NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GEN TRONG CON ĐƯỜNG HOẠT HÓA THỤ THỂ DIOXIN Ở NGƯỜI PHƠI NHIỄM DIOXIN TẠI ĐÀ NẴNG

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Đoàn Thị Thu Hương NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GEN TRONG CON ĐƯỜNG HOẠT HÓA THỤ THỂ DIOXIN Ở NGƯỜI PHƠI NHIỄM DIOXI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đoàn Thị Thu Hương

NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GEN TRONG CON ĐƯỜNG HOẠT HÓA THỤ THỂ DIOXIN

Ở NGƯỜI PHƠI NHIỄM DIOXIN TẠI ĐÀ NẴNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đoàn Thị Thu Hương

NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GEN TRONG CON ĐƯỜNG HOẠT HÓA THỤ THỂ DIOXIN

Ở NGƯỜI PHƠI NHIỄM DIOXIN TẠI ĐÀ NẴNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Trung Nam

PGS.TS Nguyễn Lai Thành

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành đề tài luận văn một cách hoàn chỉnh, bên cạnh sự nỗ lực cố gắng của bản thân còn có sự hướng dẫn nhiệt tình của các quý thầy cô, cũng như sự giúp đỡ, tạo điều kiện của Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp trong suốt thời gian học tập nghiên cứu và thực hiện luận văn thạc sĩ

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến TS Nguyễn Trung Nam, PGS.TS Nguyễn Lai Thành và TS Hoàng Thị Thu Hằng đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể cán bộ trong phòng Công nghệ ADN Ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu và thực hiện đề tài luận văn

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn đến gia đình, các anh chị và các bạn đồng nghiệp đã hỗ trợ cho tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh

Hà Nội, ngày tháng năm

Học viên thực hiện

Đoàn Thị Thu Hương

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Học viên

Đoàn Thị Thu Hương

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2

1.1 Giới thiệu chung về dioxin 2

1.2 Ảnh hưởng của dioxin tới sức khỏe con người 4

1.3 Cơ chế hoạt hóa dioxin trong tế bào 5

1.4 Vai trò của Cyp1b1 và Cyp1a1 trong con đường hoạt hóa dioxin (dioxin – Ahr – Cyp) 8

1.5 Vai trò của AhrR trong con đường truyền tín hiệu dioxin receptor 12

1.6 Nghiên cứu phân tích và khắc phục hậu quả của chất dioxin trong chiến tranh Việt Nam 14

Chương 2: MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 18

2.2 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 18

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2.2 Phạm vi nghiên cứu 19

2.3 Nội dung nghiên cứu 19

2.4 Phương pháp nghiên cứu 19

2.4.1 Phương pháp tách RNA từ máu tổng số 20

2.4.2 Phương pháp tổng hợp cDNA 21

2.4.3 Phương pháp real time PCR 23

2.4.4 Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng Realtime PCR 26

2.4.5 Phương pháp thống kê, phân tích và xử lý số liệu 26

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Tách chiết RNA của nhóm người phơi nhiễm dioxin và nhóm đối chứng khỏe mạnh 27

3.2 Xác định các điều kiện tối ưu cho phản ứng real-time PCR với các cặp mồi đặc hiệu 29

3.2.1 Xác định các điều kiện tối ưu cho phản ứng real-time PCR với cặp mồi Cyp1a1 29

3.2.2 Xác định các điều kiện tối ưu cho phản ứng real-time PCR với cặp mồi Cyp1b1 31

3.2.3 Xác định các điều kiện tối ưu cho phản ứng real-time PCR với cặp mồi AhrR 34

3.3 Định lượng tương đối gen Cyp1a1 giữa nhóm phơi nhiễm dioxin và nhóm đối chứng khỏe mạnh 36

3.4 Định lượng tương đối gen Cyp1b1 giữa nhóm phơi nhiễm dioxin và nhóm đối chứng khỏe mạnh 39

3.5 Định lượng tương đối gen AhrR giữa nhóm phơi nhiễm dioxin và nhóm đối chứng khỏe mạnh 42

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

4.1 Kết luận 49

4.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Độ độc của các đồng phân Dioxin [8,9] 3 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA (theo ThermoFisher, #K1621) 22 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng và thể tích của phản ứng tổng hợp cDNA 22 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp cDNA 22

Bảng 2.4 Trình tự mồi các gen AhrR, Cyp1A1, Cyp1B1 và β-actin sử dụng trong

phản ứng real time PCR 26 Bảng 3.1 Kiểm tra RNA tổng số tách chiết từ các mẫu máu bằng dung dịch

Trizol™LS 28 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi đến độ đặc hiệu của sản phẩm PCR 29 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ mồi đến độ đặc hiệu của sản phẩm PCR 30

Bảng 3.4 Xác định chu kì ngưỡng phát hiện gen Cyp1a1 với các mẫu cDNA 31

ở những độ pha loãng khác nhau 31 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi đến độ đặc hiệu của sản phẩm PCR 32 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ mồi đến độ đặc hiệu của sản phẩm PCR 32

Bảng 3.7 Xác định chu kì ngưỡng phát hiện gen Cyp1b1 với các mẫu cDNA ở

những độ pha loãng khác nhau 33 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi đến độ đặc hiệu của sản phẩm PCR 34 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ mồi đến độ đặc hiệu của sản phẩm PCR 35

Bảng 3.10 Xác định chu kì ngưỡng phát hiện gen AhrR với các mẫu cDNA 35 Bảng 3.11 Xác định chu kì ngưỡng gen Cyp1a1 và β-actin của nhóm phơi nhiễm

Bảng 3.15 Xác định giá trị chu kì ngưỡng gen Cyp1b1 và β-actin của nhóm đối

chứng khỏe mạnh 40

Bảng 3.16 So sánh sự biểu hiện của gen Cyp1b1 giữa nhóm người phơi nhiễm

dioxin và nhóm đối chứng khỏe mạnh 41

Bảng 3.17 Đánh giá chu kì ngưỡng các gen AhrR và β-actin của nhóm phơi nhiễm

dioxin 43

Bảng 3.18 Giá trị chu kì ngưỡng các gen AhrR và β-actin của nhóm đối chứng

khỏe mạnh 44

Bảng 3.19 So sánh biểu hiện gen AhrR giữa nhóm người phơi nhiễm dioxin và

người không nhiễm dioxin 44

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của một số phối tử điển hình của Ahr [15,57] 7

Hình 1.2 Cơ chế hoạt hóa Ahr dưới sự cảm ứng của phối tử [47] 7

Hình 1.3 Kích hoạt chuyển hóa các chất gây ung thư dibenzo[a,l]pyrene (DB[a, l]P) (A) và 7,12-Dimethyl benzanthracene (7, 12-DMBA) (B) thành vùng epoxides bằng P450 và edoxides hydrolase [56] 8

Hình 1.4 Sự tham gia của các enzyme thuộc họ P450 trong pha I của quá trình chuyển hóa thuốc ở người [18] 9

Hình 1.5 Vị trí và cấu trúc gen Cyp1a1 của người [65] 10

(Các exon được đánh số theo thứ tự từ 1 đến 7) 10

11

Hình 1.6 Vị trí và cấu trúc gen Cyp1b1 của người [65] 11

(Các exon được đánh số theo thứ tự từ 1 đến 3) 11

Hình 1.7 Sự tham gia của CYP1A/B trong quá trình chuyển hóa hydrocacbon đa vòng thơm [50] 12

Hình 1.8 Vị trí và cấu trúc gen AhrR của người [62] 13

(Các exon được đánh số theo thứ tự từ 1 đến 10) 13

13

Hình 1.9 Các giả định về cơ chế hoạt động của AhrR [54] 13

Hình 1.10 Bản đồ phân bố chất độc màu da cam ở miền Nam Việt Nam [58] 16

Hình 2.1 Đường biển diễn chuẩn xác định mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng (Ct) với số lượng copies DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng 24

Hình 3.1 Xây dựng đường chuẩn và xác định hiệu suất của phản ứng PCR với cặp mồi Cyp1a1-F/R 31

Hình 3.2 Xây dựng đường chuẩn và xác định hiệu suất của phản ứng PCR với cặp mồi Cyp1b1-F/R 34

Hình 3.3 Xây dựng đường chuẩn và xác định hiệu suất của 36

phản ứng PCR với cặp mồi AhrR-F/R 36

Hình 3.4 Biểu đồ định lượng tương đối của gen Cyp1a1 ở nhóm người phơi nhiễm dioxin (DN) so với nhóm người không nhiễm dioxin (CT) **, p<0.01; số phản

ứng lặp lại cho mỗi mẫu máu là 2 39

Hình 3.5 Biểu đồ định lượng tương đối của gen Cyp1b1 ở nhóm người phơi nhiễm dioxin (DN) (n=14) so với nhóm đối chứng khỏe mạnh (CT) (n=13) *, p<0.05; số

phản ứng lặp lại cho mỗi mẫu máu là 2 41

Hình 3.6 Biểu đồ định lượng tương đối của gen AhrR ở nhóm người phơi nhiễm dioxin (DN) so với nhóm người không nhiễm dioxin (CT) **, p<0.01; số phản ứng

lặp lại cho mỗi mẫu máu là 2 45

Hình 3.7 Sơ đồ giả định sự kích hoạt các gen trong con đường Ahr cổ điển và phi

cổ điển bởi dioxin [30] (Sự tăng cường biểu hiện của Ahr (1), AhrR (2) và

Cyp1a1/b1 (3) được phát hiện ở những người phơi nhiễm dioxin tại Đà Nẵng) 46 Hình 3.8 Mối tương quan giữa gen AhrR và Cyp1b1 47 Hình 3.9 Mối tương quan giữa gen AhrR và Cyp1a1 48

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AHRR Aryl hydrocarbon receptor repressor

7, 12-DMBA 7,12-Dimethyl benzanthracene

FICZ 6-formylindolo[3,2-b]carbazole

ITE 2-(1'H-indole-3'-carbonyl)-thiazole-4-carboxylic acid methyl ester

NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

p38MAPK p38 mitogen-activated protein kinases

ĐẶT VẤN ĐỀ

Aryl hydrocarbon receptor (Ahr) hay còn gọi là dioxin receptor là một nhân

tố phiên mã, điều khiển rất nhiều các phản ứng của tế bào chống lại các độc tố và các tác nhân gây hại xâm nhập từ ngoài môi trường cũng như hình thành bên trong

cơ thể Ahr phân bố khắp cơ thể, đặc biệt là ở những hàng rào bảo vệ cơ thể như da, phổi, ruột và tham gia trực tiếp vào các đáp ứng miễn dịch với các tác nhân bất lợi cho cơ thể Khi được hoạt hóa, Ahr tạo phức hợp với nhân tố dẫn truyền nhân (Ahr nuclear translocator-Arnt) và gắn với các yếu tố đáp ứng dioxin (dioxin receptor element-DRE) trên promoter của các gen đích trong họ cytochrome P450 (CYP) tạo

ra sự phiên mã của các gen đích bao gồm CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1 và Ahr repressor (AhRR) Ngoài Arnt, Ahr cũng tương tác với các yếu tố khác và điều

khiển hoạt động sản xuất các cytokine viêm thông qua các cơ chế đặc hiệu

Gần đây, đã có công trình tại Việt Nam nghiên cứu sự thay đổi về biểu hiện của một số gen trong con đường hoạt hóa thụ thể dioxin Những công trình này đã

chứng minh sự tăng cường hoạt động của gen Ahr và các gen mã hóa một số cytokine viêm như IL-1b, TNFa và IL-6 ở các bệnh nhân phơi nhiễm dioxin tại Việt

Nam Tuy nhiên, để hiểu rõ hơn về mối liên quan giữa cơ chế tác động của dioxin lên bệnh nhân phơi nhiễm dioxin, việc tiếp tục nghiên cứu sự biểu hiện của các gen

như Cyp1a1, Cyp1b1 và AhrR trong con đường hoạt hóa thụ thể dioxin là hết sức

cần thiết Những kết quả thu được sẽ góp phần làm rõ hơn cơ chế tác động của

dioxin trên người thông qua Ahr cũng như có những hướng tác động đến các gen

liên quan nhằm hạn chế ảnh hưởng của dioxin đến sức khỏe của người phơi nhiễm

Xuất phát từ những vấn đề thực tế nêu trên, được sự hướng dẫn của TS Nguyễn Trung Nam và PGS TS Nguyễn Lai Thành, tôi đã tiến hành nghiên cứu đề

tài: “ Nghiên cứu sự biểu hiện của một số gen trong con đường hoạt hóa thụ thể dioxin ở người phơi nhiễm dioxin tại Đà Nẵng”

Chương 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu chung về dioxin

Dioxin có 75 đồng phân poly-chloro-dibenzo-dioxines (PCDD) và 135 đồng phân poly - chloro -dibenzo - furanes (PCDF) với độc tính khác nhau, thường là các sản phẩm biến đổi các chất từ việc đốt các chất thải công nghiệp hay nông nghiệp, cháy rừng, sử dụng khí đốt Ngoài ra, dioxin còn bao gồm nhóm các polychlorinated biphenyls (PCBs), là các chất tương tự dioxin, bao gồm 419 chất hóa học trong đó có 29 chất đặc biệt nguy hiểm thường được sản xuất có chủ định,

sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau Khi các hợp chất dioxin phát tán ra môi trường thường để lại những hậu quả rất nghiêm trọng đến sinh thái và sức khỏe con người [20,61,63]

Dioxin chỉ bị phân hủy ở nhiệt độ trên 750oC và không tác dụng với kiềm hay acid ngay cả khi bị đun nóng Dioxin có tính ái mỡ (lipophilic) và kỵ nước (hydrophobic); hai đặc tính này của dioxin liên quan chặt chẽ với độ bền vững của chúng trong cơ thể sống cũng như trong tự nhiên và sự phân bố của chúng trong các

cơ quan của cơ thể Hàm lượng của TCDD trong cơ thể như sau: mô mỡ: 300 ppt; da: 30 ppt; gan: 25 ppt; sữa mẹ: 13 ppt; thành ruột: 10 ppt; máu: 10 ppt; thận: 7 ppt; bắp thịt: 4 ppt; mật: 0,5 ppt; nước tiểu: 0,00005 ppt Vì vậy, khi nghiên cứu đánh giá độ tồn lưu của dioxin trong cơ thể người, thường lấy mỡ, máu và sữa mẹ Trong sữa mẹ có khoảng 3-4% mỡ, còn trong máu khoảng 0,3-0,7% mỡ [64] Theo cơ quan bảo vệ môi trường Hoa Kỳ (EPA) thời gian bán hủy của dioxin trong cơ thể con người có thể là 3-5 năm, 10 năm hoặc có khi kéo dài đến 30 năm, do đó dioxin

có khả năng gây ung thư rất cao, đặc biệt là ung thư gan và da [17]

Bảng 1.1 Độ độc của các đồng phân Dioxin [8,9]

2,3,7,8-TCDD là chất độc mạnh nhất trong các hóa chất, được quy ước là 1 đương lượng độc (toxic equivalency factor – TEF); các đồng phân còn lại của dioxin có độ

độc nằm trong khoảng 0-1 (Bảng 1.1) TCDD độc gấp 1 triệu lần so với tất cả các chất độc đã có trong tự nhiên và tồn tại lâu bền nhất Năm 1997, Tổ chức quốc tế về nghiên cứu ung thư (IARC) thuộc WHO đã công bố 2,3,7,8-TCDD là chất gây ung thư nhóm 1 Trong một nghiên cứu kiểm định năm 2003, các nhà khoa học cũng khẳng định không có một liều lượng hoặc ngưỡng dioxin nào là an toàn mà dưới nó thì không gây ung thư [16]

1.2 Ảnh hưởng của dioxin tới sức khỏe con người

Con người tiếp xúc với mức độ thấp của các hợp chất dioxin, chủ yếu thông qua tiêu thụ thực phẩm [13,22] Đặc điểm nguy cơ phơi nhiễm dioxin vẫn khó thiết lập, mặc dù đây là một vấn đề ảnh hưởng rộng rãi đến các quyết định chính sách y

tế công cộng quan trọng [22] Do đó, phơi nhiễm mãn tính với liều lượng dioxin thấp hoặc trung bình có thể không chỉ liên quan đến độc tính của dioxin ở một số cá thể di truyền dễ mắc bệnh [6] mà còn liên quan tới vai trò mới được xác định của các hợp chất này trong các tế bào T gây bệnh tự miễn [10,36] Các nhà khoa học chứng minh rằng ở nồng độ cao TCDD làm giảm số lượng các tế bào lympho, đặc biệt trong tuyến ức Bên cạnh đó, sự thay đổi chức năng hệ thống miễn dịch cũng xảy ra khi tế bào tiếp xúc với nồng độ TCDD thấp, như sự mất cân bằng Th17/Treg

và rối loạn sản xuất cytokine [19,49]

Dioxin còn gây một số rối loạn chuyển hóa glucose, insulin, glycogen, hormon tuyến giáp, tuyến yên… TCDD đã được chứng minh là gây ức chế các enzym sinh tổng hợp glucose, giảm hormon corticosteron – hormon tổng hợp glucose cũng như rối loạn tổng hợp hormone tuyến thượng thận ở bà mẹ mang thai và trẻ sơ sinh cũng như trên các động vật thí nghiệm [14,23,24] Hơn thế nữa, các thương tổn của dioxin trên da thường liên quan đến thay đổi tế bào keratin, dẫn đến các dạng trứng

cá như bệnh chloracne điển hình [12]

Tiếp xúc với TCDD được chứng minh là chất gây rối loạn nội tiết, làm gián đoạn tín hiệu nội tiết ở những công nhân làm việc trong môi trường chứa TCDD [25], dẫn đến sự thay đổi trong phát triển buồng trứng, ức chế sự phát triển nang trứng ở cá ngựa vằn [27]

Viện Hàn lâm Khoa học Mỹ đã công nhận một số bệnh có liên quan với dioxin, trong đó có bốn bệnh đã được xác định là có bằng chứng liên quan chắc chắn với dioxin (Ung thư phần mềm-sarcoma, non-Hodgkin lymphoma, Hodgkin lymphoma và bệnh trứng cá do clor-cloracne) và chín bệnh được coi là có bằng chứng liên quan với dioxin (Ung thư đường hô hấp gồm ung thư thanh quản, ung thư phổi, ung thư khí phế quản, ung thư tiền liệt tuyến, bệnh đa u tuỷ ác tính - multiple myeloma, bệnh gai sống chẻ đôi - spina bifida, bệnh porphyria cutanea tarda, bệnh rối loạn thần kinh ngoại biên và bệnh đái tháo đường) Ngoài ra, những nghiên cứu gần đây cho thấy dioxin còn có liên quan đến một số bệnh của hệ thống

hô hấp, hệ thống miễn dịch, bệnh da liễu, bệnh di truyền Một số nghiên cứu ở Việt Nam đã cho thấy có mối liên hệ của nhiễm dioxin với các bệnh liên quan đến

hệ thống miễn dịch và thần kinh như ung thư phần mềm, Hodgkin lymphoma, Hodgkin lymphoma, đau tủy xương ác tính, đa u tủy ác tính, rối loạn thần kinh ngoại biên, ung thư đường hô hấp, ung thư tuyến tiền liệt [2,4] Theo quyết định của Bộ Y tế , các bệnh tật dị dạng, dị tật có liên quan đến phơi nhiễm chất độc hoá học/dioxin bao gồm: ung thư phần mềm, u lympho không Hodgkin, u lympho Hodgkin, ung thư phế quản - phổi, ung thư khí quản, ung thư thanh quản, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư gan nguyên phát, bệnh đau tuỷ xương ác tính, bệnh thần kinh ngoại biên cấp tính và bán cấp tính, tật gai sống chẻ đôi, bệnh trứng cá do Clo, bệnh đái tháo đường type 2, bệnh porphyrin xuất hiện chậm, các bất thường sinh sản, các dị dạng, dị tật bẩm sinh (đối với con của người bị nhiễm chất độc hóa học/dioxin) và rối loạn tâm thần [1]

non-1.3 Cơ chế hoạt hóa dioxin trong tế bào

Aryl hydrocarbon receptor (Ahr) là một thụ thể tiếp nhận dioxin, điều khiển

rất nhiều các phản ứng của tế bào chống lại các độc tố và các tác nhân gây hại xâm

nhập từ ngoài môi trường cũng như hình thành bên trong cơ thể Đồng thời, Ahr còn

đóng vai trò điều hoà trong nhiều phản ứng miễn dịch bao gồm các phản ứng miễn

dịch bẩm sinh và miễn dịch đáp ứng Ahr có thể được kích hoạt bởi tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), bezo[a]pyrene (BaP), 6-formylindolo[3,2-

2,3,7,8-b]carbazole (FICZ), kynurenine (KYN) và carboxylic acid methyl ester (ITE) [23,60] (hình 1.1) Ngoài ra, khi các toll-like receptor (TLR) được kích thích bởi các tác nhân đặc hiệu, ví dụ lypopolysaccharide

2-(1'H-indole-3'-carbonyl)-thiazole-4-(LPS) hoặc unmethylated deoxycytidyl-deoxyguanosine (CpG), Ahr sẽ được cảm

ứng, hoạt hóa và tương tác với các protein để điều khiển sự sản xuất các cytokine viêm [7,40,44]

Trong điều kiện bình thường không có sự có mặt của các chất kích hoạt, Ahr

ở trạng thái bất hoạt trong tế bào chất, hình thành phức hợp cùng với các protein khác như heat shock protein 90 (HSP90), Ahr-interacting protein (AIP), p23 cùng

một số các protein chaperone khác [32,48] Khi Ahr được hoạt hoá bởi các chất kích hoạt như TCDD, nó di chuyển vào trong nhân tế bào Tại nhân tế bào, Ahr được giải phóng khỏi hệ thống phức hợp và gắn với nhân tố dẫn truyền nhân của Ahr (Ahr

nuclear translocator-Arnt) Phức hợp Ahr-Arnt sẽ gắn với các nhân tố đáp ứng dioxin (dioxin receptor element-DRE) trên promoter của các gen đích trong họ cytochrome P450 (CYP), tạo ra sự phiên mã của các gen đích bao gồm các gen như

Cyp1a1, Cyp1a2, Cyp1b1 và Ahr repressor (AhrR) [38,55,59] Tín hiệu của Ahr được kiểm soát bởi 3 con đường bao gồm (i) sự thoái hóa proteasome của Ahr, (ii)

sự phân hủy phối tử bởi Cyp1a1 và (iii) sự phân hủy phức hợp Ahr-ArnT bởi AhrR

(Hình 1.2)

2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) Kynurenine (KYN) 6-formylindolo[3,2-b]carbazole (FICZ)

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của một số phối tử điển hình của Ahr [15,57]

Hình 1.2 Cơ chế hoạt hóa Ahr dưới sự cảm ứng của phối tử [47]

Bên cạnh đó, khi các toll-like receptor (TLR) được kích thích bởi các tác nhân đặc hiệu, ví dụ: TLR-4 được kích thích bởi lypopolysaccharide (LPS), Ahr sẽ được cảm ứng, hoạt hóa và tương tác với các protein trong con đường NF-κB để

1.4 Vai trò của Cyp1b1 và Cyp1a1 trong con đường hoạt hóa dioxin (dioxin – Ahr – Cyp)

Cytochromes P450 (CYP) là một nhóm mono-oxygenases chứa thiolate có xúc tác chủ yếu cho các phản ứng mono-oxygenase [11] Ở động vật và người, enzym này có ở gan, tim, phổi, thận nhưng tập trung chủ yếu ở gan Trong các microsome gan, họ enzyme này tham gia vào một lộ trình vận chuyển electron phụ thuộc vào Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) Nó oxy hóa một loạt các hợp chất, bao gồm steroid, axit béo, retinoid và các chất gây ô nhiễm như dioxin và polychlorinated biphenyls [56] (hình 1.3)

heme-CYP là nhóm enzym chính tham gia chuyển hóa thuốc ở gan góp phần giải độc các chất có hại trước khi chúng được phân phối vào hệ thống tuần hoàn Một loạt các enzyme thuộc CYP đã được chứng minh là có liên quan đến quá trình quan trọng này (hình 1.4) [18]

Hình 1.3 Kích hoạt chuyển hóa các chất gây ung thư dibenzo[a,l]pyrene (DB[a,

l]P) (A) và 7,12-Dimethyl benzanthracene (7, 12-DMBA) (B) thành vùng epoxides

bằng P450 và edoxides hydrolase [56]

Hình 1.4 Sự tham gia của các enzyme thuộc họ P450 trong pha I

của quá trình chuyển hóa thuốc ở người [18]

Cytochrome P450 1A1 (Cyp1a1) là một enzyme thuộc họ cytochrome P450 tham gia vào quá trình chuyển hoá thuốc và các chất nội sinh, đào thải các xenobiotic, trong đó có các chất gây ung thư và chất gây ô nhiễm từ môi trường

Khi tăng hoạt tính Cyp1a1 có thể làm tăng nguy cơ bị ung thư [35,54] Cyp1a1 ở

điều kiện bình thường biểu hiện ở mức thấp nhưng lại có thể được cảm ứng rất mạnh nhờ sự tương tác giữa các cơ chất của nó (như các hydrocarbon đa vòng thơm

hoặc các amine dị vòng) với thụ thể Ahr Cyp1a1 thường chiếm tỉ lệ biểu hiện cao

trong các mô ung thư [42,43]

Hình 1.5 Vị trí và cấu trúc gen Cyp1a1 của người [65]

(Các exon được đánh số theo thứ tự từ 1 đến 7)

Gen Cyp1a1 nằm trên nhiễm sắc thể 15 có độ dài tổng số là 6069 nucleotide,

gồm 7 exon (hình 1.5), mã hóa cho protein gồm 512 axit amin có trọng lượng là

58,2 kDa Tính đa hình của Cyp1a1 được chứng minh có liên quan tới một số bệnh

lý điển hình Có nhiều bằng chứng cho thấy sự thay đổi nucleotide T thành C ở vị trí 3801 (Ile462Val) có liên quan tới bệnh vô sinh ở nam giới [34] Hơn nữa, sự thay đổi Ile462Val ở vị trí 462 có liên quan chặt chẽ tới bệnh ung thư thận ở những người hút thuốc lá [37]

Một nghiên cứu khác cho thấy ảnh hưởng của các chất hydrocacbon đa vòng

tới tình trạng methyl hóa của gen Cyp1a1, từ đó có thể ảnh hưởng đến các phản ứng

hóa sinh trong cơ thể Nhóm cư dân sinh sống tại A Lưới, Nam Đông - vùng bị

nhiễm dioxin tại Thừa Thiên Huế – có sự giảm methyl hóa DNA ở gen Cyp1a1 so

với nhóm đối chứng (từ Quảng Bình trở ra Bắc) Tuy nhiên, nhóm tác giả cho rằng

sự giảm methyl hóa ở nhóm này không phải do tác động của dioxin tồn lưu trong môi trường hiện nay mà có thể đã được di truyền bằng con đường biểu sinh từ những biến đổi methyl hóa DNA của thế hệ bố mẹ, những người phơi nhiễm trực tiếp với Dioxin trong thời kì rải chất độc hóa học chiến tranh Giả thiết này cần sự kiểm chứng qua các nghiên cứu mở rộng với thân nhân của nhóm phơi nhiễm dioxin [5]

Hình 1.6 Vị trí và cấu trúc gen Cyp1b1 của người [65]

(Các exon được đánh số theo thứ tự từ 1 đến 3)

Tương tự như Cyp1a1, Cyp1b1 cũng là một enzyme ngoại bào thuộc họ Cytochrome P450 Gen Cyp1b1 nằm trên nhiễm sắc thể số 2, có chiều dài 8580

nucleotid (hình 1.6), mã hóa cho protein gồm 544 axit amin Các phản ứng xúc tác

bởi Cyp1b1 có liên quan tới sự chuyển hóa các chất, trong đó có các tác nhân gây ung thư Gen Cyp1b1 được hoạt hóa bởi các hydrocarbon thơm đa vòng, đặc biệt là dioxin, thông qua thụ thể Ahr (hình 1.7) Cyp1b1 chuyển hóa estrogen thành 4-

hydroxy estrogen, một chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành ung thư nhờ kích thích làm tổn thương, đột biến DNA và khử purine [26]

Hình 1.7 Sự tham gia của CYP1A/B trong quá trình

chuyển hóa hydrocacbon đa vòng thơm [50]

Không chỉ là Cyp1b1 tham gia vào sinh ung thư, nó cũng tham gia vào quá

trình chuyển hóa của một số loại thuốc hóa trị liệu và kháng thuốc như được nghiên

cứu bởi Rochat et al, 2001 [51] Nghiên cứu trước đây đã tìm thấy nồng độ Cyp1b1

trong mô ung thư cao hơn so với những người bình thường lân cận [42]; điều này

cho thấy Cyp1b1 đóng một vai trò trong kháng thuốc hóa trị liệu Mức độ cao của Cyp1b1 trong các tế bào khối u có liên quan đến sự kháng thuốc như docetaxel làm

giảm độc tính đối với các tế bào này

Bên cạnh đó, Cyp1b1 cũng giữ vai trò quan trọng trong việc điều hòa các quá

trình sinh lý xảy ra trong cơ thể Nghiên cứu của Su và cộng sự (2012) trên 61 bệnh nhân và 100 đối chứng khỏe mạnh ở Đài Loan cho thấy rằng đột biến Arg thành His

ở vị trí 390 có nguy cơ làm tăng nhãn áp [59]

1.5 Vai trò của AhrR trong con đường truyền tín hiệu dioxin receptor

AhrR, cũng là một thành viên của họ protein basic helix-loop-helix( bHLH),

có cấu trúc tương tự Ahr nhưng thiếu một khu vực ràng buộc phối tử Per-Arnt-Sim

B (PAS B domain) và một miền kích hoạt (hình 1.8) [39,62] Gen AhrR nằm trên

nhiễm sắc thể số 5, mã hóa cho protein gồm 719 axit amin (axit amin 1-719;

NM_020731) và AhrRΔ8 (axit amin 1-701; NM_001242412) thiếu exon 8 [28]

Hình 1.8 Vị trí và cấu trúc gen AhrR của người [62]

(Các exon được đánh số theo thứ tự từ 1 đến 10)

Ngoài ra, AhrR có thể cảm ứng được bởi các phối tử Ahr halogen hóa và

không halogen hóa [29,39] Cảm ứng này chủ yếu được trung gian bởi các tương tác của phức hợp Ahr-Arnt với các yếu tố phản ứng xenobiotic (XREs), thường nằm ở đầu promoter [29,39] Các giả định về cơ chế hoạt động của AhrR được thể hiện trên hình 1.9

Hình 1.9 Các giả định về cơ chế hoạt động của AhrR [54]

(A) AhrR cạnh tranh với Ahr để liên kết với Arnt

(B) Phức hệ AhrR-Arnt thu hút các protein khác như HDAC đến và ức chế phiên mã các gen đích

(C) Phức hệ AhrR-Arnt cạnh tranh với Phức hệ Ahr-Arnt trong sự liên kết với một yếu tố chưa được biết đến

Mặc dù các nghiên cứu trên chuột, người và cá chứng minh rằng mRNA

AhrR thường được biểu hiện như là một đáp ứng với phơi nhiễm TCDD, biểu hiện

trong các loại mô và các dòng tế bào rất khác nhau [21,29,39] Tsuchiya et al (2003)

đã kiểm tra biểu hiện AhrR ở một số dòng tế bào người cảm ứng bởi TCDD Nghiên cứu chỉ ra rằng dòng tế bào HeLa biểu hiện nhiều mRNA AhrR hơn các dòng tế bào khác Kết quả này có thể liên quan tới sự biểu hiện của các gen Cyp1a1, Cyp1a2, Cyp1b1 cảm ứng bởi TCDD trong dòng tế bào HeLa [60] Hoạt động AhrR nội tại

cũng có thể ảnh hưởng đến đáp ứng TCDD Fujita et al (2002) đã ghi nhận mối

tương quan đáng kể giữa sự đa hình AhrR của một người cụ thể và tỷ lệ micropenis,

một bệnh lý phát triển có thể do phơi nhiễm tử cung với mức TCDD thấp [21] Do

đó, mặc dù AhrR dường như đóng một vai trò trong sự đáp ứng TCDD khác biệt

trong dòng tế bào người [60], không có trường hợp nào có biểu hiện hoặc hoạt động

AhrR ở mức độ cao được chứng minh là làm giảm khả năng đáp ứng hoặc độc tính

nước khác nhưng không gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người Trong làn sóng phản đối chiến tranh tại Việt Nam vào cuối những năm 1960 có yêu cầu Mỹ dừng

sử dụng chất gây trụi lá Sau đó vào những năm 1970, 1980 các cựu chiến binh Mỹ đưa ra các bằng chứng về ảnh hưởng của chất làm trụi lá đến sức khỏe của họ và con cái họ đặc biệt là bằng chứng về ung thư và dị tật bẩm sinh ở trẻ Hiện nay, ở Việt Nam trên 70.000 m3 đất và trầm tích tại vùng nóng nhiễm dioxin với nồng độ trên 1000 lần mức cho phép nên ảnh hưởng của dioxin vẫn còn rất nặng nề

Tại Việt Nam cũng đã có nhiều đề tài nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiễm dioxin trên người Từ 2005-2007, Nông Văn Hải và cs., Viện Công nghệ sinh học

đã tiến hành nghiên cứu đề tài độc lập cấp Nhà nước “Nghiên cứu xác định bằng chứng khoa học về ảnh hưởng của chất da cam/dioxin trên các đối tượng nạn nhân”

Đề tài đã nghiệm thu và có nhiều kết quả tốt như đã khảo sát, lựa chọn, thu thập, và xác định nồng độ dioxin của nhiều mẫu máu nạn nhân; phân tích trình tự các gen liên quan và hệ protein huyết thanh tổng số của các nạn nhân; triển khai lắp đặt và phân tích nồng độ dioxin trong máu theo công nghệ DR-CALUX Trong các năm

từ 2008-2013, Đặng Thị Cẩm Hà và cs , Viện Công nghệ sinh học cũng đã tiến hành nghiên cứu các đề tài liên quan đến dioxin như: “Nghiên cứu cấu trúc tập đoàn

vi sinh vật kỵ khí loại khử clo và gene reductive dehalogenase (rdh) đại diện trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin bằng phương pháp phân hủy sinh học tại Biên Hòa”;

“Nghiên cứu và xác định enzyme lignin peroxidase (LiP), manganese peroxidase (MnP) và laccase từ vi sinh vật phân hủy các hợp chất hữu cơ bền vững (POPs) và các hợp chất vòng thơm ô nhiễm khác”; “Tẩy độc đất nhiễm chất độc hóa học chứa dioxin tại sân bay Biên Hòa bằng phương pháp phân hủy sinh học” Các đề tài này cũng đã thu được nhiều kết quả rất tốt, tìm ra được cấu trúc của các tập đoàn vi sinh vật có khả năng phân hủy sinh học, góp phần vào việc tẩy độc có hiệu quả việc nhiễm dioxin ở sân bay Biên Hòa Việc xử lý triệt để đất nhiễm chất độc da cam/dioxin trên các vùng đất ở Việt Nam là vấn đề lớn và hết sức nan giải, đồng thời cũng là vấn đề cấp bách phải giải quyết Nó không chỉ đòi hỏi rất nhiều công sức, kinh phí mà còn cần có công nghệ tiên tiến, hiện đại

Hình 1.10 Bản đồ phân bố chất độc màu da cam ở miền Nam Việt Nam [58]

Năm 2012, Nguyễn Minh Phương thuộc Học Viện Quân Y đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng tế bào cảm biến sinh học đặc hiệu để ứng dụng phát hiện dioxin trong máu” Ngoài ra, tại Đại học Y Hà Nội cũng đã hoàn thành dự án đề tài nghiên cứu về tình hình tai biến sinh sản và dị tật bẩm sinh, tại một số vùng phun rải chất da cam/dioxin trong chiến tranh Trần Văn Khoa và cs thuộc Học viện Quân y đang tiến hành đề tài nghiên cứu cấp Nhà nước 2012-2015 “Nghiên cứu biến động sức khỏe, bệnh tật ở người có nồng độ dioxin cao, đề xuất các giải pháp điều trị Đề tài cũng đã thu được nhiều kết quả ban đầu tốt Sau ba năm nghiên cứu

từ năm 2011 đến năm 2013, nhóm tác giả Hoàng Mạnh An và cs tại Bệnh viện quân

y 103 (Hà Nội) đã công bố hai phương pháp giải độc mới với nạn nhân chất độc da cam/dioxin, bằng phương pháp vận động, xông hơi (phương pháp Hubbard) và sử dụng thuốc y học cổ truyền Nhóm tác giả đã chọn 69 trường hợp sống ở “vùng

nóng” về chất độc da cam/dioxin là Đà Nẵng và Đồng Nai chia làm hai nhóm điều trị theo hai phương pháp giải độc trong bốn tuần Trong đó, phương pháp Hubbard

do nhà khoa học L.Ron Hubbard nghiên cứu và ứng dụng thành công ở Mỹ (1979)

và Nga sau thảm họa Chernobyl năm 1986 Theo các công trình nghiên cứu, hóa chất độc khi nhiễm vào cơ thể chủ yếu được tích lũy bền vững ở các mô mỡ, nằm ngoài khả năng chữa trị của các loại thuốc thông thường Tuy nhiên, phương pháp Hubbard có khả năng thanh lọc chất độc ra khỏi cơ thể một cách ưu việt, bao gồm các bước sau: (1) dùng niacin liều cao hơn bình thường để kích thích chuyển hoá chất béo, tăng sự di chuyển của chất độc ra khỏi tế bào mỡ và giảm nhiễm phóng xạ; (2) vận động với một lượng vừa phải để tăng lưu chuyển tuần hoàn sâu bên trong cơ thể; (3 ) xông hơi nước nóng nhằm làm tăng tiết mồ hôi, sau xông hơi là tắm ngay bằng nước mát, nhiệt độ chừng 15-20oC; (4) bổ sung dầu, chất béo (trong các viên nang dầu cá, vitamin A, D), nước và khoáng Hiện phương pháp đã được triển khai tại Đà Nẵng, Gia Lai, Thái Bình, Hà Nội, tương lai là tỉnh Vĩnh Phúc và bất cứ tỉnh, thành phố nào có Hội nạn nhân chất độc da cam/dioxin đều có thể áp dụng Hai phương pháp này mới chỉ ở bước đầu, cần thử nghiệm ở những giai đoạn tiếp theo và hiện chưa thể triển khai đồng loạt do kinh phí cho mỗi ca xét nghiệm chất độc da cam và tẩy độc lên tới trên 500 USD, chưa kể đến liệu trình tẩy độc và các chi phí khác kèm theo

Tuy đã có nhiều nghiên cứu từ giai đoạn 2005-2013, nhưng việc công bố các bài báo và các kết quả nghiên cứu trên các tạp chí quốc tế liên quan đến vấn đề dioxin ở Việt Nam còn gặp rất nhiều khó khăn do chính phủ Mỹ vẫn chưa công nhận một số ảnh hưởng của dioxin ở Việt Nam là do từ thời kì chiến tranh Thêm vào đó, một số các kết quả nghiên cứu vẫn còn trong giai đoạn đầu và chưa được phép công bố rộng rãi, nên không có nhiều công bố trong nước cũng như quốc tế về vấn đề này Mãi đến những năm 2017-2018, Việt Nam mới có một số công bố về

ảnh hưởng của dioxin đến sức khỏe con người liên quan đến biểu hiện của gen Ahr

cũng như phát hiện một số đa hình và đột biến mới trên một số gen ở người phơi nhiễm dioxin [45,46]

Chương 2: MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát:

Nghiên cứu sự biểu hiện của một số gen trong con đường hoạt hóa thụ thể dioxin ở người phơi nhiễm dioxin tại sân bay Đà Nẵng

Mục tiêu cụ thể:

- Tối ưu hóa các điều kiện real-time PCR trong phân tích sự biểu hiện của

các gen AhrR, Cyp1b1, Cyp1a1 trong các mẫu máu đã thu thập được

- Xác định và so sánh được mức độ biểu hiện của các gen AhrR, Cyp1b1, Cyp1a1 trong các mẫu máu đã thu thập được

2.2 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu máu của mười bốn người nhiễm dioxin bao gồm: nam và nữ có độ tuổi 42-67, chỉ số BMI 21.89 ± 1.84 và mười ba mẫu máu người không nhiễm dioxin có

độ tuổi và chỉ số BMI tương đương Các đối tượng đáp ứng một trong ba tiêu chuẩn sau: (1) Có tiền sử bị phơi nhiễm rõ ràng (trực tiếp hoặc gián tiếp), (2) Đang sống tại điểm nóng về chất độc màu da cam tại Việt Nam (sân bay Đà Nẵng) với thời gian trên 10 năm, (3) Gia đình có người mắc một trong các bệnh đặc trưng do dioxin hoặc bị dị tật bẩm sinh Các đối tượng được phỏng vấn về thời gian sống tại địa bàn nghiên cứu, tiền sử tiếp xúc với chất da cam/dioxin (trực tiếp và gián tiếp), các yếu tố ảnh hưởng đến sức khỏe (như thói quen sinh hoạt, nguồn nước, thực phẩm), tình trạng sức khỏe và bệnh tật của quân nhân và gia đình của họ: tình trạng thai sản và sinh con dị tật Những mẫu máu người khỏe mạnh được thu từ những người sống ở khu vực phía Bắc Việt Nam, nơi không bị ảnh hưởng bởi chất độc hóa học từ chiến tranh Các mẫu máu được cung cấp bởi học viện Quân Y, được thu thập bởi các bác sĩ được đào tạo bài bản và tuân thủ theo hiệp ước Helsinki về vấn

đề y đức trong nghiên cứu liên quan đến con người Các mẫu máu nghiên cứu trong luận văn đã được xác định hàm lượng dioxin tại Phòng thí nghiệm dioxin, Trung

tâm nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân Y (đã được cấp chứng nhận quốc tế đạt tiêu chuẩn phân tích dioxin trong huyết thanh bằng phương pháp DR-CALUX) [44]

2.2.2 Phạm vi nghiên cứu

Phân tích sự biểu hiện của các gen Cyp1b1, