NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỊU AXIT VÀ HẤP THỤ NHÔM CỦA VI SINH VẬT ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ ĐẤT TRỒNG CHÈ VÙNG TÂN CƯƠNG, THÁI NGUYÊN

Nguyễn Thị Mai Lương NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỊU AXIT VÀ HẤP THỤ NHÔM CỦA VI SINH VẬT ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ ĐẤT TRỒNG CHÈ VÙNG TÂN CƯƠNG, THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC... Nguyễn Thị M

Nguyễn Thị Mai Lương

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỊU AXIT VÀ HẤP THỤ NHÔM CỦA

VI SINH VẬT ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ ĐẤT TRỒNG CHÈ

VÙNG TÂN CƯƠNG, THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Nguyễn Thị Mai Lương

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỊU AXIT VÀ HẤP THỤ NHÔM CỦA

VI SINH VẬT ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ ĐẤT TRỒNG CHÈ

VÙNG TÂN CƯƠNG, THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: Khoa học môi trường

Mã số: 8440301.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Ngô Thị Tường Châu

trong và ngoài trường

Trước tiên, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Ngô Thị Tường Châu – người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, động viên và luôn dõi theo sát sao quá trình thực hiện đề tài của tôi

Tiếp theo, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy, cô, cán bộ trong khoa Môi trường, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội nói chung và các thầy, cô trong bộ môn Tài nguyên và Môi trường đấtnói riêng đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài, truyền đạt cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm quý báu, những lời khuyên bổ ích

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô, cán bộ Phòng thí nghiệm Phân tích môi trường và các thầy, cô, các anh/chị/bạn làm việc tại Phòng thí nghiệm Thổ nhưỡng và Môi trường Đất đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các cô bác nông dân tại hợp tác xã (HTX) chè Soi Vàng và HTX chè Hồng Thái, xã Tân Cương, thành phố Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên đã tận tình giúp đỡ khi tôi về địa phương làm việc

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất đến gia đình và bạn bè - những người đã luôn ở bên động viên và giúp đỡ tôi khi tôi gặp khó khăn trong quá trình làm luận văn

Do thời gian và kinh nghiệm còn hạn chế nên luận văn khoa học của tôi còn nhiều thiếu sót, kính mong nhận được sự góp ý của các thầy cô giáo, các anh/chị và bạn bè để luận văn của tôi được hoàn chỉnh hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 30 tháng 12 năm 2018

Học viên cao học Nguyễn Thị Mai Lương

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1.Tổng quan về cây chè và đất trồng chè 3

1.1.1.Tổng quan về cây chè 3

1.1.2.Tổng quan về đất trồng chè 5

1.2.Tổng quan về khả năng hút thu nhôm của cây chè 6

1.3.Tổng quan về mối quan hệ giữa nhôm và một số bệnh liên quan 7

1.4 Tổng quan về khả năng chịu axit và hấp thụ kim loại của vi sinh vật 8

1.4.1 Ảnh hưởng của axit đến hoạt động sống của vi sinh vật 8

1.4.2.Ảnh hưởng của nhôm và kim loại nặng đến hoạt động của vi sinh vật 10

1.4.3.Vi sinh vật kháng kim loại 11

1.4.4.Vi sinh vật kháng nhôm 13

1.4.5.Khả năng loại bỏ kim loại ra khỏi môi trường của vi sinh vật 14

1.5 Tổng quan về tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật chịu axit và hấp thụ nhôm ở trong và ngoài nước……… ……… 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1.Đối tượng nghiên cứu 19

2.2.Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Phương pháp thu thập tài liệu sơ cấp và thứ cấp 19

2.2.2 Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu 19

2.2.3 Phương pháp xác định một số tính chất đất 20

2.2.4 Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật chịu axit và hấp thụ nhôm 21

2.2.5 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng chịu axit và hấp thụ nhôm cao từ các chủng được phân lập 22

tuyển chọn 25

2.2.8 Nghiên cứu khả năng hấp thụ nhôm của các chủng vi sinh vật được tuyển chọn 25

2.2.9 Phương pháp sơ bộ đánh giá khả năng ứng dụng hỗn hợp vi sinh vật nhằm hạn chế hàm lượng nhôm linh động trong đất trồng chè 26

2.2.10 Phương pháp xử lý số liệu 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1.Một số tính chất cơ bản và hàm lượng nhôm tổng số của đất trồng chè vùng Tân Cương, Thái Nguyên 29

3.1.1 Một số chỉ tiêu lí, hóa học của đất 29

3.1.2 Mật độ vi sinh vật tổng số trong đất 33

3.2 Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật chịu axit và hấp thụ nhôm từ đất trồng chè vùng Tân Cương, Thái Nguyên 34

3.3 Kết quả tuyển chọn các chủng vi sinh vật chịu axit và hấp thụ nhôm phân lập được từ đất trồng chè vùng Tân Cương, Thái Nguyên 37

3.4 Kết quả định danh các chủng vi sinh vật có khả năng kháng nhôm cao đã được tuyển chọn 38

3.4.1 Kết quả định danh chủng vi khuẩn B2 38

3.4.2 Kết quả định danh chủng vi khuẩn B4 40

3.4.3 Kết quả định danh chủng nấm mốc F8 41

3.4.4 Kết quả định danh chủng nấm mốc F13 42

3.4.5 Kết quả định danh chủng nấm mốc F17 44

3.5 Kết quả nghiên cứu khả năng chịu axit của các chủng vi sinh vật được tuyển chọn 47

3.6 Khả năng sinh trưởng, phát triển và hấp thụ nhôm của các chủng vi sinh vật được tuyển chọn 49

1 KẾT LUẬN 55

2.KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 2.2 Thành phần môi trường nước thịt pepton 20

Bảng 2.3 Thành phần môi trường của các chủng vi sinh vật 22

Bảng 2.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR……… 24

Bảng 3.1 Một số chỉ tiêu lí, hóa học của các mẫu đất nghiên cứu 29

Bảng 3.2 Mật độ tế bào vi sinh vật tổng số trong đất 33

Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật được phân lập 35

ảng 3.4 Hiệu suất hấp thụ nhôm của các chủng vi sinh vật nghiên cứu trong các môi trường nuôi cấy chứa nồng độ nhôm khác nhau (%) 52

ảng 3.5 Hàm lượng nhôm linh động trong các mẫu đất nghiên cứu……….53

Hình 3.3 Kết quả so sánh chi tiết từng trình tự tương đồng của chủng 2 được tra cứu trên NCBI 39 Hình 3.4 Hình thái tế bào (×100) của chủng B4 40 Hình 3.5 Trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn B4 40 Hình 3.6 Kết quả so sánh chi tiết từng trình tự tương đồng của chủng B4 tra cứu trên NCBI 41 Hình 3.7 Hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch Sabouraud và trình tự gen 28S rRNA của chủng F8 42 Hình 3.8 Kết quả so sánh chi tiết từng trình tự tương đồng của chủng F8 tra cứu trên NCBI 42 Hình 3.9 Hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch Sabouraud của chủng F13 43 Hình 3.10 Trình tự gen 28S rRNA của chủng F13 43 Hình 3.11 Kết quả so sánh chi tiết từng trình tự tương đồng của chủng F13 tra cứu trên NCBI 44 Hình 3.12 Hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch và trình tự gen 28S rRNA của chủng F17 45 Hình 3.13 Kết quả so sánh chi tiết từng trình tự tương đồng của chủng F17 tra cứu trên NCBI 46Hình 3.14 Biểu diễn sự ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn B2 và B4 46 Hình 3.15 Biểu diễn lượng sinh khối tạo thành của các chủng nấm mốc trong các môi trường có pH khác nhau 49 Hình 3.16 Sinh khối của chủng F8 trái ; F13 (giữa) và F17 (phải) trong môi tru ờng Hansen pH 2,4 49 Hình 3.17 Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ nhôm trong môi trường đến

sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn B2 và B4 50 Hình 3.18 Biểu đồ biểu diễn khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm mốc trong các môi trường dịch thể có hàm lượng nhôm khác nhau 51

FAO

Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc)

HCBVTV Hóa chất bảo vệ thực vật

ICP – OES

Inductively Coupled Plasma – Optical Emission Spectroscopy (Kỹ thuật phân tích phổ phát xạ nguyên tử)

NCBI National Center for Biotechnology Information

(Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia) TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

US EPA United States Environmental Protection Agency Cơ

quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ)

WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

MỞ ĐẦU

Chè xanh (Camellia sinensis) có nhiều vitamin có giá trị dinh dưỡng và bảo

vệ sức khỏe Có tác dụng giải khát, bổ dưỡng và kích thích hệ thần kinh trung ương, giúp tiêu hóa các chất mỡ, giảm được bệnh béo phì, chống lão hóa… Do đó chè đã trở thành sản phẩm đồ uống thông dụng trên toàn thế giới Chè được sử dụng hàng ngày và hình thành nên một tập quán tạo ra được nền văn hóa Chè có giá trị sử dụng và là hàng hóa có giá trị kinh tế, sản xuất chè mang lại hiệu quả kinh tế khá cao góp phần cải thiện đời sống cho người lao động Hiện nay chè đã trở thành mặt hàng xuất khẩu có giá trị của Việt Nam, trong đó sản phẩm nổi tiếng nhất là chè Tân Cương, Thái Nguyên

