Tối ưu hóa quá trình thủy phân tạo đường glucose từ rong vaucheria spp

Mặc dù rong có tiềm năng rất lớn đểnuôi kết hợp tôm ở các vùng nước lợ, tuy nhiên, hiện nay, chưa có công trìnhnghiên cứu sâu nào để đánh giá hết vai trò của rong đối với môi trường ao n

NGHỆ SINH HỌC

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN

TẠO ĐƯỜNG GLUCOSE TỪ RONG VAUCHERIA SPP

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD : CN ĐỖ THỊ TUYẾN SVTH : PHAN CẨM BÌNH MSSV : 0851110016 - LỚP: 08DSH3

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài:

Việt Nam có đường bờ biển dài 3.260 km và vùng đặc quyền kinh tế rộng

kinh tế khai khác từ rong, tảo mang lại lơi nhuận khá lớn của ngành kinh tế biển.Tảo được ứng dụng rộng rãi và rất nhiều trên thế giới trên quy mô công nghiệp vớinhiều sản phẩm được chiết xuất từ tảo phục vụ trong nhiều lĩnh vực như : trong yhọc, công nghệ mỹ phẩm, công nghiệp thực phẩm, năng lượng xanh Hiện nay

nước ta có khoảng 700 loài rong tảo thuộc 3 ngành Chlorophyta, Heterkontophyta,

Rhodophyta Nhiều loài mang lại giá trị kinh tế cao, có khoảng 121 loài đang được

khai thác phục vụ nhu cầu con người

Với lợi thế về khí hậu nóng ẩm, và diện tích nước mặt nhiều nên rong tảo tạiViệt Nam phát triển khá cao Trong những năm gần đây, nguồn lợi từ rong tảo manglại cho nước ta khá lớn Nên như cầu khai thác cũng như tìm tòi, nghiên cứu những

loài mới có ý nghĩa hết sức quan trọng Tảo lục (Chlorphyta) là ngành lớn và rất đa

dạng, phân biệt với các ngành tảo khác ở chỗ luôn có màu lục giống như ở thực vật.Đến nay trên toàn thế giới biết khoảng 500 chi và 8000 loài Phần lớn chúng sốngtrong nước ngọt gần 90%, còn lại ở biển và đại dương hơn 10% Trong các biển vàđại dương thế giới đã biết 984 loài thuộc 112 chi , 18 họ và 8 bộ Hiện nay có một

số loại rong thuộc ngành rong lục Chlorophyta như Vaucheria Spp là một loài mới

đang trong quá trình nghiên cứu của nhiều nhà khoa học, thuộc ngành tảo vàng lục

có phân bố nhiều ở những vùng nước ngọt nghèo chất dinh dưỡng phát triển tựnhiên khá nhiều ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long đã được khai thác và nuôi trồngrộng rãi Một số loại rong cũng được nghiên cứu nuôi trồng kết hợp với thủy sảnnhằm cải thiện môi trường nước và tăng năng suất tôm nuôi Lợi ích mà nó mang lạikhá lớn, không chỉ phục vụ như cầu sản xuất thực phẩm, y học, ngành công nghệ

mỹ phẩm, chăn nuôi…mà còn là nguồn nhiên liệu mới trong ngành công nghệ nănglượng, sản xuất xăng sinh học Tuy nhiên, khả năng sử dụng tất cả các loài rong nóitrên hay một trong số chúng làm nguyên liệu đầu vào để sản xuất

nhiên liệu sinh học lại phụ thuộc rất nhiều vào thành phần hóa sinh và khả năngđường hóa.

Hiện nay, các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu về tiềm năng của việc sảnxuất sinh nhiên liệu sinh học từ tảo và đã thu được nhiều kết quả khả quan từ nguồnnguyên liệu này Và việc xác định các thành phần hóa sinh của rong tảo cũng nhưtối ưu hóa quá trình thủy phân tạo đường Glucose từ rong Vaucheria Spp đóng vaitrò quan trọng trong bước khởi đầu của việc tìm ra nguồn nguyên liệu phù hợp sảnxuất xăng sinh học từ tảo

Đề tài “Tối ưu hóa quá trình thủy phân tạo đường Glucose từ rong

Vaucheria spp.” là nhu cầu cấp thiết giải quyết vấn đề trên.

2 Tình hình nghiên cứu:

Tình hình nghiên cứu rong biển trên thế giới:

Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu thực hiện theo nhiều khiá cạnh đadạng sinh học, nguồn lợi, chế biến, nuôi trồng và tạo giống rong biển Rong biển đãđược nghiên cứu sử dụng trong thực phẩm, công nghiệp và dược phẩm ở nhiềunước trên thế giới Các thành phần chiết xuất từ rong có giá trị sinh học như β-caroten, các chất chống oxy hóa cũng đang được nhiều nhà khoa học quan tâm.Rong biển rất giàu protein và khoáng chất, có thể tận dụng sử dựng thực phẩm vàthức ăn gia súc ( Akiko Isa et al., 2009)

Một số nghiên cứu đề cập tới ảnh hưởng của các điều kiện nuôi tới thànhphần hóa sinh của rong Hàm lượng protein trong rong biển khá cao và chịu ảnhhưởng bởi các điều kiện nuôi như ánh sáng và dưỡng chất ( Evan &Langdon 2000;Rosen et al 2000)

Một số tác giả cũng đã tìm hiểu về cấu tạo thành phần các polysaccharide của

tế bào rong Ulva spp, Enteromorpha sp (Kausik Chattopadhyay, 2006; Bimalendu

Ray, 2006) Kết quả cho thấy các thành phần carbonhydrat có thể chiếm tới 29%tổng lượng chất khô của rong Polysacchride thành tế bào của rong thường chứa cácthành phần cellulose và hemicellulose có cấu trúc phân nhánh khá phức tạp với cácđường monosaccharide như rhamnose, xylose, glucose, galactose,

chiếm tỉ lệ chính và một lượng nhỏ hơn protein và sulphate Khác với tảo đỏ haytảo nâu, các loài tảo lục thường không chứa thành phần polysaccharide có tính nhầynhưa agar và alginic acid (Akiki Asa at el., 2009) Hàm lượng lignin cũng rất thấptrong tế bào Những đặc tính về hóa lý, tính chất lưu biến và sinh học đặc biệt củacác thành phần carbonhydrat thành tế bào rong biển đã và đang mở ra nhiều cơ hội

sử dụng chúng trong tương lai

Tình hình nghiên cứu rong biển trong nước:

Ở Việt Nam các nghiên cứu nuôi trồng rong cũng được thực hiện khá nhiều

nhưng chủ yếu ở các giống rong câu Gracilariace và rong sụn Kappaphycus.Một số loài rong như G Bailinae cũng đã được nuôi trồng thử nghiệm ở miền Trung Việt

Nam năng suất có thể đạt 8-10 tấn khô/ha trong thời gian nuôi 6 tháng (HuỳnhQuang Năng & Nguyễn Hữu Dinh, 1999)

Một số nghiên cứu nuôi trồng kết hợp rong với các loài thủy sảnh khác cũng

đã được thực hiện Nguyễn Hữu Khánh và cộng sự (2005) đã thử nghiệm nuôi trồngkết hợp tôm hùm với bào ngư , rong sụn và vẹm xanh Huỳnh Quang Năng (2005)

Đã xây dựng mô hình trồng rong sụn Kappaphycus alvarezii luân canh trong ao đìa

nuôi tôm ven biển Kết quả thu được rất là khả thi trong việc khai thác tiềm năngnước mặt

