóa Bao gồm: vi khuẩn lưu huỳnh lục,vi khuẩn không lưu huỳnhlục, vi khuẩn tía lưu huỳnh và vi khuẩn tía không lưu huỳnh.[1]

• Vi khuẩn lưu huỳnh lục

Thuộc nhóm này là các vi khuẩn kị khí bắt buộc, có khả năng quang tự dưỡng vô

cơ (photolithoautotroph), tế bào có chứa chlorophyll a cùng với b, c hoặc e, chứacarotene nhóm 5, hệ thống quang hợp liên quan đến các lục thể (chlorosom) và độc lậpvới màng sinh chất Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang hợpthường sử dụng H2, H2S hay S Hạt lưu huỳnh tíchc lũy bên ngoài tế bào, không có khảnăng di động, một số loài có túi khí; tỷ lệ G+C là 48-58%.Gồm có các chi:Chlorodium, Prosthecochloris, Pelodictyon, Ancalichliris, Chloroherpeton.[12]

• Vi khuẩn không lưu huỳnh lục

Thuộc nhóm này là vi khuẩn đa bào, dạng sợi, thường kỵ khí không bắt buộc,thường là quang dị dưỡng (photoheterotrop), có loài quang tự dưỡng hoặc hóa dịdưỡng Tế bào có chứa chlorophyll a và c, trong điều kiện kỵ khí thấy có chlorosom.Dùng để làm nguồn điện tử (electron donors) trong quang dị dưỡng là glucose, aminoacid, acid hữu cơ, trong quang tự dưỡng là H2, H2S Di động bằng phương thức trường(gliding), tỷ lệ G + C là 53-55% Chi điển hình là Chloroflexux, Chloronema.[12]

• Vi khuẩn quang hợp tía

Vi khuẩn quang hợp tía là các tế bào gram âm, đơn bào, có các dạng cầu xoắn,hình que ngắn, hình phẩy… đứng riêng rẽ hoặc thành chuỗi Các loài vi khuẩn quanghợp tía đều sinh sản bằng cách nhân đôi, một số loài sinh sản bằng cách nảy chồi.Chúng có khả năng chuyển hóa năng lượng mặt trời thành năng lượng hóa học bởi quátrình quang hợp kỵ khí VKQH tía thường có màu hồng đến màu đỏ tía, sắc tố quanghợp chính là bacteriocholorophyll a hoặc b Cơ quan quang hợp là màng quang hợpđược gắn với tế bào [1]

Vi khuẩn quang hợp tía lưu huỳnh

Thuộc nhóm này là các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, có khả năng quang tự dưỡng vô

cơ (photolithoautotroph), tế bào có chứa chlorophyll a hoặc b , hệ thống quang hợpchứa các màng hình cầu hay hình phiến (lamellar) gắn với màng sinh chất Để dùnglàm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang hợp thường sử dụng H2, H2S hay

S Có khả năng di động với tiên mao mọc ở cực, có loài chu mao, tỷ lệ G+C là

45-70%.[13]

Vi khuẩn quan hợp tía không lưu huỳnh.

Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía là nhóm vi khuẩn quang dị dưỡng hữu cơ(photoorganoheterotrophs) thường kỵ khí bắt buộc, một số loài là quang tự dưỡng vô

cơ không bắt buộc (trong tối là hoá dị dưỡng hữu cơ- chemoorganoheterotrophs) Tếbào chứa chlorophyl a hoặc b, hệ thống quang hợp chứa các màng hình cầu hay hìnhphiến (lamellar) gắn với màng sinh chất Để dùng làm nguồn cho điện tử (electrondonors) trong quang hợp thường sử dụng chất hữu cơ, đôi khi sử dụng hợp chất lưuhuỳnh dạng khử hoặc H2 Có khả năng di động với tiên mao mọc ở cực, hoặc không diđộng, một số loài có túi khí (gas vesicles), tỷ lệ G+C là 61-72%.[13]

Bảng 1.2 Một số đặc điểm của vi khuẩn tía lưu huỳnh và không lưu huỳnh

Vi khuẩn tía không lưu huỳnh (alpha- hoặcbetaproteobacteria)

