Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor, hệ thống LED cải tiến, môi trường hai lớp đến quá trình nhân giống, tạo củ và tích lũy saponin trong sâm ngọc linh (panax

Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường hai lớp kiểu bổ sung các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy đến khả năng tăng trưởng, tạo củ Sâm Ngọc Linh Panax vietnamensi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ

MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ELICITOR,

HỆ THỐNG LED CẢI TIẾN, MÔI TRƯỜNG HAI LỚP ĐẾN QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG, TẠO CỦ VÀ TÍCH

LŨY SAPONIN TRONG SÂM NGỌC LINH (PANAX

VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) IN VITRO

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS Trịnh Thị Lan Anh Sinh viên thực hiện

MSSV: 1411100609

: Nguyễn Thị Kim Ngân Lớp: 14DSH04

TP Hồ Chí Minh, 2018

LỜI CAM ĐOANTôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố và hệ thống

LED lên quá trình nhân nhanh sinh khối, tích lũy saponin in vitro của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)” là công trình nghiên cứu của tôi dưới

sự hướng dẫn của TS Trịnh Thị Lan Anh Những số liệu và kết quả nghiên cứu trong đềtài này là trung thực chưa được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào và không trùng lặpvới các đề tài khác Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đềtài này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong đề tài đã được ghi rõ nguồn gốc.Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Kim Ngân

LỜI CẢM ƠN

Warren Buffett cũng đã từng nói rằng: “Nếu muốn đi nhanh hãy đi một mình, nếumuốn đi xa hãy đi cùng nhau” Câu nói ấy quả thật không sai, trong suốt quá trình hoànthành đề tài của mình, em đã được sự quan tâm chăm sóc và dạy dỗ từ Cô TS Trịnh ThịLan Anh Em xin chân thành và trân trọng cảm ơn sự ân cần dạy bảo và những yêuthương mà cô dành cho em, cũng như là các thế hệ sinh viên Cảm ơn cô vì cô khôngchỉ là người giảng viên đầy tâm huyết đã cho em hành trang kiến thức vững vàng đểvững bước trên con đường nghiên cứu khoa học, mà cô còn yêu thương em như ngườithân trong một gia đình, luôn quan tâm, động viên, giúp đỡ em để em sống trọn vẹn vớicái tuổi đôi mươi tại giảng đường đại học

Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô, các Anh Chị nhân viên phòng thínghiệm Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH, trường Đại học Công nghệ Thành Phố

Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và hỗ trợ cho em trong suốt quá trình hoàn thành đề tàinày Có người từng nói: “Đời cho ta bao lần đôi mươi” Tuổi đôi mươi là lứa tuổi đẹpnhất của mỗi người trong chúng ta Tuổi đôi mươi của em thật đẹp khi là sinh viênngành Công nghệ sinh học của Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, trường Đại họcCông nghệ HUTECH Trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại giảng đường đại họcdưới sự chỉ dạy tận tình và được sự hỗ trợ nhiệt tình từ các thầy cô, em đã được học tập

và cháy hết mình với lứa tuổi đôi mươi của mình trog các hoạt động tại Viện, tạiTrường

Em xin chân thành cảm ơn bạn Thảo và em Hải đã hỗ trợ tận tình và giúp đỡ emnhư người thân trong gia đình

Và để có được thành công của ngày hôm nay, có em của ngày hôm nay thì khôngthể không nhắc đến tình yêu thương và sự ủng hộ từ phía gia đình Gia đình đã là hậuphương vững chắc cho con vượt qua mọi khó khăn, thử thách trong cuộc sống và tiếpthêm nghị lực cho con Con cảm ơn Ông Bà ngoại, Ba Mẹ và Cậu đã dạy dỗ, dìu dắt con

từ khi chập chững bước đi cho đến khi lớn khôn thành người, luôn cho con những điềutốt nhất Công ơn trời biển và tình yêu thương vô bờ bến của gia đình là món quà lớnnhất và quý giá nhất mà con được nhận Con xin biết ơn gia đình vì đã luôn bên cạnh,ủng hộ và động viên con trên mỗi bước đường mà con đã chọn

Vì kiến thức bản thân còn hạn chế, trong quá trình thực tập, hoàn thiện đề tài này

em không tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận được những ý kiến đóng góp từquý thầy cô

TP Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 07 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Kim Ngân

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC HÌNH ẢNH ix

DANH MỤC BẢNG xii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Tầm quan trọng của đề tài 1

1.3 Ý nghĩa của đề tài 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

1.4 Lý do chọn đề tài 4

2 Tình hình nghiên cứu 4

3 Mục đích nghiên cứu 6

4 Tình hình nghiên cứu 7

5 Phương pháp nghiên cứu 8

6 Các kết quả đạt được của đề tài 8

7 Kết cấu của đề tài 9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10

1.1 Giới thiệu về vi nhân giống và các elicitor 10

1.1.1 Khái niệm vi nhân giống 10

1.1.2 Các chất cảm ứng – Elicitor 10

1.1.2.1 Than hoạt tính 11

1.1.2.2 Saccharose 12

1.1.2.3 Bạc nitrate 13

1.1.3 Phương pháp nuôi cấy lỏng lắc 13

1.1.4 Vai trò của ánh sáng trong vi nhân giống 15

1.1.4.1 Vai trò của ánh sáng đối với quá trình quang hợp ở thực vật 15

1.1.4.2 Vai trò của ánh sáng đối với quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật 16

1.1.4.3 Vai trò của ánh sáng trong nhân giống in vitro 18

1.1.4.4 Nguồn chiếu sáng nhân tạo sử dụng trong nuôi cấy in vitro hiện nay 19

1.1.5 Đèn LED (Light Emitting Diode) 22

1.1.5.1 Giới thiệu đèn LED 22

1.1.5.2 Ưu, nhược điểm của đèn LED 23

1.1.5.3 Một số thành tựu trên thế giới và Việt Nam khi sử dụng nguồn sáng LED trong nuôi cấy in vitro 24

1.1.5.4 Hướng phát triển ứng dụng của đèn LED trong nuôi cấy in vitro ở Việt Nam 27

1.1.6 Ánh sáng đối với thực vật 28

1.1.6.1 Vai trò của một số phổ ánh sáng đơn sắc đến đời sống thực vật 28

1.1.6.2 Vai trò của ánh sáng đến quá trình tích lũy các chất hữu cơ đối với thực vật 30

1.2 Phương pháp định tính và định lượng saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 33

1.2.1 Định tính saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) bằng phương pháp Sắc ký lớp mỏng 33

1.2.2 Định lượng saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao 34

1.3 Sơ lược về cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 37

1.3.1 Giới thiệu sơ lược về cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 37

1.3.2 Đặc điểm hình thái 38

1.3.3 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển 39

1.3.4 Đặc điểm phân bố 40

1.3.5 Nhân giống cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 40

1.3.5.1 Nhân giống từ hạt 40

1.3.5.2 Nhân giống in vitro 42

1.3.6 Thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 42

1.3.6.1 Thành phần hóa học 42

1.3.6.2 Tác dụng dược lý 43

1.3.7 Một số nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn cây Sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis Ha et Grushv.) 45

1.3.7.1 Nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn nguồn gene cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trên thế giới 45

1.3.7.2 Nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn nguồn gene cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam 46

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 50

2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài 50

2.1.1 Địa điểm 50

2.1.2 Thời gian 50

2.2 Vật liệu 50

2.2.1 Nguồn mẫu 50

2.2.2 Môi trường và điều kiện nuôi cấy 50

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ 51

2.3 Phương pháp nghiên cứu 51

2.3.1 Thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED đơn 53

2.3.2 Thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED hỗn hợp 54

2.4 Bố trí thí nghiệm 55

2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 55

2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 55

2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của bạc nitrate (AgNO3) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 56

2.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 57

2.4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp với tỷ lệ 50:50 (đỏ-vàng; đỏ-xanh dương, vàng-xanh dương) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 58

2.4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm

ứng) đến khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et

Grushv.) in vitro 59

2.4.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường hai lớp (kiểu bổ sung các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro 60

2.5 Hình thái giải phẫu củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro 62

2.6 Thu nhận hợp chất saponin triterpenoid từ sản phẩm của quá trình nuôi cấy in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi trường hai lớp 62

2.6.1 Định tính saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng 62

2.6.2 Định lượng saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chrotomatography – HPLC) 63

2.7 Chỉ tiêu theo dõi 64

2.8 Thống kê và xử lý số liệu 64

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 65

3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của elicitor than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 65

3.2 Thí nghiệm 2 Ảnh hưởng của elicitor saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 68

3.3 Thí nghiệm 3 Ảnh hưởng của elicitor AgNO3 đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 71

3.4 Thí nghiệm 4 Ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 74

3.5 Thí nghiệm 5 Ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 76

3.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 80

3.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy (môi trường hai lớp) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro và tích lũy saponin của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 82

3.8 Hình thái Giải phẫu củ in vitro cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et

Grushv.) 883.9 Định tính saponin bằng sắc ký lớp mỏng 90

3.10 Định lượng saponin trong củ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần nuôi cấy bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 90

KẾT LUẠN VÀ KIẾN NGHỊ 92

TÀI LIỆU THAM KHẢO 94

PHỤ LỤC

Sắc ký lỏng hiệu năng caoSắc ký lớp mỏng cao ápAcid b-IndolyaceticAcid b-IndolybutyricCường độ ánh sáng đỏ xaCường độ ánh sáng đỏMonopotassium phosphateKhoa học công nghệKinetin

Light-Emmitting DiodeMurashige và Skoog, 1962Acid a-naphtaleneaceticSodium hypoclorideSchenk và Hildebrandt (1972)Thidiazuron

Sắc ký lớp mỏngSắc ký lỏng hiệu năng cao siêu nhanhWoody Plant Medium

2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Các bước sóng ánh sáng (nguồn Internet) 15

Hình 1.2 A Sự hấp thu các bước sóng bởi các loại sắc tố quang hợp và cường độ quang hợp; B Sự hấp thu ánh sáng của chlorophyll a và chlorophyll b (nguồn Internet) 17

Hình 1.3 Các hệ thống chiếu sáng bằng đèn LED a Đèn LED với tỷ lệ chiếu sáng 70% LED đỏ kết hợp 30% LED xanh; b LED uni-Pack (LP) (Nguyễn Bá Nam, 2012) 22