Một số tác giả cũng đã nghiên cứu về tác động môi trường, khả năng xử lý ônhiễm và sinh trưởng của rong trong những điều kiện khác nhau Ngô Quốc Bưu vàcộng sự (2000) đã nghiên cứu về sử dụng rong biển để xử lý nhiễm bẩn hữu cơ

trong nước thải ao nuôi tôm Kết quả cho thấy 2 loài nghiên cứu là Gracilacia

hecteroclada và rong sụn Kappaphycus alvarezii đều thể hiện khả năng hấp thụ nitơ

và phosphor trong nước thải

Đối với rong bún (Enteromorpha or Ulva) và rong Tóc Đốt Chaetomorpha

những nghiên cứu đầu tiên về sinh hóa và tiềm năng ứng dựng của chúng được thựchiện bởi nhóm nghiên cứu của Viện Sinh học nhiêt đới trong khuôn khổ dự ánFSPSII/SUDA 3.3.4 năm 2009 (do DANIDA tài trợ) Các loài rong này lọc tự nhiêntrong các ao nuôi tôm ở Đồng bằng sông Cửu Long Kết quả khảo sát sơ bộ cho

thấy, người nuôi tôm rất thích sự hiện diện của các loại rong này so với các loạirong khác và cho rằng sự xuất hiện của chúng đã cải thiện môi trường ao nuôi, làmthức ăn cho tôm và cải thiên năng suất tôm Mặc dù rong có tiềm năng rất lớn đểnuôi kết hợp tôm ở các vùng nước lợ, tuy nhiên, hiện nay, chưa có công trìnhnghiên cứu sâu nào để đánh giá hết vai trò của rong đối với môi trường ao nuôi, sứckhỏe tăng trưởng của tôm.

Tình hình nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học từ rong biển:

Rong biển được coi là một trong những ứng viên tốt nhất cho con ngườitrong việc tận dụng tài nguyên mặt nước và là đối tượng phù hợp để chuyển đổi cơcấu nông nghiệp – thủy sản trong bối cảnh biến đổi khí hậu ở các vùng ven bờ vàcác vùng đất ngập mặn Thực vật thủy sinh chưa bao giờ được xem xét một cáchnghiêm túc làm nguồn cung cấp nhiên liệu sinh học cho mãi tới thời gian gần đây.Nhiều dự án khác nhau bắt đầu được thực hiện trong ba năm trời lại đây, là kết quảcủa yêu cầu giảm phụ thuộc vào lượng nước ngọt cho trồng trọt và chuyển hoá thựcvật trên cạn

Nhật Bản là nước đi đầu trong nghiên cứu sử dụng rong lục (green algae) làmnguyên liệu đầu vào để sản xuất nhiên liệu sinh học Akiko Isa (2009) đã xác định

thành phần Carbonhydrate của một số loài rong Enteromorpha sp., Cheatomorpha sp., Cladophora sp., Ulva sp Mọc tự nhiên ở Thái Lan, Việt Nam và Nhật Kết quả

cho thấy rong ở Việt Nam chứa hàm lượng glucose cao nhất (300mg/g sinh khối) và

sử dụng cellulase có thể chuyển 95% carbonhydrate thành đường

Mặc dù rong biển đã bắt đầu được nghiên cứu sử dụng làm nguyên liệu đầuvào cho quá trình sản xuất nhiên liệu sinh học tại nhiều nước trên thế giới nhưnghiện nay ở Việt Nam mới chỉ có đề tài của TS Nguyễn Như Hậu – NITRA“Nghiêncứu đánh giá tiềm năng rong biển Việt Nam sử dụng làm nguyên liệu sản xuấtethanol nhiên liệu (Biofuel) đang được triển khai trong ba năm từ 2009 -2011, trongkhuôn khổ đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015 và tầm nhìn đến năm

2025 (Bộ Công Thương)

Ở Việt Nam, nhìn chung đã có nhiều công trình nghiên cứu về rong biển vànuôi trồng rong biển, tuy nhiên chưa có công trình nào về phát triển sinh khối rongbiển tại vùng nuôi tôm trọng điểm ở ĐBSCL và dùng nguồn sinh khối này làmnguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học và các sản phẩm có giá trị khác Việcchuyển hóa nguồn carbohydrat thành đường có thể lên men và sau đó thành ethanol

và butanol là một cách tiếp cận mới mẻ và có triển vọng

3 Mục đích nghiên cứu:

Tìm ra nguồn vật liệu khởi đầu thích hợp cho việc nghiên cứu chuyển hóanguồn carbohydrat thành đường có thể lên men và sau đó thành ethanol và butanol

từ rong biển thông qua hàm lượng đường khử sau quá trình thủy phân tạo glucose

Giải quyết vấn đề năng lượng mới

4 Nhiệm vụ nghiên cứu:

Xác định thành phần hóa sinh của rong Vaucheria spp

Xác định các thông số thích hợp cho quá trình tiền xử lý mẫu rong trước khi tiến hành thủy phân tạo đường

Xác định các yếu tố ảnh hưởng quá trình thủy phân tạo đường glucose từ

rong Vaucheria spp.

Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân

5 Phương pháp nghiên cứu:

Các thành phần hóa sinh của rong được xác định theo phương pháp LAPS( Standard compositional laboratory analytical procedure ) được mô tả bởi Dien et

al 2010 Theo đó thì Protein dược xác định bằng phương pháp Kjeldahl, Lipid đượcxác định bằng phương pháp Soxhlet; Các chỉ tiêu Carbohydrat tổng, đường tổng,tinh bột, chất xơ , hàm lượng tro và ẩm dược xác định theo phương pháp của FAO

và AOAC

Xác định các yếu tố thích hợp cho quá trình thủy phân tạo đường glucose từ

chất, nồng độ enzyme, pH, thời gian, nhiệt độ trong quá trình ủ mẫu

Định lượng hàm lượng glucose sau quá trình ủ mẫu được xác định theophương pháp của Miller dựa trên việc đo mật độ quang của phức màu đỏ sậm đặctrưng được tạo ra giữa đường khử với thuốc thử DNS ở bước sóng 540nm.

Định lượng hàm lượng HMF của mẫu sau khi ủ bằng phương pháp so màuquang phổ kế

Định lượng độ brix của mẫu bằng thiết bị khúc xạ kế

Các quá trình tối ưu hóa được tiến hành theo quy hoạch thực nghiệm bậc 2.Các thí nghiệm được lặp lại 2- 3 lần để đảm bảo độ tin cậy

Kết quả được tính toán, xử lý trên phần mềm excel 2007 và Statgraphics

6 Dự kiến kết quả đạt được của đề tài

Kết quả cho được các số liệu cụ thể về các chỉ tiêu sinh hóa của rong

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát chung về rong, tảo:

Rong tảo là những sinh vật có nhân thật, trong tế bào luôn có chất diệp lụcnên chủ yếu sống tự dưỡng Một số ít cộng sinh với Nấm thành Địa y Rong tảosống chủ yếu trong nước, một số ít sống trên đất ẩm hoặc trên vỏ cây Từ thời Linné(1753), Tảo được coi như một nhóm tập hợp tất cả các “Thực vật bậc thấp” có diệplục Phần lớn các hệ thống phân loại công nhận quan điểm này Theo quan điểmnày, Tảo lam cũng nằm trong nhóm Tảo Tuy nhiên, khi xét các đặc điểm về tế bàohọc và đặc biệt là sự có mặt của nhân thật dấu hiệu cơ bản nhất của sự tiến hóa, tảolam vì chưa có nhân thật đã được tách khỏi nhóm tảo Theo hệ thống sinh giới gồm