Tuy nhiên chè là loại cây u a đạm, vì vậy trong quá trình canh tác, một lu ợng lớn phân đạm đặc biệt là ammonium sulfate đã được bón vào trong đất trồng chè nhằm ta ng hàm lu ợng amino axit trong lá chè, đồng thời tạo màu sắc hấp dẫn và hương vị đậm đà của sản phẩm chè Khi ca y chè hấp thụ một lu ợng lớn ammonium, còn sulfate được t ch tụ trong đất Ngoài ra, ammonium được bón vào đất trồng chè nhanh chóng bị chuyển đổi thành nitrate bởi vi khuẩn nitrate hóa tự du ỡng có khả năng chịu axit Hậu quả là một lu ợng đáng kể nitrate và sulfate được tích luỹ dần trong đất trồng chè, làm pH đất giảm xuống c n 4,0 hoạ c thạ m ch thấp ho n, từ đó làm tăng hàm lượng nhôm linh động trong đất trồng chè Trong điều kiện này, cây chè được cho là hấp thụ một lượng nhôm đáng kể, khi hàm lượng nhôm trong các sản phẩm chè quá cao có thể gây hại đến sức khoẻ (yếu thận cho người tiêu dùng Hơn nữa, hàm lượng nhôm trong cơ thể người cao được giả thuyết là có mối liên kết với nhiều bệnh khác nhau như chứng mất tr não, xơ não, gãy xương và bệnh Alzheimer

Là một thành phần quan trọng của môi trường đất, vi sinh vật (VSV) đất chắc chắn bị ảnh hưởng bởi độc tính nhôm Tuy nhiên một số VSV có thể sống sót rất tốt trong đất axit và làm giảm độc tính nhôm nhờ các cơ chế kháng và hấp thụ kim loại Vì vậy việc sử dụng hệ VSV có khả năng chịu axit, hấp thụ nhôm để cải thiện môi trường đất rất có tiềm năng và không thể phủ nhận rằng việc phân lập và

nghiên cứu đặc tính của VSV hấp thụ nhôm cao là tiền đề cho biện pháp phục hồi sinh học đất trồng chè Tuy nhiên nghiên cứu về khả năng chịu axit, hấp thụ nhôm của hệ VSV ở đất trồng chè tại Việt Nam chưa thực sự được quan tâm Do vậy, đề tài hy vọng kết quả nghiên cứu này sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu sau này về khả năng chịu axit, hấp thụ nhôm ở đất trồng chè của VSV nhằm mục đ ch cải thiện môi trường đất mà vẫn đảm bảo hiệu quả sản xuất

Trên cơ sở đó, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng chịu axit và hấp thụ nhôm của vi sinh vật phân lập được từ đất trồng chè vùng Tân Cương, Thái Nguyên”

- Phân lập hệ VSV chịu axit và hấp thụ nhôm từ một số mẫu đất trồng chè vùng Tân Cương, Thái Nguyên

- Tuyển chọn được các chủng VSV có khả năng hấp thụ nhôm cao từ các chủng VSV được phân lập

- Định danh các chủng VSV có khả năng chịu axit và hấp thụ nhôm cao được tuyển chọn

- Nghiên cứu khả năng chịu axit và hấp thụ nhôm của các chủng VSV tuyển chọn

- Sơ bộ đánh giá khả năng ứng dụng hỗn hợp VSV nhằm hạn chế hàm lượng nhôm linh động trong đất trồng chè

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây chè và đất trồng chè

1.1.1 Tổng quan về cây chè

Chè xanh (Camellia sinesis) là cây công nghiệp dài ngày, chỉ một lần trồng

cho thu hoạch 30-40 năm, là loài cây mà lá và chồi của chúng được sử dụng để sản xuất chè

Trong lá chè tươi có rất nhiều thành phần trong đó nước chiếm hàm lượng nhiều nhất Trong chè cũng có rất nhiều các loại vitamin, chính vì vậy giá trị dược liệu cũng như giá trị dinh dưỡng của chè rất cao Theo các tài liệu của Trung Quốc, hàm lượng một số vitamin trong chè tính theo mg/1000 g chất khô như sau: Vitamin A: 54,6; vitamin B1: 0,70; vitamin 2: 12,20; PP: 47,0; C: 27,0… Đáng chú ý nhất

là hàm lượng vitamin C ở trong chè nhiều hơn trong cam, chanh từ 3-4 lần [5]

Nước chè là loại nước giải khát rất tốt cho con người Chè cũng là một chất lợi tiểu, kích thích hệ thống tuần hoàn máu và hô hấp Chè xanh được sử dụng thích hợp như là một nguồn cung cấp các chất chống oxy hóa chữa bệnh Lá của nó bao gồm một chất chống oxy hóa rất đặc biệt được gọi là EGCG (epigallocatechin-gallate) cũng như các chất chữa bệnh đáng chú ý khác, bao gồm fluoride, catechin

và tannin Cụ thể, chè xanh c n được sử dụng làm thức uống phòng ngừa và chống ung thư vú, dạ dày và da Các chất chống oxy hóa EGCG chuyển động trong cơ thể tạo thành một quá trình gọi là apoptosis và tế bào chết, chỉ xảy ra và ảnh hưởng đến

tế bào ung thư, không gây ảnh hưởng gì khác tới những người khỏe mạnh EGCG cũng có thể làm tăng cường quá trình hoạt động chống oxy hóa tự nhiên của cơ thể, thuận lợi loại bỏ các phân tử oxy gây hại được gọi là các gốc tự do Bên cạnh đó, các chất chống oxy hóa có thể ngăn ngừa và làm giảm mức độ nghiêm trọng của viêm xương khớp và các hợp chất tannin làm se lại có thể làm giảm chứng khó tiêu, tiêu chảy và các dạng triệu chứng khác của đau bụng Nói cách khác, nồng độ chất chống oxy hóa cao dường như tăng cường tuổi thọ bằng cách chống lại bệnh tim, ung thư và các bệnh khác [5] Chè có tác dụng làm sáng mắt, trí óc sảng khoái, nhuận tràng, vô hiệu hóa nhiều chất độc trong cơ thể Nó có tác động vào tim, phổi

và bao tử Polyphenol còn tác dụng lên enzyme chuyển đường glucotransferase, tăng sức chống đỡ axit của men răng đồng thời chống sự cấu tạo mảng răng Vì vậy chè là một thành phần trong thuốc đánh răng hay trong nước súc miệng ngừa sâu răng, chống viêm khớp răng, nhai lá chè thay cho kẹo chewing gum chống được hôi miệng, thơm hơi thở Bã chè cũng làm phân bón rất tốt

Uống chè là một thói quan truyền thống không những của người Việt mà còn

là hoạt động văn hóa mang đậm bản sắc dân tộc của nhiều nước trên thế giới Việt Nam được xác định là một trong tám cội nguồn của cây chè Có điều kiện địa hình, đất đai, kh hậu phù hợp cho cây chè phát triển cho chất lượng cao Hiện sản phẩm chè của Việt Nam đã có mặt trên 110 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới Đặc biệt thương hiệu “CheViet” đã được đăng ký và bảo hộ trên rất nhiều thị trường của các quốc gia trên thế giới và khu vực Việt Nam hiện đang là quốc gia đứng thứ 5 trên thế giới về sản lượng cũng như kim ngạch xuất khẩu chè, là một trong những nước có lịch sử trồng chè lâu đời

Hiện nay, ở Việt Nam cây chè đã được phân bố rộng trên phạm vi cả nước, hình thành lên nhiều vùng chè tập trung như: vùng Tây ắc (gồm Sơn La, Lai Châu), vùng Việt Bắc- Hoàng Liên Sơn gồm Hà Giang, Tuyên Quang, Yên Bái, Lào Cai), vùng Trung du Bắc Bộ (gồm Phú Thọ, nam Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Bắc Kanj, Bắc Giang, Thái Nguyên), vùng Bắc Trung Bộ (gồm Thanh Hóa, Nghệ

An, Hà Tĩnh , vùng Tây Nguyên gồm Gia Lai, Kontum, Lâm Đồng) Cây chè trung

du được trồng ở vùng Tân Cương, Thái Nguyên cho hương vị thơm ngon hơn hẳn khi trồng ở các vùng khác Chè Tân Cương có hương thơm tự nhiên, vị đượm, chát nhẹ, màu nước xanh, sau khi uống có vị ngọt còn lắng sâu trong vị giác người thưởng thức Thái Nguyên nổi tiếng với cây chè là bởi điều kiện thổ nhưỡng nơi đây rất thích hợp để trồng nên cây chè cho ra loại chè ngon Có nhiều vùng trồng chè trên địa bàn tỉnh, tuy nhiên vùng chè Tân Cương tại thành phố Thái Nguyên được biết đến là vùng chè nổi tiếng nhất tỉnh Thái Nguyên Chè Tân Cương đã khẳng định thương hiệu trên thị trường trên 100 năm nay

1.1.2 Tổng quan về đất trồng chè

So với một số cây trồng khác, chè yêu cầu về đất không nghiêm khắc lắm Song để cây chè sinh trưởng tốt, năng suất cao và ổn định thì đất trồng chè cần đáp ứng một số yêu cầu như: độ chua, độ sâu và độ ẩm, hàm lượng chất hữu cơ… T nh chất chung của đất trồng chè Việt Nam là có phản ứng axit từ chua đến chua nhẹ, hàm lượng chất hữu cơ khoảng 1-2%, nghèo lân, kali, canxi, magie và có hàm lượng sắt, nhôm cao Ngoài ra đất trồng chè còn có thành phần cơ giới nặng, chủ yếu do được hình thành trên các đá mẹ giàu sét, cấu trúc kém và t tơi xốp Nhiều nghiên cứu cho thấy đất trồng chè của nước ta có hàm lượng chất hữu cơ ở mức thấp và dao động từ rất nghèo đến trung bình thường <2) Ở những vùng trồng chè

có điều kiện khí hậu thuận lợi cho sự t ch lũy chất hữu cơ và t bị xói mòn rửa trôi thì hàm lượng chất hữu cơ đạt ở mức khá [2; 3] Theo Trần Thị Tuyết Thu (2012), hàm lượng chất hữu cơ trong 3 mô hình thâm canh cao, trung bình và thấp ở vùng trồng chè Tân Cương, Thái Nguyên là 4,13%, 3,63% và 2,76% Hàm lượng chất hữu cơ trong đất trồng chè ở Khải Xuân, Phú Thọ có mức đầu tư trung bình dao động từ 1,8% đến 2,81% [7; 8] Cho thấy tự t ch lũy hàm lượng chất hữu cơ trong đất trồng chè ở Việt Nam phụ thuộc chủ yếu vào kỹ thuật canh tác và hoạt động quản lý đầu vào cung cấp phân bón và nguồn chất hữu cơ cho đất

