TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT CỦA ACID URSOLIC

nămNHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngày, tháng, năm sinh: 02/05/1983 Nơi sinh: Cần ThơChuyên ngành: Công Nghệ Hóa Học MSHV: 10050130I- TÊN ĐỀ TÀI: TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT CỦA ACID URSOLIC II- NH

ĐẶNG THẾ SƠN

TỎNG HỢP CÁC DẪN XUẤT

CỦA ACID URSOLIC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ

• •

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HÔ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS TÔNG THANH DANH

Tp HCM, ngày tháng năm

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ngày, tháng, năm sinh: 02/05/1983 Nơi sinh: Cần ThơChuyên ngành: Công Nghệ Hóa Học MSHV: 10050130I- TÊN ĐỀ TÀI: TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT CỦA ACID URSOLIC

II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Tổng hợp các dẫn xuất acid ursolic chủ yếu bằng phản ứng ester hóa, oxy hóa và xácđịnh cấu trúc của sản phẩm bằng phổ 'H-NMR, MS Xác định hoạt tính kháng ung thưtrên 3 dòng tế bào HeLa, NCI-H460, MCF-7

III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Ngày tháng năm 20

IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: Ngày tháng năm 20

V- CÁN Bộ HƯỚNG DẪN : TS TỐNG THANH DANH

QL CHUYỀN NGÀNH

Nội dung và đề cương luận văn thạc sĩ đã được Hội đồng chuyên ngành thông qua

Ngày tháng năm TRƯỞNG KHOA QL

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sẳc đến Thầy TS Tống Thanh Danh, Thầy đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận vãn Xin gởi lời cảm ơn chăn thành đển tất cả các Thầy Cô và các anh chị trong bộ môn Hóa Hữu Cơ, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đờ tôi hoàn thành tốt luận vãn này

Xin cảm ơn Ban Tong Giám, các bạn và các anh chị đong nghiệp phòng Nghiên Cứu & Phát Triển Công ty Cp Dược Hậu Giang đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành các khóa học và thực hiện luận vãn.

Xin gởi lời biết ơn đến cha, mẹ và toàn thể gia đinh của tôi Đã sinh thành, nuôi dưỡng và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành tốt luận vãn.

TÓM TẮT

Nhằm tăng cường hoạt tính bảo vệ gan và kháng ung thư, mười một dẫn xuấtmới của acid ursolic được thiết kế và tổng hợp bằng cách biến đổi tại các vị trí C-3 vàC-28 của acid ursolic, cấu trúc của chúng được xác định bằng phổ MS và 1H- NMR.Hoạt tính gây độc tế bào in vitro được đánh giá đối với các dòng tế bào ung thư(HeLa, NCI-H460 và MCF-7)

ABSTRACT

In an effort to improve potential hepatoprotective and anti-tumor activities,eleven novel ursolic acid derivatives were designed and synthesized with substitution

at positions of C-3, and C-28 of ursolic acid Then structures were confirmed using

MS and 'H-NMR Then in vitro cytotoxicity against various cancer cell lines (HeLa,NCI-H460 and MCF-7) was evaluated by the standard MTT assay

MỤC LỤC

1.1.4 Một số công trình nghiên cứu về Acid ursolic ở Việt Nam 3

1.2.1 Hoạt tính kháng ung thư của một số dẫn xuất acid ursolic 81.2.2 Hoạt tính kháng Hrv của một số dẫn xuất acid ursolic 12

1.5 Một số phương pháp xác định cấu trúc của hop chất 15

2.1 Mục tiêu nghiên

17

2.2 Mô tả qui trình tổng hợp 17

2.5.1 Tổng hợp các dẫn xuất N-[3-oxo-urs-12-en-28-oyl]-ester 212.5.1.1 Tổng họp 3-Oxo-urs-12-en-28-oic acid (2) 212.5.1.2 Tổng hợp Hexyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (3) 222.5.1.3 Tổng hợp Butyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (4) 23

ổng hợp Benzyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (5) 232.5.1.5 Tổng hợp Octyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (6) 242.5.1.6 Tổng hợp Allyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (7) 252.5.1.7 Tổng hợp 3-Oxo(lH-Imidazole-l-yl)-urs-12-en-28-dione (8) 252.5.2 Tổng hợp các dẫn xuất ester của 3,4 lactone-urs-12-en-28-oic acid 262.5.2.1 Tổng hợp 3,4 lactone-urs-12-en-28-oic acid (9) 272.5.2.2 Tổng hợp 3,4 lactone(lH-Imidazole-l-yl)-urs-12-en-28-dione (10) 27

ổng hợp Benzyl 3,4 lactone-urs-12-en-28-oate (11) 282.5.2.4 Tổng hợp Allyl 3,4 lactone-urs-12-en-28-oate (12) 292.5.2.5 Tổng hợp Octyl 3,4 lactone-urs-12-en-28-oate (13) 292.5.3 Tổng họp 3-acetoxy-(lH-Imidazole-l-yl)-urs-12-en-28-dione (15) 30

