Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens HB

DANH MỤC HÌNH ẢNHHình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát được dưới kính hiển vi Gillen và Gibbs, 2011 Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens Hì

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện : HỒ TRUNG LỘC

MSSV: 1411100591 Lớp: 14DSH03

TP Hồ Chí Minh, năm 2018

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện : HỒ TRUNG LỘC

MSSV: 1411100591 Lớp: 14DSH03

TP Hồ Chí Minh, năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướngdẫn khoa học của TS Nguyễn Hoài Hương (Giảng viên Viện Khoa Học Ứng DụngHUTECH, trường Đại học Công Nghệ TP.HCM)

Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bốtrong bất kỳ công trình nào khác Tôi xin chịu trách nhiệm về khóa luận tốt nghiệpcủa mình

TP.HCM, ngày 27 tháng 7 năm 2018

Sinh viên thực hiện

HỒ TRUNG LỘC

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, người đã nuôi nấng dạy

dỗ con trong 22 năm qua, người đã cùng con trải qua biết bao nhiêu khó khăn trongcuộc sống và luôn quan tâm con, chăm sóc con, luôn bên cạnh con lúc khó khănnhất Con xin cảm ơn gia đình ông bà nội ngoại Đặc biệt là bà nội, bà ngoại, ba, côbảy và cậu mợ mười trong suốt những năm qua đã tạo điều kiện thuận lợi tốt nhất

để con được bước vào giảng đường đại học với tâm thế thoải mái

Em xin cảm ơn quý thấy cô trong Viện Khoa học Ứng Dụng HUTECH vànhững thầy cô giảng viên của trường đã tận tâm dạy bảo và truyền đạt kiến thức cho

em trong suốt 4 năm đại học Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắcnhất đến cô Nguyễn Hoài Hương, người thầy đầy nhiệt huyết, luôn định hướng vàcung cấp những kiến thức bổ ích cho chúng em, người trực tiếp hướng dẫn emxuyên suốt quá trình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp này

Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai, người đã cho em lời khuyêntrong quá trình nuôi sâu khoang thí nghiệm và cung cấp trứng sâu cho em Em xinchân thành cảm ơn thầy Phạm Minh Nhựt, chị Huỳnh Ngọc Nhi đã cho em vật liệuthử nghiệm để em tiến hành các thí nghiệm khảo sát

Em xin chân thành biết ơn anh Trương Hoài Nguyên, anh Nguyễn PhướcSinh, anh Phạm Hoàng Nhân, chị Cao Thị Thanh Thúy đã truyền đạt cho em nhữngkinh nghiệm, lời khuyên bổ ích trong suốt quá trình thực hiện đề tài Và em xin cảm

ơn tất cả các bạn đồng nghiệp Lê Đình Nhân, Nguyễn Mộng Trâm, Đặng Thị KimTuyền, Đào Đặng Phương Dung, Đinh Ngọc Phương Trinh, Võ Lan Hương, VõThành Lâm cùng hai em Võ Đình Chiến và Nguyễn Đăng Thùy Dương đã đồnghành giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2018

HỒ TRUNG LỘC

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

DANH MỤC CÁC BẢNG i

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu: 1

3 Nhiệm vụ nghiên cứu: 1

4 Phương pháp nghiên cứu 2

5 Kết quả cần đạt được 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học 3

1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học 3

1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trường hiện nay 3 1.1.3 Những ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học 4

1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens 5

1.2.1 Lịch sử phát hiện 5

1.2.2 Phân loại 6

1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens 6

1.2.3 Đặc điểm sinh lí 7

1.2.4 Đặc điểm sinh hóa 7

1.2.5 Đặc điểm phân bố 9

1.3 Giới thiệu về Prodigiosin 10

1.3.1 Khái niệm vê Prodigiosin 10

1.3.2 Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin 10

1.3.3 Hoạt tính sinh học của prodigiosin 13

1.3.4 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens 13

1.4 Enzyme 17

1.5.Yếu tố độc lực của Serratia marcescens 17

1.6 Khả năng diệt sâu của vi khuẩn Serratia marcescens 18

1.7 Một số nghiên cứu trên thế giới 20

1.7.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens 20

1.7.2 Tình hình nghiên cứu Prodigiosin 21

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 22

2.1.1 Thời gian 22

2.1.2 Địa điểm 22

2.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị 22

2.2.1 Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens 22

2.2.2 Nguồn nấm 22

2.2.3 Nguồn sâu khoang Spodoptera litura 22

2.2.4 Môi trường nuôi cấy và hóa chất 22

2.2.5 Dụng cụ, thiết bị 23

2.3 Mục tiêu nghiên cứu 24

2.4 Nội dung nghiên cứu 24

2.5 Phương pháp thí nghiệm 24

2.5.1 Phương pháp luận 24

2.5.2 Bố trí thí nghiệm 27

2.6 Phương pháp nghiên cứu bố trí thí nghiệm 29

2.6.1 Phương pháp chọn lọc chủng seratia marcescens có khả năng tổng hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào Protease mạnh nhất .30

2.6.1.1 Phương pháp định tính enzyme 30

2.6.1.2 Phương pháp trích ly thu Prodigiosin 31

2.6.2 Khảo sát phương pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens hiệu quả 33

2.6.2.1 Phương pháp xử lý tế bào bằng acid .33

2.6.2.2 Phương pháp xử lý nhiệt 33

2.6.2.3 Phương pháp xử lý tế bào bằng Formalin 34

2.6.3 Phương pháp định tính enzyme của dịch nuôi cấy sau khi xử lý tế bào 34

2.6.4 Phương pháp khảo sát sự ảnh hưởng của tia UV từ ánh sáng mặt trời đến hiêu lực diệt sâu của chế phẩm ở các công thức phụ gia 37

2.6.4.1 Tỷ lệ các chất phụ gia trong chế phẩm 37

2.6.4.2 Khảo sát hiệu lực diệt sâu khoang bằng phương pháp quét lá 38

2.6.6 Phương pháp khảo sát khả năng kháng nấm 40

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1.Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme

ngoại bào và prodigiosin cao nhất .43

3.1.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào .43

3.1.2 Trích ly thu prodigiosin 45

3.1.3 So sánh hình thái của chủng SH1 và HB .47

3.2 Kết quả khảo sát phương pháp tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens hiệu quả nhất .50

3.2.1 Phương pháp xử lý acid 51

3.2.2 Phương pháp xử lý nhiệt 52

3.2.3 Phương pháp xử lý tiêu diệt tế bào bằng dung dịch Formalin .54

3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào của dịch nuôi cấy Serratia marcescens HB sau khi xử lý tế bào .57

3.3.1 Thử nghiệm hoạt tính protease 57

3.3.2 Thử nghiệm hoạt tính Chitinase 57

3.5 Khả năng ảnh hưởng của tia UV từ ánh sáng mặt trời đến hiệu lực diệt sâu của chế phẩm ở các nồng độ phụ gia .59

3.6 Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm có lợi 62

3.8 Quy trình sản xuất chế phẩm chứa dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens HB .…64

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

4.1 Kết luận 66

4.2 Kiến nghị 66

Tài liệu tiếng Việt 67

Tài liệu nước ngoài 68

PHỤ LỤC A THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG 72

PHỤ LỤC B HÌNH ẢNH 75

PHỤ LỤC C: BIỂU ĐỒ 82

PHỤ LỤC D: SỐ LIỆU THỐNG KÊ 84

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

EPN : Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (viết tắt tên tiếng Anh:

Entomopathogenic nematodes).

H-CP16 : Heterorhabditis indica CP16

A.nauplii : Artemia nauplii

S.marcescens: Serratia marcescens.

PGA :Môi trường Peptone glycerol agar

CMC :Carboxymethyl cellulose

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát được dưới kính hiển vi (Gillen và

Gibbs, 2011

Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia

marcescens Hình 1.3 Các chất đại diện Prodigiosin (Fursttner, 2003)

Hình 1.4 So sánh các cụm sinh tổng hợp Prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC

39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp Undercylprodigiosin (cụm màu đỏ từStreptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001)

Hình 1.5 Con đường được đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp Prodigiosin

Hình 1.6 Cơ chế gây bệnh của enzyme serralysin metallprotease của S marcescens

đối với ấu trùng tằm (K Ishi et al; 2014)

Hình 2.4 Quy trình trích ly thu prodigiosin từ dịch lên men các chủng vi

khuẩn Hình 2.5 Cách bố trí nghiệm thức trên môi trường thạch gelatin agar

Hình 2.6 Cách bố trí nghiệm thức trên môi trường thạch Tween 80

agar Hình 2.7 Cách bố trí nghiệm thức trên môi trường thạch chitin

agar Hình 2.8 Bố trí nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA

Hình 3.1 Khả năng tiết enzyme Protease của 5 chủng Serratia marcescens SH1,

SH4, SH5, SB, HB tương ứng với các ký hiệu A, B, C, D, E

Hình 3.2 Khả năng tiết enzyme chitinase của chủng SB và HB.

Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện giá trị OD hiệu chỉnh của 5 chủng SH1, SH4, SH5, SB,

HB

Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc và hình thái nhuộm Gram của hai chủng SH1 và HB

Hình 3.5 Kết quả quét phổ hấp thu dịch lên men hai chủng Serratia marcescens

Hình 3.8 Khuẩn lạc Serratia marcescens xuất hiện trên thạch PGA ở đĩa đối chứng

(A) và đĩa khảo sát (B) sau 48 giờ ủ

Hình 3.9 Kết quả sau khi ria lại trên thạch PGA sau 24 giờ ủ ở hai nghiệm thức

1000C (A) và 650C (B)

Hình 3.10 Kết quả sau khi cấy ria dịch canh trường Serratia marcescens HB đã xử

lý Formalin ở các nồng độ

Hình 3.11 Hiệu lực diệt sâu khoang Spodoptera litura của chế phẩm với các nồng

độ phụ gia theo thời gian theo công thức Abbott (1925)

Hình 3.12 Sâu khoang chết sau khi thử nghiệm chế phẩm.

Hình 3.13 Sơ đồ sản xuất chế phẩm trừ sâu sinh học từ dịch nuôi cấy vi khuẩn

Serratia marcescens HB đã xử lý tế bào.

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens.

Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) Bảng 1.3 Tóm tắt những nghiên cứu liên quan đến chế phẩm diệt sâu từ

Serratia marcescens đã thực hiện.

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Theo thống kê của tổ chức Lương – Nông thế giới cho thấy: các loài cây trồnghiện nay phải chống đỡ với 100.000 loài sâu hại khác nhau, 10.000 loài nấm, 200loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh Đây quả là một lựclượng hùng hậu tấn công cây trồng, gây tổn thất lớn cho mùa màng Để giải quyếtvấn đề trên, con người đã tích cực tìm kiếm các biện pháp phòng chống các tácnhân gây hại.Từ đó đã ra đời nền công nghiệp thuốc trừ sâu hóa học, diệt các mầmbệnh cho cây trồng Tuy nhiên, người nông dân đã dùng thuốc hóa học với liềulượng quá mức cho phép, vô tình tạo cho côn trùng khả năng kháng thuốc, làm chotình hình sâu hại trở nên nghiêm trọng và diễn biến phức tạp hơn

Những năm gần đây, việc trích ly được hợp chất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia

marcescens có khả năng diệt sâu đã mở ra một triển vọng mới trong việc tạo chế phẩm

trừ sâu sinh học là hợp chất thứ cấp của vi sinh vật Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện naychỉ có một vài đề tài nghiên cứu về hợp chất thứ cấp này mà chưa có nghiên cứu nào

về ứng dụng tạo phẩm diệt sâu từ hợp chất prodigiosin hoặc đã nghiên cứu nhưng vẫnchưa hoàn thiện được sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học Dựa trên cơ sở đó mà ngườithực hiện đề tài đã chọn hướng cho Đồ án tốt nghiệp là:

“Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn

Serratia marcescens HB.

2 Mục đích nghiên cứu:

Hoàn thiện quy trình tạo chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn

Serratia marcesces chứa hợp chất prodigiosin.

3 Nhiệm vụ nghiên cứu:

Khảo sát chọn chủng vi khuẩn Serratia marcescens thích hợp có khả năng sinh

tổng hợp Prodigiosin với nồng độ cao và hoạt lực enzyme protease, chitinase mạnh

Khảo sát phương pháp xử lý tiêu diệt tế bào vi khuẩn sau lên men thích hợp và để đảm bảo mục tiêu an toàn sinh học.

Khảo sát sự ảnh hưởng của việc phơi nắng đối với hiệu lực diệt sâu của chế phẩm ởcác công thức phụ gia

Đưa ra quy trình hoàn thiện để tạo chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn

Serratia marcescens.

4 Phương pháp nghiên cứu

Sử dụng công thức Abbott (1925) để tính toán hiệu lực diệt sâu

Sử dụng phần mềm SAS 9.4 để phân tích ANOVA từ số liệu kết quả thu được

5 Kết quả cần đạt được

Chọn được chủng vi khuẩn Serratia marcescens có khả năng sinh tổng hợp

enzyme ngoại bào và nồng độ prodigiosin cao

Chọn phương pháp xử lý thích hợp đối với dịch nuôi cấy sau lên men để tiêudiệt tế bào vừa đảm bảo mục tiêu an toàn sinh học vừa giữ được hoạt tính, nồng độcủa hợp chất thứ cấp prodigiosin

Khảo sát được hoạt tính của dịch nuôi cấy sau xử lý: hoạt lực enzyme, khả năngkháng nấm

Khảo sát khả năng ảnh hưởng của tia UV từ ánh sáng mặt trời đến hiệu lực diệtsâu của chế phẩm ở các nồng độ phụ gia

Chọn ra được tỷ lệ phụ gia thích hợp cho việc tạo chế phẩm

Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm sinh học trừ sâu từ dịch lên men vi

khuẩn Serratia marcescens HB.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học

1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học

Thuốc trừ sâu sinh học là chất có khả năng kiểm soát dịch hại bằng cơ chếkhông độc Thuốc trừ sâu sinh học có thể là các sinh vật sống (thiên địch) hoặc chếphẩm của chúng (hóa chất thực vật, chế phẩm vi sinh) hoặc hóa chất truyền tinđược sử dụng để quản lý dịch hại cho thực vật

Thuốc trừ sâu sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cây trồng,mặc dù hầu hết các loại thuốc này thường được sử dụng kết hợp với các công cụkhác (thuốc trừ sâu hóa học) như một phần của hoạt động quản lý dịch hại bằngphương pháp sinh học

1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trường hiện nay

1 Chế phẩm Bt: Gồm 2 loại: dạng sữa 4.000 IU/ml và dạng bột Biotox16.000 IU/mg chuyên dùng trừ sâu tơ, sâu xanh hại rau, sâu kéo ra lá, cácloại sâu thuộc họ Lepidoptera

2 Chế phẩm NPV: là chế phẩm trừ sâu hoạt lực mạnh và có tính chuyên hóacao, gồm 2 loại V- Ha và V- S1 Thuốc chuyên dung để diệt trừ sâu xanh,sâu xanh đốm trắng, sâu khoang, sâu tơ trên các loại cây rau màu, cây côngnghiệp, cây ăn quả với hiệu quả rất cao NPV có nồng độ đặc hơn so vớicác loại thuốc khác, sử dụng tương đối dễ dàng: chỉ cần hòa thuốc vào bình

và phun bình thường với liều lượng 1,0 – 1,2 kg/ha

3 Chế phẩm M&B có 2 loại: Metarhizium và Beauveria Metarhizium

anisopliae (nấm xanh) được dùng để trừ rầy, bọ xít trên lúa va cây ăn quả

đạt 70-90%, dạng nấm trắng (Beauveria sp.) đạt 50-85% Chế phẩm

Beauveria chuyên dung để trị sâu róm thong và sâu đo nâu hại bồ đề với hiệu quả tiêu diệt sâu tới gần 87%.Tiến sĩ Nguyễn Văn Vấn cho biết: “Loại

thuốc này có thể sử dụng để tiêu diệt sâu róm hại thong đang xảy ra tại Nghệ An hiện nay”.

4 Chế phẩm tuyến trùng EPN Biostar 15-20 x106 IJs trừ sâu xám hại thuốc

lá, đặc biệt là mía đạt hiệu quả khá cao Hiện những sản phẩm đầu tiên đãđược đưa vào ứng dụng để trư sâu xám hại thuốc lá tại Ba Vì (Hà Tây), bọhung hại mía tại Thạch Thành (Thanh Hóa)

5 Chế phẩm hóa sinh Momosertatin (MM) 2IU/lít trư các loại sâu hại rau màu đạt 45-50%

6 Chế phẩm Ditacin 8% và Ketomium 1,5 x 106 Cfu/g, trừ bệnh hại trên cây

ăn quả, cây lâu năm (Nguyễn Văn Tấn, 2004)

1.1.3 Những ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học

Ưu điểm:

- Ít độc với người và các sinh vật có ích nên có thể bảo vệ được sự cânbằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và sâu), ít gâytình trạng bùng phát dịch côn trùng

- Thời gian phân hủy trong tự nhiên nhanh chóng, ít để lại dư lượngđộc trên nông sản và có thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sửdụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao như các loại rau, chè…

- Ngoài ra, các nguyên liệu để làm thuốc trừ sâu sinh học thường có sẵn

và rất phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc như ớt, tỏi, hành, gừng…Chi phísản xuất khi tự làm thuốc trừ sâu sinh học thấp hơn so với thuốc trừsâu hóa học, do vậy sẽ tiết kiệm hơn cho người dân mà vẫn mang lạihiệu quả cao

1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens

1.2.1 Lịch sử phát hiện

Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm được nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ

6 trước công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên bánh

mì Sau đó, vào năm 332 trước công nguyên, những người lính trong quân độiMacedonian của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đôi khi dường như có

“máu” trên đó Và họ cho rằng hiện tượng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấymáu sẽ sớm chảy trong thành phố Tyre và Alexander sẽ giành chiến thắng

Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuấthiện kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran(1969), đã phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó, sự

cố như vậy được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch Trong bóng tối

và sự ẩm ướt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh được sử dụng trong

Thánh lễ thường xuyên bị nhiễm Serratia marcescens Tuy nhiên, điều này lại

khiến nhiều người nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một phép lạ(Gillen và Gibbs, 2011)

Bizio, một dược sĩ ở Padua (Italya) là người đầu tiên phát hiện và đặt tên

Serratia marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang

màu đỏ máu Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đó để

ở nơi khô ráo Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều được bao phủ bởi một lớp visinh vật màu đỏ Năm 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia,theo nhà vật lý nổi tiếng người Italya đã phát minh ra tàu hơi nước là Serrati, tênloài marcescens có nguồn gốc từ tiếng Latin, có nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật nàyphân hủy rất nhanh bánh mì và polenta

Ban đầu Bizio mô tả Serratia marcescens như một loại nấm, do ông nhìn

thấy những đốm đỏ dưới kính hiển vi Thời gian sau đó, vào những năm 1850, các

nhà khoa học đã phân loại lại Serratia marcescens là vi khuẩn.

1.2.2 Phân loại

Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên

quan với nhau về hình thái và trình tự DNA Trong đó, loài điển hình của chi

Serratia là Serratia marcescens.

Theo Bizio (1823), Serriatia marcescens được phân loại như sau:

Giới: BacteriaNgành: ProteobacteriaLớp: Gramma proteobacteriaBộ: Enterobacteriales

Họ: Enterobacteriaceae Chi: Serratia

Loài: Serratia marcescens

1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens

Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi, có hình que,

đường kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm m và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm m Serratia

marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 400C và có thể phát triển ở

pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012)

Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát được dưới kính hiển

vi (Gillen và Gibbs, 2011)

Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc Serratia marcesens 1.2.3 Đặc điểm sinh lí

Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trường Nutrient agar được mô

tả là khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng làsắc tố thường thấy trong các khuẩn lạc Các sắc tố bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ(David, 2012)

Vi khuẩn Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trường

thạch, tạo thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8 %); các cụm tế bào này có chiều

dài từ 5 – 30 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm l Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học.

1.2.4 Đặc điểm sinh hóa

Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trường hiếu khí và kỵ khí.

Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men để lấy năng lượng và nhờ

có các enzyme như superoxide dismutase, catalase, peroxides,…bảo vệ chúng khỏi

các phản ứng oxy hóa Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và

gelatinase (Giri và cộng sự, 2004)

Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di

động và sinh một số enzyme ngoại bào nhƣ nuclease, protease và hemolysin (Hejazi

và Falkiner, 1997) Trong đó, thủy phân casein là một đặc điểm chung của Serratia

marcescens Casein là một protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat

và một số chất dẻo Serratia marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào để phá

vỡ liên kết peptide (CO-NH) trong casein

Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens

sang acid, không sinhkhí và không sinh H2S

15 Ornithine +

decarboxylase

Serratia marcescens được coi là một trong những tác nhân gây bênh tiềm năng đối

với côn trùng, chúng làm côn trùng chết bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết saukhi xâm nhập (Francine và Patrick, 2006)

Hơn nữa, Serratia marcescens cũng được tìm thấy nhiều trong thực phẩm,

nhất là trong tinh bột biến tính, vì đây là môi trường rất thuận lợi cho sự tăngtrưởng của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001)

Gần đây, người ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong các loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006) Và trong báo

cáo mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa

Serratia marcescens với Steinernema carpocapsae.

1.3 Giới thiệu về Prodigiosin

1.3.1 Khái niệm vê Prodigiosin

Prodigiosin là một tripyrrole đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc

trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc từ

“prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu Prodigiosin đƣợc tìm thấy ở dạngtúi bên ngoài tế bào cũng nhƣ các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế bào(Kobayashi và Ichikawa, 1991)

Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi

khuẩn Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998) Các sắc tố thuộc nhóm này bao

gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochlodride (cPrG–HCI),uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin Trong đó,khả năng ức chế miễn dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin vàcycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI)

1.3.2 Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin

Prodigiosin với tên gọi methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và trọnglƣợng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự,2006;Williamson và cộng sự, 2006)

(5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)-Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrroletạo thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếpvới nhau, còn vòng thứ ba đƣợc gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri vàWilliams, 1972; Gerber, 1975) Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi vàđƣợc miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008)

Hình 1.3 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)

Các sắc tố màu đỏ của S marcescens đã được phân lập là đặt tên là

“prodigiosine” bởi Kraft (1902) Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác

của prodigiosin tổng hợp bởi S marcescens mới được biết đến (Rapoport và

Holden, 1962) Do sự tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổtrong những năm tiếp theo prodigiosin trở nên rõ ràng hơn (Hesse, 2000), có mộtloạt các chất đều mang cùng pyrrolypyrromethene (prodigionine) với nhóm thếalkyl khác nhau (Wasserman và cộng sự, 1969) Những nhóm thế thường gắn trở lại

để tạo thành vòng tròn hoặc macrocycles Furstner (2003) cho rằng danh pháptruyền thống là rất phù hợp và do đó khuyến khích sử dụng “prodigiosin” để chỉ tất

cả Được phân lập là đặt tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902) Prodigiosin nhạycảm với ánh sáng và không tan được trong nước Prodigiosin có thể tan tương đốitrong alcohol và ether Bên cạnh đó, nó dễ tan trong chloroform, methanol,acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafar và cộng sự, 2006) Hầuhết các sắc tố này hấp thụ ánh sáng ở một số bước sóng nhất định và sự biểu hiệnsắc tố có thể dễ dàng theo dõi bằng quang phổ

Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973)

Trọng lƣợng

công thức

e

1.3.3 Hoạt tính sinh học của prodigiosin

Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trưởng của một số loài vi khuẩn(Khanafari và cộng sự, 2006) Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khảnăng thấm qua màng ngoài tế bào và khả năng tổng hợp các enzyme như DNAgyrase, topoisomerase IV,… dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trưởng của tế bào vikhuẩn (Ramina và Samira,2009)

Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể

kháng một số loài vi khuẩn như: Staphylococcus aureus, Staphylococcus

saprophyticus, Bacillus subtilus, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsielpneumoniae, Bacillus cereus (Ramina và Samira, 2009; Chandni

và cộng sự, 2012)

Theo nghiên cứu của Chandni và cộng sự (2012) về khả năng kháng nấm của

hợp chất màu thu nhận từ chủng vi khuẩn Serratia marcescens cho thấy hợp chất màu có khả năng kháng một số loài nấm men như: Candida albicans, Candida

parapsilosis và Cryptococcus sp Prodigiosin khi được đưa vào cơ thể sâu sẽ thấm

vào tế bào và ức chế quá trình phát triển của tế bào, từ đó, dẫn đến sự từ vong của

sâu Spodoptera litura (Nguyễn Hiếu Dân, 2013) Ngoài ra, hoạt chất prodigiosin còn

có khả năng chống ung thư (Pandey và cộng sự 2009; Pérez – Tomás và Vi as, 2010)

và ức chế miễn dịch (Pandey và cộng sự 2007)

1.3.4 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens

Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon lớn Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp ATCC 39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens ATCC 274 (Sma 274)

đã được báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001) Nhiều chủng Serratia marcescens sản

xuất sắc tố thông qua con đường ngưng tụ enzyme 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP)

và enzyme 4-methoxy-2, 2'-bipyrrole-5- carboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất

tripyrrole, đƣợc gọi là 2-methyl-3-amyl-6- methoxyprodigiosene hoặc prodigiosin(Williams và Qadri, 1980) Dauenhauer và cộng sự (1984) đã phân lập đƣợc một

chủng Serratia marcescens có khả năng tạo MAP và MBC, để hình thành

prodigiosin Tuy nhiên, không có tài liệu nào về trình tự của dòng tế bào này đƣợcbáo cáo

Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp ATCC 39.006 đƣợc biểu hiện trong Erwinia carotovora sub sp carotovora (ECC; 25 chủng trong số 36 chủng thử nghiệm) Trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin đƣợc quy định bởi

nhiều yếu tố, bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR,SmaI và SmaR (Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003) Điều thú vị làviệc sản xuất prodigiosin tạo thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine lacton(OHHL) tùy thuộc vào sự biểu hiện trong ECC, mặc dù sau này, việc sản xuất một

phân tử tín hiệu khác đã đƣợc thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng sự,

2000)

Nhóm sắc tố Serratia đƣợc quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia và

Streptomyces coelicolor và đƣợc bố trí từ pigA đến pigN, trong đó có năm gene

tổng hợp MBC (màu đỏ) và bốm gene tổng hợp MAP (màu xanh), đƣợc mô tả ởhình 2.18

Hình 1.4 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia

marcescens ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm

màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001).

Bốn gene còn lại không có vai trò tổng hợp.Tuy nhiên, có một protein còn lại(PigL) tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức hợp Thứ

tự gene của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và 14 protein thể hiện kích

thước và trình tự amino acid khác nhau giữa các loài (Cerdeno et al, 2001)

Các cụm gene giữa Streptomyces coelicolor và Serratia có những vị trí

tương đồng Gene quy định của các cụm màu đỏ được hiển thị trong màu đen, chịutrách nhiệm tổng hợp phân nửa bipyrrole là màu đỏ và chịu trách nhiệm tổng hợpphân nửa monopyrrole là màu xanh lam Các gene không có chức năng tổng hợpđược thể hiện qua màu trắng và những gene không nằm trong cụm gene sinh tổnghợp được thể hiện qua màu xám Các mũi tên đen chỉ đơn vị phiên mã của các cụmmàu đỏ

Cụm màu đỏ (gồm 23 gene) lớn hơn cụm pig (14 – 15 gene), có thể phản ánh

sự phức tạp hơn về các sản phẩm undercylprodigiosin được tổng hợp bởi

Streptomyces coelicolor (Harris và cộng sự, 2004).

Tuy nhiên, prodigiosin có thể tổng hợp trong sự tái tổ hợp giữa Escherichia

coli và Erwinia, điều này đòi hỏi hoạt động chức năng tương ứng của Escherichia coli và enzyme Erwinia để bổ sung cho các hoạt động của enzyme được mã hóa bởi

các nhóm sắc tố (Harris và cộng sự, 2004)

Hình 1.5 Con đường được đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin.

1.4 Enzyme

Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme như protease, chitinase,

DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase,

Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải

có chứa chitin trong quá trình sản xuất sản thủy sản đóng gói, cũng như kiểm soátsinh học đối với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nước,… (Joshi và cộng sự,

1989) Một nghiên cứu đã cho thấy Serratia marcescens sản xuất ít nhất ba enzyme

chitinase (ChiA, ChiB, ChiC), một chitobiase và một protein chitin-binding(CBP21) (Fuchs và cộng sự, 1986; Jones và cộng sự, 1986; Sundheim và cộng sự,1988; Harpster và Dunsmuir, 1989; Bruberg và cộng sự, 1996; Tews và cộng sự,1996;Watanabe và cộng sự, 1997; Gal và cộng sự, 1998, Suzuki và cộng sự, 1998),chúng có khối lượng phân tử lần lượt là 57, 52, 48, 36, và 21 kDa, cùng với cáchoạt động phân giải chitin (Fuchs và cộng sự, 1986)

1.5 Yếu tố độc lực của Serratia marcescens

Yếu tố độc lực là các yếu tố đóng vai trò thúc đẩy khả năng gây bệnh của cáctác nhân gây bệnh bằng cách cho phép các tác nhân gây bệnh nhập vào vật chủ,tránh sự tự bảo vệ của vật chủ và sinh trưởng phát triển, gây ảnh hưởng đến vậtchủ, mà phổ biến là chính bản thân tác nhân gây bệnh hay các sản phẩm của chúng(Weiss và Hewlett, 1986)

Một số yếu tố độc lực của Serratia marcescens đã được nghiên cứu, bao gồm

sự bám dính, tính kị nước, mannose - resistant, mannose - sensitive,LipoPolySaccharide (LPS) Trong đó, yếu tố quan trọng đầu tiên trong quá trìnhtương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính

Các yếu tố bám dính của vi sinh vật có bản chất là polypeptide hoặc

polysaccharide Serratia marcescens thuộc loại vi khuẩn Gram âm, có khuẩn mao

nên yếu tố bám dínhla Polypeptide

Bên cạnh đó, LPS hay còn được gọi là Lipoglycan Saccharide, là các phân tửlớn lưỡng tính nằm trong lớp màng ngoài tế bào vi khuẩn, bao gồm lipid và

polysaccharide liên kết với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị LPS được coi như nộiđộc tố, bảo vệ màng tế bào khỏi các tác động từ bên ngoài Cấu tạo của LPS gồm 3phần: O – antigen, lõi oligosaccharide và lipid A Mà lipid A chính là thành phầngây độc của phân tử LPS, gây bên sự giải phóng hàng loạt các cytokine gây viêm.

Ngoài ra, các enzyme khác của Serratia marcescens tạo ra cũng được xem

như một yếu tố độc lực, chẳng hạn enzyme lipase, chitinase, chloroperoxidase và cảprotein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997)

Theo Kenichi Ishii và cộng sự (2014), Serralysin metalloprotease góp phần

vào cơ chế gây bệnh của S.marcescens đối với côn trùng bằng cách ức chế quá trình

làm lành vết thương, dẫn đến tổn thất lớn huyết tương từ ấu trùng tằm Silkwormlarvae

1.6 Khả năng diệt sâu của vi khuẩn Serratia marcescens

Serratia marcescens đã được khảo sát về sự tăng trưởng và khả năng gây

bệnh của nó trong các ấu trùng sâu bướm sáp (Galleria mellonella) Tất cả các

chủng gây bệnh cho ấu trùng của G Mellonella dẫn đến tử vong trong vòng 48 giờ

Chủng S.marcescens đã được chứng minh có một gen mã hóa protein

metalloprotease serrlaiysin được xác định vai trò góp phần vào quá trình gây chết

côn trùng (J.T Tambong; Xu, R; Sadiku, 2014).

Serratia marcesccens được biết đến với khả năng tiết nhiều enzyme ngoại

bào như chitinase, lecthinase, hemolysin, lipase, protease, nuclease Mặc dùS.marcescens có thể sản xuất nhiều loại enzyme protease khác nhau, trong đó có

metalloprotease kẽm, serralysin Meada và cộng sự năm 199 báo cáo ràng serralysin

đóng một vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của sinh vật này Nghiên cứu đãchứng minh serralysin nhanh chóng làm suy giảm một loạt cấu trúc protein và huyếtthanh Theo đó, protease vi khuẩn như serralysin đóng một vai trò quan trọng nhưmột yếu tố độc lực (Yutaka Kida và cộng sự, 2007) Theo K Ishii et al (J InvertebrPathol 117, 61-67 2014), Serralysin metalloprotease góp phần vào cơ chế

gây bệnh của S.marcescens đối với côn trùng bằng cách ức chế quá trình làm lành

vết thương, dẫn đến tổn thất lớn huyết tương từ ấu trùng tằm (silkworm larvae)

Hình 1.6 Cơ chế gây bệnh của enzyme serralysin metallprotease của S

marcescens đối với ấu trùng tằm (K Ishi et al; 2014)

Serratia marcescens còn được biết đến với khả năng lây nhiễm cho trứng, ấu

trùng, nhộng và sâu trưởng thành của loài heliothines-thuộc chi bướm đêm gây hạicho nông nghiệp (Sikorowski và Lawrence, 2009) Ấu trùng lớn tuổi bị nhiễm vikhuẩn thường bộc lộ phản ứng là giảm các kích thích bên ngoài, và cái chết xảy ramột hoặc hai ngày sau đó Vi khuẩn sau khi xâm nhập vào trong đường máu của vikhuẩn và gây ra nhiễm trùng huyết và gây tử vong Theo kết quả nghiên cứu củaEstrada và cộng sự năm 2012 thì ấu trùng bị nhiễm trở thành màu đỏ sau khi chết,

và tỉ lệ sống sót của những ấu trùng bị nhiễm là rất ít Một số ấu trùng bị nhiễmtrong giai đoạn cuối của ấu trùng thì sau khi hóa nhộng nó cũng sẽ bị chết do nhiễm

khuẩn và khi chết nó cũng xuất huyết có màu đỏ của S marcescens Đến giai đoạn

sâu trưởng thành, nó có thể được lây nhiễm bằng cách cho ăn thực phẩm bị ô

nhiễm, các vi khuẩn sẽ xâm nhập vào các mô của côn trùng và gây chết Serratia

marcescens có khả năng lây nhiễm và loại bỏ cao đối với bộ H Zea và H virescens Serratia marcescens còn có thể kết hợp với một số loại tuyến trùng hay giun tròn để

gây bệnh cho côn trùng ví dụ như: O Carolinensis kết hợp với Serratia marcescens

gây bệnh côn trùng trên lớp biểu bì bên ngoài của nó Ngoài ra cũng có thể tạo được

mối quan hệ nhân tạo giữa vi khuẩn và các tuyến trùng, bằng cách trộn chung tuyếntrùng với vi khuẩn và nuôi chúng trong một khoảng thời gian Cũng trong nghiên

cứu của Estrada và cộng sự, năm 2012 thì khi Steinernema carpocapsae kết hợp với

S marcescens mang đến hiệu quả diệt 100% ấu trùng Galleria mellonella chỉ sau 48

giờ Mặc dù vậy sự tồn tại của S.marcescens cũng không ảnh hưởng đến vi khuẩn cộng sinh X Nematophila.

1.7 Một số nghiên cứu trên thế giới

1.7.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens

Brigida và cộng sự (2006), đã tiến hành nghiên cứu về sự đối kháng của

S.marcescens với Phytophthora paeasitica, cũng như ảnh hưởng của S marcescens

lên thúc đẩy tăng trưởng của cây thuộc chi cam chanh

Jaiganesh và cộng sự (2007), đã thực hiện thử nghiệm kiểm soát nấm

Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn trên cây lúa bằng cách sử dụng S.marcescens.

Maria và cộng sự (2012), đã tiến hành thử nghiệm về quá trình lây nhiễm S.

marcescens cùng tuyến trùng Steinernema cerpocapsae vào ấu trùng Galleria mellonella và đạt được kết quả gây chết 100% ấu trùng.

Các nghiên cứu trước đã chứng minh prodigiosin từ Serratia marcescens

(phân lập từ tuyến trùng EPN) có hiệu lực diệt sâu khá mạnh Khi cho ăn theophương pháp nhỏ giọt trên bề mặt lá khi cho ăn ở nồng độ 27,66 ng/cm2 gây chết90% sâu khoang sau 120 giờ (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2014) Prodigiosin trong

dịch nuôi cấy Serratia marcescens đã qua xử lý diệt tế bào sau khi phối hợp với các

chất phụ gia với tỷ lệ 0,2%, CMC, 0,2% rỉ đường và 0,04% Tween 80 để tạo chế

phẩm Chế phẩm diệt sâu tơ Plustella xylostella tốt nhất ở nồng độ pha loãng 104

(OD 499 = 0,924) có nồng độ Prodigiosin 14,9 ng/cm2 Sau 96 giờ, tỷ lệ sâu chết đãđạt 100% theo phương pháp nhỏ giọt trên bề mặt lá tương đương với thuốc trừ sâusinh học Reasgant 3.6EC (Trương Hoài Nguyên, 2017)

Để phát triển một chế phẩm diệt sâu cần đơn giản hóa tối đa các quá trìnhDownstream Processing đối với dịch nuôi cấy lên men vi khuẩn Vì vậy, ngoài việc

sử dụng phương pháp xử lý acid để tiêu diệt tế bào có ưu điểm là giữ lại phần lớncác hoạt tính từ dịch nuôi cấy vi khuẩn và không làm ảnh hưởng đến Prodigiosintrong dịch nuôi cấy vi khuẩn (Trương Hoài Nguyên, 2017) nhưng khi áp dụng trên

chủng Serratia marcescens HB người thực hiện đề tài nhận thấy tế bào vẫn còn khả

năng sống sót Do vậy việc tìm ra phương pháp xử lý mới có thể khắc phục đượcnhược điểm của phương pháp này nhưng vẫn không làm ảnh hưởng đếnProdigiosin sau quá trình xử lý cũng là mục đích mà đề tài hướng tới

1.7.2 Tình hình nghiên cứu Prodigiosin

Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ưu hóa sản xuất

prodigiosin bởi S marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của

prodigiosin Kết quả cho thấy prodigiosin thu nhận được có tác dụng ức chế tốt ở cả

vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm

Chandni và cộng sự (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có khả năng

kháng khuẩn như Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh như

Candida albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp

Nghiên cứu của San và cộng sự (2012) cho thấy prodigiosin có khả năng diệtcôn trùng Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu

nhận từ chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn như Alteromonas sp và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng

6,75 g/ml và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 g/ml Bên cạnh đó,Ananda và cộng sự cũng đã sử dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên

Artemia cho thấy LD 50 khoảng 50 g/ml.

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

2.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị

2.2.1 Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens

Giống vi khuẩn Serratia mascescens SH1, SH4, SH5, SB, HB được phân lập từ đồ

án tốt nghiệp của Nguyễn Hoàng Anh Kha (2014) và Lê Quốc Vũ (2015), lưu trữtại phòng thí nghiệm Vi sinh trường Đại học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh(HUTECH)

2.2.2 Nguồn nấm

Nấm Trichoderma sp, Paecilomyces lilacinus do TS Nguyễn Thị Hai, Đại

học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp

2.2.3 Nguồn sâu khoang Spodoptera litura

Trứng sâu khoang Spodoptera litura được cung cấp tại phòng thí nghiệm Vi

sinh trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

2.2.4 Môi trường nuôi cấy và hóa chất

a Môi trường (Thành phần môi trường xem phụ lục A)

Môi trường Peptone Glycerone Agar

(PGA) Môi trường Peptone Glycerone

Broth (PG) Môi trường Lipid

Đũa thủy tinh

Bao hấp, giấy gói, thun

Đèn cồn, que cấy thẳng, que cấy vòng

Bông không thấm, bông thấm

Chai syrum 100ml

2.3 Mục tiêu nghiên cứu

Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia

marcescens HB

2.4 Nội dung nghiên cứu

Chọn chủng vi khuẩn Serratia marcescens có khả năng tổng hợp prodigiosin nồng

độ cao và hoạt lực enzyme ngoại bào mạnh

Xác định phương pháp xử lý diệt tế bào vi khuẩn sau khi lên men

Khảo sát hoạt lực diệt sâu khoang Spodoptera litura của chế phẩm khi phối trộn tỷ

lệ phụ gia khác nhau trong điều kiện phơi nắng và không phơi nắng 5 ngày

Khảo sát khả năng kháng nấm có lợi Trichoderma sp., Paecilomyces lilacinus.

2.5 Phương pháp thí nghiệm

2.5.1 Phương pháp luận

Khảo sát chọn chủng Serratia marcescens phù hợp từ bộ sưu tập được phân lập từ tuyến trùng EPN Heterorhabditis indica CP-16 Các nghiên cứu trước được thực hiện trên các chủng Serratia marcescens SH1 (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013)

và Serratia marcescens SH4 (Trương Hoài Nguyên, 2017) Nhưng ở nghiên cứu

này, người nghiên cứu tiến hành khảo sát trên chủng Serratia marcescens HB được

phân lập bởi Lê Quốc Vũ (2015)

Dựa trên các kết quả nghiên cứu trước đó, để hoàn thiện quy trình sản xuất

chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens bao gôm các nội

dung sau:

Từ bộ sưu tập các chủng Serratia marcescens được phân lập từ tuyến trùng

EPN Heterorhabditis indica CP 16 tiến hành chọn lọc chủng thể hiện khả năng sinh

tổng hợp prodigiosin cao nhất và ổn định nhất

Xác định phương pháp và chế độ xử lý tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia

marcescens sống hiệu quả không ảnh hưởng đến nồng độ prodigiosin và hoạt tính

enzyme là hai yếu tố độc học đối với sâu

Thiết lập công thức phụ gia thích hợp để tăng hiệu lực diệt sâu, từ đó đề nghịquy trình sản xuất chế phẩm

Để chứng tỏ tính an toàn của chế phẩm, đề tài có sự đánh giá ảnh hưởng củachế phẩm lên một số tác nhân bảo vệ thực vật nguồn gốc sinh học như nấm

Trichoderma sp và Paecilomyces lilacinus.

Bảng 1.3 Tóm tắt những nghiên cứu liên quan đến chế phẩm diệt sâu từ các

chủng Serratia marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN Heterorhabditis CP 16 đã

thực hiện

2011 Đinh Thị Minh Châu SH1 Chứng minh prodigiosin diệt sâu xanh da

láng (Spodoptera exigua)

2013 Nguyễn Hoàng Anh Kha SH1 Chứng minh prodigiosin gây chết 90%

sâu khoang (Spodoptera litura) sau 120

giờ ở nồng độ 27,66 ng/cm2

2015 Lê Quốc Vũ HB, SB Chứng minh hai chủng SB và HB có

hiệu lực diệt sâu xanh da láng

(Spodoptera exigua) rất mạnh.

2016 Lê Thị Ngọc Dung SH1 Sản xuất chế phẩm diệt sâu khoang từ

dịch nuôi cấy chủng SH1

2017 Trương Hoài Nguyên SH4 Sản xuất chế phẩm diệt sâu tơ (Plutella

xylostella) từ dịch nuôi cấy chủng SH4.

Từ những nghiên cứu trên, người thực hiện đề tài nhận thấy:

Các chủng Serratia marcescens đã khảo sát trên thực tế có sự biến động về nồng độ

prodigiosin sau thời gian giữ giống

Nhu cầu tuyển chọn chủng có khả năng tổng hợp hoạt chất diệt sâu nồng độ cao và

ổn định hơn

Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu trên chủng đó

Trích ly lỏng - rắn Trích ly lỏng - lỏng

EtOH:HCl (95:5, [v:v])

Hình 2.1 Quy trình chọn lọc chủng vi sinh vật