Đất có t nh axit đặc biệt phù hợp với cây chè, trước tiên là do cây chè sinh trưởng cần môi trường có tính axit Theo phân tích hoá học, trong dịch ở rễ cây chè

có chứa nhiều các axit hữu cơ như axit citric, axit malic, axit oxlic, axit succimat Chất dịch được tạo thành do axit hữu cơ có t nh axit khá lớn và tính kiềm thấp; cũng

có thể nói cây chè khi gặp môi trường sinh trưởng có tính axit, chất dịch tế bào của

nó sẽ không bị phá hoại khi bị axit thâm nhập vào, đây ch nh là một trong những nguyên nhân quan trọng về mặt sinh lý cây chè có thể đặc biệt thích ứng với đất có

độ axit

Ngoài ra, bộ rễ của cây chè có những chỗ phình to, chúng ta gọi nó là “rễ khuẩn” Rễ khuẩn cũng giống như những nốt rễ của thực vật họ đậu, bên trong có VSV nấm rễ khuẩn Mối quan hệ giữa nấm rễ khuẩn và rễ khuẩn là mối quan hệ

cộng sinh hai bên cùng dựa vào nhau, cùng có lợi Nấm rễ khuẩn hấp thụ nước và chất dinh dưỡng trong đất, ngoài đáp ứng nhu cầu của chính bản thân nó ra, còn truyền lượng còn lại đến cho cây chè, vì thế cải thiện lớn điều kiện nước và điều kiện dinh dưỡng cho cây chè Nhưng nấm rễ khuẩn tự mình không thể tạo ra hợp chất cacbon oxit, mà hầu hết các hợp chất cacbon oxit mà nó cần đều dựa vào cây chè cung cấp Do cây chè và nấm rễ khuẩn có mối quan hệ cộng sinh như vậy, cho nên muốn cây chè sinh trưởng tốt, còn phải làm cho nấm rễ khuẩn cũng sinh trưởng tốt, mà môi trường thích hợp cho sinh trưởng của loại nấm rễ khuẩn ch nh là điều kiện đất axit Như vậy, đất axit sẽ cung cấp điều kiện sinh trưởng thuận lợi cho cây chè, lại tạo ra môi trường cộng sinh l tưởng cho nấm rễ khuẩn của sự cộng sinh đó,

vì vậy đất axit đặc biệt thích ứng với sinh trưởng của cây chè

Tỉnh Thái Nguyên là một điển hình của trung du miền núi phía Bắc, có nhiều dãy núi cao chạy dần theo hướng Bắc - Nam và thấp dần xuống phía Nam Diện tích đất tự nhiên chủ yếu được hình thành do sự phong hóa trên đá Macma, đá biến chất

và đá trầm tích Thực tiễn cho thấy, Thái Nguyên có 6 loại đất có khả năng trồng chè, trong đó chè được trồng trên 2 loại đất: đất vàng nhạt trên đá cát, đất vàng nâu trên đá phù sa cổ có thành phần cơ giới nhẹ, đều có hương thơm tự nhiên vị đậm, màu nước đẹp hơn chè trồng trên các loại đất có thành phần cơ giới nặng hơn Cây chè sinh trưởng tốt trên đất có kết viên, tơi xốp Trên các loại đất này bộ rễ chè phát triển tốt, hệ sinh vật hoạt động mạnh, cây chè có tuổi thọ cao

1.2 Tổng quan về khả năng hút thu nhôm của cây chè

Chè cần rất nhiều chất dinh dưỡng, mỗi chất có vai trò quan trọng nhất định với sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng chè Chè cần nhiều đạm nhất sau tới lân, kali và các chất trung vi lượng Chè là cây khá khác biệt so với các cây khác đó là có nhu cầu cao về nhôm, natri, sắt và mangan Nhôm là nguyên tố cần thiết đối với cây chè, có tác dụng điều tiết cân bằng dinh dưỡng của cây chè nhất là chống tác dụng ngộ độc của mangan; đồng thời nhôm ảnh hưởng tốt đến hương thơm và vị đậm của chè, tăng năng suất và nâng cao phẩm cấp của chè búp khô Để đảm bảo cung cấp đủ nhu cầu dinh dưỡng cho cây chè ngoài việc lựa chọn những

loại phân bón hợp lý và áp dụng đúng kỹ thuật bón phân thì yếu tố canh tác chè cũng rất quan trọng

Đối với thực vật, nhôm là nguyên tố dinh dưỡng thiết yếu, nhưng nếu quá nhiều sẽ gây hại cho cây Do đó nhiều loại cây không thể sống trong môi trường đất chua vì có lượng Al3+

quá lớn Cây chè phát triển tốt ở điều kiện đất chua (pH 4,5 – 5,5) Đặc t nh đầu tiên của đất chua là có chứa ion Al3+, độ chua càng cao thì lượng ion Al3+ càng lớn Trong môi trường đất kiềm và trung tính, nhôm ở trạng thái cố định Lượng nhôm hòa tan lớn hơn 1000 lần ở pH 4,5 so với pH 5,5 Ở điều kiện pH đất dưới 4,5, cây chè t ch lũy hàm lượng Al3+ cao [66]

Khả năng hút thu Al3+ của cây chè là rất lớn Một cây chè khỏe mạnh có thể hút thu một hàm lượng Al3+ chiếm tới 1% so với rất nhiều các nguyên tố khác Ion

Al3+ di chuyển rất chậm đến các phần trên của thực vật Phần lớn thực vật chứa không quá 0,2 mg Al3+/g sinh khối khô Tuy nhiên, một số thực vật được biết đến khả năng t ch lũy nhôm, chúng có khả năng t ch lũy nhiều hơn 10 lần nhôm mà không bị ảnh hưởng bất lợi nào đến sự sinh trưởng, phát triển của chúng Cây chè là loại cây có khả năng t ch lũy Al3+, Al3+ trong cây chè có thể lên cao đến 30 mg/g khối lượng chất khô trong các lá già [33]

Các Al3+ được thực vật hút thu chủ yếu thông qua hệ thống rễ và chỉ có một lượng Al3+

nhỏ được chuyển đến lá Hầu hết các tác giả đều cho rằng quá trình hút thu kim loại liên quan đến chất mang ion đặc hiệu tiêu tốn năng lượng nhưng cơ chế vận chuyển ion Al3+ cụ thể thì chưa được tìm thấy [54]

1.3 Tổng quan về mối quan hệ giữa nhôm và một số bệnh liên quan

Nhôm là kim loại có khắp mọi nơi trong môi trường sống của con người – tức là con người “gặp” nhôm thường xuyên trong sinh hoạt hàng ngày Chính vì thế, các nhà khoa học từ lâu đã nghiên cứu về ảnh hưởng của nhôm đối với sức khoẻ con người

Là kim loại chiếm tỉ lệ cao nhất ở vỏ Trái Đất (8,3%), nhôm được tìm thấy trong đất, nước và không khí nhưng hầu hết nó tồn tại chủ yếu ở dạng khoáng đất aluminosilicate và chỉ có một lượng rất nhỏ ở dạng hòa tan có khả năng ảnh hưởng

đến hệ thống sinh học [36] Đặc điểm vật lý và hoá học của nhôm biến nó thành một loại kim loại lý tưởng, được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau, từ chế tạo thân máy bay cho tới sản xuất thực phẩm, dược phẩm, đồ dùng nhà bếp và các vật dụng sinh hoạt khác Nhôm và các hợp chất của nhôm thường được dùng trong chất phụ gia thực phẩm, trong dược phẩm, trong các sản phẩm tiêu dùng như đồ dùng nhà bếp) và trong xử lý nước uống (các chất lắng lọc nước… Lượng nhôm sẽ ngấm vào dung dịch chè thông qua dịch truyền, do đó gây ra mối đe dọa nghiêm trọng đối với sức khỏe của người tiêu dùng [13]

Theo nghiên cứu tại Đại học Keele ở Anh cho thấy, Al3+ tích tụ trong não với hàm lượng cao đối với người tiếp xúc thường xuyên với nhôm trong công việc và độc tố của nhôm gây ra các bệnh suy thoái thần kinh trong đó có chứng mất trí nhớ Alzheimer – chứng bệnh gây sa sút trí tuệ ở người cao tuổi và hiện nay bệnh này cũng đã được phát hiện ở người trẻ tuổi [9]

Cũng có những nghiên cứu cho thấy sự liên quan giữa lượng Al3+

đưa vào cơ thể với bệnh xơ cứng và teo cơ bên (bệnh Lou Gehrig) và bệnh Parkinson (bệnh liệt rung, thường xảy ra ở người cao tuổi) Không những thế, nguy cơ sức khỏe tiềm tàng về các bệnh lý đối với những trẻ em uống sữa có chứa Al3+ là rất cao [13] Một

số bệnh thần kinh như chứng mất trí nhớ Alzheimer, bệnh Parkinson, chứng xơ cứng teo bên amiđan được giả định là do Al3+ [39]

1.4 Tổng quan về khả năng chịu axit và hấp thụ kim loại của vi sinh vật

VSV là một phần quan trọng của hệ sinh thái VSV trong các hệ sinh thái có thể phát triển phụ thuộc vào các điều kiện môi trường như nhiệt độ, pH, chất dinh dưỡng… Các yếu tố môi trường như vậy có thể tạo ra một môi trường sống khắc nghiệt Môi trường khắc nghiệt có thể hạn chế sự tồn tại và ảnh hưởng đến các hoạt động sống của VSV Bên cạnh đó nhiều VSV được tìm thấy trong môi trường “cực đoan”, trong điều kiện sống khắc nghiệt chúng không chỉ tồn tại mà còn hoạt động trao đổi chất dưới những điều kiện đặc biệt này

1.4.1 Ảnh hưởng của axit đến hoạt động sống của vi sinh vật

1.4.1.1 Ảnh hưởng của axit đến hoạt động của vi sinh vật

Điều kiện axit có tác động rất lớn đến tế bào VSV Do đó, ảnh hưởng của sự biến đổi pH bên ngoài đ i hỏi các tế bào và màng tế bào phát triển để kiểm soát pH trong tế bào là tối ưu cho các hoạt động của các enzym nội bào Hơn nữa, điều chỉnh quá trình trao đổi chất được diễn ra ở bề mặt tế bào VSV để thích ứng với các điều kiện có tính axit mạnh Ví dụ, bề mặt tế bào VSV thay đổi theo pH môi trường Điều này kiểm soát sự tương tác với các chất dinh dưỡng t ch điện Hơn nữa, các enzyme có bề mặt cũng như các enzyme ngoại bào cũng có khả năng hoạt động ở nồng độ ion hydro cao Hoạt động tối ưu được thể hiện ở pH chiếm ưu thế hoặc thay đổi tỷ lệ tổng hợp enzyme để cho hoạt động enzym hạn chế xảy ra trong điều kiện có tính axit Ngoài ra, việc điều chỉnh tỷ lệ tổng hợp enzym có thể cần thiết cho những enzym bị biến t nh trong điều kiện có tính axit Nếu sản phẩm enzyme là thiết yếu cho sản phẩm tế bào thì tế bào cần điều chỉnh tốc độ tổng hợp enzyme sao cho nó luôn luôn có mặt ở mức hiệu quả [47]

Thành tế bào thường được biết đến là rào cản đầu tiên và quan trọng nhất để thích ứng với độ axit cao trong nấm men Nguyen VA và các cộng sự, năm 2001 đã

chỉ ra vỏ tế bào của Rhodotorula glutinis R-1 trở nên nhăn và dày hơn khi giá trị pH

của môi trường giảm Màng tế bào ở pH 1,5 dày gấp 4 lần so với ở pH 6,0 Người ta cho rằng những thay đổi trong vỏ tế bào đóng một vai trò quan trọng khi độ axit trong môi trường thay đổi [40]

Ngoài ra, sự biến đổi t nh lưu động của màng và thành phần axit béo [53] và hoạt tính ATPase của màng plasma [12] đã được nghiên cứu ở nấm men có khả năng chịu áp lực pH thấp Ngoài ra, nấm mốc có khả năng duy trì độ pH trung tính tương đối bằng cách bơm proton ra khỏi tế bào và bằng cách thiết lập độ thấm màng proton thấp

Trong vi khuẩn, các hệ thống phản proton như kali/ proton và natri/ proton

có thể được điều chỉnh khi pH thay đổi nhỏ Nếu pH trở nên quá chua, các cơ chế

khác sẽ được phát huy Khi pH giảm xuống dưới 5,5- 6,0, Salmonella typhimurium

và E coli có khả năng tổng hợp một loạt các protein mới Nếu pH bên ngoài giảm xuống còn 4,5 hoặc thấp hơn, protein tổng hợp axit được tổng hợp Có lẽ điều này

ngăn chặn sự biến tính axit của protein và hỗ trợ trong việc tái tạo protein biến tính [30]

1.4.1.2 Vi sinh vật chịu axit

Một lượng lớn VSV đã được nghiên cứu trong môi trường có tính axit cao, chứng tỏ chúng có khả năng chịu được axit Phức hợp actinomycete trong đất chè axit đã được tìm thấy có chứa streptomycetes axitotolerant và nocardioforms axitophilic [43] Các điều tra cũng cho thấy rằng actinomycetes axitotolerant được tiết ra bởi micromonosporas và streptomycetes, luôn luôn hiện diện trong đất rừng

axit và đất đen nhiều bùn [65] Các vi khuẩn như Thiobacillus ferrooxidans và Thiobacillus thiooxidans,… và các vi khuẩn cổ như Sulfolobus axitocalderius và Axitianus brierleyi… đã được nghiên cứu từ môi trường axit [14] Gần đây, Ferroplasma axitamanus có khả năng tăng trưởng ở pH 0, đã được phân lập từ một

mỏ quặng sulfide ở California Hầu hết các VSV sống trong môi trường có tính axit cũng có thể phát triển dưới pH trung tính hoặc thậm chí kiềm [49]

1.4.2 Ảnh hưởng của nhôm và kim loại nặng đến hoạt động của vi sinh vật

Nhôm xuất hiện ở trạng thái oxi hóa 3+ và các khoáng chất nhôm gần như không h a tan ở pH trung tính Khi pH giảm xuống dưới 5,5, vật liệu chứa nhôm bắt đầu tan, khi này nhôm ở trạng thái linh động Nhôm linh động là nhôm có thể h a tan trong nước, khi này thực vật và VSV có thể hút thu được Mặc dù Al3+không có vai tr trao đổi chất, các báo cáo cũng cho rằng tác động độc hại của Al3+trên các phản ứng sinh hóa khác nhau [35; 31] Ảnh hưởng độc hại của Al3+ do sự thay thế các ion kim loại thiết yếu tại các vị trí quan trọng trong tế bào [17] Độc tính Al3+ theo cơ chế thay thế các ion Mg2+ trong các phản ứng sinh học Bán kính ion Al3+ gần giống nhất với Mg2+, Fe3+ và Al3+ có thể được thay thế cho các ion này trong điều kiện sinh lý [35; 31] Do đó, Al3+

có thể hoạt động như một chất ức chế một số enzyme phụ thuộc Mg2+ trong tế bào [17] Bên cạnh ADN, màng tế bào hoặc thành tế bào cũng được coi là mục tiêu chính gây độc của Al trong VSV [45]

Mặt khác, kim loại nặng (KLN) là kim loại có khối lượng riêng trên 5 g/cm3 [61] Hầu hết các KLN là các phần tử chuyển tiếp với các obitan d đầy Các obitan d

này cung cấp các cation kim loại nặng với khả năng tạo thành các hợp chất phức tạp

có thể hoặc không hoạt động oxi hóa khử Do đó, cation KLN đóng một vai trò quan trọng như là "nguyên tố vi lượng" trong các phản ứng sinh hóa phức tạp Một

số kim loại như Co, Cu và Ni có tác dụng như vi chất dinh dưỡng và được sử dụng cho quá trình oxi hóa khử để ổn định các phân tử thông qua tương tác tĩnh điện như các thành phần của các enzym khác nhau và điều hòa áp suất thẩm thấu [34] Tuy nhiên, ở nồng độ cao hơn các ion KLN tạo thành các hợp chất phức tạp không xác định trong tế bào, dẫn đến các tác động độc hại Những kim loại độc này tương tác với các thành phần tế bào thiết yếu thông qua liên kết hóa trị và ion Một số cation KLN, ví dụ: Hg2+, Cd2+ và Ag+, có khuynh hướng liên kết với các nhóm SH để hình thành các phức hợp có tính độc hại mạnh, làm cho chúng trở nên rất nguy hiểm đối với bất kỳ chức năng sinh lý nào Các nguyên tố vi lượng phổ biến như Zn2+ hoặc

Ni2+ và đặc biệt là Cu2+ có độc tính ở nồng độ cao hơn [42] Do đó, màng tế bào và cấu trúc của ADN có thể bị tổn hại, đặc hiệu enzyme có thể bị thay đổi và các chức năng tế bào có thể bị gián đoạn [34]

Tuy nhiên, độc tính kim loại đối với VSV có thể bị ảnh hưởng đáng kể bởi điều kiện môi trường Một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự sẵn có của kim loại là sự liên kết với các thành phần môi trường khác Các kim loại

có thể bị loại bỏ hoàn toàn hoặc một phần bằng cách liên kết, tính độc hại của chúng

có thể giảm đi hoặc không xảy ra Tương tự, kim loại có thể kết tủa như các hydroxit hoặc oxit không tan trong môi trường kiềm làm giảm độc tính của nó đối với VSV

1.4.3 Vi sinh vật kháng kim loại

Để thích nghi với hàm lượng kim loại cao trong môi trường, một số VSV đã phát triển các cơ chế kháng Sự đề kháng có thể được định nghĩa là khả năng tồn tại của các VSV ở nồng độ cao hơn so với các kim loại độc hại bằng các cơ chế giải độc, được kích hoạt phản ứng trực tiếp với sự hiện diện của kim loại [15] Tuy nhiên, những cơ chế giải độc này không chỉ dành riêng cho vi khuẩn phát triển

trong môi trường bị ô nhiễm kim loại [16] Các cơ chế tham gia vào tính kháng kim loại [16] và vi khuẩn có thể sở hữu một hoặc kết hợp một số cơ chế kháng như:

 Loại trừ kim loại bằng hàng rào thấm:

Sự thay đổi trong thành tế bào và màng tế bào vi sinh là những ví dụ về loại

bỏ kim loại bởi hàng rào thấm Cơ chế này là một nỗ lực của VSV để bảo vệ các thành phần tế bào nhạy cảm và thiết yếu với kim loại Vi khuẩn tạo thành một lớp phủ polysaccharide ngoại bào, thể hiện khả năng sinh ra các ion kim loại sinh học

và ngăn cản chúng tương tác với các thành phần tế bào quan trọng Lớp phủ exopolysaccharide của các vi khuẩn này có thể cung cấp các vị trí gắn các cation kim loại [50]

 Vận chuyển kim loại hoạt động:

Vận chuyển chủ động là cơ chế kháng kim loại chính của VSV Cơ chế vận chuyển chủ động của VSV nhằm đưa kim loại độc hại từ tế bào chất ra bên ngoài Các cơ chế này có thể được mã hóa nhiễm sắc thể hoặc plasmid Kim loại không cần thiết đi vào tế bào thông qua hệ thống vận chuyển dinh dưỡng thông thường nhưng có thể được đưa ra nhanh chóng Các hệ thống này có thể không liên kết với ATPase hoặc liên kết với ATPase và rất cụ thể đối với cation hoặc anion mà chúng kháng [51]

 Cố định kim loại trong và ngoài tế bào:

Ức chế nội bào là sự t ch lũy kim loại trong tế bào chất nhờ vi khuẩn để ngăn chặn sự tiếp xúc với các thành phần thiết yếu của tế bào Kim loại thường được cố định là Cd2+

, Cu2+ và Zn2+ Sản xuất metallothionein bởi Synechococcus sp và các protein giàu cystein do Pseudomonas sp [52] là những ví dụ điển hình cho cơ chế

kháng kim loại này Ngoài ra, VSV sản sinh hydrogen sulfide cũng có tác động đáng kể đến độc tính kim loại vì hầu hết các kim loại tạo thành sulfide không hòa tan với hydrogen sulfide Do đó, các vi khuẩn sản sinh hydrogen sulfide có khả năng chống lại các KLN Trong nấm men, dung nạp kim loại thường được liên kết với sản xuất hydrogen sulfide [26]

Sức đề kháng kim loại dựa trên sự hấp thụ ngoài tế bào đã được đưa ra giả thuyết chỉ trong vi khuẩn, nhưng cũng đã được tìm thấy trong một số loài nấm men

và nấm mốc [23] Một trong các dạng kháng Ni2+ trong nấm men có thể dựa trên cơ

chế này Saccharomyces cerevisiae có thể làm giảm hấp thụ Ni2+ bằng cách bài tiết một lượng lớn glutathione có khả năng liên kết với ái lực lớn đối với kim loại nặng [38] Hơn nữa, liên kết hoặc chelate hóa của một kim loại bởi các hợp chất hữu cơ như citric và axit oxalic được sản xuất trong môi trường nuôi cấy VSV cũng ảnh hưởng đáng kể đến độc tính kim loại [48]

 Biến đổi kim loại:

Sự biến đổi sinh học của một số kim loại nặng là một quá trình quan trọng xảy ra ở nhiều môi trường sống và được thực hiện bởi nhiều loại VSV, chủ yếu là vi khuẩn và nấm Một kết quả của hoạt động sinh học, kim loại có thể thay đổi về hóa trị hoặc chuyển đổi thành các hợp chất organometallic [16]

Sự biến đổi liên quan đến những thay đổi trong hóa trị đã được nghiên cứu với thủy ngân Một số loại vi khuẩn và nấm men đã được chứng minh là ảnh hưởng đến việc giảm cation thủy ngân (Hg2+) thành trạng thái nguyên tố (Hg0) [11; 28] Thủy ngân kim loại sau đó được bay hơi để khuếch tán qua màng tế bào và vào môi trường xung quanh

Biến đổi một số kim loại thành hợp chất organometallic bằng cách methyl hóa cũng là một cơ chế giải độc quan trọng Methyl hóa có thể được xúc tác bởi một loạt các VSV: cả hai vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí [56], nấm men và nấm mốc Mặc

dù các sản phẩm methyl hóa có thể độc hại hơn kim loại tự do, nhưng chúng thường

dễ bay hơi và có thể thải vào khí quyển Đây là trường hợp với thủy ngân và các dẫn xuất methyl hóa của nó, metyl và dimethyl Hg

1.4.4 Vi sinh vật kháng nhôm

a cơ chế giải độc kim loại bao gồm đào thải, chelate hóa và trao đổi chất Mặc dù sự đào thải và trao đổi chất của Al3+ chưa được nghiên cứu nhiều, trong khi hàm lượng Al3+

tích tụ trong thực vật được nghiên cứu là có liên quan đến sự tiết axit hữu cơ như là chelate monomeric Al [27] Với một số thực vật tích tụ Al3+

trong lá của chúng có thể giải độc nhôm từ bên trong bằng cách hình thành phức hợp với các axit hữu cơ [22] Axit hữu cơ bài tiết từ rễ tạo các khả năng kết tủa nhôm khác nhau Thứ tự giảm dần khả năng kết tủa nhôm như sau: axit oxalic > axit citric > axit malic > axit succinic [20] Mặt khác, vi khuẩn nốt sần chịu axit và kháng kim loại có thể sản sinh được một lượng exo – polysaccharides (EPS) cao hơn so với các chủng nhạy cảm Người ta cho rằng việc sản sinh EPS là một cách trung hòa với tính độc hại của Al3+ [10] vì EPS có khả năng kết hợp với Al3+, có thể làm giảm đáng kể hoạt động của các ion độc trên bề mặt tế bào Bên cạnh đó,

Flavobacterium sp ST – 3991 đã được báo cáo là tiết ra một số chất như protein

trong quá trình sinh trưởng, phát triển để cố định ion Al3+ và tăng độ pH của môi trường, minh chứng là môi trường nuôi cấy trở nên đục và rất nhớt trong quá trình nuôi cấy chúng [29]

Gần đây, từ các loại đất có tính axit nói chung và các loại đất chè nói riêng, một số loại vi khuẩn chịu được tính axit cao và kháng Al3+, như Cryptococcus, Rhodotorula, Aspergillus, Penicillium, Trichoderma và Flavobacterium… đã được

phân lập [24; 29]

1.4.5 Khả năng loại bỏ kim loại ra khỏi môi trường của vi sinh vật

a) Tiềm năng loại bỏ kim loại của vi sinh vật

 Thành tế bào:

Thành tế bào VSV đóng một vai trò quan trọng trong việc loại bỏ kim loại độc hại Nói chung, thành tế bào VSV, chủ yếu bao gồm polysaccharide, protein và lipid, cung cấp các nhóm chức năng gắn kết kim loại đặc biệt phong phú như carboxylate, hydroxyl, sulphate, phosphate và các nhóm amin [57]

Polyme ngoại bào (exopolymer) được sản xuất bởi vi khuẩn và nấm tạo thành lớp chất nhờn liên kết với các kim loại có thể gây độc [62] Hầu hết trong số này bao gồm polysaccharide và glycoprotein có thể được liên kết với protein Thành

tế bào của vi khuẩn cũng có một số thành phần gắn kim loại góp phần vào quá trình hấp phụ Các nhóm cacboxyl của peptidoglycan là vị trí gắn kết chính trong các thành tế bào Gram dương với các nhóm phosphate góp phần đáng kể trong các sinh

vật Gram âm Chitin là thành phần cấu trúc quan trọng của thành tế bào nấm được coi là chất hấp phụ hiệu quả kim loại [55] Ngoài ra, chitosan và các dẫn xuất chitin khác cũng có khả năng sinh học đáng kể [60]

 Protein gắn kim loại và peptide:

Một số phân tử sinh học được tạo ra khi có sự hiện diện của các kim loại độc hại với chức năng đặc biệt là liên kết các kim loại Các protein liên quan đến kim loại và peptide cụ thể đã được ghi nhận trong tất cả các nhóm vi khuẩn và đặc biệt

là trong một số chủng nấm men được nghiên cứu Thông thường, các metallothionein là các polypeptide giàu cysteine có thể liên kết các kim loại thiết yếu, ví dụ: Cu và Zn cũng như Cd ên cạnh đó, phytochelatein là các peptide ngắn liên quan đến giải độc kim loại nặng trong một số loại nấm mốc và nấm men [37]

b) Cơ chế loại bỏ kim loại của vi sinh vật

Một loạt các cơ chế hóa học và sinh học đã được nghiên cứu là có khả năng loại bỏ các kim loại độc hại Các cơ chế loại bỏ hóa lý có thể bao gồm hấp phụ vật

lý, trao đổi ion và hấp thụ sinh học bởi sinh khối VSV sống và chết [62] Trong các

tế bào sống, sự hấp thụ kim loại có thể chịu ảnh hưởng trực tiếp và gián tiếp bởi cách vận chuyển kim loại qua màng tế bào Hiện tượng này liên quan đến quá trình trao đổi chất của tế bào và tạo ra sự t ch lũy nội bào [57] Một khi ở bên trong tế bào, kim loại có thể được cố định trong các cấu trúc nội bào hoặc bào quan hoặc chuyển sang một cấu trúc nhất định nào đấy tùy thuộc vào các yếu tố liên quan và đối tượng VSV [63]

c) Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hấp thụ kim loại của vi sinh vật

Ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình hấp thụ kim loại của VSV như sau [57]:

 Nhiệt độ dường như không ảnh hưởng đến hiệu suất hấp thụ sinh học trong

khoảng nhiệt độ từ 20oC đến 35oC

 pH được xem là yếu tố quan trọng nhất trong quá trình hấp thụ sinh học bởi vì pH

ảnh hưởng đến trạng thái hóa học của kim loại, hoạt động của các nhóm chức năng trong sinh khối và sự cạnh tranh của các ion kim loại

 Lượng sinh khối trong dung dịch ảnh hưởng đến sự hấp thụ, cụ thể là đối với các

giá trị sinh khối thấp có thể dẫn đến sự tăng hiệu quả hấp thụ

 Hấp thụ sinh học trong một số trường hợp có tính chọn lọc Việc loại bỏ một kim

loại có thể bị ảnh hưởng bởi sự hiện diện của các kim loại khác Sự hấp thụ

Co của các VSV khác nhau bị ức chế hoàn toàn bởi sự hiện diện của U, Pb,

Hg và Cu

Bên cạnh đó, tuổi của giống vi khuẩn cũng có ảnh hưởng đáng kể đến sự hấp thụ kim loại Volesky và May – Phillips 1995 đã báo cáo rằng các tế bào nấm men còn non có hiệu quả hơn trong việc cố định uranium [58]

1.5 Tổng quan về tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật chịu axit và hấp thụ nhôm ở trong và ngoài nước

Hiện nay, việc sử dụng VSV trong xử lý kim loại nói chung và kim loại nặng nói riêng đã được quan tâm ở nhiều quốc gia Trên thế giới, hiện đã có một vài nghiên cứu liên quan đến khía cạnh VSV chịu axit và kháng nhôm trong đất trồng chè như Shigeki Konishi và các cộng sự (1994) nghiên cứu các chủng vi khuẩn chịu axit và kháng nhôm được phân lập từ đất trồng chè, kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuẩn phát triển trong điều kiện nồng độ nhôm Al3+ cao và pH thấp được định danh

là Flavobacterium sp Vi khuẩn này có thể chịu được nồng độ nhôm dưới 2000

mg/l, pH 3,5 Sự phát triển của vi khuẩn bị ảnh hưởng bởi nồng độ ion Al3+ Độ pH của môi trường nuôi cấy không chứa nhôm tăng nhanh đến pH 4,4 sau 10 ngày [29]

Một nhiên cứu khác cũng về các chủng vi khuẩn có khả năng chịu axit và kháng nhôm của Ngô Thị Tường Châu và các cộng sự (2014) cho thấy vi khuẩn

Bacillus sp An 3 (DQ234567) trong đó Bacillus cereus được phân lập từ đất trồng

chè tại Kagoshima, Nhật Bản Vi khuẩn này có khả năng phát triển trên đĩa thạch

S-LB (pH 3,7) với nồng độ nhôm 1000 mg/l và có thể tồn tại trong môi trường nước thịt LB chứa 10000 mg/l Al3+ pH 2,0 Trong môi trường nuôi cấy dịch thể LB, sự phát triển của vi khuẩn bị ức chế khi nồng độ nhôm tăng 0, 100 và 200 mg/l đặc biệt ở nồng độ 200 mg/l Độ pH của môi trường nuôi cấy không chứa nhôm tăng nhanh đến pH 7,0 sau 10 ngày cao hơn so với nghiên cứu của Konishi và các cộng

sự, 1994), trong khi đó nó gần như liên tiếp trong các trường hợp khác Vi khuẩn loại bỏ nhôm ra khỏi môi trường nuôi cấy cũng đã được báo cáo, nhận thấy rõ ràng điều này ở nồng độ 100 mg/l nhôm Do vi khuẩn có khả năng chịu axit cao, kháng

và hấp thụ một lượng nhôm đáng kể nên chúng có thể được ứng dụng để cải thiện đất phèn đặc biệt là đất trồng chè [41]

Ngoài vi khuẩn có khả năng chịu axit, kháng và hấp thụ nhôm như các nghiên cứu trên đã báo cáo thì nấm men cũng đã được nghiên cứu và thấy rằng chúng cũng có khả năng này Điều đó được chứng minh thông qua nghiên cứu của Shinjiro Kanazawa và các cộng sự (2005), nghiên cứu này chỉ ra rằng từ đất trồng chè vùng Kagoshima tại Nhật Bản cũng đã phân lập trên môi trường nuôi cấy YG (gồm: cao nấm men: 1 g, glucozo: 1 g, KH2PO4: 0,2 g, MgSO4.7H2O: 0,2 g, agar:

15 g, nước: 1000 ml, pH 4,0 đến 7,0) được 38 chủng VSV Thêm vào môi trường nuôi cấy YG các nồng độ nhôm khác nhau để đánh giá khả năng hấp thụ nhôm và

đã lựa chọn được 2 chủng nấm men tồn tại và phát triển được ở môi trường chứa nhôm từ nồng độ 100 mM đến 300 mM, pH 3,0 Hai chủng nấm men này được

định danh là Cryptococcus sp và Candida palmioleophila qua phương pháp phân

tích trình tự nucleotide của 28S rDNA Để đánh giá khả năng chịu axit của các chủng nấm men tác giả điều chỉnh các giá trị pH khác nhau trong môi trường nuôi cấy YG dịch thể Sau khi nuôi cấy tác giả nhận thấy các chủng nấm men có thể phát triển được trong điều kiện nuôi cấy có độ axit cao (pH 2,0) Bên cạnh đó tác giả sử dụng phương pháp ICP- MS để xác định lượng nhôm được loại bỏ sau khi nuôi cấy nấm men trên môi trường YG Kết quả cho thấy lượng nhôm trong môi trường YG giảm đáng kể Có thể thấy các chủng nấm men này có khả năng chịu axit, kháng với nồng độ nhôm cao và loại bỏ nhôm đáng kể nên các chủng nấm men này có tiềm năng ứng dụng trong đất trồng chè có chứa hàm lượng nhôm cao [25]

Nghiên cứu của Genhe He và các cộng sự (2016) ở đất trồng chè vùng Jiangxi, Trung Quốc cũng đã phân lập được 8 chủng nấm mốc có khả năng chịu axit, kháng và hấp thụ nhôm cao Và hai chủng nấm mốc có khả năng phát triển được trên môi trường nuôi cấy chứa nồng độ dưới 550 mM và pH (3,20-3,11 đã

được tuyển chọn và dựa vào phương pháp phân t ch trình tự nucleotide của 26S

rDNA định danh hai chủng nấm mốc đó là Eupenicillium và Trichocomaceae [18]

Tại Việt Nam, hiện nay chưa có nghiên cứu nào về hệ VSV chịu axit và có khả năng hấp thụ nhôm tại đất trồng chè Chính vì vậy nghiên cứu này có ý nghĩa thực tiễn nhằm bổ sung dữ liệu sơ bộ về hệ sinh thái VSV của đất trồng chè, góp phần quan trọng trong việc phát triển ngành chè bền vững

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng VSV (vi khuẩn và nấm mốc) chịu axit và hấp thụ nhôm phân lập được từ đất trồng chè vùng Tân Cương, Thái Nguyên

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu thập tài liệu sơ cấp và thứ cấp

Các thông tin phục vụ cho luận văn được thu thập từ nhiều nguồn tài liệu khác nhau:

- Các thông tin về điều kiện tự nhiên, kinh tế xã hội, thực trạng đất trồng chè,… được thu thập tại thôn Soi Vàng và thôn Hồng Thái, xã Tân Cương, thành phố Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên từ sách, báo, internet,…

- Các tài liệu liên quan đến khả năng chịu axit và hấp thụ nhôm của các chủng VSV được thu thập từ sách, các bài báo khoa học, báo cáo chuyên đề,…

2.2.2 Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu

- Địa điểm thu mẫu: Các mẫu đất được thu tại một số vườn chè tại thôn Soi Vàng và thôn Hồng Thái, xã Tân Cương, thành phố Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Bảng ký hiệu mẫu đất

TT Ký hiệu mẫu đất Đặc điểm chi tiết mẫu đất

1 MĐ1 Là loại đất màu đất thịt pha cát) được thu từ vùng đất

trồng chè đã canh tác 30 – 40 năm tại thôn Soi Vàng

2 MĐ2 Là loại đất được thu từ vùng đất trồng chè đã canh tác

được 3 năm tại thôn Hồng Thái

3 MĐ3 Là loại đất được thu từ vùng đất trồng chè đã canh tác

được trên 10 năm tại thôn Hồng Thái

- Phương pháp thu mẫu: Lấy mẫu đất theo phương pháp lấy mẫu hỗn hợp Mẫu đất được lấy ở tầng mặt có độ sâu 0 – 20 cm (TCVN 5297:1995) Các mẫu đất được lấy trên vùng đất đại diện theo quy tắc đường thẳng góc hoặc đường dích dắc nhằm

phân bố đều vị trí các mẫu trên vùng đất Tránh lấy mẫu đất nông hóa ở các vị trí đặc biệt như nơi tập trung phân gia súc, phân vô cơ, vôi… và những vị trí gần bờ Mật độ mẫu đất hỗn hợp phụ thuộc vào địa hình, đặc điểm đất đai, đặc điểm cây trồng và yêu cầu nghiên cứu Mỗi mẫu đất hỗn hợp gồm 10 mẫu đất riêng biệt trộn đều với nhau cho đến khi mẫu cuối cùng đạt khối lượng khoảng 1 kg/mẫu

- Phương pháp xử lý và bảo quản mẫu: Mẫu đất sau khi thu về được rây qua rây 2

mm để loại bỏ sỏi, đá, xỉ và các tạp chất sau đó bảo quản trong túi plastic, bọc kín, dán nhãn và bảo quản ở 4oC

 Độ ẩm: xác định theo phương pháp khối lượng (TCVN 4048:2011)

 Hàm lượng C tổng số: Phương pháp Walkley – Black (TCVN 8941:2011)

 Hàm lượng N tổng số: Phương pháp Kjeldahl (TCVN 6498:1999)

 Hàm lượng Al3+

tổng số: xác định bằng phương pháp quang phổ phát xạ nguyên

tử (ICP – OES OPTIMA 7300V), phá mẫu theo TCVN 7370-1:2004

 Mật độ VSV tổng số:

- Chuẩn bị các bình tam giác chứa môi trường thạch – nước thịt – pepton (Bảng 2.2), khử trùng bằng nồi hấp áp lực (autoclave) ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút, sau đó phân phối vào các đĩa petri vô trùng, để yên trong 30 phút cho thạch đông

Bảng 2.2 Thành phần môi trường nước thịt pepton

- Pha loãng các mẫu đất đã qua xử lý thành các mẫu có độ pha loãng khác nhau bằng nước cất (10-2 đến 10-5)

- Nhỏ 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng vào bề mặt của đĩa môi trường và gạt đều

- Nuôi cấy trong tủ ấm ở 30oC trong 2 ngày

- Đếm số khuẩn lạc mọc trên các đĩa môi trường và xác định mật độ VSV tổng số theo công thức sau:

M (CFU/g) = C1 + + Ci

n1Vf1 + + niVfi M: số tế bào đơn vị hình thành khuẩn lạc) VSV trong 1 g đất tươi

Ci: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ở độ pha loãng i

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa

fi: hệ số pha loãng tương ứng (10-1 10-i)

ni: số lượng đĩa tương ứng với mỗi một hệ số pha loãng (1, 2, 3, )

2.2.4 Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật chịu axit và hấp thụ nhôm

 Phương pháp chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy: rửa sạch, sấy khô, bao gói và khử trùng bằng nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 15 phút

 Phương pháp chuẩn bị dung dịch nhôm:

- Pha các dung dịch nhôm với nồng độ khác nhau từ muối Al2(SO4)3.18H2O

- Điều chỉnh pH 3,0 đối với tất cả các dung dịch nhôm đã pha

 Phương pháp chuẩn bị các đĩa môi trường chứa nhôm:

- Sau khi khử trùng các môi trường nuôi cấy (pH 3,0) phù hợp cho nhóm VSV khác nhau (bảng 2.3) ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút, dung dịch nhôm sẽ được thêm vào từng môi trường nuôi cấy riêng biệt một cách vô trùng (sử dụng các màng lọc khuẩn có k ch thước lỗ lọc 0,2 µm để đạt được các nồng độ nhôm mong muốn Phân phối vào các đĩa petri

Bảng 2.3 Thành phần môi trường của các chủng vi sinh vật

Môi trường Hansen

 Phương pháp pha loãng mẫu đất: Tiến hành pha loãng các mẫu đất đã qua xử lý

thành các mẫu có độ pha loãng khác nhau bằng nước cất (10-2 đến 10-5)

 Phương pháp phân lập:

- Nhỏ 0,1 ml mẫu đã pha loãng vào mỗi đĩa thạch đã chuẩn bị ở trên với nồng độ

nhôm là 100 mg/l, sử dụng que gạt trải đều trên đĩa rồi nuôi cấy tại nhiệt độ

30oC trong 5 – 7 ngày

- Sau thời gian nuôi cấy, chọn các khuẩn lạc riêng biệt có hình thái đặc trưng mọc

trên các đĩa thạch, cấy truyền ra các ống thạch nghiêng chứa môi trường phù hợp với từng nhóm VSV (không có nhôm để giữ giống

Tất cả các thí nghiệm trên đều được thực hiện trong điều kiện môi trường sạch và thao tác trong tủ cấy vô trùng, mỗi thí nghiệm đều được làm lặp lại ít nhất 3 lần

2.2.5 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng chịu axit và hấp thụ nhôm cao từ các chủng được phân lập

Nghiên cứu được thực hiện trên môi trường thạch đĩa:

- Chuẩn bị các đĩa thạch chứa nhôm tương tự như trên với các nồng độ nhôm

tăng dần (300 mg/l, 500 mg/l, 700 mg/l)

- Sử dụng que cấy móc để cấy từng khuẩn lạc từ các ống thạch nghiêng vào mỗi

đĩa thạch với từng nồng độ nhôm

- Với mỗi nồng độ nhôm thay đổi, nuôi cấy tại nhiệt độ 30oC trong 2 – 3 ngày để

xác định khả năng kháng nhôm của các chủng

- Sau 2 – 3 ngày nuôi cấy, kiểm tra các đĩa môi trường rồi xác định khuẩn lạc đáp

ứng hai trong ba tiêu chí (tiêu chí 1 và 2 hoặc 1 và 3) rồi tuyển chọn:

2.2.6.1 Phương pháp định danh dựa vào đặc điểm hình thái

Hình thái tế bào của các chủng VSV tuyển chọn được quan sát dưới kính hiển vi quang học và được chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử sau một tuần nuôi cấy Tế bào vi khuẩn được nhuộm Gram

2.2.6.2 Định danh bằng phương pháp phân tử

Để xác định chính xác tên giống- loài- chủng của các chủng VSV nghiên cứu

đề tài sử dụng phương pháp phân tử Các mẫu VSV tuyển chọn đã thuần khiết được gửi đến phòng xét nghiệm công ty trách nhiệm hữu hạn và dịch vụ Nam Khoa để định danh bằng phương pháp phân tử Đặc điểm di truyền (dựa vào trình tự 16S rRNA đối với vi khuẩn) và 28S rRNA đối với nấm)) được phòng thực hiện theo các bước như sau:

- Chuẩn bị mẫu cấy thuần khiết

Lấy 5 µl mẫu cho vào phản ứng PCR để khuếch đại đặc hiệu đoạn ADN trên vùng gen 16S rRNA đối với vi khuẩn); vùng gen 28S rRNA đối với nấm) bằng hệ thống máy PCR Thermal Cycler của Bio-Rad

Bảng 2.4 Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR

- Tinh sạch sản phẩm PCR:

Thực hiện tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ QIA quick PCR Purification Kit của QIAGEN

Điện di kết quả tinh sạch: điện di kiểm tra kết quả sản phẩm ADN bằng máy

hệ thống máy Agilent 2100 Bioanalyzer

- Giải trình tự gen: PCR SEQ sản phẩm đã tinh sạch trước khi giải trình tự trên hệ thống máy ABI 3130XL

- Phương pháp phân tích số liệu:

Phân tích kết quả bằng phần mềm Sequecing analysis 5.3

So với kết quả trên ngân hàng gen và ngân hàng dữ liẹ u NC I National Center for iotechnology Information bằng phần mềm LAST SEARCH asic Local Alignment Search Tool)

2.2.7 Phương pháp nghiên cứu khả năng chịu axit của các chủng vi sinh vật được tuyển chọn

Nghiên cứu các chủng VSV được tuyển chọn trong môi trường dịch thể phù hợp với từng nhóm VSV:

- Pha độ đục chuẩn McFarland đối với các chủng vi khuẩn) (Phụ lục 1)

- Chuẩn bị các môi trường dịch thể phù hợp với từng nhóm VSV (môi trường

không chứa thạch) có chứa 100 mg/l nhôm tương tự như trên , chia đều dịch

ra các bình nón rồi điều chỉnh pH của môi trường và pH dung dịch nhôm từ

pH 3,0 giảm dần xuống đến pH 2,2 bằng dung dịch NaOH hoặc HCl Thêm một bình với pH 5,0 để đối chứng

- Nhỏ cùng một thể tích dịch huyền phù các chủng vi khuẩn vào các bình nón chứa

dịch thể Giống nấm mốc được cấy chuyển từ các ống thạch nghiêng vào các bình nón chứa dịch thể, nút kín miệng bình

- Đặt các bình nón cố định trong tủ ấm lắc tạo môi trường, thiết lập chương trình

chạy máy với tốc độ lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ 30oC Bật tủ lắc trong vòng

5 ngày

- Sau 5 ngày nuôi cấy, ly tâm dịch thể với tốc độ 3000 vòng/ phút trong 15 phút rồi

lọc thu sinh khối Đánh giá khả năng chịu axit của các chủng thông qua sinh khối thu được

- Riêng đối với vi khuẩn do sinh khối tạo thành nhỏ nên đề tài tiến hành nuôi cấy

cùng một thể tích dịch huyền phù các chủng vi khuẩn trên các môi trường thạch đĩa có chứa 100 mg/l nhôm và pH khác nhau; gạt đều trên đĩa Sau 5 ngày nuôi cấy đếm khuẩn lạc trên đĩa đối với vi khuẩn) để đánh giá khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn

2.2.8 Nghiên cứu khả năng hấp thụ nhôm của các chủng vi sinh vật được tuyển chọn

- Pha độ đục chuẩn McFarland đối với các chủng vi khuẩn) (Phụ lục 1)

- Chuẩn bị các môi trường dịch thể phù hợp vời từng nhóm VSV (môi trường

không chứa thạch) có chứa nhôm tương tự như trên với các nồng độ nhôm

tăng dần từ 0 – 2000 mg/l Điều chỉnh pH 3,0 đối với cả môi trường và dung dịch nhôm

- Nhỏ cùng một thể tích dịch huyền phù của các chủng vi khuẩn vào các bình nón

chứa dịc thể Giống nấm mốc được cấy chuyển từ các ống thạch nghiêng vào các bình nón chứa dịch thể, nút kín miệng bình

- Đặt các bình nón cố định trong tủ ấm lắc tạo môi trường, thiết lập chương trình

chạy máy với tốc độ lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ 30oC Bật tủ lắc trong vòng

5 ngày

- Sau 5 ngày, ly tâm dịch thể với tốc độ 3000 vòng/phút trong 15 phút, lọc tách

sinh khối và dịch lọc Sinh khối sau khi thu được đem đi sấy khô đến khi khối lượng không đổi Tiếp tục ly tâm dịch lọc, sau đó phần dịch được qua màng lọc vô trùng k ch thước lỗ 0,25 µm Đánh giá khả năng kháng nhôm dựa vào sinh khối thu được và khả năng hấp thụ nhôm dựa vào nồng độ nhôm còn lại trong dịch sau nuôi cấy được xác định bằng phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử

- Riêng đối với vi khuẩn do sinh khối tạo thành nhỏ nên đề tài tiến hành nuôi cấy

cùng một thể tích dịch huyền phù các chủng vi khuẩn trên các môi trường thạch đĩa có chứa nồng độ nhôm tăng từ 0 – 2000 mg/l và pH 3,0; gạt đều trên đĩa Sau 5 ngày nuôi cấy đếm khuẩn lạc trên đĩa đối với vi khuẩn để đánh giá khả năng kháng nhôm của các chủng vi khuẩn

2.2.9 Phương pháp sơ bộ đánh giá khả năng ứng dụng hỗn hợp vi sinh vật nhằm hạn chế hàm lượng nhôm linh động trong đất trồng chè

Để đánh giá khả năng ứng dụng hỗn hợp VSV nhằm hạn chế hàm lượng nhôm linh động trong đất trồng chè tiến hành nuôi cấy các chủng VSV trong môi trường đất của khu vực nghiên cứu quy mô phòng thí nghiệm:

ước 1: Nhân giống tạo hỗn hợp sinh khối của các chủng VSV:

- Chuẩn bị các môi trường dịch thể (không chứa thạch và không chứa nhôm) phù

hợp với các chủng VSV (các chủng vi khuẩn được nuôi trong môi trường

LB, các chủng nấm mốc được nuôi trong môi trường Hansen) Khử trùng

100 ml môi trường dịch thể đã được phân phối vào bình nón

- Sử dụng que cấy móc, cấy truyền từng khuẩn lạc của các chủng VSV từ ống

nghiệm giống vào các bình nón chứa dịch thể, nút kín miệng bình

- Đặt các bình nón cố định trong tủ ấm lắc tạo môi trường, thiết lập chương trình

chạy máy với tốc độ lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ 30oC Bật tủ lắc trong vòng

7 ngày nhằm tăng sinh khối

- Sau 7 ngày, ly tâm dịch thể với tốc độ 3000 vòng/phút trong 15 phút rồi thu sinh

Cân 100 g đất của mẫu đất trồng chè MĐ1 vào bình đã khử trùng và bổ sung

5 mg hỗn hợp sinh khối trên phân phối đều vào trong mẫu đất

Do khả năng chịu axit của nấm mốc thường cao hơn so với vi khuẩn Nên nấm mốc được cho là chiếm ưu thế trong tổng số VSV chịu axit và kháng nhôm

Mặt khác, trong quá trình nghiên cứu chủng nấm mốc Penicillium janthinellum F17

có hiệu suất hấp thụ nhôm là lớn hơn cả so với hai chủng nấm mốc còn lại nên tôi

bố trí thêm mẫu đất có bổ sung chủng nấm mốc Penicillium janthinellum F17 nhằm

đánh giá tiềm năng ứng dụng của chủng F17 so với hỗn hợp VSV Cân 5 mg sinh khối của chủng nấm mốc F17 sau đó phân phối vào 100 g đất của mẫu đất trồng chè MĐ1 do chủng nấm mốc F17 có hiệu suất hấp thụ nhôm tương đối cao nên đã được lựa chọn để thử nghiệm

Thực tế trong đất đã chứa hệ VSV đất hoạt động thường xuyên, chính vì vậy

để đánh giá khả năng ứng dụng của các chủng VSV nghiên cứu tôi bố trí thêm mẫu đối chứng (mẫu đất không bổ sung VSV) Chuẩn bị thêm 100 mg đất không bổ sung hỗn hợp VSV vào bình đã khử trùng để đối chứng

Sau đó sử dụng giấy bạc đậy kín các miệng bình

ước 3: Tiến hành ủ mẫu đất đã bổ sung hỗn hợp sinh khối của các chủng VSV ở nhiệt độ 30oC trong 7 ngày

Sau 7 ngày xác định hàm lượng nhôm linh động trong các mẫu đất trồng chè (mẫu đối chứng) và mẫu đất sau khi ủ (mẫu thí nghiệm để so sánh và đánh giá khả năng ứng dụng các chủng VSV nghiên cứu vào thực tiễn

2.2.10 Phương pháp xử lý số liệu

Dựa vào các số liệu thứ cấp và số liệu phân tích trong phòng thí nghiệm, xử

lý số liệu bằng phần mềm thống kê trong Excel và phương pháp thống kê sinh học như đếm số lượng, tính toán mật độ VSV và lấy giá trị trung bình

3.1 Một số tính chất cơ bản và hàm lượng nhôm tổng số của đất trồng chè vùng Tân Cương, Thái Nguyên

3.1.1 Một số chỉ tiêu lí, hóa học của đất

Nhận thấy đất tại khu vực xã Tân Cương là đất phù sa cổ Đất có đặc điểm chung là màu vàng đậm và nhiều đá sỏi xen lẫn với các k ch thước khác nhau Phân tích các chỉ tiêu lí, hóa học của các mẫu đất thuộc khu vực nghiên cứu, tôi thu được kết quả (Bảng 3.1) và một số nhận xét như sau:

Bảng 3.1 Một số chỉ tiêu lí, hóa học của các mẫu đất nghiên cứu

Mẫu pH (H2O) Độ ẩm

(%)

Nhôm tổng số (mg/kg đất)

dao động từ 3,46 - 4,29 Đất biểu hiện bị chua hóa có thể do hoạt động thâm canh, nhất là mức độ sử dụng phân lân cao liên tục trong những năm gần đây ở khu vực nghiên cứu Thêm vào đó, theo khảo sát thì hàng năm các hộ trồng chè còn bổ sung thêm một lượng lớn các vật liệu hữu cơ để ủ gốc cho chè, thời gian dài quá trình phân hủy các vật liệu hữu cơ này cũng sinh ra các axit hữu cơ, từ đó làm tăng độ chua của đất Mẫu MĐ1 có giá trị pH rất thích hợp cho việc trồng chè, trong khi đó mẫu MĐ2 và MĐ3 giá trị pH tương đối thấp (pH (H2O) 3,68 và 3,46) Với các giá trị pH này của đất, cây chè vẫn có khả năng th ch nghi cho dù không phải ở phạm vi tốt nhất Theo thời gian, đất trở nên chua hơn bởi việc sử dụng HCBVTV, tạo điều kiện cho sự t ch lũy Al3+ tăng cao

b) Độ ẩm

Nước là yếu tố vô cùng quan trọng cho sự phát triển của cây trồng Cây trồng sống và phát triển được nhờ chất dinh dưỡng trong đất và được nước h a tan, đưa lên cây qua hệ thống rễ Nước giúp cây trồng thực hiện các quá trình vận chuyển các chất khoáng trong đất giúp điều kiện quang hợp, hình thành sinh khối tạo nên sự sinh trưởng của cây trồng Nước cũng là yếu tố ch nh tạo độ ẩm cho đất Đối với các loại đất trồng nói chung thì độ ẩm dao động từ 40 – 80 %, tuy nhiên với đất chè thì không cần độ ẩm cao bởi đây không phải là loại cây trồng ưa ẩm Theo nghiên cứu của một số công trình, độ ẩm của đất trồng chè cao nhất là vào mùa mưa tháng

5 – 9 hàng năm , khoảng 34 – 37 % và thấp nhất là vào mùa khô tháng 10 đến tháng 3 năm sau , khoảng 20 – 23 % [4]

Đất chè vùng Tân Cương, Thái Nguyên được thu mẫu nghiên cứu vào tháng 2/2018 có độ ẩm trung bình, từ 27,7 – 28,0% Tại trước thời điểm thu mẫu 2 – 3 ngày, ở địa phương có mưa phùn nhỏ, tuy nhiên lượng mưa không đáng kể nên không ảnh hưởng đến độ ẩm khi thu mẫu Với độ ẩm khoảng 28 % là khoảng độ ẩm

th ch hợp cho sự phát triển của cây chè Đất chè có độ ẩm trung bình cây chè vẫn có thể th ch nghi và sinh trưởng tốt, tuy nhiên việc bổ sung nước tưới cho đất chè vẫn

cao hơn

c) Hàm lượng nitơ tổng số trong đất

Nitơ đạm) là một trong những nguyên tố dinh dưỡng quan trọng trong cây trồng Đạm là yếu tố dinh dưỡng hàng đầu để nâng cao năng suất chè Có thể nói phân đạm là yếu tố then chốt tạo điều kiện sinh trưởng và phát triển của cây chè Cung cấp đầy đủ đạm, chè phát triển nhanh, cây tăng chiều cao, ra nhiều lá và búp mới Thiếu đạm hoặc thừa đạm làm cho cây sinh trưởng phát triển kém, ít nảy chồi, búp bé, sức chống chịu kém, năng suất thấp, chất lượng giảm

Hầu hết nitơ trong đất đều ở dạng hữu cơ 95 – 99%), chỉ một phần rất nhỏ là

ở dạng vô cơ 1 – 5%) Nts trong đất là một chỉ tiêu thường được phân t ch để đánh giá độ phì nhiêu tiềm tàng của đất Theo kết quả nghiên cứu một số chỉ tiêu của đất trồng chè với các mức độ thâm canh khác nhau ở một số khu vực tại Tân Cương, Thái Nguyên, hàm lượng Nts trong các mẫu đất dao động từ 0,16 – 0,22% Nts ở mức giàu khi đất ở mức độ thâm canh cao [1] Kết quả phân tích đất trồng chè Tân Cương, Thái Nguyên tại thời điểm nghiên cứu dao động từ 0,11 – 0,3% Như vậy, hàm lượng Nts của các mẫu đất chênh lệch khá lớn Điều này có thể được giải thích

do các mẫu đất khác nhau về tính chất đất và có thời gian canh tác là khác nhau: Mẫu đất MĐ2 là mẫu được thu tại khu vực mới được canh tác 3 năm nên lượng đạm bón vào đất tích tụ còn ở mức thấp nên hàm lượng Nts = 0,11 % là thấp nhất trong

ba mẫu đất Còn mẫu MĐ3 có hàm lượng Nts cao nhất trong ba mẫu và cũng thuộc mức cao so với các mẫu đất trồng khác do đây là mẫu được thu tại đồi chè canh tác trên 10 năm, lượng phân đạm và phân hữu cơ được bón vào đất tồn lưu là rất lớn Đối với mẫu đất MĐ1 là mẫu đất cát pha thịt với hàm lượng mùn sẵn có cao nên việc bổ sung đạm là không nhiều so với hai mẫu đất sỏi cơm trên đồng thời đây là khu vực đã được canh tác lâu năm nhất trong ba mẫu nên hàm lượng Nts ở mức trung bình là 0,2 %, đây cũng là mức thích hợp với cây chè, giúp cung cấp đủ nitơ

để cây chè phát triển tốt

d) Hàm lượng cacbon tổng số trong đất