Một số loài chính Vi khuẩn tía lưu huỳnh: Allochromatium

vinosum, Thiocapsa roseopersicina

Vi khuẩn tía không lưu huỳnh: Rhodobactercapsulatus, Rhodobacter sphaeroides,

rhodopsin và dẫn xuất của chúngMàu sắc huyền phù tế bào: tía, đỏ tía, đỏ, tía-tím, cam, nâu, vàng-nâu (với những loài chứaBChl a), xanh hoặc vàng (với những loài chứaBChl b)

Vị trí sắc tố trong tế bào Nằm trong lớp màng sinh chất, được sắp xếp

thành dạng ống, dạng màng, dạng túi hoặc dạngphiến lamellae

Phổ hấp thụ cực đại của tế bào sống Những loài chứa BChl a gần 800nm và những

vùng có bước sống từ 815-960nmVới những loài chứa BChl b: 835-850 nm và1010-1040 nm

Chất cho electron/ giọt lưu huỳnh Sulfide, S0,2-, H 2 , Fe2+

Nếu S0 được hình thành từ quá trình oxi hóasulfide thì S0 được tích lũy trong tế bào, và điềunày chỉ xảy ra ở vi khuẩn tía có lưu huỳnhQuang tự dưỡng/ hô hấp tối Vi khuẩn tía lưu huỳnh bị hạn chế về số lượng

Vi khuẩn tía không lưu huỳnh đa dạng về sốlượng

(Nguồn trích từ Mỵ Trần Hương Trà, 2015)

1.2.2 Nguyên lý chung quá trình quang hợp và khả năng cố định CO 2 ở vi khuẩn

Tất cả vi khuẩn quang hợp đều chứa sắc tố quang hợp Sắc tố quang hợp ở vi khuẩnđược gọi là bacteriochlorophyll, chlorophyll và bacteriochlorophyll còn được gọi làchất dệp lục và chất khuẩn lục Chất diệp lục, khuẩn lục và huyết sắc có cấu trúc tương

tự nhau, đó là một vòng pocphiril do 4 nhân pirol liên kết với nhau Lõi của chất diệplục và chất khuẩn lục là Mg, còn lõi của của huyết sắc tố là Fe, chất diệp lục a khác vớichất khuẩn lục a, b, c, d, e ở gốc 7 gốc R (từ R1 đến R7).[14]

Chúng thuộc loại tự dưỡng quang năng, có thể sử dụng CO2 làm nguồn carbon tổnghợp nên chất hữu cơ của cơ thể, dưới tác động của năng lượng ánh sáng mặt trời.Phương trình có thể biểu diễn như sau:

2CO 2 + H 2 S + 2H 2 O…(CH 2 O) + H 2 SO 4

Trong quá trình oxy hóa H2S, lưu huỳnh được tích lũy Sau đó S được chuyển hóathành SO4 và dần dần ra ngoài Vi khuẩn cũng có thể dung đồng thời H2S nhu chất cho

H trong cả quá trình quang hợp.[14]

Khi quang hợp, chu trình calvin, hệ thống cố định notơ, hệ thống DMSO/DMSORđược tế bào sử dụng để duy trì thế oxy hóa khử Các phản ứng của chu trình calvin chophép CO2 có chức năng thu nhận các lực khử dư thừa do trao đổi chất các chất hữu cơnhu malate, succinate Do đó, vai trò của chu trình calvin trong suốt quá trình sinhtrưởng quang dị dưỡng là giữ thế cân bằng oxy hóa khử trong tế bào Khi tế bào sinhtrưởng trong điều kiện quang tự dưỡng thì vai trò chủ yếu của chu trình calvin là cốđịnh CO2 để tổng hợp vật liệu tế bào Chính nhời tính lưỡng cực này mà chu trìnhcalvin có vai trò điều khiển giữa hai quá trình quang tự dưỡng và quang dị dưỡng [1]

1.2.3 Ảnh hưởng các nhân tố hóa lý đến sinh trưởng vi khuẩn quang hợp tía

1 Độ pH

Quang hợp của vi khuẩn quang hợp tía có thể xảy ra trong môi trường có pH 3-11

Vi khuẩn tía sinh trưởng và phát triển ở pH tối ưu khoảng 6-7.[15]

2 Cường độ ánh sáng

Vi khuẩn quan hợp tía sử dụng ánh sáng để quang hợp, phát triển mạnh ở môitrường có ánh sáng đỏ, ngoài ra chúng có thể phát triển quang dưỡng và trong bóng tối.[15]

1.2.4 Ứng dụng của vi khuẩn quang hợp

Vi khuẩn quang hợp dần trở nên phổ biến hơn khi những mặt lợi ích của chúng đượcthể hiện rõ qua thời gian Chúng được sử dụng trong xử lý nhiều loại nước thải cónguồn gốc nông nghiệp, chăn nuôi, chế biến nông sản, nuôi trồng thủy hải sản, thậmchí cả công nghiệp khai thác dầu khí Sinh khối của nhóm vi khuẩn này còn rất giàudinh dưỡng nên có thể sử dụng như một nguồn thức ăn tươi sống trong nuôi giống thủyhải sản

Làm thuốc làm sạch chất nước của nước nuôi trồng

Trong quá trình nuôi hải sản, định kỳ cho một lượng vi khuẩn quang hợp thích hợpvào nước nuôi, có thể làm mất ion N trong nước và các vật sinh ra do phân giải vật hữu

cơ khác từ đó đạt tới việc không thay nước mà vẫn có thể giữ được môi trường nướctốt Ðiều đó chủ yếu là do vi khuẩn quang hợp ở trong nước có thể lợi dụng vật hữu cơlàm vật cung ứng H để tiến hành tác dụng quang hợp, đồng thời với việc loại

bỏ vật ô nhiễm, bản thân vi khuẩn quang hợp cũng sinh sôi tăng trưởng, đạt tới tácdụng tuần hoàn ưu việt.[18]

Dự phòng và điều trị bệnh

Do sự sinh sôi nhanh chóng của vi khuẩn quang hợp, mà hạn chế sự sinh sôi củakhuẩn khác gây bệnh Theo thông báo, vi khuẩn quang hợp có tác dụng rõ rệt đối vớibệnh đỏ vỏ tôm, bệnh đen mang, bệnh khuẩn dạng sợi Và khuẩn quang hợp trong quátrình chuyển hoá có thể sinh ra loại men chống độc tố bệnh (men phân giải trypsin, cótác dụng dự phòng và chữa trị bệnh tôm cá) Theo thông báo, vi khuẩn quang hợp cóthể điều trị bệnh loét mang của cá chép do vi khuẩn dính gây nên Theo thông báokhác, dùng vi khuẩn quang hợp ít hơn 10 lần, đối với cá chép bị bệnh có lỗ, cá chình bịbệnh mốc nước và đỏ vây, bệnh cảm nhiễm do bị sát thương của cá trác đen, tắm thuốc

từ 10 -15 phút, sau lại đem nuôi trong nước có thả một lượng thích hợp vi khuẩn quanghợp, độ nửa tháng có thể chữa khỏi Sử dụng lâu dài trong ao nuôi cua, có thể tránhxảy ra bệnh thiếu máu.[18]

Làm thức ăn cho ấu thể tôm cá

Vi khuẩn quang hợp có giá trị dinh dưỡng rất cao hàm lượng prôtêin đạt trên 60%,đồng thời còn chứa vitamin nhóm B phong phú và folacin, sinh vật tố và chất thúc lớnsinh vật chưa biết, chấy lượng của nó thì men không có cách gì so sánh được Cònkhuẩn thể của vi khuẩn quang hợp rất nhỏ (chỉ là 1/20 của tảo tiểu cầu), do đó, còn làthức ăn vừa miệng nhất của ấu thể cá, tôm, nhuyễn thể có vỏ Trong quá trình nuôi ấuthể cá, tôm, nhuyễn thể có vỏ ứng dụng vi khuẩn quang hợp có thể nâng cao tỷ lệ sống,tăng nhanh sự sinh trưởng, giảm bớt lượng nước thay Cuối cùng nguyên nhân của nó,một là làm sạch nước, cải thiện môi trường nước, hai là làm thức ăn cho ấu thể, ba là

vi khuẩn quang hợp sau khi trở thành loài ưu thế của khối nước, vật chất sinh trưởng

do nó giải phóng ra có thể làm cho một số nguyên nhân bệnh khó tồn tại, có thể giảmbớt bệnh của ấu thể, từ đó nâng cao tỷ lệ sống của ấu thể.[18]

Làm chất phụ gia cho thức ăn có chất lượng

thường trong thức ăn tăng 0,5 -1% là có thể tăng rõ rệt hiệu quả thức ăn và tỷ lệ tăngtrọng Căn cứ kết quả thí nghiệm cho biết, vi khuẩn quang hợp dùng cho nuôi cá chìnhNhật Bản tỷ lệ tăng trọng có thể cao tới 10%, dùng để nuôi tôm he dưới 8 mm, mỗimẫu có thể tăng sản lượng 12% dùng để nuôi cá nước ngọt, mỗi mẫu có thể tăng sảnlượng 25%.[18]

1.3 Phương pháp định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Phương pháp định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử dựa vào vật liệu

di truyền là một phương pháp tin cậy, có độ chính xác cao, tiến hành trong thời gianngắn, không cần nuôi cấy, khắc phục được một nhược điểm lớn của phương pháp địnhdanh truyền thống là phải nuôi cấy, tiến hành nhiều phản ứng sinh hóa phức tạp, tuynhiên đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại, cơ sở dữ liệu, thông tin về đặc điểm ditruyền của đối tượng cần nghiên cứu đầy đủ Trình tự gen 16S rDNA với chiều dàikhoảng 1500 bp mã hóa cho cấu trúc phân tử 16S ribosome thể hiện sự tiến hóa của hệthống vi sinh và là một công cụ tuyệt vời để làm sáng tỏ mối quan hệ phát sinh loài Lý

do để sử dụng những trình tự này làm chỉ thị phân tử đó là cấu trúc phân tử rRNA làyếu tố cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp protein ở tất cả các hệ thống tế bào Do đógen mã hóa cấu trúc 16S rDNA có tính bảo tồn cao, chứa những vùng tương đồng giữacác loài Nếu giữa các loài có mối quan hệ họ hàng thì độ tương đồng càng cao [19]

Để thể hiện lịch sử tiến hóa của một nh1om các loài có mối quan hệ với nhau, cácphương pháp giải trình tự đoạn gene 16S rDNA và việc xây dựng cây phát sinh loàihiện nay đã trở nên khá phổ biến và được xây dựng trên cơ sở dữ liệu của sinh học vàtin học (sinh tin học) Những trình tự mới này sẽ được so sánh với những trình tự trongngân hàng dữ liệu gene bằng cách sử dụng chương trình BLAST (Basic LocalAlignment Search Tool) cho kết quả những loài nào có số trình tự tương đồng cao nhấtvới chủng đang khảo sát Sau đó sử dụng các phần mềm sinh tin học như ChromasPro1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 để xây dựng cây phát sinh loài, tập hợpnhững thông tin có liên quan đến tiến hóa

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu

Làm việc tại Phòng Vi sinh – Viện Sinh học Nhiệt đới 9/621 Xa lộ Hà Nội, phườngLinh Trung, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

2.1.2 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 03/2018 – 07/2018

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn quang hợp, có khả năng cố định CO2 từ các nguồn nước từ ruộnglúa

2.1.4 Nguồn mẫu

Nguồn mẫu phân lập được thu tại rừng ngập mặn huyện Ngọc Hiển thuộc tỉnh Cà Maunằm ở vị trí 8066’65’’ vĩ độ Bắc, 105000’28’’ Kinh độ Đông và Đức Hòa thuộc tỉnhLong An nằm ở vị trí 100 90’23’’ vĩ độ Bắc, 106041’85’’ Kinh độ Đông

Hình 2.1 Mô phỏng vị trí lấy mẫu tại Đức Hòa (A) và Ngọc Hiển (B)

Hóa chất sử dụng tron tinh sạch DNA

− Nước khử ion

− Buffer PB

− Buffer PE

Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn BIM (Basic Isolation Media)

Bảng 2.1 Các thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy

Môi trường được hấp khử trùng ở 121℃ trong vòng 15 phút

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu

Vi khuẩn quang hợp phân bố rộng rãi trong tự nhiên như ở các vùng ao, hồ, đặcbiệt là các vùng ao lúa có ánh nắng chiếu rọi cao Các mẫu thu thập được kiểm tra pHtrước khi thu

Dụng cụ thu mẫu bao gồm túi nilon dày, ly nhựa Ta sử dụng ly nhựa để múc nước

ao ruộng cùng với vớt 1 lớp đất trồng dày khoảng 2-3 cm phân phối vào trong bịch

2.3.2 Quy trình phân lập và định danh vi khuẩn quang hợp cố định CO 2

Mẫu

Tăng sinh 10 ngày

Pha loãng mẫu đến 10-3Phân lập

Ủ 3 -4 ngày ở nhiệt độ phòng, nơi có ánhnắng chiếu rọi

Hình 2.2 Quy trình phân lập và định danh vi khuẩn quang hợp

2.3.3 Phương pháp tăng sinh mẫu

Môi trường lỏng cơ bản BIM được sử dụng để tăng sinh các nguồn mẫu Môitrường lỏng được chuẩn bị và phân phối vào ống nghiệm với thể tích 10 ml, sau đómẫu nước được đổ vào ống môi trường sao cho mẫu gần ngập đầy miệng ống nghiệm

để tránh sự sinh trưởng của tảo Tất cả mọi thao tác đều thực hiện trong tủ cấy vôtrùng, các ống sau đó được đặt ở vị trí có sự tiếp xúc của ánh nắng mặt trời và quan sát

sự thay đổi màu sắc trong vòng 10 ngày

2.3.4 Phương pháp phân lập mẫu

Đối với nguồn mẫu phân lập trực tiếp, tiến hành pha loãng mẫu nước ở các nồng

độ khác nhau từ 10-1, 10-2, 10-3 nhằm thu được các khuẩn lạc riêng rẽ khi ta trải đĩa,mỗi nồng độ pha loãng tương ứng với 1 ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng Tahút 1 ml từ nguồn mẫu cho vào ống thứ nhất để được nồng độ 10-1, tiếp theo ta hút 1

ml từ ống có nồng độ 10-1 cho vào ống thứ 2 để đạt nồng độ 10-2, và làm tương tự đốivới ống thứ 3 để đạt nồng độ 10-3

Ta phân lập bằng cách cấy trải 0,1 ml dịch nuôi cấy ở mỗi nồng độ pha loãng lênmôi trường thạch BIM, ủ ỏ nhiệt độ phòng trong 2 – 3 ngày

Sau khi khuẩn lạc hình thành trên bề mặt đĩa môi trường, ta tiến hành chọn nhữngkhuẩn lạc có hình dạng và màu sắc khác nhau và cấy chuyền 2 -3 lần để sang đĩa thạchkhác để thu được khuẩn lạc đồng nhất

Đối với mẫu tăng sinh, tiến hành pha loãng ống tăng sinh đến nồng độ 10-3, cấytrải trên bề mặt đĩa thạch BIM với thể tích 0,1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng như trênSau khi các chủng vi khuẩn đã được làm thuần sẽ được đem đi nhuộm Gram đểquan sát đặc điểm hình thái và màu sắc

2.3.5 Phương pháp, kỹ thuật nhuộm Gram

Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩnthành 2 nhóm (Gram dương và Gram âm) dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tếbào Các hóa chất được sử dụng trong kỹ thuật này bao gồm: Crystal Violet, Lugol,

Để cố định tế bào, ta sử dụng kẹp thủy tinh để gắp phiến kính và hơ lửa trên ngọn đèn cồn cho đến khi bề mặt kính khô.

2 Tiếp đến ta nhỏ 1 – 2 giọt thuốc nhuộm Crystal Violet trên vị trí mà ta cố địnhkhuẩn lạc trước đó và để yên trong vòng 50 – 60 giây Sau đó ta rửa sạch thuốcnhuộm bằng bình tia có chứa nước cất và thấm khô

3 Tiếp theo, ta nhỏ 1 -2 giọt thuốc nhuộc Lugol ở vị trí có định khuẩn lạc trong vòng

50 – 60 giây Sau đó ta rửa nước và thấm khô

4 Sau khi nhỏ Lugol, ta nhỏ vài giọt cồn 960 trên phiến kính trong vòng 10 – 15 giây

để tẩy màu, rửa nước và thắm khô

5 Cuối cùng, nhuộm bằng dung dịch Safranin bằng cách nhỏ 1 – 2 giọt trong vòng 50– 60 giây, rửa nước thấm khô

Các mẫu trên sau đó được đem đi quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học, quansát ở vật kính 100X và chụp ảnh bằng màn hình LCD được kết nối với thiết bị

2.3.6 Phương pháp khảo sát sự tăng trưởng của vi khuẩn ở các nồng độ muối khác nhau

Các chủng vi khuẩn sau khi quan sát hình thái được khảo sát khả năng tăng trưởngqua các nồng độ muối khác nhau trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung NaCl nồng

độ 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 phần nghìn Ta tiến hành dung que cấy chuyển khuẩn lạcthuần chủng cho vào môi trường lỏng có các nồng độ muối khác nhau Thời gian theodõi trong vòng 7 ngày liên tục

Khả năng tăng trưởng được theo dõi thông qua dịch huyền phù của tế bào thôngqua máy đo OD tự động Bio - Rad ở bước song 660

2.3.7 Phương pháp khảo sát khả năng tăng trưởng và sử dụng nguồn CO 2 của vi khuẩn quang hợp

Sau khi khảo sát sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn ở các nồng độ muối khácnhau Ta tiến hành kiểm tra sự hấp thụ CO2 của các chủng

Ta sử dụng que cấy chuyển khuẩn lạc thuần chủng và hòa tan vào nước cất vôtrùng, tiến hành đo OD đạt giá trị khoảng 0,1 nhằm có lượng tế bào đầu vào cân bằnggiữa các chủng khảo sát, ly âm và thu hồi tế bào và cho môi trường BIM lỏng và bổsung hỗn hợp khí H2: O2: CO2 theo thời gian 8 phút: 1 phút: 2 phút thông qua bình nénkhí có đưởng ống kết nối với một kim tiêm vô trùng, đâm xuyên qua ống nấp nhựa ống

nghiệm, thổi khí trực tiếp vào môi trường lỏng Qua đó, một đầu ống tiêm khác cũngđược bố trí như trên, nhưng không tiếp xúc với môi trường và không kết nối với bìnhkhí, đầu kim tiêm này nhằm mục đích dẫn các thành phần khí không cần thiết có trongống nghiệm ra bên ngoài Lô đối chứng không bổ sung hỗn hợp khí như trên.

Các thành phần khí không Ống dẫn kết nối

cần thiết với bình khí

Kim tiêm

Môi trường lỏng BIM

Hình 2.3 Mô hình thí nghiệm thổi khí vào môi trường lỏngKhả năng tăng trưởng được theo dõi thông qua quan sát sự gia tăng liên tục độ đụccủa môi trường

2.3.8 Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn

DNA có kích thước lớn, mọi việc chiết tách cần phải tránh mọi tác nhân cơ học, hoá họctới phân tử DNA này.Việc tách DNA từ tế bào vi khuẩn được chia làm bốn bước cơ bản:

1 Nuôi cấy và thu sinh khối

Tùy từng loại vi khuẩn mà người nghiên cứu chuẩn bị môi trường và điều kiện nuôicấy khác nhau như nhiệt độ, độ pH, và điều kiện dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triểncủa vi khuẩn.Tách tế bào ra khỏi dịch nuôi cấy bằng cách ly tâm và làm sạch tế bào.Thông thường khoảng 1.000ml dịch nuôi cấy li tâm và thu lấy khoảng 10ml cặn vi khuẩn

Mg+2 dạng hòa tan và làm vỡ thành tế bào Đồng thời EDTA ngăn không cho enzymetrong tế bào phân hủy DNA Người ta còn có thể phá vỡ màng tế bào và giải phóngDNA ra khỏi liên kết histon bằng chất tẩy rửa SDS (Sodium Derecyl Sylfat) hoặcenzyme protease Các chất phá vỡ màng này làm li giải màng, tách rời các phần tử lipit

và gây ra sự gẫy màng tế bào

3.Làm sạch DNA từ dịch chiết tế bào

Loại bỏ các thành phần không mong muốn như protein, lipit và các thành phầnkhác bằng kế ttủa phân đoạn Mẫu được lắc mạnh trong hệ dung môi phenol-chloroform để biến tính, kết tủa protein và giải phóng acid nucleic vào dung dịch lỏng.Protein bị biến tính sẽ tách ra khỏi pha nước có chứa DNA sẽ được tách ra nhờ ly tâm.Dịch nổi gồm acid nucleic và nước được hút ra và tiếp tục phân hủy RNA bằngenzyme RNase Sau đó, tách DNA và nước để thực hiện bước phân tích tiếp theo

4.Thu hồi DNA dạng đặc

Mục đích của bước này là thu DNA dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phânhủy của enzyme Có 2 phương pháp kết tủa:

Kết tủa DNA trong etanol với sự có mặt Na+nồng độ cao, nhiệt độ thấp, tỷ lệ giữaetanol và mẫuphân tích là 3:1.- Kết tủa trong izopropanol, tỷ lệ giữa rượu và mẫu là1:1 Với phương pháp này không cần sự cómặt của muối và loại được DNA có phân tửlượng thấp Ly tâm cao tốc và thu nhận DNA dạng cô đặc.Trong cả hai phương pháp,DNA thu được sẽ rửa trong etanol-70% để loại izopropanol và muối để thu được DNAtinh khiết

2.3.9 Khuếch tán DNA bằng phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR)

Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR là 27F (5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) và 1492R (5’- GGTTACCTTGTTACG ACTT-3’), cặp mồi phổ rộngđặc trưng cho vi khuẩn Thành phần phản ứng PCR 16S rRNA gồm có: 1 μl 27F và 1l 27F và 1

μl 27F và 1l 1492R (pmol/μl 27F và 1l), 12.5 μl 27F và 1l nước sinh học phân tử, 9.5 μl 27F và 1l master mix (Bioline, Anh)

và 1 μl 27F và 1l mẫu DNA Tổng thể tích phản ứng là 25 μl 27F và 1l Thông số của chu trình phản ứngPCR 16S rRNA được thể hiện như trong hình

Hình 2.4 Chu trình phản ứng PCR 16S rRNASau phản ứng PCR, ta tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm ly trích DNA, sản phẩmPCR trên gel 1% agarose

1 gram bột agarose hòa vào 100ml dung dịch đệm Tris – acetate – EDTA (TAE),gia nhiệt để agarose tan hoàn toàn Sau khi nhiệt độ gel xuống còn 50 – 55oC thì tiếnhành đổ gel và lắp lược 8 giếng vào khuôn điện di Khi miếng gel đặc lại hoàn toànthì cho vào buồng điện di chứa đệm TAE sao cho dung dịch cao hơn mặt gel 3 – 5mm

Tiến hành trộn sản phẩm ly trích DNA/PCR vào dịch Loading dye (6X) theo tỷ lệ5:1 (v/v, μl 27F và 1l) Nạp hỗn hợp vào trong các giếng Tiến hành điện di mẫu với điện thế90V trong khoảng 20 – 30 phút Sau khi điện di, miếng gel được nhuộm trong dungdịch ethidium bromide trong 15 phút, rửa lại bằng nước trong 2 phút Cuối cùng quansát vệt DNA xuất hiện trên gel dưới ánh sáng UV

2.3.10 Giải trình tự DNA và định danh

Mẫu sản phẩm PCR kèm theo mồi xuôi 27F được gửi tới công ty Nam KhoaBiotek để thực hiện giải trình tự một chiều Kết quả gửi về công ty sẽ được đọc bằngphần mềm MEGA5 (http://www.megasoftware.net/) Chọn vùng trình tự ổn định và

so sánh với ngân hàng BLAST của NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) đểtìm ra các chủng tương đồng Kết quả chấp nhận khi mức tương đồng trình tự đạt trên

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

Từ 63 mẫu nước ban đầu thu thập từ Long An và Cà Mau, tiến hành phân lập được

44 chủng vi khuẩn trên trường thạch BIM Kết quả thu nhận được là, 12 chủng vikhuẩn được phân lập và làm thuần từ 22 mẫu nước ao ruộng từ Long An; 32 chủng vikhuẩn được phân lập và làm thuần từ 41 mẫu nước từ rừng ngập mặn Cà Mau

Từ 44 chủng tiếp tục tiến hành sàng lọc sơ bộ các chủng không thuộc nhóm vikhuẩn quang hợp thông qua quan sát đặc điểm hình thái bằng kỹ thuật nhuộm Gram sosánh với đặc điểm hình thái của vi khuẩn quang hợp, hầu hết các vi khuẩn quang hợpđều bắt Gram (+) và có hình thái đa dạng như hình cầu, oval, trứng, que, Sau khichọn lọc các chủng vi khuẩn có đặc điểm hình thái thích hợp, tiến hành khảo sát khảnăng sinh trưởng thông qua các nồng độ muối khác nhau và khả năng cố định CO2 đểlựa chọn những chủng vi khuẩn tốt nhất đáp ứng cả 2 thí nghiệm trên

Sau hai thí nghiệm trên đã chọn ra 5 chủng đại diện trên tổng số 44 chủng ban đầu,

5 chủng vi khuẩn này được tiến hành ly trích DNA và khuyếch đại đoạn gene bằng kỹthuật PCR và tinh sạch bằng bộ kit The QIAquick PCR Purification (QIAGEN) Sảnphẩm PCR được giải trình tự

5 chủng vi khuẩn được chọn lọc để định danh bao gồm : RL1.2, CM23.1, CM24.1,CM34.3

3.1 Kết quả thu mẫu

Các mẫu nước được thu nhận từ các ao ruộng ở huyện Đức Hòa, thuộc tỉnh Long

An và rừng ngập mặn huyện Ngọc Hiển thuộc tỉnh Cà Mau thu nhận được 22 mẫunước ruộng ở Đức Hòa, 41 mẫu nước từ rừng ngập mặn ở Ngọc Hiển

Các mẫu nước từ ao ruộng thuộc huyện Đức Hòa nằm ở vi trí 100 90’23’’ vĩ độBắc, 106041’85’’ Kinh độ Đông, khu vực lấy mẫu chủ yếu ở Ấp 2 và Ấp 4, xã HữuThạnh

Các mẫu nước từ rừng ngọc mặn thuộc huyện Ngọc Hiển nằm ở vị trí 8066’65’’ vĩ

độ Bắc, 105000’28’’ Kinh độ Đông, khu vực lấy mẫu chủ yếu ở Liên tiểu khu 104 –

Xã Viên An Đông, rừng phòng hộ Nhưng Miên

Bảng 3.1 Danh sách các nguồn mẫu từ Long An và Cà Mau

Hình ảnh một số mẫu được thu thập từ Long An

Thành, huyện ThủThừa, Long An

Thạnh, huyện ĐứcHòa, Long An

Thạnh, huyện ĐứcHòa, Long An

RL7 3.78 RL8 5.17 ấp 2 – xã Hựu

Thạnh, huyện ĐứcHòa, Long An

Thạnh, huyện ĐứcHòa, Long An