4 giới: nhóm tảo được xếp vào giới thực vật làm thành phân giới thực vật bậc thấp(theo P Raven & G Johnson (1989)) sự phân chia sinh giới nhất là nhóm có nhânchuẩn thành các giới đôi khi tùy tiện Không có một hệ thống phân loại nào đượctoàn thế giới chấp nhận Ngày nay, một số các nhà sinh học chấp nhận hệ thống sinhgiới gồm 5 giới Theo hệ thống này thì tảo được tách khỏi giới thực vật và được xếpvào giới Nguyên sinh (Protista)

1.1.1 Tổ chức cơ thể

Tảo có cấu trúc rất đa dạng: đơn bào, tập đoàn hay đa bào Mặc dù về cấutạo, hình dạng, kích thước và màu sắc của tảo rất khác nhau nhưng các tảo cũng có

1 số điểm chung nhau như:

Tảo có cơ thể dạng tản chưa phân hóa thành thân, rễ, lá gọi là tản thực vật(Thallophyta) và cũng chưa có các loại mô điển hình trong cấu trúc của tản

Tảo có một vài hình thức sinh sản cũng như môi trường phân bố gần giốngnhau nên người ta thường gộp chúng thành một nhóm có ý nghĩa sinh học

1.1.2 Cấu tạo tế bào

Vách tế bào bằng cellulose và pectin Một vài ngành tảo: Tảo silic, tảo vàngánh: vách thấm thêm silic, hoặc tảo vòng, tảo đỏ: vách có thêm canxi cacbonat

Mỗi tế bào có 1 nhân, đôi khi nhiều nhân (ở tảo thông tâm) Trong chấtnguyên sinh có những bản chứa chất màu (diệp lục và các chất màu phụ khác) gọi là

thể màu Thể màu có hình dạng khác nhau: hình bản, sao, dải, hình mạng lưới, đĩa, hạt… và ổn định với từng chi Trong thể màu có những thể nhỏ là hạch tạo bột,

chung quanh có các hạt tinh bột lắng tụ (ở tảo lục, tảo vòng) Những chất dự trữkhác là các hydratcacbon đặc biệt (laminarin, amylodextrin…) ở trong hoặc ngoàithể màu

Nhiều dạng tảo đơn bào còn có roi, số lượng có thể là 1, 2 hoặc nhiều Cácroi này xuất phát từ đầu cùng của tế bào, có chức năng vận chuyển Roi có cấu tạogiống với roi của các sinh vật có nhân thật Một số tảo còn có một chấm đỏ ở gốcroi gọi là điểm mắt là cơ quan thụ cảm ánh sáng Một số tảo đơn bào nước ngọt cókhông bào co bóp

1.1.3 Sinh sản

Tảo cũng rất đa dạng trong sinh sản Các hình thức sinh sản: sinh sản sinhdưỡng, sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính, nhiều tảo có sự xen kẽ thế hệ

1.1.3.1 Sinh sản sinh dưỡng

Được thực hiện bằng những phần riêng rẽ của cơ thể, không chuyên hóa vềchức phận sinh sản

Ở các tảo đơn bào, sinh sản sinh dưỡng thực hiện bằng cách phân đôi tếbào

Ở các tảo tập đoàn có một số tế bào phân chia nhanh hình thành những tập

đoàn nhỏ bên trong tập đoàn mẹ (ở tảo Volvox, tảo lưới).

Ở các tảo dạng sợi thực hiện bằng cách đứt đoạn gọi là tảo đoạn hay hình

thành chồi ở Tảo vòng (Chara).

1.1.3.2.Sinh sản vô tính

Được thực hiện bằng các bào tử chuyên hóa, có roi (bào tử động) hay khôngroi (bào tử bất động), hình thành trong túi bào tử, về sau bào tử nảy mầm thành tảnmới

1.1.3.3 Sinh sản hữu tính

Được thực hiện bằng sự kết hợp của những tế bào chuyên hóa là giao tử, hìnhthành trong các túi giao tử đơn bào

Dựa vào mức độ giống hay khác nhau của các giao tử mà có 3 hình thức sinhsản hữu tính: đẳng giao, dị giao và noãn giao.

Ở một số tảo còn có quá trình sinh sản hữu tính đặc biệt theo lối tiếp hợp giữa hai tế bào sinh dưỡng và không tạo thành giao tử (ở Tảo xoắn)

Một số tảo có sự xen kẽ thế hệ trong quá trình sống Sự xen kẽ thế hệ có thể

là đẳng hình hay dị hình

1.1.4 Phân loại

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều hệ thống phân loại tảo của nhiều tác giả:

hệ thống của Pascher (1931), hệ thống của West & Fritsch (1927) và Fritsch (1935),

hệ thống của Chadefaud (1960), hệ thống của Chadefaud được Fett sửa đổi (1967)

Các hệ thống phân loại này đều dựa vào màu sắc và cấu trúc tản để phân loại.Hiện nay con số các ngành Tảo vẫn chưa thống nhất

Gần đây nhiều tác giả thường xếp nhóm tảo vào 9 ngành sau đây: Tảo giáp

(Pyrrhophyta), Tảo vàng ánh (Chrysophyta), Tảo vàng lục (Xanthophyta), Tảo mắt (Euglenophyta), Tảo silic (Bacillariophyta), Tảo lục (Chlorophyta), Tảo vòng (Charophyta), Tảo nâu (Phaeophyta) và Tảo đỏ (Rhodophyta).

1.1.5 Khái quát ngành Tảo lục (Chlorophyta)

Tảo lục là ngành lớn và rất đa dạng, phân biệt với các ngành tảo khác ở chỗluôn có màu lục giống như ở thực vật

Tổ chức cơ thể:

Đơn bào, tập đoàn hay đa bào hình sợi đơn, phân nhánh hay hình bản mỏng,

có khi có cấu tạo cộng bào (tản hình ống thông trong chứa nhiều nhân)

Cấu tạo tế bào:

Vách tế bào bằng cellulose, pectin hóa nhày, một số dạng nguyên thủy có tếbào trần

Thể màu có nhiều hình dạng khác nhau: hình bản, dải xoắn, sao, hạt… chứadiệp lục a và b, carotin, xantophin, trong đó diệp lục a và b chiếm ưu thế so với cácchất màu phụ khác nên tản luôn có màu lục

Chất dự trữ là tinh bột tập trung quanh hạch tạo bột nằm trong thể màu, đôikhi chất dự trữ là những giọt dầu.

Một số Tảo lục đơn bào hay tập đoàn có thể di động được ở trạng thái dinhdưỡng nhờ có roi, còn các tảo lục khác chỉ có bào tử hay giao tử có roi mới di độngđược

số tảo lục Sinh sản hữu tính theo kiểu tiếp hợp

Phân bố và sinh thái:

Tảo lục có khoảng 8.000 loài, phân bố rộng rãi khắp mọi nơi có ánh sáng,chủ yếu sống trong nước ngọt, một số trong nước mặn, trên đất ẩm, có khi trên thâncây hoặc bờ tường, vách đá ẩm; còn gặp những dạng kí sinh và cộng sinh

Một số đại diện thường gặp:

Tảo lục đơn bào (chi Chlamydomonas): Tế bào hình trứng với 2 roi bằng

nhau ở đầu, có điểm mắt ở gốc roi, trong chứa 1 thể màu lớn hình chén sống ở các

ao hồ

Tảo tiểu cầu (chi Chlorella): Tảo đơn bào, hình cầu nhỏ, thể màu lõm hình

chữ U chiếm gần hết khoang tế bào Tế bào chứa lượng mỡ và đạm cao nên có giátrị trong chăn nuôi Sống trong nước ngọt Hiện nay có nhiều cơ sở đang nuôi loạitảo này để sản xuất thức ăn gia súc

Tảo cầu (chi Chlorococcus): Dạng cầu, lớn hơn loài trên, thể màu hình chén.

Sống trong nước ngọt, trên vỏ cây, làm thành một lớp màu lục tươi

Tảo lưỡi liềm (chi Closterium): Tảo đơn bào, hình lưỡi liềm, nhân nằm giữa

2 thể màu hình bản, 2 đầu tế bào có 2 không bào co bóp Thường gặp ở các ao hoặcrãnh nước bẩn, có khi sống với khuẩn lam dao động trân mặt đất ẩm

Đoàn tảo (chi Volvox): Tập đoàn hình cầu, đường kính 0,52mm, gồm tới 2

vạn tế bào dàn ra ở phía ngoài, phía trong chứa chất nhầy Gặp ở các ao tù nướcngọt

Tảo mắt lưới (chi Hydrodyction): Tập đoàn hình mạng lưới, các tế bào kết

hợp với nhau thành những mắt lưới 4-6 cạnh, mỗi cạnh là một tế bào có nhiều nhân,

ở giữa có 1 không bào lớn

Tảo xoắn (chi Spirogyra): Tảo dạng sợi, gồm nhiều tế bào hình chữ nhật dài,

thể màu hình dải xoắn, trong thể màu chứa nhiều hạch tạo bột Sinh sản hữu tínhtheo lối tiếp hợp Tảo xoắn rất phổ biến ở nước ngọt, mọc thành đám ở mương rãnhhoặc ruộng lúa

Rau diếp biển (chi Ulva): Tản có dạng "lá" do 2 lớp tế bào tạo thành Tản

lớn, mép nguyên hay xẻ thành nhiều phiến Phần gốc do những tế bào sinh dưỡngmất diệp lục kéo dài tạo thành rễ giả Trong chu trình sống của tảo có xen kẽ thế hệgiống nhau (đẳng hình)

Tảo thông tâm (chi Caulerpa): Tản khá lớn, phân hóa giống như "thân", "lá",

"rễ" tuy chỉ là một ống liên tục, thường bám vào vách đá ven biển

1.1.6 Khái quát về chi tảo Vaucheria spp

Vaucheria thuộc lớp Tảo vàng lục (Xanthophyceae)

Bảng 1.1 phân loại sinh giới của chi Vaucheria spp

Tảo vàng lục khác với Tảo lục ở chỗ không có chlorophyll b và sản phẩmđồng hóa CO2 không phải là tinh bột mà là leucosin và lipid Tảo vàng lục khác vớiTảo vàng ánh và Tảo silic ở chỗ không có sắc tố Fucoxanthin và nhiều đặc điểmkhác nữa Hình thái tảo vàng lục rất đa dạng: hình monad, hình amíp, hình hạt Sống đơn độc hay thành tập đoàn Một số có dạng sợi đơn hay phân nhánh, dạngống thông suốt chứa nhiều nhân Thành tế bào cấu tạo bởi cellulose Các dạngmonad và động bào tử của các dạng khác thường có 2 lông roi không đều nhau,cũng có khi có 1 hay nhiều lông roi (xếp thành từng đôi không đều, đính ở phía cực

tế bào) Lông roi dài thường có lông và dài gấp 4-6 lần lông roi ngắn Lông roi dàihướng về phía trước còn lông roi ngắn trơn nhẵn hướng xiên so với trục dọc hay

hướng hẳn về phía sau Thành tế bào nguyên vẹn, trừ chi Tribonema thành tế bào

gồm hai mảnh Sắc lạp có từ 2 dến 6 trong mỗi tế bào, có hình khay Thành phầnsắc tố gồm có chlorophyll a, c, carotenoid, xanthophyll Tản thường có màu vànglục

Sinh sản sinh dưỡng theo cách phân đôi tế bào hay từ một phần của tập đoàn.Sinh sản vô tính bằng động bào tử Động bào tử có hai lông roi lệch nhau, có khi chỉ

có 1 lông roi Thường động bào tử được sinh ra từ nang động bào tử(zoosporangium) Có loài sinh sản vô tính bằng bào tử bất động Có loài sinh sản vôtính bằng tự thân bào tử (autospore) hay bằng bào tử màng dầy Sinh sản hữu tínhrất ít khi gặp ở Tảo vàng lục Tribonema có hai loại giao tử- bất động và di động.Botrydium có giao tử chuyển động, đẳng giao hay dị giao.

Tảo vàng lục thường gặp trong các thủy vực nước ngọt có độ dinh dưỡngtrung bình hay nghèo Chúng có đời sống phù du hay sống bám Một số loài sốngtrên đất hay trên thân cây ẩm ướt Tảo vàng lục có các chi phổ biến sau đây:

Hình 1.1 Chi tảo Vaucheria (noãn giao)

1.2 Tổng quan về enzyme

1.2.1 Khái quát chung

Enzyme theo tiếng Hi Lạp là chất trong nấm men, là một chất xúc tác sinhhọc chỉ được tạo thành trong tế bào sinh vật

Enzyme đóng một vai trò rất quan trọng trong việc tham gia xúc tác cho cácphản ứng sinh hóa của tế bào cơ thể trong điều kiện đẳng nhiệt, đẳng áp“sự sống cóthể được định nghĩa là được điều phối của các phản ứng enzyme”

Enzyme tham gia xúc tác cho các phản ứng trong hoặc ngoài tế bào, với đặcđiểm này đã được con người chúng ta ứng dụng enzyme vào cuộc sống

Mỗi enzyme có tính đặc hiệu riêng biệt với một phản ứng nhất định

Dưới tác dụng của enzyme các phản ứng sinh hóa xảy ra đạt hiệu quả cao,nhiều phản ứng xảy ra đồng thời theo dây chuyền, ít tiêu tốn năng lượng

Enzyme là protein có tính đặc hiệu cao và có hiệu quả hơn gấp nhiều lần sovới các chất xúc tác vô cơ

Enzyme là chất rất khó chế biến bằng phương pháp tổng hợp hóa học mà nóđược thu từ các nguồn vi sinh vật, thực vật, động vật vì vậy việc sử dụng chúng antoàn.