Hình 1.4 Hệ thống nuôi cấy LED truyền điện không dây (Wireless power transfer – LED uni-Pack (WPT - LP)) a Thiết bị phát; b Thiết bị thu; c.d Hoạt động của hệ thống (Nguyễn Bá Nam, 2012) 27

Hình 1.5 Các bước của quá trình sắc ký lớp mỏng 34

Hình 1.6 Sơ đồ hệ thống Sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC 36

Hình 1.7 Hệ thống Sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC 36

Hình 1.8 Cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) (Nhut et al., 2011) 37

Hình 1.9 Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) (nguồn Internet) 38

Hình 2.1 Mô hình thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED đơn a Hệ thống chiếu sáng đèn LED trắng; b Hệ thống chiếu sáng đèn LED vàng; c Hệ thống chiếu sáng đèn LED xanh dương; d Hệ thống chiếu sáng đèn LED đỏ 53

Hình 2.2 Hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED đơn sau khi thiết kế và thi công a Hệ thống chiếu sáng đèn LED trắng; b Hệ thống chiếu sáng đèn LED vàng; c Hệ thống chiếu sáng đèn LED xanh dương; d Hệ thống chiếu sáng đèn LED đỏ 53

Hình 2.3 Mô hình hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED kết hợp a 100% LED đỏ (ĐC); b 50% LED đỏ kết hợp 50% LED vàng; c 50% LED đỏ kết hợp 50% LED xanh dương; d 50% LED vàng kết hợp 50% LED xanh dương 54

Hình 2.4 Hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED hỗn hợp sau khi thiết kế và thi công a Tỷ lệ chiếu sáng 100% LED đỏ (ĐC); b Tỷ lệ 50% LED đỏ kết hợp 50% LED vàng; c Tỷ lệ 50% LED đỏ kết hợp 50% LED xanh dương; d Tỷ lệ 50% LED vàng kết hợp 50% LED xanh dương 54

Hình 3.1 Ảnh hưởng của elicitor than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy A0,

A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 tương ứng với nồng độ than hoạt tính lần lượt là

0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 g/L 67

Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ elicitor saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in

vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi

cấy B0, B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 tương ứng với nồng độ saccharose lần

lượt là 30; 40; 50; 60; 70; 80 g/L 70Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ elicitor AgNO3 đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy.

C0, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7 tương ứng với nồng độ AgNO3 lần lượt là 0;

0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 mg/L73

Hình 3.4 Ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in

vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi

cấy D0, D1, D2, D3, D4 tương ứng với với nguồn sáng là đèn huỳnh quang;

LED trắng; LED vàng; LED xanh dương; LED đỏ75Hình 3.5 Ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo

củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần

nuôi cấy G0, G1, G2, G3 tương ứng với với các tỷ lệ 100% đỏ; 50% đỏ:50%

vàng; 50% đỏ:50% xanh dương và 50% vàng:50% xanh dương 79Hình 3.6 Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả

năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

sau 3 tuần nuôi cấy L0, L1, L2 tương ứng với trạng thái nuôi cấy là rắn

(agar), lỏng tĩnh, lỏng lắc 81Hình 3.7 Ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng

tăng trưởng, tạo củ in vitro của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et

Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy 83

Hình 3.8 Ảnh chụp hiển vi soi nổi hình thái cây và củ Sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần nuôi cấy87 Hình 3.9 Cấu tạo củ Sâm Ngọc Linh Ngọc in vitro sau 16 tuần nuôi cấy 88Hình 3.10 Ảnh chụp hình thái giải phẫu dưới kính hiển quang học củ Sâm Ngọc Linh

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy; a) Lát cắt dọc chồi

mọc từ củ; b) Lát cắt ngang củ; c1) Lát cắt ngang mô củ, c2) Hình thái tế bào

mô củ, c3) Mô củ với tế bào nhân bắt màu hồng đậm (mũi tên), c4) Hình thái

bó mạch trong lát cắt dọc củ 89Hình 3.11 Sắc ký đồ HPLC định lượng Rg1 và Rb1 ở nghiệm thức ĐC (nuôi cấy trên

môi trường agar một lớp: không than hoạt tính) Sâm Ngọc Linh (Panaxx

vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy 91

Hình 3.12 Sắc ký đồ HPLC định lượng Rg1 và Rb1 ở nghiệm thức E8 (nuôi cấy trên

môi trường 2 lớp lỏng-rắn: có than hoạt tính) Sâm Ngọc Linh (Panaxx

vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy 91

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của các bước sóng ánh sáng khác nhau lên thực vật (Trần Thị

Hồng Thúy, 2014) 18Bảng 1.2 Thành phần hoá học chung của Sâm Ngọc Linh 43Bảng 1.3 So sánh thành phần và hàm lượng của saponin trong Sâm Ngọc Linh và các

loài Sâm nhóm 1 44

Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm

Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 55

Bảng 2.2 Khảo sát ảnh hưởng của saccharose đến sự tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm

Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 56Bảng 2.3 Khảo sát ảnh hưởng của AgNO3 đến sự tăng trưởng, tạo củ in vitro của cây

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 57

Bảng 2.4 Ảnh hưởng ánh sáng LED đơn đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm

Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 58Bảng 2.5 Ảnh hưởng của ánh sáng LED cải tiến hỗn hợp với tỷ lệ 50:50 (đỏ-vàng; đỏ-

xanh dương, vàng-xanh dương) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm

Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 59Bảng 2.6 Khảo sát ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng)

đến khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et

Grushv.) 60Bảng 2.7 Khảo sát ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy đến

khả năng tăng trưởng, tạo củ và tích lũy saponin trong củ Sâm Ngọc Linh

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro 61

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của elicitor than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro

của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy 65 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ elicitor saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in

vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi

cấy 68Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ elicitor AgNO3 đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy 71

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in

vitro của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần

nuôi cấy 74

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo

củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần

nuôi cấy 77Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả

năng tăng trưởng của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et

Grushv.) sau 3 tuần nuôi cấy80

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của môi trường hai lớp đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro và

tích lũy saponin của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau

16 tuần nuôi cấy 82Bảng 3.8 Kết quả phân tích HPLC hàm lượng saponin (ginsenoside Rg1 và Rb1) trong

củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần

nuôi cấy khi khảo sát ảnh hưởng của kiểu bổ sung dinh dưỡng vào môi trường

nuôi cấy 78

Grushv.) là một loài Sâm đặc hữu của Việt Nam được biết đến từ năm 1973 Tại hội nghịquốc tế về Sâm, loài Sâm này được xếp vào nhóm Sâm quý trên thế giới cùng với Sâm

Triều Tiên (Panax ginseng), Sâm Mỹ (Panax quinquefolium),… (Phai et al., 2002).

Sâm Ngọc Linh là một trong những cây dược liệu quý cần được bảo tồn, có têntrong Sách Đỏ Việt Nam 2007 [25] Sâm Ngọc Linh chứa 52 loại saponin, 17 acid amin,

20 chất khoáng vi lượng và 0,1% tinh dầu Sâm Ngọc Linh có hàm lượng saponin khungdammaran cao nhất (khoảng 12 – 15%) và lượng saponin triterpenoidoid nhiều nhất so

với các loài khác của chi Panax trên thế giới (Le Thi Hong Van et al., 2015) Qua nhiều

nghiên cứu, các nhà khoa học ở Việt Nam và trên thế giới đã thấy rằng Sâm Ngọc Linhkhông chỉ có các tác dụng dược lý đặc trưng của chi Nhân Sâm mà còn có những tác dụngdược lý điển hình như chống stress, chống trầm cảm, chống oxy hóa, chống ung thư vàtăng cường hệ miễn dịch (Nguyễn Thượng Dong và cộng sự, 2007) Với những đặc điểm

đó, Sâm Ngọc Linh không chỉ là loài Sâm quý của Việt Nam mà còn là của thế giới

1.2 Tầm quan trọng của đề tài

Sâm Ngọc Linh là một cây dược liệu quý và có giá trị kinh tế cao của Việt Nam (40– 100 triệu VNĐ/kg) Từ đầu tháng 10/2017, Ủy Ban Nhân Dân huyện Nam Trà My(Quảng Nam) đã chính thức mở phiên chợ Sâm Ngọc Linh nhằm góp phần tìm ra giảipháp duy trì, bảo tồn và phát huy giá trị Sâm Ngọc Linh theo Chương trình phát triển sảnphẩm quốc gia đến năm 2020 do Thủ tướng Chính Phủ phê duyệt Tại phiên chợ SâmNgọc Linh lần thứ 6 được tổ chức vào đầu tháng 3/2018, Sâm Ngọc Linh có giá bán từ 85triệu/kg [79] Từ khi phát hiện năm 1973 đến 1995 thì loài này đã bị khai thác cạn kiệt vàđang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng mất nguồn gene quý hiếm (Trần Công Luận, 2003).Đến nay, quần thể Sâm Ngọc Linh tự nhiên đang bị khai thác mạnh mẽ, dẫn tới nguy cơtận diệt do nhu cầu của thị trường dược liệu ngày càng tăng cao Ngày 12/9/2015, Phó

Thủ tướng Chính phủ Vũ Đức Đam đã phê duyệt Đề án bảo tồn và phát triển cây SâmNgọc Linh (Sâm Việt Nam) đến năm 2030 trị giá 9.500 tỷ đồng nhằm bảo vệ nguồn genequý, kết hợp bảo vệ và phát triển nguồn nguyên liệu Sâm góp phần xóa đói giảm nghèo,

phát triển kinh tế - xã hội (nguồn Internet).