3.1 Tổng họp các dẫn xuất N-[3-oxo-urs-12-en-28-oyl]-ester 32

3.1.5 Tổng hợp Octyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (6) 393.1.6 Tổng hợp Allyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (7) 413.1.7 Tổng hợp 3-Oxo(lH-Imidazole-l-yl)-urs-12-en-28-dione (8) 433.2 Tổng hợp các dẫn xuất ester của 3,4 lactone-urs-12-en-28-oic acid 453.2.1 Tổng hợp 3,4 lactone(lH-Imidazole-l-yl)-urs-12-en-28-dione (10) 453.2.2 Tổng hợp Benzyl 3,4 lactone-urs-12-en-28-oate (11) 463.2.3 Tổng hợp Allyl 3,4 lactone-urs-12-en-28-oate (12) 483.2.4 Tổng hợp Octyl 3,4 lactone-urs-12-en-28-oate (13) 50

Bảng 3.32 Hoạt tính kháng ung thu của các dẫn xuất acid ursolic 54

Hình 1.5 Một số dẫn xuất acid ursolic có hoạt tính kháng HIV 12

Hình 3.1 Ket quả tạo sản phẩm (2) thể hiện trên bản mỏng 32

Hình 3.2 Ket quả tạo sản phẩm (3) thể hiện trên bản mỏng 34

Hình 3.3 Ket quả tạo sản phẩm (4) thể hiện trên bản mỏng 36

Hình 3.4 Ket quả tạo sản phẩm (5) thể hiện trên bản mỏng 37Hình 3.5 Ket quả tạo sản phẩm ( 6 ) thể hiện trên bản mỏng 39

Hình 3.6 Ket quả tạo sản phẩm (7) thể hiện trên bản mỏng 41Hình 3.7 Kết quả tạo sản phẩm ( 8 ) thể hiện trên bản mỏng 43

Hình 3.8 Ket quả tạo sản phấm (10) thế hiện trên bản mỏng 45Hình 3.9 Ket quả tạo sản phấm (11) thế hiện trên bản mỏng 47

Hình 3.10 Ket quả tạo sản phấm (12) thế hiện trên bản mỏng 49

Hình 3.11 Ket quả tạo sản phấm (13) thế hiện trên bản mỏng 50

Hình 3.12 Ket quả tạo sản phấm (15) thế hiện trên bản mỏng 52

DANH SÁCH Sơ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Qui trình tổng hợp dẫn xuất acid ursolic 18

Sơ đồ 2.2 Phản ứng tổng hợp các dẫn xuất acid ursolic 19

Sơ đồ 2.3 Tổng hợp các dẫn xuất N-[3-oxo-urs-12-en-28-oyl]-ester 21

Sơ đồ 2.4 Tổng họp 3-Oxo-urs-12-en-28-oic acid 21

Sơ đồ 2.5 Tổng hợp Hexyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate 22

Sơ đồ 2.6 Tổng hợp Butyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate 23

Sơ đồ 2.7 Tổng hợp Benzyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate 23

Sơ đồ 2.8 Tổng hợp Octyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate 24

Sơ đồ 2.9 Tổng hợp Allyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate 25

Sơ đồ 2.10 Tổng hợp 3-Oxo(lH-Imidazole-l-yl)-urs-12-en-28-dione 25

Sơ đồ 2.11 Tổng hợp các dẫn xuất ester của 3,4 lactone-urs-12-en-28-oic acid 26

Sơ đồ 2.12 Tổng hợp 3,4 lactone-urs-12-en-28-oic acid 27

Sơ đồ 2.13 Tổng hợp 3,4 lactone(lH-Imidazole-l-yl)-urs-12-en-28-dione 27

Sơ đồ 2.14 Tổng hợp Benzyl 3,4 lactone-urs-12-en-28-oate 28

Sơ đồ 2.15 Tổng hợp Allyl 3,4 lactone-urs-12-en-28-oate 29

Sơ đồ 2.16 Tổng hợp Octyl 3,4 lactone-urs-12-en-28-oate 29

Sơ đồ 2.17 Tổng họp 3-acetoxy-(lH-Imidazole-l-yl)-urs-12-en-28-dione 30

CH2C12 Dichloromethane

DMF N,N-Dimeứiylíormamide

DMSO Dimethyl sulfoxide

MS Khối phổ (infrared spectroscopy)

m-CPBA Meta-Chloroperoxybenzoic acid

NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance spectroscopy)THF T etrahydrofuran

MỞ ĐẦU

Ngày nay trình độ khoa học kỹ thuật phát triển mạnh mẽ, đời sống ngày càngđược cải thiện đáng kể Tuy nhiên song hành với sự phát triển là nhiều căn bệnh nan yđược phát hiện, đòi hỏi con người phải liên tục nghiên cứu phát triển, phải tìm ra cácphương pháp mới, hoạt chất mới để có thể chống lại bệnh tật và kéo dài tuổi thọ Mộttrong những hướng nghiên cứu được thế giới quan tâm hàng đầu đó chính là nhữnghoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên Trong đó phải kể đến các họp chất thuộc họtriterpenoid được phân bố rộng rãi trong thế giới thực vật Và cũng đã trải qua hàngnghìn năm, các loài thực vật có chứa các họp chất triterpenoid trong các bài thuốc dângian dùng để chữa trị rất nhiều căn bênh như: nhiễm trùng, sưng tấy, tiêu chảy, đaubụng