Enzyme được thu từ nhiều nguồn khác nhau nhưng chỉ có nguồn enzyme từ

vi sinh vật mới đáp ứng được nhu cầu và sản xuất trên quy mô công nghiệp

Các enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính cao, đa dạng, dễ thu nhận Đặc biệt lànguyên liệu sản xuất enzyme từ nguồn vi sinh vật đa dạng, phong phú, dễ kiếm và

rẻ tiền

Hiện nay người ta khám phá hơn 2000 enzyme trong đó hơn 200 enzyme thuđược ở dạng tinh thể Enzyme ngày nay được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnhvực như y dược, chăn nuôi, thú y, một số ngành công nghiệp đặc biệt như côngnghiệp chế biến thực phẩm như bia, rượu, nước chấm,bánh mỳ…

1.2.2 Lịch sử phát triển

Bảng 1.2 Tóm tắt lịch sử phát triển của enzyme

tẩy rửa

Fleming phát hiện ra penicilline

Boyeretal đưa ra kỹ thuật di truyền và được ứng dụng vào công

Nito xác lập quy trình cơ bản tạo acrylamide và một loạt các quá

Là giai đoạn của việc tạo ra hàng trăm loại enzyme khác nhau

thuật enzyme cố định ra đời đã đưa công nghệ enzyme lên tầmcao mới

1.2.3 Tính chất của enzyme

Bản chất sinh học

Enzyme được tạo ra bên trong tế bào và chịu sự điều khiển của gen

Phản ứng của enzyme ít hao tốn năng lượng và có khả năng tham gia phản ứng cả trong và ngoài tế bào

Enzyme có thể thu nhận dễ dàng từ các nguồn nguyên liệu khác nhau từ sinhvật, các enzyme thu nhận từ nguồn sinh vật như rau quả thông dụng không có tínhchất gây độc.

Đa số enzyme hoạt động xúc tác phản ứng trong điều kiện nhiệt độ 20 –

Mỗi enzyme tham gia xúc tác đặc hiệu với một cơ chất nhất định, vận tốcphản ứng tăng gấp nhiều lần so với chất xúc tác sinh học vì vậy enzyme cần dùngvới lượng rất nhỏ

Có thể điều chỉnh hay ngừng phản ứng bằng nhiệt độ, pH, thời gian xúctác…

1.2.4 Nguồn thu nhận enzyme

Hiện nay người ta có nhiều cách thu nhận enzyme từ các nguồn sau:

Có nhiều rủi ro và không ổn định về nguồn nguyên liệu

Chưa có nghiên cứu nào nhằm tạo ra giống động vật với mục đích thu nhậnenzyme

Nguồn enzyme từ thực vật

Trong các bộ phận của thực vật có chứa rất nhiều enzyme và có hoạt tính rấtcao Phần lớn gồm các loại sau:

Enzyme amylase: Từ đại mạch nảy mầm (malt)

Enzyme papain: Từ quả đu đủ

Enzyme bromelin: Từ cây dứa

Enzyme ficin: Từ quả sung

Nhược điểm: Tuy các loài thực vật cho enzyme có hoạt tính cao nhưng cũnggặp rất nhiều khó khăn do lệ thuộc vào điều kiện thiên nhiên và thời gian thu hoạchdài, khó đáp ứng nhu cầu sử dụng

Nguồn enzyme từ vi sinh vật

Đây là nguồn enzyme duy nhất được sử dụng để sản xuất enzyme trên quy

mô công nghiệp, nó được quan tâm nhiều để phát triển về khối lượng và số lượngenzyme

Khác với nguồn động thực vật, các loài vi sinh vật là động vật đơn bào nên

có những ưu điểm hơn hẳn như: Thời gian thu nhận enzyme tương đối ngắn, sốlượng enzyme lớn…

Hoạt tính của enzyme từ nguồn vi sinh vật cao hơn các nguồn động vật, thựcvật

Tốc độ sinh sản của vi sinh vật cao trong thời gian ngắn nên có thể thu đượclượng sinh khối sau nuôi cấy lớn Từ đó ta có thể chiết xuất ra lượng lớn enzyme

Ưu điểm lớn nhất của vi sinh vật là chúng rất nhỏ nên dễ dàng được đưa vàocác thiết bị lên men, từ đó sẽ rất dễ dàng điều khiển và kiểm soát các điều kiện nhiệt

độ, pH, nồng độ cơ chất, ánh sáng, lưu thông khí… nên ta có thể điều khiển đượctốc độ sinh tổng hợp enzyme

Nguyên liệu dùng để nuôi vi sinh vật sản xuất enzyme là nguồn nguyên liệu

rẻ tiền và dễ kiếm, thường là các phế liệu của các ngành công nghiệp

Có nhiều phương pháp để nuôi cấy và thu nhận enzyme từ vi sinh vật tùy vàođiều kiện khác nhau như: Nuôi cấy trong môi trường lỏng, nuôi trên môi trường bánrắn, nuôi trên môi trường rắn.

Hiện nay việc nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường bán rắn đang được tậptrung nghiên cứu và được đánh giá là mang lại hiệu quả cao trong việc thu nhậnenzyme

1.2.5 Giới thiệu sơ lược về enzyme cellulase

Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết β -1, glucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tương tự khác Đó là một phức

4-O-hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau và được xếp thành 3 nhóm cơ bản: endo-β-1,4-glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), exo-β-1, 4-glucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và β-glucosidase hay β-D-glucosideglucohydrolase (EC 3.2.1.21)

Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định vànhờ có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủyphân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất

Hình 1.2 Cấu trúc không gian của enzyme cellulase

Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase

Một phức hệ enzyme cellulase gồm: endo-β-1,4-glucanase, glucanase, β-glucosidase Trong đó: Endo- β-1, 4-glucanase xúc tác cho phản ứngthủy phân các liên kết ở bên trong phân tử cellulose

exo-β-1,4-Exo- β-1, 4-glucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khửcủa phân tử cellulose

β -Glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose thànhglucose

Hình 1.3 Cơ cấu chi tiết của các hoạt động beta-glucosidase của cellulase

Tính chất lý hóa của enzyme cellulase

Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạtmạnh nhất ở nhiệt độ, pH nhất định

Ảnh hưởng của nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lênkhi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúcenzyme Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độ thích

enzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độ thích hợp Hoạt

Ảnh hưởng của pH: Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào pHmôi trường phản ứng Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp đểenzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid Theo nghiên cứu trước đây cho

thấy, pH tối ưu cho hoạt động của cellulase từ Trichoderma reesei là 4,0-5,0.

Ảnh hưởng của ion kim loại: Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa

sự hoạt động của các enzyme Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể gâybiến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme

Ngoài ra, các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rửa cũng ảnh hưởng mạnh mẽđến hoạt tính của enzyme Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bảnchất của enzyme mà tính chất và mức độ ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme làkhác nhau Các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol và acetone đều ứcchế hoạt động của cellulase, đặc biệt là n-butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tínhcellulase chỉ còn 33-63% Các chất tẩy rửa tween 20, tween 80, SDS và triton X-

100 đều làm giảm hoạt tính cellulase ở mức độ khác nhau, trong đó SDS làm giảmmạnh hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34%

Ứng dụng của enzyme cellulase

Enzym cellulase được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp sản xuất cồn,trong xử lý môi trường Enzym cellulase được ứng dụng rất ít trong thực phẩm(khoảng 1%) nhưng hầu như quá trình chế biến nào liên quan đến nguồn nguyênliệu là thực vật nếu có enzym cellulase đều cho hiệu suất cao hơn Hơn nữacellulase được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp dệt, bột giặt, ngành côngnghiệp giấy, cellulase còn được sử dụng cho các ứng dụng dược phẩm

1.2.6 Giới thiệu sơ lược về enzyme Amylase

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Các enzymenày thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trongnhóm polysaccharide với sự tham gia của nước

Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose vàdextrin hạn chế Các enzyme Amylase có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin),trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn,nấm men và vi khuẩn Trong nước bọt của người có ptyalin nhưng ở một số loạiđộng vật có vú thì không có như ngựa, chó, mèo Ptyalin bắt đầu thủy phân tinhbột từ miệng và quá trình này hoàn tất ở ruột non nhờ Amylase của tuyến tụy (còn

được gọi là amylopsin) Amylase của malt thủy phân tinh bột lúa mạch thànhdisaccharide làm cơ chất cho quá trình lên men bởi nấm men.

Amylase là một trong những loại enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trongcông nghiệp, y tế, và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là trong ngành côngnghiệp thực phẩm

Enzyme α-Amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trongkhoảng 50.000 đến 60.000 Dal Có một số trường hợp đặc biệt như α-Amylase từ

loài vi khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal Đến nay

người ta đã biết rất rõ các chuỗi acid amin của 18 loại α-Amylase nhưng chỉ có 2

loại α-Amylase là taka-Amylase từ Apergillus orysee và α-Amylase của tụy lợn

được nghiên cứu kỹ về hình thể không gian cấu trúc bậc 3 Mới đây các nghiên cứu

về tính đồng nhất của chuỗi mạch acid amin và về vùng kị nước cho thấy các chuỗimạch acid amin của tất cả các Enzyme α-Amylase đều có cấu trúc bậc 3 tương tựnhau

Hình 1.4 Cấu trúc không gian của α-Amylase

Cơ chế tác dụng của α-Amylase:Amylase:

α-Amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau α-Amylase

có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơchất ( tinh bột hoặc glycogen ) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả.α-Amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyênsong với tốc độ rất chậm

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-Amylase là quá trình đa giai đoạn:

Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủyphân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt của hồ tinhbột giảm nhanh ( các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh )

Sang giai đoạn 2 ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo thành

bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine Các chấtnày bị thủy phân rất chậm bởi α-Amylase cho tới disaccharide và monosaccharide.Dưới tác dụng của α-Amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thànholigosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose ( vì vậy, người ta cho rằng α-Amylase luônphân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốc glucopiranose 1 )

Sau đó, các poliglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạchpolyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose

và maltose Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa13% glucose và 87% maltose Tác dụng của α-Amylase lên amylopectin cũng xảy

ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạchnhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuốicùng, ngoài các đường nói trên ( 72% maltose và 19% glucose ) còn có dextrin phân

tử thấp và isomaltose 8%

Tóm lại, dưới tác dụng của α-Amylase, tinh bột có thể chuyển thànhmaltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-Amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màuvới Iodine và một ít maltose Khả năng dextrin hóa cao của α-Amylase là tính chấtđặc trưng của nó Vì vậy, người ta thường gọi loại Amylase này là Amylase dextrinhóa hay Amylase dịch hóa

Tính chất của α-Amylase:Amylase

α-Amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗiloại α-Amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng α-Amylase là một proteingiàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic Các glutamic acid và asparticacid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử Enzyme:

α-Amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine

Trọng lượng phân tử của α-Amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir1956; Fisher, Stein, 1960 )

Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng

Protein của các α-Amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2 - 5,7 ( Bernfeld P, 1951 ) α-

Amylase là một metalo Enzyme Mỗi phân tử α-Amylase đều có chứa

1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 - 6 nguyên tử gam/mol Ca thamgia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động củaenzyme ( Modolova, 1965 ) Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzymekhi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các Enzyme phân giảiprotein Nếu phân tử α-Amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khảnăng thủy phân cơ chất α-Amylase bền với nhiệt độ hơn các Enzyme khác Đặc

kim loại như : Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+, không có ảnh hưởngmấy đến α-Amylase Một đặc điểm cần lưu ý là hầu hết α-Amylase khá bền với tácđộng của protease như pepsin, trypsin, papain

Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của Amylase nấmsợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose Nồng độ α-Amylase của VSV tươngđối lớn có thể chuyển hóa 70 - 85% tinh bột thành đường lên men Còn các α-Amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới

84 - 87%

Điều kiện hoạt động của α-Amylase từ các nguồn khác nhau thường khônggiống nhau pH tối thích cho hoạt động của α-Amylase từ nấm sợi là 4,0 - 4,8 ( cóthể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5 - 5,8 ) Theo số liệu của Liphis, pH tối thích

cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm Amylase từ Asp.orysee trong

vùng 5,6 - 6,2 Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrinhóa của nó là 6,0 - 7,0

Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau α-Amylase của

Asp.orysee bền vững đối với acid tốt hơn là α-Amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis Ở pH= 3,6 và 0oC, α-Amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 -

30 phút; Amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của Amylase của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu ( Fenilxova, Rmoshinoi 1989) Trong dung dịch α-Amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH= 5,0 - 5,5 ; α-Amylase

chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ

Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-Amylase từ các nguồn khácnhau cũng không đồng nhất, α-Amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động

Trong dung dịch đệm pH = 4,7 , α-Amylase của Asp.orysee rất nhạy với tác

của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn ( Miller và cộng sự )

1.2.7 Giới thiệu sơ lược về Enzyme Glucoamylase

Cấu tạo:

γ-Amylase ( glucoamylase hay α-1,4-glucan-glucohydrolase ) là nhữngEnzyme có thể thuỷ phân được cả hai kiểu liên kết của các mạch α-glucan để giảiphóng ra ở dạng β Glucoamylase hay γ-Amylase chủ yếu được tạo ra bởi các visinh vật Đặc biệt là kiểu nấm mốc aspergillus, penicillium và Rhizopus

Amyloglucosidase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượngdao động rất lớn từ 27.000 đến 112.000 Dal tuỳ thuộc vào nguồn gốc của Enzyme

Nói chung thì các amyloglucosidase đều chứa các gốc mêthioni, tritophan, vàmột nửa gốc cystein Tuy nhiên mối quan hệ giữa chuỗi acid amin, cấu trúc bậc 3 vàhoạt động của Enzyme vẫn chưa được làm sáng tỏ tất cả các amyloglucosidase từnấm mốc đều là glucoprotein chứa từ 5 - 20% gluxit trong đó chủ yếu là các monosaccharid glucose mannose, galactose và glucosamin

Các amyloglucosidase chủ yếu được tạo nên từ hai isoEnzyme I và II khácnhau ở khả năng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi độ bền của chúng.Amyloglucosidase I tự hấp thụ và thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lạiamyloglucosidase II không có cả hai tinh chất này

Cơ chế hoạt động:

Amyloglucosidase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thuỷ phân lặplại nhiều lần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử, chúng cũngthuỷ phân được các liên kết α-1,6 và α-1,3 nhưng rất chậm (10 - 30 lần ) Tốc độthuỷ phân cũng phụ thuộc vào bản chất của các liên kết kề cận với các liên kếtglucozit được thuỷ phân , cũng như kích thuớc và cấu trúc của cơ chất bị thuỷ phân Nhất là với các α-glucan mạch dài ( amylose và amylopectin ) thì bị thuỷ phânnhanh hơn là với các maltodextrin và các oligosaccharit

Tính chất:

Glucoamylase có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside.Khi thuỷ phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase táchlần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose.Enzyme này có nhiều tên gọi khác nhau: α-1,4 ,α-1,6-glucan-4; 6-glucohydrolase;glucoamylase; amyloglucosidase; taka-Amylase B; γ-Amylase… Là Enzyme ngoạibào

Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside , glucoamylase còn có khả năngthuỷ phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside

Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột , glucogen ,amylopectin , dextrin , panose , iso maltose và maltose thành glucose, mà không cần

có sự tham gia cuả các loại Enzyme khác Glucoamylase thuỷ giải các

polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so với các chất có phân tử nhỏ Cácpolisaccharide có nhánh như amylopectin, glucogen, β-dextrin bị glucoamylase thủyphân khá nhanh.

Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng có pH 3,5 – 5,5 và nhiệt độ

1.2.8 Giới thiệu sơ lược về enzyme Pectinase

Pectin là một phân tử tương tự như tinh bột, khác ở chỗ đơn vị tuần hoàn củapectin là acid galacturonic thay vì glucose ở tinh bột Pectin là hợp chất cao phân tửmạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp của các acid galacturonic qua các liên kết -1,4-glucoside

Trong thực vật, pectin có chức năng tự nhiên như một chất keo để giữ thành

tế bào cũng như các tế bào lại với nhau Tùy thuộc vào nguồn pectin mà pectin cókhối lượng phân tử từ 80.000 – 200.000 Da

Pectin không hòa tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác Pectin tantrong nước, NH3, dung dịch kiềm, Na2CO3 và trong glycerin nóng

Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin Sựphân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín Những enzyme này

có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả

Enzyme pectinase cũng được ứng dụng nhiều trong chế biến thực phẩm, đặcbiệt là khả năng làm trong nước quả

Polymethylgalacturonase: hay còn gọi là methylesglucanohydrolase, tác dụng trên polygalacturonic acid đã được methoxylhóa Enzyme này lại được phân thành 2 nhóm nhỏ là endo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểu I và exo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểuIII.

-1,4-galacturonite-Polygalacturonase: enzyme tác dụng trên pectic acid (hoặc pectinic), cũngđược chia thành 2 nhóm nhỏ là endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II và exo-glucosidase-polygalacturonase kiểu IV

Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bịester hóa Các enzyme vi sinh vật ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọngtrong quá trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làmmềm và làm mục mô thực vật

Pectinase làm đứt trạng thái gắn chặt giữa những phân tử acid galacturonic

để làm ngắn chuỗi pectin từ những đoạn lớn thành những đoạn nhỏ hơn

Cơ chế xúc tác của pectinase sử dụng nước, vì thế pectinase được xem là mộtenzyme thủy phân Nó cắt đứt phân tử nước, gắn –H vào một C và gắn –OH vàomột C khác

1.2.9 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng thủy phân bằng enzyme

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme Nhưng nếu tăngnồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ

cơ chất Nhưng khi tăng nồng độ cơ chất đến một mức độ nào đó, nếu tiếp tục tăngnồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng

Với từng enzyme, nồng độ tới hạn của cơ chất cũng như với từng cơ chất,nồng độ tới hạn của enzyme phụ thuộc vào điều kiện của quá trình phản ứng Vìvậy, với từng enzyme khi dùng để thủy phân một cơ chất cụ thể, trong những điềukiện cụ thể, cần nghiên cứu để xác định nồng độ tới hạn của enzyme

Ảnh hưởng của chất kiềm hãm và chất hoạt hóa

Hoạt độ của enzyme có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất vô cơhay hữu cơ khác nhau Các chất này có thể làm tăng (chất hoạt hóa) hoặc làm giảm(tính kìm hãm) hoạt độ của enzyme Tác dụng của chúng có thể là đặc hiệu haykhông đặc hiệu và thay đổi theo từng chất, tuy từng enzyme

Chất kìm hãm (chất ức chế) là chất khi có mặt trong phản ứng enzyme sẽlàm cho enzyme bị giảm hoạt tính nhưng không bị chuyển hóa bởi enzyme Cácchất này có thể là các ion, các phân tử vô cơ hay hữu cơ, kể cả protein

Chất hoạt hóa là những chất làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme hoặc làmcho enzyme chuyển thành hoạt động từ dạng không hoạt động Các chất này thường

có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại hoặc các chấthữu cơ Chất hữu cơ làm tăng hay hồi phục họat tính của enzyme một cách trực tiếphay gián tiếp

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng của enzyme và tốc độ phản ứngenzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Tốc độ phản ứngchỉ tăng tới một giới hạn nhiệt độ nhất định Vượt quá giới hạn đó, tốc độ giới hạn

đó sẽ giảm và dẫn đến mức bị triệt tiêu

Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ thích hợp, hoạt tính enzyme sẽ bịgiảm, khi đó enzyme không còn khả năng phục hồi lại hoạt tính

nhiệt độ lên từ từ thì hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức thích hợp

Ở nhiệt độ thấp (0 - 500C) vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng Sự tăng vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lượng cho phản ứng

phản ứng giảm do sự biến tính của protein Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở 80

-1000C

Nhiệt độ thích hợp của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của

cơ chất, pH, lực ion của môi trường

Ảnh hưởng của pH môi trường

pH của môi trường ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình thủy phân vì nó ảnhhưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và đến độ bền của protein-enzyme Đa số enzyme bền trong khoảng pH 5-9, độ bền của enzyme có thể tăng

pH thích hợp, không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: cơ chất,dung dịch đệm, nhiệt độ…

Với nhiều enzyme protease, pH thích hợp ở vùng trung tính, nhưng vẫn cómột số enzyme có pH thích hợp rất thấp (pepsin, protease acid của vi sinh vật…)hoặc khá cao như subtilin, có pH thích hợp lớn hơn 10

Ảnh hưởng của thời gian thủy phân

Trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất dài hayngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố

Thời gian thủy phân cần đủ dài để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chấttạo thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thủy phân Khi cơ chất cần thủy phân

đã hết quá trình thủy phân kết thúc Thời gian thủy phân phải thích hợp để đảm bảohiệu suất cao đồng thời đảm bảo chất lượng sản phẩm tốt

Ảnh hưởng của lượng nước

Với phản ứng thủy phân bởi enzyme thì nước vừa là môi trường để phân tánenzyme và cơ chất, lại vừa trực tiếp tham gia phản ứng Nước ảnh hưởng đến tốc độ

và chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzyme Vì thế, nước là một yếu tố

điều chỉnh phản ứng thủy phân bằng enzyme, nó có thể tăng cường hoặc ức chế của các phản ứng do enzyme xúc tác.

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Cơ chất:

Rong Vaucheria spp được thu từ Đồng bằng sông Cửu Long tại các ao nuôitôm, vùng nước lợ ở Bạc Liêu, Sóc Trăng, Trà Vinh đã được phơi khô và xaynhuyễn

2.1.2 Các Enzyme thương phẩm: Cellulase, Pectinase, Glucose-Amylase, Amylase

được cung cấp tại Viện sinh học nhiệt đới

2.1.3 Hoá chất và thiết bị

2.1.3.1 Hóa chất

Các hóa chất phục vụ cho việc xác định thành phần sinh hóa của rong như:

Bromocresol lục + cồn 960), HCL đậm đặc, Amoni molybdate Hydroquinone

đặc, Rượu ethylic 96%, dung dịch KCN 3%, dung dịch ammonium pH 10, dungdịch Trilon B 0.02N, chỉ thị Đen Eriochrom T, chỉ thị Murexid, dung dịch Trilon B0.02N, nước cất

Nước cất, DNS

2.1.3.2 thiết bị.

Dụng cụ; Ống nghiệm, becher, erlen, bình định mức, ống đong, đĩa petri,chén sứ, pipette, bình đựng mẫu, ống bóp cao su, giá đỡ ống nghiệm, giấy lọc, giấybạc, phễu, đũa thủy tinh, giấy quỳ (với các thể tích khác nhau)

Thiết bị: Tủ sấy, bếp điện, cân phân tích, cân điện tử, nồi hấp, máy votex, bộchưng cất mẫu kjeldahl, bộ chiết rút lipid, máy đo quang phổ, nồi hấp vô trùng, máy

ly tâm, tủ lạnh

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Các phương pháp xác định thành phần sinh hóa của rong Vaucheria Spp

Các thành phần hóa sinh của rong được xác định theo phương pháp LAPS( Standard compositional laboratory analytical procedure ) được mô tả bởi Dien et

al 2010 Theo đó thì Protein dược xác định bằng phương pháp Kjeldahl, Lipid đượcxác định bằng phương pháp Soxhlet; Các chỉ tiêu Carbohydrat tổng, đường tổng,tinh bột, chất xơ , hàm lượng tro và ẩm dược xác định theo phương pháp của FAO

và AOAC

2.2.1.1 Phương pháp xác định độ ẩm

Nội dung: Xác định độ ẩm của rong bằng cách sấy trong tủ cho đến trạng

thái khô không khí và xác định mức tiêu hao khối lượng trong quá trình đó

Dụng cụ:

Cân phân tích có độ chính xác tới 0,001g

Giấy bạc ( dùng để cân mẫu)

Đĩa petri

Các bước tiến hành:

Cân mẫu giấy bạc , sau đó cân chính xác 2g mẫu trên giấy, đặt vào đĩa petri

Lấy ra hút ẩm 15 phút, rồi cân trên cân phân tích

Tiếp tục sấy thêm từ 1- 2 giờ, và cân cho đến khi trọng lượng không đổi

Hình 2.1 Mẫu rong được đặt trong tủ sấy Tính toán kết quả:

Hàm lượng nước ban đầu ( X ) tính bằng phần trăm theo công thức:

Độ ẩm theo phần trăm được tính bằng công thức:

X = 1− 2 x 100%

Trong đó

G : khối lượng của mẫu tính bằng g

Kết quả cuối cùng là trung bình cộng số học của 2 kết quả xác định được khi chúng chênh lệch nhau không quá 2% so với trung bình cộng của chúng

2.2.1.2 Phương pháp xác định khoáng tổng số.

Nội dung:

- Tro thô là phần chất còn lại của mẫu sau khi nung ( vô cơ hóa) ở nhiệt độ

trước và sau khi nung, ta có được hàm lượng tro trong mẫu

- Tính hàm lượng tro không tan trong nước và tro không tan trong HCl

Dụng cụ và hóa chất:

Cân phân tích có độ chính xác 0,0001g

Chén nung bằng sứ chịu nhiệt có dung tích từ 30-50ml Chén nung đã được

Xác định hàm lượng khoáng tổng số trong mẫu

Mẫu rong đã được sấy khô đến trọng lượng tuyệt đối, cân 2g mẫu cho vàomỗi cốc sứ

có màu trắng xám hay xám xanh là được

- Xác định hàm luợng tro không tan trong HCl:

Hòa tan tro toàn toàn phần hoặc tro không tan trong nước cất vào 25ml HCL 4N Để nóng trong nồi cách thủy sôi từ 10 đến 15 phút

Cho toàn bộ vào chén sứ đem sấy khô đến trọng lượng không đổi ở 100 –

- Xác định hàm lượng tro không tan trong nước.

Sau khi hòa tan tro trong nước bằng nước cất sôi rửa phần không còn lại, lọc

Tính kết quả:

- Hàm lượng khoáng tổng số:

X % chất mất khi nung = (P1 – P2 ) x 100/m g mẫu

Trong đó: G: trọng lượng của chén (g)

P : trọng lượng của mẫu thử ( g ):

Y = 100%

Trong đó: G: trọng lượng của chén ( g )

G2: trọng lượng của chén và tro ( g )

P : trọng lượng của mẫu ( g )

2.2.1.3 Phương pháp định lượng Lipid theo phương pháp Soxhlet.

Xi phông dẫn dung môi lên hệ thống sinh hàn

Xi phông dẫn dung môi đến bình đun

Trang 35

Hệ thống sinh hàn.

Nồi cách thủy

Các bước tiến hành:

Chuẩn bị mẫu:

Sấy giấy gói mẫu đến trọng lượng khô tuyệt đối Sau đó lấy ra để nguội

nghiền nhỏ và đồng nhất Chuyển mẫu sang giấy gói đã sấy, gói kín lại Cân trọng

Chuẩn bị mẫu trên máy Soxhlet:

Cho gói mẫu vào ống hình trụ đựng mẫu một cách thận trọng để tránh rơi rớt.Đặt bình cầu đựng dung môi lên bếp đun Lắp ống đựng mẫu với bình cầu đựngdung môi theo nguyên tắc bình thông nhau Mở nước để nước chảy vào hệ thốngsinh hàn Sau cùng đổ dung môi chiết lipid qua phễu thủy tinh sao cho lượng dungmôi đủ ngập mẫu và chiếm 2/3 dung tích của bình đựng dung môi

Chiết rút Lipid trên máy Soxhlet:

lipid trong thời gian từ 10h – 12h

được dẫn phía trên của bình chiết vào ống sinh hàn gặp lạnh ngưng thành giọt chảyxuống bình chiết ngập xi phông, ether chảy xuống bình đun

Để nguội trong bình hút ẩm, cân lại tính đến trọng lượng tuyệt đối

Tính toán kết quả:

T = 2 − 3 100

Với T: % Lipid có trong mẫu

b = m2 – m1 (g)

2.2.1.4 Phương pháp định lượng carbohydrate tổng số:

Nội dung:

Sự định phân này căn cứ vào phản ứng đặc trưng của đường và nhiều chất

Dựng đường chuẩn Glucose.

Hòa tam 100mg Glucose với 80ml nước cất chuyển vào bình định mức100ml, thêm nước cất cho đến vạch và lắc đều Thực hiện dựng đường chuẩn theo

Xác định lượng đường của mẫu:

Sau đó để nguội, rồi lọc bằng giấy lọc vô trùng, đong thể tích cuối bằng100ml.

Từ đó pha loãng ra 5 lần rồi hút 1ml mẫu + 2mlDNS, đun sôi 10 phút và somàu ở bước sóng 540nm

Tính kết quả:

Từ phương trình đường chuẩn Glucose y = ax +b, ta có số OD của mẫu thếvào y tìm được x

Hàm lượng glucose có trong mẫu là : X = (x * V)/m

*HSPL 2.2.1.5 Phương pháp định lượng Nito tổng số Kjeldahl

Nội dung:

Cân 0.2g mẫu đã sấy khô, nghiền kỹ cho vào bình tam giác, bổ sung 1g chất

bếp điện cho đến khi trắng trong , tráng bằng nước cất khoảng 10ml đun tiếp trong

vòng 1h cho đến khi phá mẫu hoàn toàn ( dịch trong, không có vết đen của mẫu ).Lưu ý: trong quá trình đun tránh nơi có người để không bị ảnh hưởng bởi hơi axit

Chưng cất mẫu.

Mẫu sau khi phá để nguội, lắp vào máy chưng cất Bổ sung thêm 30ml dungdịch NaOH 32% Dịch chưng cất được thư nhờ bình thu có bổ sung trước axit boric

dịch chưng cất ( tương đương với 15 phút chưng cất )

Hình 2.2 Mẫu đang được chưng cất đạm theo phương pháp cổ điển

Chuẩn độ.

Chuẩn độ bằng HCl 0.24N Dừng chuẩn độ khi dung dịch có màu phớt đỏ