Hoàng Hải Anh và cộng sự (2011) đã báo cáo rằng Sâm Việt Nam nuôi cấy mô cũng

có các saponin chính tương tự như Sâm Việt Nam tự nhiên, gồm G-Rb1, G-Rg1, G-Rd,G-Re, N-R1 và M-R2 Tuy hàm lượng tổng cộng các saponin chính trong Sâm Việt Namnuôi cấy mô chưa cao (0,3% so với 12,96% trong Việt Nam thiên nhiên)

Việc nghiên cứu hoàn chỉnh quy trình nuôi cấy mô cây Sâm Ngọc Linh cung cấpnguồn cây Sâm giống cho trồng trọt và sử dụng để thay thế Sâm thiên nhiên, đã mở ramột hướng mới trong sản xuất nguyên liệu cây Sâm Ngọc Linh: chủ động được nguồnnguyên liệu dồi dào trong thời gian ngắn, phục vụ công tác nghiên cứu, sản xuất thuốc vàcác sản phẩm thực phẩm chức năng

Từ trước đến nay, các nghiên cứu trong lĩnh vực nuôi cấy mô ở đối tượng cây SâmNgọc Linh chưa nhiều vì đây là loài Sâm đặc hữu của Việt Nam Các nghiên cứu chủ yếutập trung vào việc cải tiến thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy, chuyểngene, chủ yếu là nghiên cứu tạo mô sẹo, phát sinh phôi, nuôi cấy rễ tóc, thu sinh khốitrong bioreactor, các kết quả đạt được là tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn Đặc điểmcủa Sâm Ngọc Linh là tăng trưởng rất chậm, yêu cầu sinh thái khắt khe, việc nghiên cứu

về tạo củ in vitro vẫn chưa nhiều, chưa có nghiên cứu nào báo cáo về kiểu bổ sung các

thành phần môi trường nuôi cấy (môi trường hai lớp lỏng-rắn) lên sự tăng trưởng, tạo củ

và tích lũy saponin ở cây Sâm Ngọc Linh Nghiên cứu về ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắcđến quá trình sinh trưởng của Sâm Ngọc Linh chỉ có một vài báo cáo được công bố, các

nghiên cứu cũng đã cho thấy rằng Sâm Ngọc Linh được nuôi cấy in vitro có thành phần

hóa học tương tự như Sâm Ngọc Linh tự nhiên tuy nhiên với hàm lượng thấp, thậm chímột số chất chỉ được phát hiện ở dạng vết, một số chất chưa được phát hiện trong Sâm

nuôi cấy in vitro Một số nghiên cứu đã cho thấy rằng các elicitor có tác động tích cực đến

sự tăng trưởng cũng như quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp ở thực vật Tuynhiên, đối với từng loại thực vật và mục đích nuôi cấy, việc lựa chọn loại và nồng độ cácelicitor phải được xem xét kỹ lưỡng Đây là một loài dược liệu vô cùng quý giá, việc hoàn

thiện quy trình nhân giống và gia tăng hàm lượng dược chất quý hiếm là điều mà nhiềunhà nghiên cứu quan tâm và được Chính phủ chú trọng phát triển nguồn cây trồng quốc

gia Trong đó, nghiên cứu tạo củ in vitro, kích thích tăng trưởng, rút ngắn thời gian nhân

giống, tăng sức sống của cây con nhằm tạo được số lượng lớn cây giống khỏe mạnh, tăng

tỷ lệ sống sót khi chuyển ra vườn ươm là điều vô cùng cấp thiết

1.3 Ý nghĩa của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài sẽ giúp hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sẽ cung cấp những cơ sở khoa học cho công tác nhân giống

in vitro cây trồng nói chung và cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

nói riêng Cung cấp cơ sở khoa học cho bảo vệ nguồn gen cây Sâm Ngọc Linh là mộttrong những mối quan tâm hàng đầu hiện nay

Nghiên cứu ảnh hưởng hệ thống LED cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro của Sâm Ngọc Linh cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá ảnh hưởng của đèn LED đến nuôi cấy in vitro cây Sâm Ngọc Linh Góp phần định hướng cho những nghiên cứu tiếp theo về ảnh hưởng của ánh sáng LED đến nuôi cấy Sâm Ngọc Linh in vitro.

Đề tài sẽ cung cấp những tài liệu khoa học về Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis

Ha et Grushv.), thuộc chi Panax Cung cấp những cơ sở khoa học về quy trình nhân giống

in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Các kết quả nghiên cứu sẽ

bổ sung thêm tài liệu khoa học phục vụ cho nghiên cứu khoa học về loài Sâm Ngọc Linh

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.).

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Xây dựng quy trình nhân nhanh Sâm Ngọc Linh thông qua khảo sát các chất yếu tố

ảnh hưởng đến cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nhằm nhân

nhanh với số lượng lớn, hạ giá thành cây giống, góp phần bảo tồn nguồn gene cây thuốcquý

Nghiên cứu ảnh hưởng của đèn LED đến sự sinh trưởng của cây Sâm Ngọc Linh là

cơ sở đánh giá khả năng ứng dụng của đèn LED trong nuôi cấy in vitro cây trồng nói

chung và Sâm Ngọc Linh nói riêng, hướng tới tìm nguồn ánh sáng thích hợp thay thế đènhuỳnh quang và các loại đèn đang dùng trong nuôi cấy Sâm Ngọc Linh hiện nay, là cơ sở

giúp hạ giá thành sản phẩm cây Sâm Ngọc Linh giống Hoặc định hướng cho các nghiên

cứu tiếp theo về ứng dụng của đèn LED đến cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha

et Grushv.)

1.4 Lý do chọn đề tài

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là loài Sâm đặc hữu của Việt

Nam đã được nghiên cứu về thực vật học, dược tính, thành phần hóa học Các kết quảnghiên cứu đã cho thấy đây là loài dược liệu quý giá và được xem là một trong nhữngphát hiện quan trọng bậc nhất trong lĩnh vực y dược Việc nhân giống Sâm Ngọc Linh còngặp nhiều khó khăn do đây là loài đặc hữu của Việt Nam, yêu cầu sinh thái rất khắt khe,tăng trưởng rất chậm và chỉ trồng được ở các khu vực quanh đỉnh núi Ngọc Linh (thuộcđịa phận hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam) Thời gian trồng trọt phải kéo dài từ 6 đến 7năm mới có thể thu hoạch (do củ cần nhiều thời gian để tích lũy các hợp chất sinh học quýgiá) Các nghiên cứu về loài Sâm này chưa nhiều, chưa có một quy trình nhân giống hoànchỉnh phổ biến được chuyển giao công nghệ Đây là loài dược liệu đắt tiền bậc nhất, nhucầu thị trường rất cao, khai thác cạn kiệt và đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng.Đang được Chính phủ quan tâm và chú trọng đầu tư phát triển Xuất phát từ những yêucầu cấp thiết đó chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor, hệthống LED cải tiến, môi trường hai lớp đến quá trình nhân giống, tạo củ và tích lũy

saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro” được thực

hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Viện Khoa học Ứng dụngHUTECH, trường Đại học Công nghệ TP Hồ Chí Minh nhằm mục đích cải tiến môitrường, điều kiện nuôi cấy, hệ thống nuôi cấy, kiểu bổ sung thành phần dinh dưỡng (môitrường hai lớp lỏng-rắn) và hoàn thiện quy trình nhân nhanh loài Sâm quý này góp phầnbảo tồn và nhân nhanh giống loài Sâm đặc hữu của Việt Nam

2 Tình hình nghiên cứu

Hiện nay, cây Sâm Ngọc Linh là đối tượng đang rất được quan tâm và chú ý nghiêncứu nhằm xây dựng quy trình nhân giống nhanh, rút ngắn được thời gian sinh trưởng sovới cây Sâm Ngọc Linh trong tự nhiên mà vẫn đảm bảo được hàm lượng các dược chấtquý giá vốn có như saponin triterpenoid, ginsenoside để đảm bảo được nhu cầu tiêu dùngcủa thị trường Trong đó phải kể đến các công trình nghiên cứu như Hoàng Văn Cương

(2012) đã chứng minh ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên sự sinh trưởng và khả năng

tích lũy saponin thông qua quá trình nuôi cấy mô sẹo và cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro.

Nguyễn Thị Liễu và cộng sự (2011) đã tạo được rễ bất định của Sâm Ngọc Linh

trong nuôi cấy in vitro.

Hà Thị Loan (2014) đã sử dụng Agrotobacterium rizogenes chứa gene rol cảm ứng

tạo rễ tóc Kết quả cho thấy rễ tóc được nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc sinh trưởng tốt

và có sự hiện diện của 3 hoại chất saponin đặc trưng trong Sâm Ngọc Linh Nuôi cấy rễtóc với những ưu điểm vượt bậc đã được khẳng định là sinh trưởng mạnh, không hướngđất, không phụ thuộc vào chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh, bền vững về mặt

di truyền và có khả năng tổng hợp các hoạt chất thứ cấp với hàm lượng cao hơn hoặcbằng cây mẹ giúp giảm được những ảnh hưởng không mong muốn đến sức khỏe ngườitiêu dùng và nâng cao tính an toàn của sản phẩm, mở ra giải pháp mới cho sản xuấtsaponin ở quy mô công nghiệp

Mai Trường và cộng sự (2014) đã thành công trong việc tạo và nhân phôi soma Sâm

Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi trường lỏng.

Vũ Thị Hiền và cộng sự (2015) đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong

nghiên cứu quá trình cứu hình thái của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et

Grushv.) Trước nhu cầu rất lớn về Sâm Ngọc Linh dùng để làm thuốc, thực phẩm chứcnăng của các công ty dược và người dân, một số Trung tâm nuôi cấy mô đã chuyển hướng

nghiên cứu nhân nhanh giống Sâm Ngọc Linh in vitro.

Trong nhân giống in vitro thực vật, ánh sáng khác nhau về chất lượng, cường độ và

thời gian chiếu sáng đều có ảnh hưởng lên sự sinh trưởng, phát triển của thực vật Tổnglượng ánh sáng mà cây thu nhận trong suốt quá trình chiếu sáng có tác động trực tiếp lênquang hợp, sự sinh trưởng và năng suất của cây Nguồn sáng nhân tạo sử dụng phổ biến

trong nhân giống in vitro hiện nay là đèn huỳnh quang Mặc dù một số đèn huỳnh quang

thích hợp cho sự tăng trưởng thực vật nhưng tất cả các đèn huỳnh quang đều tỏa nhiệt, lạiphải tiêu tốn thêm một phần điện năng để làm giảm nhiệt độ nóng do các đèn này gây ra.Theo Dương Tấn Nhựt (2002), chi phí điện năng ước tính khoảng 65% dùng cho thắpsáng trong phòng nuôi cây và khoảng 25% để làm mát phòng nuôi Do đó, sự phát triển

nguồn bức xạ hiệu quả hơn được sử dụng trong các phòng nuôi cấy mô sẽ mang lại nguồnlợi đáng kể để giảm chi phí sản xuất trong vi nhân giống.

Các nghiên cứu trong nước về lĩnh vực nuôi cấy mô hiện nay chủ yếu tập trung vàonghiên cứu ảnh hưởng của các phytohormone trong quá trình phát sinh hình thái hay sinhtrưởng và phát triển của thực vật mà chưa đi sâu tìm hiểu vai trò của ánh sáng trong nhân

giống in vitro, đặc biệt là nguồn chiếu sáng từ đèn LED (Light Emitting Diode) Hiện

nay, đèn LED là thiết bị chiếu sáng đầy hứa hẹn cho các phòng nuôi cấy mô và nâng caokhả năng tăng trưởng sinh học nhờ vào kích thước nhỏ, cấu trúc rắn, an toàn và tuổi thọcao LED có những đặc tính tốt hơn so với các nguồn sáng khác như: đèn huỳnh quang,đèn sợi đốt, đèn natri cao áp Bước sóng của nó phát ra rất đặc biệt, chiều rộng của vạchquang phổ ngắn, do vậy hiện nay LED được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu

về quang sinh học như là sự tổng hợp chlorophyll, quang hợp và quang phát sinh hình

thái

3 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor (than hoạt tính, saccharose và AgNO3) ảnh

hưởng đến quá trình sinh trưởng và tích lũy saponin của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nhằm tìm ra nồng độ thích hợp của các elicitor trên bổ sung

vào môi trường nuôi cấy giúp mẫu cấy tăng trưởng và tích lũy saponin tối ưu

Sau khi xác định được nồng độ các elicitor (than hoạt tính, saccharose và AgNO3)thích hợp, tiến hành thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến sử dụng đèn LED bóng trònđược sản xuất sẵn có thể sử dụng trực tiếp nguồn điện 220V để lắp đặt và thi công trongthiết kế hệ thống LED đơn và LED kết hợp để khảo sát ảnh hưởng của các bước sóng ánhsáng LED riêng lẻ (đỏ, xanh dương, vàng và trắng) và LED kết hợp (đỏ-vàng; đỏ-xanhdương, vàng-xanh dương với tỷ lệ kết hợp là 50:50) đến quá trình quá trình sinh trưởng,

tạo củ và tích lũy saponin của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.).

Sau khi xác định được nguồn chiếu sáng thích hợp, để đẩy nhanh tốc độ tăng trưởngcủa mẫu cấy, tiến hành nuôi cấy lỏng (lỏng tĩnh và lỏng lắc) nhằm tìm ra điều kiện nuôicấy thích hợp (lỏng lắc-giai đoạn cảm ứng) giúp thúc đẩy mẫu cấy tăng trưởng nhanh Saugiai đoạn nuôi cấy cảm ứng các mẫu cấy sẽ được cấy chuyền sang môi trường nuôi cấyhai lớp nhằm tìm ra kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy thích hợp (môi

trường hai lớp) cho sự tăng trưởng, tạo củ và tích lũy saponin trong củ Sâm Ngọc Linh

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Mục đích nghiên cứu giúp rút ngắn thời gian nhân

giống, tăng số lượng và chất lượng cây giống, giúp hạ giá thành sản phẩm, góp phần bảo

tồn và cung cấp nguồn gene Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) quý giá.

Cung cấp cây giống chất lượng cao với số lượng lớn không giới hạn cho các nhà vườn,doanh nghiệp trồng làm nguyên liệu dược và thực phẩm chức năng, từ đó có thể cải thiệnđời sống nhân dân, tiến dần đến thương mại hóa sản phẩm Sâm Ngọc Linh, tạo thươnghiệu cho sản phẩm đặc hiệu của Việt Nam

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất cảm ứng – elicitor đến quá trình sinh trưởng

và tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.):

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến quá trình sinh trưởng và tạo củ in vitro + Nghiên cứu ảnh hưởng của saccharose đến quá trình sinh trưởng và tạo củ in vitro

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của bạc nitrate đến quá trình sinh trưởng và tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.).

 Nghiên cứu ảnh hưởng của hệ thống LED cải tiến đến quá trình sinh trưởng và

tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.):

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến quá trình sinh trưởng và

tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.).

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp với tỷlệ 50:50 (đỏ-vàng; đỏ-xanh

dương, vàng-xanh dương) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.).

 Nghiên cứu ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến

khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in

 Giải phẫu hình thái củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in

vitro.

 Thu nhận hợp chất saponin triterpenoid từ sản phẩm của quá trình nuôi cấy in

vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi trường hai lớp:

+ Định tính saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

+ Định lượng saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HighPerformance Liquid Chrotomatography – HPLC)

5 Phương pháp nghiên cứu

Tùy vào mục đích thí nghiệm mà chúng tôi thay đổi các yếu tố khảo sát để bố trí thínghiệm (các elicitor, nguồn chiếu sáng cải tiến LED đơn hay LED hỗn hợp, hệ thống nuôicấy lỏng tĩnh, lỏng lắc, kiểu bổ sung dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy – môi trườnghai lớp) Mỗi thí nghiệm có nhiều nghiệm thức khác nhau Thiết kế và thi công hệ thốngđèn LED cải tiến sử dụng các bóng LED tròn được sản xuất sẵn tỏa nhiệt thấp sử dụngtrực tiếp nguồn điện 220V tiết kiệm chi phí cho bộ chuyển đổi điện một chiều 110V sang220V dễ dàng thi công lắp đặt Định tính saponin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng,định lượng saponin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố với 3 lần lặp lại (30bình nuôi cấy/lần) Các số liệu thu được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.1 vàchương trình MicroSoft Excel 2013 Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉtiêu theo dõi, được thống kê và biểu diễn dưới dạng các giá trị trung bình cùng ký tự a, b,c,…thì không có sự khác biệt về mặt thống kê Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sựsai khác thống kê ở mức ý nghĩa 0,05

6 Các kết quả đạt được của đề tài

 Xác định được nồng độ các elicitor như than hoạt tính, saccharose, AgNO3, thích hợp

cho nhân giống, tăng trưởng, và tạo củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et

+ Môi trường SH bổ sung 1 g/L than hoạt tính là thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo

củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) (nghiệm thức A2).

+ Tùy vào mục đích nghiên cứu mà nồng độ saccharose thay đổi (tạo cây hoàn chỉnh

30 m/L; nhân nhanh sinh khối mô sẹo: 70 g/L)

+ Môi trường SH bổ sung 2,0 mg/L AgNO3 (C4) là thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo

củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.).

+ Hệ thống chiếu sáng cải tiến LED đỏ thích hợp cho việc thay thế các nguồn sáng

huỳnh quang truyền thống nhằm kích thích sự phát triển và tạo củ in vitro Sâm Ngọc

Linh mang lại hiệu suất kinh tế cao hơn do tiết kiệm năng lượng chiếu sáng và nănglượng làm mát không gian phòng nuôi mẫu

+ Hệ thống chiếu sáng cải tiến LED xanh dương và ánh sáng LED đỏ kết hợp với tỷ lệ

50:50 thích hợp cho sự phát triển và tạo củ in vitro của Sâm Ngọc Linh.

 Nuôi cấy lỏng lắc (nghiệm thức L2) cho kết qủa mẫu cấy Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) tăng trưởng tốt nhất sau 3 tuần nuôi cấy.

 Môi trường nuôi cấy 2 lớp dạng lỏng-rắn (lỏng-agar) (E8), lớp trên lỏng có than hoạt

tính, lớp dưới đặc có than hoạt tính thích hợp nhất cho sự tăng trưởng và tạo củ in vitro Sau 16 tuần nuôi cấy, mẫu cấy tăng trưởng khỏe mạnh, tạo củ in vitro với kích thước lớn,

hình thái củ tương tự với củ Sâm Ngọc Linh trong tự nhiên

 Kết quả phân tích sơ bộ bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy, sắc đồ sắc ký lớp mỏng của củ

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần nuôi xuất cấy

hiện các vết tương tự như Sâm Việt Nam tự nhiên, các vết saponin tương ứng với các vết

của saponin chuẩn Kết quả phân tích cho thấy củ Sâm Ngọc Linh in vitro có sựhiện diệncủa các saponin Rg1, Rb1, MR2

 Kết quả phân tích định lượng saponin (ginsenoside Rg1 và Rb1) trong củ Sâm Ngọc

Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy in vitro cho thấy có sự

hiện diện của 2 loại saponin với hàm lượng cao (G-Rg1: 1,314 mg/g và G-Rb1: 1,425 mg/g)

7 Kết cấu của đồ án

Đồ án gồm những chương sau:

Chương 1: Tổng quan tài liệuChương 2: Vật liệu và phương phápChương 3: Kết quả và thảo luậnChương 4: Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Giới thiệu về vi nhân giống và các elicitor

1.1.1 Khái niệm vi nhân giống

Vi nhân giống (micropropagation) hay còn gọi là nhân giống in vitro (in vitro

propagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhângiống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ,sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấykhác

Nhân giống in vitro, trong nhiều thập niên vẫn được xem là một trong những kỹ

thuật hữu hiệu nhất dùng để nhân nhanh các giống cây trồng sạch bệnh đã được tuyểnchọn hoặc các nguồn gene thực vật quý hiếm

1.1.2 Các chất cảm ứng – Elicitor

Hợp chất thứ cấp của thực vật không chỉ giúp thực vật tự vệ, chống chịu lại sâu bệnh

và điều kiện môi trường khắc nghiệt mà còn hữu ích cho con người khi có khả năng ứngdụng trong nhiều lĩnh vực: y dược, hóa học, mỹ phẩm và nông nghiệp Saponintriterpenoid là hợp chất quý hơn cả vàng có trong chi Nhân Sâm nói chung và Sâm NgọcLinh nói riêng Để thu được lượng lớn hợp chất thứ cấp, theo phương pháp truyền thốngđòi hỏi hao tốn rất nhiều sinh khối thực vật Do đó, khoa học hiện đại đã nghiên cứu ứngdụng các chất cảm ứng (elicitor) trong nuôi cấy mô tế bào thực vật để thu được lượng lớnhợp chất đích như mong muốn Elicitor được định nghĩa là một chất cơ bản mà khi đưavới các nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì kích thích sự sinh tổng hợp các hợp chấtthứ cấp trong tế bào Sự kích kháng thực vật là quá trình cảm ứng hoặc tăng cường sinhtổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp do sự bổ sung theo hàm lượng của elicitor(Namdeo, 2007) Đối với loài có thời gian tăng trưởng kéo dài và khó nhân giống trong tựnhiên như Sâm Ngọc Linh, việc bổ sung các chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy vừagiúp nhân nhanh sinh khối, rút ngắn thời gian tăng trưởng và thu được lượng lớn hợp chấtthứ cấp

Elicitor bao gồm các chất có nguồn gốc từ mầm bệnh và các chất được tiết ra từ thựcvật bằng phản ứng của mầm bệnh (elicitor nội sinh) Trên cơ sở bản chất tự nhiên, elicitor

có thể được phân thành 2 nhóm là: elicitor phi sinh học và elicitor sinh học

 Elicitor phi sinh học là các chất có nguồn gốc không thuộc sinh vật học, gồm cácmuối vô cơ, các kim loại nặng và các tác nhân vật lý như sóng siêu âm, áp suất, nhiệt độ,

và pH

 Elicitor sinh học là các chất có nguồn gốc sinh vật học, bao gồm các polysacharide

có nguồn gốc từ thành tế bào thực vật (pectin hoặc cellulose), các vi sinh vật (chitin hoặcglucan) và các glycoprotein, G-protein hay các protein nội bào có chức năng là gắn vớicác receptor và tác động bằng cách hoạt hóa hoặc bất hoạt một số enzyme hoặc các kênhion

Ngoài ra, có thể phân loại elicitor dựa trên nguồn gốc của chúng 2 loại elicitor là elicitor ngoại sinh và elicitor nội sinh

 Elicitor ngoại sinh là các chất có nguồn gốc bên ngoài tế bào như các

polysaccharide, polyamine và các acid béo

 Elicitor nội sinh là các chất có nguồn gốc bên trong tế bào, được hình thành thôngqua các phản ứng thứ cấp, được cảm ứng bằng tín hiệu sinh học hay phi sinh học, chẳnghạn như galacturonide hoặc hepta-β-glucoside, (Namdeo, 2009)

1.1.2.1 Than hoạt tính

Trước đây, than hoạt tính (Actived charcoal – AC) thường được sử dụng để phòngđộc, lọc không khí và các chất lỏng Hiện nay, than hoạt tính đã được tinh chế và sản xuấtrộng rãi như một chất có tính hấp phụ cao và được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô

nhờ tác động lên sự phát sinh hình thái và phát sinh cơ quan của thưc vật (Pan et al.,

1998) Vai trò của AC trong nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu là tạo điều kiện “tối”cho môi trường nuôi cấy, hấp phụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vậynhư phenolic, dịch rỉ nâu sinh ra từ mẫu môi trường nuôi cấy (Biniak, 1990) Ngoài ra

than hoạt tính cũng có thể hấp thụ các vitamin, cytokinin và auxin (Ebert et al., 1990; Fridborg et al., 1978), làm thay đổi tỷ lệ thành phần các chất có trong môi trường nuôi cấy cũng như pH môi trường (Wann et al., 1997).

Từ khi AC được ứng dụng trong lĩnh vực nuôi cấy mô, các nhà khoa học chủ yếutập trung nghiên cứu và đã công bố về ảnh hưởng của nó trong việc cải tiến môi trường

nuôi cấy (Buter et al., 1993), tăng cường khả năng tái sinh cây (Krajnáková et al., 2009), phát sinh phôi (Mathews et al., 1993), tăng sinh tế bào trần (Kunitake H et al., 1995),

ngăn cản sự phát triển bất bình thường của cây con, kích thích quá trình hình thành và

phát triển chồi (Kee-Kee-oeup et al., 2000), thúc đây hay ức chế sự tăng trưởng và hình thành rễ (Christopher et al., 2012); ngoài ra AC còn có khả năng làm giảm hiện tượng thủy tinh thể ở một số loài thực vật (Debergh et al.1981).

Nguyễn Thị Nhật Linh và cộng sự (2012) đã tiến hành cấy các chồi cây Hồng mônvào môi trường được phân thành 2 phần, một phần không có AC và phần còn lại bổ sungcác nồng độ AC tối ưu đã khảo sát ở hai đối tượng cây Cúc (3 g/L AC) và Hồng môn (2 g/

L AC) bằng cách thay đổi vị trí lớp AC trong môi trường nuôi cấy (trên, giữa hoặc dưới).Kết quả cho thấy, hầu hết các rễ phát sinh trong lớp môi trường có AC (trên 80% rễ).Ngoài ra, các kết quả cũng cho thấy sự định hướng rễ của cây Hồng môn phụ thuộc vào vịtrí lớp AC nhiều hơn ở cây Cúc Vị trí lớp môi trường có AC ở dưới là tối ưu cho sự phát

triển của cây và rễ in vitro của cả cây Cúc và cây Hồng môn Mặt khác, những cây sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện in vitro cũng sinh trưởng và phát triển tốt

ở điều kiện ex vitro; điều này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu nhân giống vô tính cây

trồng

1.1.2.2 Saccharose

Trong nuôi cấy in vitro, mô và tế bào thực vật sống chủ yếu theo phương thức dị

dưỡng, nên việc đưa đường vào môi trường nuôi cấy làm nguồn chất hữu cơ là điều bắtbuộc (Lê Trần Bình và cộng sự, 1997) Đường saccharose không chỉ điều hòa áp suấtthẩm thấu của môi trường mà còn là nguồn cacbohydrate tốt nhất cung cấp cho mô và tếbào Nhưng khi nồng độ đường quá cao sẽ hạn chế hiệu quả hấp thu nước của mô cây

Hai dạng đường thường gặp nhất trong nuôi cấy in vitro là glucose và saccharose, trong

đó saccharose được sử dụng phổ biến hơn (Nguyễn Đức Lượng, 2001) Tùy theo mụcđích nuôi cấy mà hàm lượng đường cho vào môi trường khác nhau, thông thường là 30 –

40 g/L là tương đối thích hợp cho nhiều loại cây (Vuylsteke, 1989) Các nghiên cứu trên

dưa Cucumis hystrix (Michael et al., 2001), cây dâu tây (Hyung, 1996) và cây hành

(Teruyuki, 1999) đều cho thấy hàm lượng đường 30 g/L là thích hợp cho chồi phát triển

tốt trong nuôi cấy in vitro.

Theo nghiên cứu của Lâm Ngọc Phương và cộng sự (2005) đã chứng minh rằng chothấy sự phát triển của chồi dưa hấu tam bội tốt nhất trong môi trường MS có chứa 30 g/L

saccharose với 0,5 mg/L BA dưới cường độ ánh sáng 1.800 lux Những chồi này pháttriển rất tốt, cao và nhiều lá sẽ là vật liệu tốt để nhân chồi, ra nhiều rễ và dễ thuần dưỡng.

1.1.2.3 Bạc nitrate

AgNO3 còn được gọi là bạc nitrate AgNO3 là chất có khả năng điều khiển quá trìnhsinh trưởng, phát triển của chồi thông qua tác động vào quá trình trao đổi ethylene(Biddington, 1992) Chính vì thế, bổ sung AgNO3 vào môi trường nuôi cấy có thể ức chếviệc tổng hợp ethylene hoặc chức năng của ethylene bằng cách tác động lên quá trìnhtổng hợp hoặc tác động lên tín hiệu trao đổi chất (Pua và Chi, 1993), qua đó ảnh hưởngđến sinh trưởng và phát triển của cây trồng Do vậy, bạc nitrate cũng là một elicitor

Các ion bạc dưới dạng nitrate (AgNO3) có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến

quá trình phát sinh cơ quan, sinh phôi, ra rễ in vitro, cảm ứng hoa, ra hoa sớm, kiểm soát

hiện tượng rụng lá thông qua việc ức chế hoạt động của ethylene (Sharma, 2008)

Nguyễn Thị Phương Thảo và cộng sự (2015) nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều

hòa sinh trưởng thực vật và khoáng vi lượng đến sự sinh trưởng và ra hoa in vitro của cây

hoa hồng cho thấy kết quả là bổ sung 30 µM AgNO3 là tốt nhất cho sự sinh trưởng vàhình thành hoa với tỷ lệ ra hoa ở các giống hoa hồng

Trương Thị Phương Lan và cộng sự (2017) nghiên cứ ảnh hưởng của AgNO3 đến

quá trình tái sinh cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) cho thấy kết quả là bổ sung

1,5 mg/L AgNO3 vừa có thể tạo rễ lẫn phát sinh chồi mới

1.1.3 Phương pháp nuôi cấy lỏng lắc

Nuôi cấy lỏng lắc: nuôi cấy lỏng lắc thúc đẩy sự phân chia và tăng trưởng của tế bàotrong môi trường lỏng (Torres, 1989) Là phương pháp nuôi cấy thực vật bằng môi trườnglỏng, bình nuôi cấy được đặt trên máy lắc (shaker), tuỳ vào mục đích nuôi cấy, đối tượngnuôi cấy mà số vòng quay của máy lắc được điều chỉnh khác nhau (từ 90 – 180vòng/phút)

Các tế bào được tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng do mẫu được ngâm trực tiếpvào dung dịch môi trường Sự thông khí được thực thực hiện nhờ máy lắc ở tốc độ 100 –

150 vòng/phút Khí đưa vào phải đảm bảo vô trùng Quá trình thông khí còn ngăn chặn vàlàm giảm sự kết dính của các tế bào với nhau

Theo Thomass và Davey (1975), nuôi cấy huyền phù tế bào có dung tích 25 mL, tốc

độ phù hợp nhất của máy lắc là 100 − 150 vòng/phút Thể tích của môi trường lỏng phảiphù hợp với kích thước bình nuôi cấy, thường chiếm 20% thể tích bình

Debergh (1983) và George (1993) đã cho rằng lượng nước trong môi trường thạchrắn thấp khiến cho sự hấp thụ bởi thực vật thấp hơn so với môi trường lỏng lắc

Các nuôi cấy quy mô nhỏ như phòng thí nghiệm và trong những thời gian ngắn, cóthể máy lắc từ ở tốc độ 250 vòng/phút và thời gian nuôi cấy thường từ 10 – 15 ngày Sau

đó, các mẫu nuôi cấy phải được chuyển vào môi trường mới để đảm bảo sự sinh trưởng

và phát triển của các tế bào

Phương pháp nuôi cấy lỏng lắc có ưu thế hơn các phương pháp khác là mẫu cấyđược tiếp xúc đầy đủ hơn với môi trường dinh dưỡng nên tốc độ sinh trưởng và phát triểnnhanh Nhờ việc liên tục được di chuyển trong môi truờng nuôi cấy nên ít xảy ra hiệntượng ưu thế ngọn, sự ngủ của chồi biến mất và kết quả là tạo ra được nhiều chồi hơn

 Mục đích của nuôi cấy lỏng lắc:

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật bằng môi trường lỏng sẽ khắc phụcđược một số nhược điểm khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn:

Các mẫu nuôi cấy được ngập và phân bố theo không gian 3 chiều nên tiết kiệm đượckhông gian, mẫu cấy hấp thụ hết môi trường dinh dưỡng trong bình nuôi cấy Tăng cườngđược sự thoáng khí nên kích thích mẫu phát triển nhanh

Khi nuôi cấy ngập và được di chuyển tự do trong môi trường, hiệu ứng ưu thế ngọn

bị biến mất và các chồi phát triển tương đối đồng đều nhau Giảm chi phí sản xuất thôngqua việc giảm được lượng agar sử dụng cho môi trường nuôi cấy

 Khó khăn của nuôi cấy lỏng lắc:

Khó khăn lớn nhất của nuôi cấy lỏng lắc là mẫu mô nuôi cấy bị tổn thương do quátrình lắc Những khối mô hay cơ quan tế bào thực vật mới hình thành còn non yếu, nếu bị

va đập mạnh sẽ làm dập nát khối mô non Từ đó khả năng nhân nhanh tế bào bị giảm sút.Quá trình nhân nhanh khối mô hay tế bào sử dụng môi trường lỏng thay cho môitrường bán rắn kể từ giai đoạn tái sinh đến giai đoạn tăng sinh khối Môi trường nuôi cấylỏng thường dẫn đến sự phát sinh hình thái bất thường, chẳng hạn như hiện tượng thủytinh thể (hyperhydricity hay vitrification)

Hiện nay, khoa học và kỹ thuật phát triển nên hệ thống nuôi cấy lỏng lắc đã cải thiệnnhằm phục vụ nhân nhanh sinh khối, hoạt tính có trong cây, hoạt chất,… Các hệ thốngnhư: bioreactor, hệ thống quang tự dưỡng, hệ thống TIS, hệ thống RITA, hệ thống bìnhsinh đôi BIT, hệ thống Plantima,…

1.1.4 Vai trò của ánh sáng trong vi nhân giống

Trong môi trường nuôi cấy, quang tổng hợp không phải là một hoạt động cần thiết

do sự có mặt của đường trong môi trường, nhưng ánh sáng cần thiết để điều hòa một sốquá trình liên quan tới phát sinh hình thái của cây Tùy từng loại nuôi cấy, yêu cầu cường

độ cũng như thời gian chiếu sáng khác nhau, ví dụ như khi nuôi cấy mô sẹo, thườngkhông cần ánh sáng Ánh sáng còn ảnh hưởng tới sinh trưởng của mô nuôi cấy thông quatác động vào trạng thái và cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cũng nhưdinh dưỡng khoáng Thông thường trong phòng nuôi cấy người ta sử dụng ánh sánghuỳnh quang chiếu sáng từ 14 − 15 giờ/ngày với cường độ 2000 lux

1.1.4.1 Vai trò của ánh sáng đối với quá trình quang hợp ở thực vật

Sự sống trên trái đất phụ thuộc vào ánh sáng mặt trời bởi ánh sáng là điều kiện choquá trình quang hợp xảy ra Mọi sự sống trên trái đất không thể tách rời quá trình này.Ngày nay, chúng ta biết đến quang hợp là quá trình giúp thực vật dùng năng lượngánh sáng để tạo glucose và phóng thích oxy từ carbonic và nước

Hình 1.1 Các bước sóng ánh sáng (nguồn Internet)

Cường độ ánh sáng mà thực vật sử dụng trong phản ứng quang hợp thuộc vùngquang phổ có bước sóng từ 400 đến 700 nm với cực đại hấp thụ từ 660 đến 680 nm Đơn

vị đo cường độ ánh sáng trong các nghiên cứu về thực vật hiện nay là dòng photon quanghợp (photosynthetic photon flux – PPF), tính bằng μmol.mmol.m-2.s-1, nghĩa là số lượng photontham gia vào quá trình quang hợp của thực vật tính trong 1 giây trên một đơn vị diện tích

1 m2

Các bước sóng ánh sáng được sử dụng trong quang hợp chỉ là một phần nhỏ củatoàn bộ quang phổ điện từ Ở thực vật bậc cao, ánh sáng đỏ, tím, xanh điều khiển quátrình quang hợp hiệu quả nhất Khả năng kích thích các electron của ánh sáng liên quanđến bước sóng hơn là cường độ của chùm sáng Chỉ có một phần nhỏ ánh sáng được thựcvật thực sự hấp thu

1.1.4.2 Vai trò của ánh sáng đối với quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật

Năng lượng bức xạ được thực vật sử dụng theo hai cách hoàn toàn riêng biệt: nhưmột nguồn năng lượng và như một nguồn thông tin Ánh sáng đặc biệt phù hợp với vai tròthứ hai Ánh sáng có thể truyền thông tin qua nhiều dạng khác nhau; trong đó, có tối thiểu

4 dạng đặc trưng: chất lượng, lượng, hướng và quang kỳ

 Chất lượng: dạng năng lượng bức xạ, màu, quang phổ, thành phần bước sóng là tất

cả những từ dùng diễn tả đặc trưng này của ánh sáng

 Lượng: số lượng năng lượng bức xạ, cường độ, số photon, tốc độ dòng xác định rõđặc trưng thứ hai này

 Hướng: có sự đa dạng rất lớn giữa các môi trường sống khác nhau theo hướng chiếusáng

 Quang kỳ: mô tả sự khác nhau đều đặn do chu kì ngày đêm và sự thay đổi độ dài ngày theo mùa

Nhiều đặc tính về phát triển hình thái của thực vật ex vitro bị ảnh hưởng bởi các điều

kiện môi trường như ánh sáng (về chất lượng, cường độ, thời gian và hướng chiếu sáng), nhiệt độ, thành phần khí (CO2, O2, H2O, C2H4), thành phần môi trường

Năng lượng bức xạ có những ảnh hưởng quan trọng lên hình thái và hoạt động củathực vật bao gồm sự phát triển khả năng quang hợp, tham gia vào nhịp nội sinh và địnhhướng về không gian và thời gian

Quang phát sinh hình thái là quá trình kiểm soát sự sinh trưởng, phát triển và phátsinh hình thái của thực vật dưới ánh sáng Quá trình này được điều khiển bởi ít nhất bốncon đường khác nhau của các quang thụ thể.

Trong điều kiện tối, cây phát triển theo một chương trình gọi là

“kotomorphogensis”, chẳng hạn như kéo dài chồi, có rất ít hay không có lá mầm và láthật, bị vàng hóa

Sự phát sinh hình thái do ánh sáng (sự nảy mầm, sự kéo dài đốt thân, ) xảy ra ởnhững dải bước sóng từ 400 − 500 nm (xanh lục), 600 − 700 nm (đỏ) và 700 − 800 nm(đỏ xa)

Ánh sáng có ảnh hưởng rất lớn lên sự quang phát sinh hình thái ở thực vật thông quacác quang thụ thể Thực vật bậc cao có ít nhất ba loại quang thụ thể (photoreceptor) có độhấp thu chọn lọc với các ánh sáng quang phổ khác nhau, điều hòa sự phát sinh hình thái,

Hình 1.2 A Sự hấp thu các bước sóng bởi các loại sắc tố quang hợp và cường độ quang hợp; B Sự hấp thu ánh

sáng của chlorophyll a và chlorophyll b (nguồn Internet )

a Cường độ ánh sáng

Cường độ ánh sáng từ 1000 – 2500 lux được dùng phổ biến cho nuôi cấy nhiều loại

mô Với cường độ ánh sáng lớn hơn thì sinh trưởng của chồi chậm lại Theo Ammirato(1987), ánh sáng tham gia vào sự phát sinh và phát triển của phôi soma Ánh sáng ởcường độ cao gây nên sự sinh trưởng của mô sẹo, ở cường độ trung bình kích thích tạochồi; ngoài ra, ở cường độ thấp sẽ tăng chiều cao và lá có màu xanh đậm

b Quang phổ ánh sáng

Vấn đề quang phổ ánh sáng đã được nhiều tác giả nghiên cứu như Pierik (1987).Ảnh hưởng của ánh sáng ở các bước sóng khác nhau được trình bày tóm tắt trong bảng1.1

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của các bước sóng ánh sáng khác nhau lên thực vật

Da cam 640 Quang hợp cực đại (635 nm) do được chlorophyll hấp thụ cực

khả kiến

570 Xanh lá cây 510 Được hấp thu bởi sắc tố vàng

Xanh 500 Được hấp thu bởi sắc tố vàng

Tím 400 Được hấp thu bởi sắc tố vàng

315 Độ dày lá; kích thích sắc tố Cực tím UV–B 280 Không tốt cho quang hợp (ở cường độ cao); làm tổn thương

các mô thực vật UV–C 100 Cây chết ngay lập tức

(Trần Thị Hồng Thúy, 2014)

1.1.4.3 Vai trò của ánh sáng trong nhân giống in vitro

Cường độ ánh sáng mà thực vật sử dụng trong phản ứng quang hợp có bước sóng từ

400 − 700 nm, với đỉnh từ 660 − 680 nm Sự phát sinh hình thái do ánh sáng (sự nảy

mầm, sự kéo dài đốt thân,…) xảy ra ở những dải bước song từ 400 − 500 nm (xanh lục),

600 − 700 nm (đỏ) và 700 − 800 nm (đỏ xa)

Sự phân phối phổ ánh sáng, quang kỳ và hướng chiếu sáng cũng đóng vai trò quantrọng trong quá trình sinh trưởng của thực vật nuôi cấy mô Hiện nay, ánh sáng trắng (phổánh sáng từ khoảng 200 nm đến 800 nm) của đèn huỳnh quang được sử dụng phổ biếnnhất trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Ánh sáng đơn sắc từ đèn LED (đi-ốt phátquang) cũng đã và đang được nghiên cứu làm nguồn sáng trong nhân giống thực vật Sửdụng ánh sáng đơn sắc đỏ (600 − 700 nm) hoặc đỏ xa (700 − 800 nm) hoặc kết hợp vớixanh lam của đèn LED làm cây tăng trưởng rất tốt và tiết kiệm điện năng hơn so với dùngđèn huỳnh quang

Một trong những yếu tố của môi trường ảnh hưởng lên quá trình tạo rễ của mẫu cấy

là ánh sáng Ánh sáng góp phần vào việc tạo rễ và chồi bất định của đoạn cắt Chỉ cầncường độ ánh sáng thấp cho quá trình tạo rễ, vì cường độ ánh sáng cao quá sẽ ngăn cản sựtạo rễ Đối với một số loài, quang kỳ có thể ảnh hưởng đến sự tạo rễ

Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự ra rễ Ánh sáng đỏ cam thích hợp cho

sự ra rễ hơn ánh sáng xanh da trời Sự phát sinh hình thái thực vật bị ảnh hưởng bởi cácnhân tố của môi trường như nhiệt độ, CO2, chất dinh dưỡng, chất lượng ánh sáng, thờigian và cường độ chiếu sáng Những nhân tố này ảnh hưởng đến sự tăng trưởng chồi vàphát sinh hình thái bên cạnh vai trò của nó trong quang hợp Debergh và cộng sự (1992)

đã chứng minh rằng cường độ chiếu sáng có tác dụng điều hòa kích thước lá và thân cũngnhư con đường phát sinh hình thái đồng thời ảnh hưởng đến sự hình thành sắc tố và thủytinh thể của cây con Chất lượng ánh sáng có ảnh hưởng quan trọng trên một số đặc tínhhình thái như sự kéo dài ở cây Cúc và cây Cà chua Hình thái giải phẫu lá và kích thước lá

ở cây Phong

1.1.4.4 Nguồn chiếu sáng nhân tạo sử dụng trong nuôi cấy in vitro hiện nay

Nguồn chiếu sáng được sử dụng thông dụng trong nuôi cấy in vitro là ánh sáng huỳnh

quang Các loại đèn halogen kim loại, natri cao áp, dây tóc được sử dụng nhằm làm tăngcường độ ánh sáng Tuy nhiên, những nguồn sáng này bao gồm các bước sóng không cần

thiết cho sự sinh trưởng của cây (Kim et al., 2004) Ánh sáng đơn sắc là một nguồn

năng lượng đầy hứa hẹn cho các phòng nuôi cấy mô với khả năng nâng cao quá trình tăngtrưởng sinh học nhờ vào kích thước nhỏ, cấu trúc rắn, an toàn, ít tỏa nhiệt, tuổi thọ cao.Ánh sáng đơn sắc bao gồm các bước sóng có lợi cho quá trình quang hợp, từ đó ảnhhưởng đến quá trình phát sinh hình thái và sinh tổng hợp của cây Hiện nay, ánh sáng đơnsắc được sử dụng trong nhiều nghiên cứu về quang sinh học như sự tổng hợp chlorophyll,quang hợp và phát sinh hình thái hay quá trình tích lũy các hợp chất có hoạt tính sinh học.Ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên sự sinh trưởng và phát triển của một số loài cây đã

được nghiên cứu, ví dụ như: Euphorbia milii (Dewir et al., 2007), Zantedeschia (Jao et al., 2005), Khoai tây (Jao et al., 2004; Miyashita et al., 1995), Cúc (Kim et al., 2004), Lilium (Lian et al.,2002), Chuối (Nhut et al., 2003), Dâu tây (Nhut et al., 2003), Lan Ý (Nhut et al., 2005), Nho (Puspa et al., 2008), Cymbidium (Schuerger et al., 1997) và Lan

Hồ Điệp (Wongnok et al., 2008) Những nghiên cứu này đều chỉ ra rằng ánh sáng đơn sắc

thích hợp cho sinh trưởng của cây hơn ánh sáng huỳnh quang Ảnh hưởng của chất lượngánh sáng lên sự sinh trưởng và phát triển thực vật đã được nghiên cứu nhiều Tuy nhiên,các nghiên cứu về tác động của ánh sáng đến quá trình tổng hợp các hợp chất thứ cấp cóhoạt tính sinh học vẫn còn rất hạn chế Krewzaler và Hahlbrock (1973) đã cho rằng ánhsáng có vai trò kích thích sự tổng hợp flavonoid glycosides trong nuôi cấy tế bào cây

Petroselinum hortense (Krewzaler và Hahlbrock, 1973) Một số nghiên cứu khác cũng đã

tìm hiểu ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tích lũy các chất trên một số đối tượng như:

anthocyanin trong cây Perilla fruttiescnens (Zhong et al., 1991), artemisinin từ nuôi cấy

rễ tơ cây Artimisia annua (Liu et al., 2002) Trên đối tượng chi Panax, Yu và cộng sự

(2005) đã nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tổng hợp ginsenoside trong rễ tơ cây

Nhân Sâm (Panax ginseng C A Mayer) Hoàng Văn Cương và cộng sự (2012) nghiên

cứu ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên sự khởi tạo và tăng sinh của mô sẹo, cũng như sựsinh trưởng, phát triển và khả năng tích lũy hoạt chất saponin trong cây Sâm Ngọc Linh

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro đã được nghiên cứu.

Việc sử dụng ánh sáng nhân tạo trong nhân giống thực vật theo 2 khuynh hướngsau: hoàn toàn thay thế hay cung cấp một phần ánh sáng ban ngày cho quang hợp hayquang phát sinh hình thái

Việc sử dụng ánh sáng nhân tạo trong nhân giống thực vật đòi hỏi phải cân bằnggiữa các quá trình sinh lý của thực vật và các vấn đề kinh tế của người nuôi trồng Ánhsáng khác nhau về chất lượng, cường độ và thời gian chiếu sáng, mỗi đặc tính này đều cóảnh hưởng lên sự phát triển của thực vật Tổng lượng ánh sáng mà cây thu nhận trong suốtquá trình chiếu sáng có tác động trực tiếp lên quang hợp, sự tăng trưởng và năng suất câytrồng Sự tác động này có thể đo được dựa trên kích thước cây, số lượng hoa và các thuộctính khác Trong nhiều trường hợp, hình thái thực vật (chiều cao, hình dáng,…) bị ảnhhưởng chủ yếu bởi chất lượng ánh sáng Điều này tùy thuộc vào cường độ và sự phânphối dải năng lượng như ánh sáng xanh, đỏ và đỏ xa phát ra từ đèn Thực vật rất nhạy cảmvới các điều kiện ánh sáng, vì vậy sự tăng trưởng và phát triển ở thực vật có thể tăng bởiánh sáng nhân tạo và các đặc tính thích nghi.

Trong các nguồn chiếu sáng nhân tạo hiện nay, các nguồn sáng chủ yếu được sửdụng cho thực vật là: đèn sợi đốt, đèn compact, đèn huỳnh quang, đèn LED

Đèn sợi đốt là một trong những nguồn sáng nhân tạo cổ điển nhất mà hiện nay vẫnđược dùng ở nước ta Trong đó năng lượng trong vùng khả kiến khoảng 5%, còn chủ yếu

là bức xạ hồng ngoại Tuy nhiên, trong thực tế đèn sợi đốt có ưu điểm là giá rẻ, dễ lắp đặt.Đèn sợi đốt được dùng phổ biến để ức chế sự ra hoa của cây hoa Cúc và kích thích sự rahoa của cây Thanh long trong mùa đông (với cây hoa Cúc mỗi đêm phải thắp khoảng 4giờ, cây Thanh long khoảng 8 giờ)

Hiện nay trong các phòng nuôi cấy in vitro phần lớn sử dụng đèn huỳnh quang Đèn

huỳnh quang chủ yếu được sử dụng cho sinh hoạt của con người Ánh sáng đèn huỳnhquang là sự phối trộn của nhiều vùng quang phổ từ những vùng ánh sáng có bước sóngngắn 320 nm đến bước sóng dài 800 nm Có những vùng bước sóng ngắn không có lợicho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật

Một loại đèn nữa cũng thường được sử dụng cho cây trồng là đèn huỳnh quangcompact Đèn compact là loại đèn huỳnh quang áp suất thấp, sử dụng bột huỳnh quang đấthiếm 3 màu So với đèn sợi đốt, đèn compact có hiệu suất sáng cao hơn đối với mắtngười, nhưng đối với phổ quang hợp của thực vật, đèn compact có ít thành phần đỏ (660nm) và không có đỏ xa (730 nm) Mặc dù quang phổ phát ra từ đèn huỳnh quang compactbao gồm các vùng sáng đỏ và xanh có hiệu quả hơn đèn sợi đốt, tuy nhiên còn có một tỷ

lệ lớn các vùng quang phổ xanh lá cây (Green) và vàng (Yellow) nên làm lãng phí nănglượng.

Như vậy, mặc dù một số đèn huỳnh quang thích hợp cho sự tăng trưởng thực vậtnhưng đèn huỳnh quang trong nuôi cấy mô chiếm nhiều không gian, tuổi thọ thấp, cónhững vùng quang phổ không cần thiết, tiêu tốn nhiều điện năng và tạo ra nhiệt lượng caotrong phòng nuôi cây, do đó chúng ta phải tốn thêm một lượng điện năng đáng kể để điềuhòa nhiệt độ trong phòng Chi phí điện năng ước tính khoảng 65% dùng cho tăng sángtrong phòng nuôi cấy và khoảng 25% để làm mát phòng nuôi

1.1.5 Đèn LED (Light Emitting Diode)

1.1.5.1 Giới thiệu đèn LED

Đi–ốt phát quang (LED) là nguồn sáng bán dẫn, sẽ cung cấp lượng ánh sáng đơn sắckhi có dòng điện một chiều chạy qua nó Đèn LED (khác với bóng LED) được định nghĩa

là tổ hợp bóng LED, phần quang học, tỏa nhiệt và nguồn nuôi LED đầu tiên được phátminh bởi Texas Instrument vào năm 1960 Tại thời điểm đó cường độ sáng của LED cònrất thấp và chỉ có ánh sáng đơn sắc đỏ Sau này cường độ sáng của LED đã tăng lên rấtnhiều và biên độ dải màu cũng tăng theo (đỏ, cam, vàng, xanh lá, xanh dương, trắng,…).Đến những năm cuối thế kỷ 20 và đầu thế kỷ 21, đèn LED tạo nên một cuộc cách mạngnhanh chóng, đem lại nhiều tiện dụng cho các thiết bị kỹ thuật số và một dãy các thiết bịmới đa chức năng, như tín hiệu ra vào, đèn nổi, đèn giao thông, đèn vòm, đèn tường, đèndưới nước, đèn ngoài trời Trong những năm gần đây, LED mới thực sự được quan tâmnhư là một nguồn bức xạ cho thực vật do tiềm năng ứng dụng thương mại của nó rất lớn

Hình 1.3 Các hệ thống chiếu sáng bằng đèn LED a Đèn LED với tỷ lệ chiếu sáng 70%

LED đỏ kết hợp 30% LED xanh; b LED uni-Pack (LP) (Nguyễn Bá Nam, 2012)

Để tiến hành nghiên cứu chế tạo các hệ thống đèn LED thích hợp trong nhân giốngcây trồng và kỹ thuật phá đêm, chúng ta sẽ phải lựa chọn các bước sóng thích hợp với phổhoạt động của các sắc tố thực vật.

1.1.5.2 Ưu, nhược điểm của đèn LED

LED đem lại nhiều lợi ích trên các phương diện như sau:

 Tiết kiệm điện năng: LED có năng suất cao, do đó năng lượng tiêu thụ bởi LED nhỏ,giúp cho việc nhân giống có chi phí hiệu quả và tiết kiệm Sử dụng đèn LED có thể tiết kiệm điện năng đến 11% và giảm khí thải CO2 từ 261 − 348 triệu tấn vào năm 2020

 Tuổi thọ: LED có tuổi thọ cao, từ 20.000 – 100.000 giờ (đèn sợi đốt có tuổi thọ 1000 giờ, đèn huỳnh quang có tuổi thọ 8000 giờ)

 Dải màu: LED có nhiều các dải màu, gồm cả các ánh sáng trắng Ánh sáng trắng cũng

có thể được tạo ra khi hòa trộn LED màu đỏ, xanh lơ và xanh lục Thay vào đó, thông quaviệc kết hợp một cách sáng tạo các LED có màu sắc khác nhau, ảnh hưởng thay đổi màu

có thể tạo ra từ một vật cố định đơn giản nhờ sự hoạt hóa động lực của các phần khácnhau của LED

 Không phát ra tia UV và tia hồng ngoại: LED không tạo ra tia UV, tạo rất ít nhiệt, vìvậy là đối tượng phát sáng lý tưởng Ánh sáng LED không gây chói, mỏi mắt Do tiêu haonhiệt rất ít, LED hầu như không làm nóng môi trường xung quanh, do đó giảm nhiều nhucầu sử dụng hệ thống làm lạnh để tạo điều kiện cho cây sinh trưởng

 Độ bền: đèn LED có độ bền rất cao chịu được sốc nhiệt và va đập

 Kích thước nhỏ và dễ thay đổi linh hoạt trong thiết kế: Một LED đơn lẻ rất nhỏ và tạo

ra ít ánh sáng toàn bộ Tuy vậy, điểm yếu này thực sự là thế mạnh của nó Các LED cóthể gắn với nhau thành bất cứ hình dạng nào tạo nên một loạt kiện lumen mong muốn.Thêm nữa, LED có thể thu nhỏ hỗn hợp ánh sáng, kiểm soát sự phân phối ánh sáng nhờcác thấu kính epoxy, đơn giản hóa cấu trúc của hệ đèn LED Một thiết bị kiểm soát có thểđược gắn với phức hợp LED để làm mờ một cách chọn lọc các đèn LED độc lập, dẫn đếnviệc kiểm soát phân phối động lực, lượng và màu của ánh sáng

 Thân thiện với môi trường, không chứa thủy ngân và các chất độc khác

 Thời gian bật sáng rất ngắn (<100 ns)

 Dễ điều khiển bằng kỹ thuật số với khả năng thay đổi độ sáng 100%

 Hiệu suất biến đổi năng lượng cao.

 Điện áp nuôi một chiều thấp (3V)

 Phân bố ánh sáng định hướng cao dẫn đến hiệu suất hữu ích cao

 Chi phí bảo hành và thay thế hệ thống thấp

 Tạo màu có độ bão hòa cao không cần bộ lọc sáng

 Hoạt động trong dải nhiệt độ môi trường cao (-40°C đến 60°C)

Ngoài những lợi ích đó, rào cản duy nhất của công nghệ chiếu sáng rắn là giá thànhcủa LED, nhưng với tốc độ phát triển mau chóng, rào cản này sẽ được dỡ bỏ

1.1.5.3 Một số thành tựu trên thế giới và Việt Nam khi sử dụng nguồn sáng LED

trong nuôi cấy in vitro

Trên thế giới gần đây các đi-ốt phát sáng (LED) là thiết bị chiếu sáng được xem làđầy hứa hẹn cho các phòng nuôi cấy mô và nâng cao khả năng tăng trưởng sinh học.Bước sóng của LED phát ra rất đặc biệt, chiều rộng của vạch quang phổ ngắn, do vậyhiện nay LED được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu về quang sinh học như là

sự tổng hợp diệp lục, quang hợp và phát sinh hình thái

Một vài loại cây trồng thành công dưới hệ thống LED, những cây này bao gồm:Tiêu dưa, Lúa mì, Bó xôi Xu hướng nghiên cứu ứng dụng đèn LED vào sản xuất rau vàhoa đang được nhiều nước xác định là nhiệm vụ ưu tiên đầu tư để nâng cao chất lượngsản phẩm và tiết kiệm năng lượng

Ở Việt Nam ngoài việc được sử dụng rộng rãi trong các thiết bị, LED cũng đượcứng dụng trong các nghiên cứu nông nghiệp Việc sử dụng LED như một nguồn bức xạcho thực vật được đặc biệt chú trọng trong những năm gần đây do tiềm năng của nó trongứng dụng thương mại rất lớn Hệ thống bức xạ LED toàn phần có một số lợi điểm vượttrội so với những hệ thống chiếu sáng hiện đang được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô

Sự phát sáng cực đại của LED đỏ và xanh với độ dài sóng thích hợp tạo hiệu quả quanghợp tối đa LED đỏ có thể được ứng dụng cho thực tiễn vi nhân giống do sự phát photoncao cũng như giá thành thấp khi so sánh đèn LED với đèn có màu khác Sự kết hợp giữacác đèn LED có màu sắc khác nhau có thể tạo ra ánh sáng thích hợp cho quá trình quanghợp Một số loại cây như Dâu tây, Chuối sinh trưởng tốt dưới đèn LED

Từ năm 1996 đến nay, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã ứng dụng thành công hệthống phát sáng LED trên một số loại cây trồng như Dâu tây, Bạch đàn, Địa lan, Lan hồ

điệp, Chuối, Lan Ý, Lily, Cúc và Lan Hài Những cây này nuôi cấy ở điều kiện in vitro

dưới hệ thống đèn LED không những sinh trưởng và phát triển tốt, mà còn sinh trưởng và

phát triển tốt cả ở điều kiện ex vitro.

Đến nay các nhà khoa học đã đạt được một số thành tựu trong nghiên cứu hệ thốngchiếu sáng LED trên thực vật như:

Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2003) đã nghiên cứu đáp ứng của cây Dâu tây in vitro

dưới ánh sáng đơn sắc đỏ và xanh Kết quả cây Dâu tây sinh trưởng bình thường dướiđiều kiện chiếu sáng 90% ánh sáng LED đỏ + 10% ánh sáng LED xanh, 80% ánh sángLED đỏ + 20% ánh sáng LED xanh, 70% ánh sáng LED đỏ + 30% ánh sáng LED xanh.Trong đó, dưới điều kiện chiếu sáng 70% ánh sáng LED đỏ + 30% ánh sáng LED xanh,các chỉ tiêu đánh giá sự sinh trưởng của cây Dâu tây đều tốt hơn so với các điều kiệnchiếu sáng còn lại

Năm 2003, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã đánh giá sự sinh trưởng và phát triển của

cây Chuối nuôi cấy in vitro dưới tỷ lệ đèn LED khác nhau: 100% ánh sáng LED đỏ, 90%

ánh sáng LED đỏ + 10% ánh sáng LED xanh, 80% ánh sáng LED đỏ + 20% ánh sángLED xanh, 70% ánh sáng LED đỏ + 30% ánh sáng LED xanh, 100% ánh sáng LED xanh

và đèn huỳnh quang Nghiên cứu đã khẳng định cây Chuối sinh trưởng và phát triển tốtdưới điều kiện chiếu sáng 80% ánh sáng LED đỏ + 20% ánh sáng LED xanh

Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2006) đã tiến hành nghiên cứu nguồn phát sáng nhântạo sử dụng ánh sáng đơn sắc trong nhân giống vô tính hiệu quả của cây Lan Ý Kết quảtrọng lượng tươi của cây cao nhất khi sinh trưởng dưới điều kiện 80% ánh sáng LED đỏkết hợp với 20% ánh sáng LED xanh

Dương Tấn Nhựt và Nguyễn Bá Nam (2009) đã nghiên cứu ảnh hưởng của hệ thống

chiếu sáng đơn sắc lên sự sinh trưởng và phát triển của cây hoa Cúc (Chrysanthemum morifoliumcv “Nút”) nuôi cấy in vitro Dưới các điều kiện chiếu sáng khác nhau: 100%

LED đỏ, 100% LED xanh, 50% LED đỏ + 50% LED xanh, 70% LED đỏ + 30% LEDxanh, 80% LED đỏ + 20% LED xanh, 90% LED đỏ + 10% LED xanh và ánh sáng đènhuỳnh quang (neon) Những chồi Cúc phát triển tốt nhất dưới điều kiện chiếu sáng 90%