Hiện nay, bằng các phương tiện khoa học công nghệ hiện đại, người ta đã phânlập và xác định chính xác cấu trúc của một số hoạt chất thuộc họ triterpenoid, và đồngthời xác định hoạt tính sinh học của chúng Một trong những họp quan trọng nhấtđược xác định đó là acid ursolic vì hoạt tính tuyệt vời của nó trong kháng viêm, bảo

vệ gan, điều trị tiểu đường, và đặc biệt có hoạt tính mạnh mẽ trong kháng ung thư,virus HIV

Vì hoạt tính hữu dụng của acid ursolic và nhằm hướng đến mục tiêu tối đa hóahiệu quả điều trị, đặc biệt đối với những căn bệnh mãn tính như ung thư, HIV , hiệnnay rất nhiều nhà khoa học đang tập trung tống họp các dẫn xuất của acid ursolicnhằm tìm ra họp chất có hoạt tính ưu việt dùng trong phòng và chữa bệnh Hòa nhậpvới xu hướng chung đó chính là lý do hiến khai đề tài “Tống hợp các dẫn xuất acidursolic”

TỔNG QUAN

1.1.2 Nguồn gốc thực vật

Giống như hầu hết các triterpenoid, acid ursolic tồn tại rộng khắp trong thế giớithực vật Acid ursolic được phân lập từ vỏ quả táo, lê, nam việt quất, mận, và nhiềuloại trái cây khác [6]; còn trong rong biển thì giàu các dẫn xuất acid ursolic [6] Một

số cây dược liệu có chứa acid ursolic như được trình bày trong bảng 1 [7]

Bảng 1.1 Một số cây dược liệu có chứa acid ursolic và hoạt tính sinh học

ức chế sự đột biến của vikhuẩn

Balanehru and Nagarajan, 1991; 1992

Rosmarinus ofjicinalis L

ức chế sự tạo u ở da chuột

Gây độc tế bào bạch cầu Leeet al., 1988

Sambucus chinesis Lindl

Acid ursolic [(3P)-3-Hydroxyurs-12-en-28-oic acid] hiếm khi tồn tài mà không

có đồng phân của nó, acid oleanolic [(3b)-3-Hydroxyolean-12-en-28-oic acid], Chúng

có thế tồn tại ở dạng acid tự do như trong Hình 1.1, hoặc như aglycones củatriterpenoid saponins bao gồm một triterpenoid aglycone liên kết với một hoặc nhiềunhóm chức đường Acid ursolic và oleanolic có tác dụng dược lý tương tự nhau [1],

Hừỉ/i i.i Cấu trúc của acid ursolic và oleanolic

Tên Latin: Ursolic Acid

Tên Hóa học: (3 beta)-3-hydroxyurs-12-en-28-oic acid;

3-epi-ursolic acid Merotaineursolic acid, (3beta)-isomer, 2-(14)C-labeled ursolic acid, (3beta)-isomer, monopotassium saltCông thức phân tử: C 3 oH 48 03

Khối lượng phân tử: 456.7 g/mol

Dạng tồn tại: Bột trắng ngà

Nhiệt độ nóng chảy: 292°c

Mùi: Đặc trưng

1.1.4 Một số công trình nghiên cứu về acid ursolic ở Việt Nam

Ở nước ta, Acid ursolic được phát hiện và nghiên cứu chủ yếu trên cây Hedyotis

họ cà phê, với nhiều chi khác nhau Một số công trình được nghiên cứu như:

- Phạm Nguyễn Kim Tuyến, Nguyễn Kim Phi Phụng, Phạm Đình Hùng “Góp phần tỉm hiếu thành phần hóa học của cây Hoa kim cương Hedyotỉs Nigricans L., Họ

cà phê (Rubiaceae)” Khoa hóa- Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ

Chí Minh

- Phạm Nguyễn Kim Tuyến, Nguyễn Kim Phi Phụng, Phạm Đình Hùng “Tìm hiểu thành phần hóa học của một số cây thuộc chi Hedyotis mọc ở Việt Nam và điều chế một số dẫn xuất thioflavon từ các flavon cô lập được” Khoa hóa- Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh

- Phạm Đình Hùng “Nghiên cứu tách chiết, xác định cẩu trúc các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ cây thuốc họ cúc, cà phê, ô rô, bứa và một số họ khác mọc phổ biến ở miền nam Việt Nam” Khoa hóa- Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh.

- Thiard Franck, Tất Tố Trinh, Nguyễn Thụy Vy, Nguyễn Hoài Nghĩa, NguyễnDiệu Liên Hoa, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Hạnh, Hồ Huỳnh Thùy Dương

“Khảo sát hoạt tính ức chế tăng trưởng của các cây thuốc Việt Nam trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa” Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Viện

Công Nghệ Hóa Học tại Tp HCM

Với những nghiên cứu này đã cho kết quả tách chiết được hàm lượng cao cáchợp chất triterpenoid acid trong đó có acid ursolic hàm lượng rất cao so với cáctriterpenoid acid khác Bên cạnh đó còn cho thấy hoạt tính kháng ung thư trên một sốdòng tế bào

1.1.5 Tác dụng dược lý của acid ursolic

Các cây dược liệu có chứa acid ursolic, từ lâu đã được dùng trong các bài thuốcdân gian trước khi xác định được các thành phần trong nó có tác dụng chữa bệnh.Nghiên cứu khoa học hiện đại đã phân lập và nhận dạng acid ursolic với các tác dụngdược lý như kháng ung thư, kháng viêm, chống ung nhọt, chống nhiễm trùng, virus [1]

• Hoạt tính kháng viêm

Acid ursolic là một hoạt chất kháng viêm mạnh Vì vậy, nó được khuyến cáo sửdụng trong thuốc mỡ trị bỏng [4], Nó ức chế hoạt động của human leucocyte elastase

mg/lần) ức chế 72,4% phù nề tai chuột gây ra bởi TPA [23] Hirota và cộng sự [24] đãxác định liều dùng 200 mg và 50 mg acid ursolic ức chế lần luợt 49% và 33% đối với12-0-hexadecanoyl-16-hydroxyphorbol-13-acetate (HPPA) - gây viêm Ngoài ra, nó

ức chế concanavalin A (Con A) - gây phóng thích histamine, có thể gây viêm nhiễmnghiêm trọng, đạt 95% ở nồng độ 0,001 M [25]

• Hoạt chất chong lão hóa

Acid ursolic và các dẫn xuất của nó hình thành dầu chống nhiễm trùng trên da

và tóc nhu lớp sáp phủ bên ngoài một số loại trái cây [6] Acid ursolic đuợc dùng đểđiều trị da bị lão hóa do quang hóa vì nó ngăn ngừa và cải thiện sự xuất hiện của nếpnhăn và các đóm đồi mồi bằng cách phục hồi tính co giản và cấu trúc collagen của da[31] Nồng độ của acid ursolic trong khoảng 0.01 - 50 mg đuợc báo cáo là thích hợp

để đua vào điều trị bệnh về da [32,33]

• Kích thích sự tăng trưởng của tóc

Acid ursolic và các đồng phân đuợc dùng trong nics để tăng cuờng sụ phát triểncủa tóc và ngăn ngừa kích ứng da đầu [26,27] Hợp chất kích thích tóc phát triển bằngcách kích thích lưu lượng máu ngoại biên trong da đầu và hoạt hóa các tế bào tạo ratóc Chúng cũng chống rụng tóc và ngăn ngừa gàu hiệu quả [27]

• Hoạt tính bảo vệ gan

Tác dụng của acid oleanolic, một đồng phân của acid ursolic, đối với gan lầnđầu tiên được công bố năm 1975 trong nghiên cứu của Swertia mileensis Shi, và

được dùng cho nghiên cứu hoạt tính trên bệnh viêm gan Ke đó, acid oleanolic tiếp tụcđược chứng minh về khả năng loại bỏ và ngăn ngừa CC14 cùng với cồn gây xơ ganmãn tính ở chuột (Han et al., 1981) Do đó acid oleanolic rất hiệu quả trong bảo vệchống lại các chất hóa học gây tổn hại gan ở chuột (Liu et al.,).

Acid ursolic có cấu trúc tương tự acid oleanolic, và đều là đồng phân của acidtriterpenoid với cấu trúc pentacyclic triterpen acid nên tính chất và hoạt tính gần nhưgiống nhau Do vậy acid ursolic cũng được xác định là một trong những hoạt chất cóhoạt tính trong chữa trị các bệnh về gan, với vai trò kháng CCI4, D- galactosamine -nguyên nhân gây tổn thương gan ở chuột, và ngăn ngừa acetaminophen gây ra ứ mật(Shukla et al., 1992) Trong đó, acid ursolic thậm chí còn mạnh hơn acid oleanolictrong hạn chế tác hại của hóa chất gây tổn thương gan ở chuột (Liu et al., 1994)

• ửc chế hình thành khối u ở da

Acid ursolic và acid oleanolic, được phân lập từ cây Glechoma hederacea, ức

chế hoạt động của virus Epstein-Barr gây ra bởi 12-O-tetradecanoylphorbol acetate (TPA) ở da chuột Các tác dụng ức chế được đánh giá trong 20 tuần Dùng liêntục acid ursolic và acid oleanolic (41 nmol/lần) trước khi xử lý TPA (4,1 nmol) đã trìhoãn sự hình thành khối u trong da chuột và giảm tỉ lệ (%) số chuột mang khối u Cảhai acid ursolic và acid oleanolic thế hiện hoạt tính ức chế rõ rệt đối với sự hình thànhkhối u khi so sánh với chất kháng ung thư đã biết, acid retinoic So với acid retinoichoặc acid oleanolic, acid ursolic the hiện hoạt tính ức chế khối u tốt hơn, như trìnhbày trong Hình 1.2 Điều này cho thấy sự khác biệt về vai trò ức chế khối u của acidursolic so với acid retinoic hoặc acid oleanolic Có ý kiến cho rằng nếu tiền xử lý davới acid ursolic thì có thế ức chế đáng kế sự hình thành khối u gây ra bởi TPA [17]

13-ề control [TPAontyl.À 0A;O RA UA

fWnliK'i Id MtM: IJA VLTMI* IHAjKocrru-nr f < (IDI, OA «<n«i ITA l<HVM( f o t t l - a i d

RA YtlMli TPA-lrcílnfcr*l - í'• DPI

Hình 1.2 Khả năng ức chế hình thành khối u do TPA trên da chuột khi sử dùng

reatinoic acid (RA), ursolic acid (UA), và oleanolic acid (OA)

Tác dụng tại chỗ của acid ursolic, được tách từ dịch chiết lá hương thảo, là ứcchế TPA (gây ra sự hình thành khối u, chứng viêm, và hoạt động ornithinedecarboxylase ở da chuột) Acid ursolic thể hiện hoạt tính kháng viêm mạnh, và ứcchế sự hình khối u ở da chuột - khi chỉ dùng 1 hoặc 2 mmol acid ursolic cùng với5nmol TPA cho họat tính kháng sự hình khối u ở chuột sau 20 tuần lần lượt là 45 hoặc61%

Ở liều thấp hơn (0,1 hoặc 0,3 mmol), acid ursolic có tác dụng ức chế giống nhưdùng ở liều cao Mỗi tuần, bôi tiếp xúc acid ursolic với nồng độ lần lượt là 0.1, 0.3, 1hoặc 2 mmol cùng với 5nmol TPA trong 8,12, và 18 tuần làm giảm tỉ lệ chuột bị ungthư lần lượt là 52 - 86%, 49 - 63 %, và 44 - 61% [18],

Acid ursolic và dẫn xuất của nó, acid oleanoic được chỉ định cho điều trị ung thư

da ở Nhật [19] Các mỹ phẩm bôi có chứa acid ursolic / acid oleanolic đã được cấpbằng sáng chế ở Nhật để phòng ngừa ung thư da [20] Thuốc mỡ acid ursolic/ acidoleanolic ức chế 7,12-dimethylbenz [a] anthracene (DMBA) - gây ra ung thư da ởchuột Ket quả cho thấy, chỉ có 0% và 3% số chuột bị ung thư trong 15 và 30

tuần, trong khi lần lượt có tới 50% và 90% số chuột bị ung thư nếu chỉ dùng TPA[20].

1.2 Tổng quan về dẫn xuất acid ursolic

Acid ursolic là một hợp chất triterpene được phân lập từ nhiều loại cây dược liệu[34] Các dẫn xuất của nó được báo cáo là có một loạt tác dụng dược lý, bao gồmkháng viêm, chống dị ứng, kháng khuẩn, kháng virus và kháng ung thư Trong số cáchoạt tính sinh học, đáng chú ý nhất là hoạt tính gây độc tế bào cao

1.2.1 Hoạt tính kháng ung thư của một số dẫn xuất acid ursolic

Acid ursolic và các dẫn xuất được báo cáo là ức chế khả năng sản sinh interferon

- gây tạo ra NO, và hoạt tính sẽ được gia tăng đáng kể khi thêm vào các nhómcarbonyl, methoxycarbonyl, hoặc cyano- Căn cứ trên các báo cáo, nhóm chức estertại C-3 là cần thiết cho hoạt tính dược lý của các pentacyclic triterpenes [36], và nhómcho hydrogen tại vị trí C-3 hoặc C-28 của acid ursolic là cần thiết cho hoạt tính gâyđộc tế bào [37] Từ đó một loạt các dẫn xuất acid ursolic được tổng họp và hoạt tínhcủa chúng được đánh giá in vitro trên các dòng tế bào ung thư (HeLa, SKOV3, BGC-823 ) Các kết quả đã khẳng định cấu tạo tại vị trí C-3 có vai trò quan trọng quyếtđịnh hoạt tính , dẫn xuất 3 p-amino có hoạt tính gấp 20 lần so với tiền chat acidursolic [37]; acetyl hóa nhóm OH- ở vị trí C-3 cùng với tạo liên kết amino ở vị trí C-

28 thì thu được các dẫn xuất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào mạnh hơn sovới acid ursolic, Hình 1.3a [38] Ngoài ra, đưa nhóm carbonyl vào C-11 của acidursolic cũng có thể ức chế sự phát triển của tế bào khối u [38],

e- R , * CH(CH J )CM J OH

3: R,"

CH.CHJCHJOH10: Ri= o- OCH3

131 pUCHirO

Hình 1.3a Một số dẫn xuất acid ursolic có hoạt tính kháng ung thư

Trong một nghiên cứu khác, Yan-Qiu Meng và cộng sự đã tổng hợp các dẫnxuất acid ursolic và hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất này cũng được xác địnhđối với các dòng tế bào (HeLa, SKOV3, BGC-823), Hình 1.4b [41]

Hình 1.3b Một số dẫn xuất acid ursolic có hoạt tính kháng ung thư

Trong đó, các dẫn xuất acetyl hóa C-3 alcohol cùng với tạo liên kết amino acidmethyl ester hoặc amino alcohol acetate tại C-28 có hoạt tính ức chế sự phát triển củacác dòng tế bào ung thư mạnh hơn so với tiền chat acid ursolic.Tuy nhiên, các dẫnxuất có nhóm hydroxyl tại C-3 thì hoạt tính kém hơn; còn nhóm hydroxyl trên mạchamide tại C-28 thì không ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của họp chất Trường họp

có quá nhiều mạch nhánh alkyl trên mạch amide ở C-28 sẽ làm giảm hoạt tính do hiệuứng không gian

Bên cạnh đó, theo một hướng khác, Huang-Yao Tu và cộng sự cũng đã nghiên cứu các dẫn dẫn xuất của acid ursolic trên dòng tế bào NTUB1 [40]

.

2fi: R—COCH-CHCHj 27: R -COCH vCH^CM.Oj 28: \ I -COCH J CH J COOH

Hình 1.4 Một số dẫn xuất acid ursolic

Hầu hết các dẫn xuất đều thế hiện hoạt tính gây độc đối với đối với dòng tế bàoNTUB1 Các dẫn xuất acetyl hóa tại vị trí C3-OH đều thế hiện tăng cường hoạt tínhgây độc, như dẫn xuất 28 có hoạt tính gia tăng đáng kế đối với dòng tế bào NTUB1.Tuy nhiên, trong số các dẫn xuất trên, việc tăng chuỗi carbon trên nhóm tạo sản phamester sẽ làm giảm hoạt tính, còn tăng tính chưa no của chuỗi sẽ làm hoạt tính tăng hơn.Các quá trình oxy hóa của C3-OH tạo nhóm keton làm tăng hoạt tính, còn tạo dẫnxuất lactone làm giảm hoạt tính Tuy nhiên khi thủy phân lactone

tạo các dẫn xuất 3,4-seco- cho khả năng ức chế có hiệu quả đối với sự tăng trưởng của

tế bào khối u, nguyên nhân có thể do hình thành cấu trúc dạng seco-

1.2.2 Hoạt tính kháng HIV của một số dẫn xuất acid ursolic

Trong xu hướng nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có hiệu quả kháng HIV, acidbetulinic, một acid triterpenoic tương tự acid ursolic, được phân lập từ lá câySyzygium claviflorum (Myrtaceae), được xác định là một hoạt chất kháng HIV (EC50

=1,4 |iM; TI = 9,3) Và điều đặc biệt là từ acid betulinic người ta đã tổng hợp đượcdẫn xuất 3-0-(3',3'-dimethylsuccinyl) có hoạt tính kháng Hrv vượt trội (EC50 < 0,00035

ịiM; TI > 20 000).

Với chỉ số EC50 = 4.4 |iM, acid ursolic, được phân lập từ Pr glandulosa, Ph

juniperinum, s claviflorum, và H capitata, cũng được xem là hợp chất có hoạt tính

kháng HIV tương tự acid betulinic Yoshiki Kashiwada và cộng sự đã nghiên cứu tổnghợp và xác định hoạt tính kháng HIV của các dẫn xuất acid ursolic [39]

Hình 1.5 Một số dẫn xuất acid ursolic có hoạt tính kháng HIV

Trong số các dẫn xuất 3-O-acyl-ursolic acid, 3-O-diglycoryl-ursolic acid (10)

xuất 3-0X0 (15) và muối potassium (16) có hoạt tính kháng Hrv tương tự tiền chất Tómlại, các dẫn xuất acid ursolic cũng thể hiện hoạt tính kháng Hrv nhưng kém hơn so vớicác dẫn xuất cùng loại từ acid betulinic.

1.3 Phản ứng Jones Oxidation

Phản ứng Jones Oxidation cho phép dễ dàng chuyển hóa rượu bậc 2 thành ketone:

( HR^R' CfOs.HjSOfl.HjO

Na 2 Cr 2 0,

Rượu và acid chromic hình thành ester chromate, trong họp chất trung gian nàyxảy ra phản ứng nội phân tử và giữa các phân tử với nhau trong môi trường base(nước) để hình thành họp chat carbonyl tương ứng:

Khả năng di chuyển: H > alkyl bậc 3 > cyclohexyl > alkyl bậc 2, aryl > alkyl bậc

1 > methyl

1.5 Một số phương pháp xác định cấu trúc của hợp chất

1.5.1 Phương pháp phổ khối lượng

Phương pháp phổ khối

lượng là một kĩ thuật dùng để

đo đạc tỉ lệ khối lượng trên điện

tích của ion; dùng thiết bị

• Xác định kết cấu chất đồng vị của các thành phần trong hợp chất

• Xác định cấu trúc của một hợp chất bằng cách quan sát từng phần tách riêng của nó

• Nghiên cứu cơ sở của hóa học ion thế khí (ngành hóa học về ion và chất trungtính trong chân không)

• Xác định các thuộc tính vật lí, hóa học hay ngay cả sinh học của hợp chất với nhiều hướng tiếp cận khác nhau

1.5.2 Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân

Cộng hưởng từ hạt nhân là hiện tượng vật lí dựa trên từ tính của hạt nhân

nguyên tử Cộng hưởng từ hạt nhân cũng được xem là một nhóm các phương phápkhoa học áp dụng cộng hưởng từ hạt nhân vào việc nghiên cứu các phân tử

Mọi hạt nhân chứa một số lẻ các proton hay neutron có một mômen từ nội tại vàmômen động lượng Các hạt nhân thường được đo nhất là hydro-1 (đồng vị nhiều nhấttrong tự nhiên) và carbon-13, mặc dù cũng có thể gặp hạt nhân từ các đồng vị củanhiều nguyên tố khác (như 15N, 14N 19F, 31p, 170, 29Si, 10B, nB, 23Na, 35C1,195Pt).

Tần số cộng hưởng từ hạt nhân đối với một chất cụ thể trực tiếp tỉ lệ với cường

độ từ trường áp dụng, phù họp với phương trình tần số tuế sai Larmor

THựC NGHIỆM

2 THỰC NGHIỆM

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Khảo sát một số phản ứng tổng hợp hữu cơ bao gồm phản ứng ester hóa và oxy hóa

- Tổng hợp các dẫn xuất acid ursolic

- Xác định cấu trúc và hoạt tính kháng ung thu của các dẫn xuất đã tổng hợp

2.2 Mô tả qui trình tổng hợp

Các dẫn xuất acid ursolic đuợc tổng hợp với sụ biến đổi tại vị trí C-3 và C-28của tiền chat acid ursolic

Hình 2.1 Cấu trúc acid ursolic

Tác chất phản ứng đuợc hòa tan trong dung môi hữu cơ thích hợp, đuợc cho vàobình phản ứng cùng với xúc tác (nếu cần) Phản ứng đuợc thục hiện trong điều kiệnkhuấy, gia nhiệt hoặc làm lạnh, đồng thời đuợc theo dõi bởi sắc ký bản mỏng với hệdung môi thích hợp Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp đuợc lọc, chiết bằng nuớc,rửa nhiều lần bằng dung môi hữu cơ (ethyl acetate hoặc dichloromethane), và làmkhan bằng Na2S04 (muối sodium sulfate khan) Sau đó cô quay tách loại dung môi vàtinh khiết bằng cột silicagel với hệ dung môi Hexane : Ethyl acetate ở tỉ lệ thích hợp

Sơ đồ 2.1 Quỉ trình tổng hợp dẫn xuất acid ursolic

Chuỗi phản ứng tạo các dẫn xuất acid ursolic

• Hóa chất thi nghiêm Acid

ursolic Các alkyl halide

N,N'-carbonyldiimidazole (CDI)

Dung dịch Jone’s reagent

Triethylamine Acetone

Ethyl acetate Chloroform Dichloromethanen-Hexane

N,N-Dimethylformamide (DMF)

Anhydride acetic-(CH3C0)20 NaHC03

- Bep khuấy từ có hỗ trợ gia nhiệt

- Thiết bị cô quay chân không, bình cô quay

- Hệ thống triển khai sắc ký bản mỏng

- Hệ thống sắc ký cột

- Một số thiết bị khác,

2.4 Phương pháp nghiên cứu

- Các dẫn xuất acid ursolic được tổng họp trong chuyên luận này chủ yếu là sảnphâm ester hóa và oxy hóa

- Tiến trình phản ứng được theo dõi bằng sắc ký bản mỏng

- Sản phấm được tinh chế bằng sắc ký cột silicagel với hệ dung môi Hexane :Ethylacetate ở tỉ lệ thích họp

- Cấu trúc của các dẫn xuất được xác định bằng phổ 'H-NMR, MS tại Viện HóaHọc, Viện KHCN VN

- Hoạt tính sinh học được thử (tại Trung tâm phân tích, Trường Đại học KHTNTP.HCM) trên ba dòng tế bào ung thư: HeLa (ung thư cổ tử cung), NCI-H460(Ung thư phổi), NCF-7 (Ung tư vú)

2.5 Nội dung thí nghiệm

2.5.1 Tổng hợp các dẫn xuất N-[3-oxo-urs-12-en-28-oyl]-ester (3-7)

2.5.1.1 Tổng hợp 3-Oxo-urs-12-en-28-oic acid (2)

;onn

Sơ đồ 2.4 Tổng hợp 3-Oxo-urs-12-en-28-oic acid

Phản ứng tạo sản phấm (2) là phản ứng oxi hóa với tác nhân oxi hóa là Jones’

Hỗn hợp phản ứng được làm ấm đến nhiệt độ phòng (25 °C) và được khuấy trong 2

giờ Kiểm tra bản mỏng thấy phản ứng kết thúc Sau đó làm lạnh hỗn hợp đến 5°c,

2-propanol (2 ml) được cho vào và khuấy thêm 20 phút ở nhiệt độ phòng Ket tủaxanh được tách ra và rửa bằng aceton Phần dung dịch sau lọc được cô và sấy khô(loại bỏ dung môi) Sản phẩm được tinh chế trên cột silicagel với hệ dung môi 15%Etylacetate : 85% Hexane Thu được sản phẩm (2), đây là sản phẩm trung gian chophản ứng tiếp theo

Sơ đo 2.5 Tong hợp Hexyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate

Hòa tan 30mg (2) trong 10ml acetone, khuấy khoảng 5 phút thêm K2CO3

(50mg), và thêm tiếp 1- Bromohexane (0.2ml), hỗn hợp phản ứng có màu đục sữa.Phản ứng trong 2h thì kiếm tra sắc ký bản mỏng một lần, theo dõi phản ứng xảy ra.Rồi đế qua đêm thử lại sắc ký bản mỏng, sau khoảng 24h thấy phản ứng chuyến hóahoàn toàn thì ngừng phản ứng đem chiết trong nước và etylacetat 3 lần, kết hợp làmkhan bởi Na2S04 Chiết xong đem cô quay chân không để đuổi hết dung môietylacetat, rồi đem chạy cột trong hệ dung môi Etylacetat : Hexane tương ứng 1:9 (tức

10%) Thu được sản pham ester hóa Hexyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (3) với dẫn xuất

alkyl halide tương ứng là 1-Bromohexane

2.5.1.3 Tổng hợp Butyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (4)

Sơ đồ 2.6 Tổng hợp Butyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate

Hòa tan 30mg (2) trong 10ml acetone, khuấy khoảng 5 phút thêm K2C03

(50mg), và thêm tiếp 1- Bromobutane (0.2ml), hỗn hợp phản ứng có màu đục sữa.Phản ứng trong 2h thì kiểm ứa sắc ký bản mỏng một lần, theo dõi phản ứng xảy ra.Rồi để qua đêm thử lại sắc ký bản mỏng, sau khoảng 24h thấy phản ứng chuyển hóahoàn toàn thì ngừng phản ứng đem chiết trong nước và etylacetat 3 lần, kết hợp làmkhan bởi Na2S04 Chiết xong đem cô quay chân không để đuổi hết dung môietylacetat, rồi đem chạy cột trong hệ dung môi Etylacetat : Hexane tương ứng 1:9 (tức

10%) Thu được sản phẩm ester hóa Butyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (4) với dẫn xuất

alkyl halide tương ứng là 1-Bromobutane

2.5.1.4 Tổng hợp Benzyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (5)

Hòa tan 30mg (2) trong 10ml acetone, khuấy khoảng 5 phút thêm K2C03

(50mg), và thêm tiếp 1- Bromomethylbenzene (0.2ml), hỗn hợp phản ứng có màu đụcsữa Phản ứng trong 2h thì kiểm tra sắc ký bản mỏng một lần, theo dõi phản ứng xảy

ra Rồi để qua đêm thử lại sắc ký bản mỏng, sau khoảng 24h thấy phản ứng chuyểnhóa hoàn toàn thì ngừng phản ứng đem chiết trong nước và etylacetat 3 lần, kết hợplàm khan bởi Na2S04 Chiết xong đem cô quay chân không để đuổi hết dung môietylacetat, rồi đem chạy cột trong hệ dung môi Etylacetat: Hexane tương ứng 1:9 (tức

10%) Thu được sản phẩm ester hóa Benzyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (5) với dẫn xuất

alkyl halide tương ứng là l-Bromomethylbenzene

2.5.1.5 Tong họp Octyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (6)

Sơ đồ 2.8 Tổng hợp Octyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate

Hòa tan 30mg (2) trong 10ml acetone, khuấy khoảng 5 phút thêm K2C03

(50mg), và thêm tiếp 1- Bromooctane (0.2ml), hỗn hợp phản ứng có màu đục sữa.Phản ứng trong 2h thì kiếm tra sắc ký bản mỏng một lần, theo dõi phản ứng xảy ra.Rồi đế qua đêm thử lại sắc ký bản mỏng, sau khoảng 24h thấy phản ứng chuyến hóahoàn toàn thì ngừng phản ứng đem chiết trong nước và etylacetat 3 lần, kết hợp làmkhan bởi Na2S04 Chiết xong đem cô quay chân không để đuổi hết dung môietylacetat, rồi đem chạy cột trong hệ dung môi Etylacetat : Hexane tương ứng 1:9 (tức

10%) Thu được sản phẩm ester hóa Octyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (6) với dẫn xuất

alkyl halide tương ứng là 1-Bromooctane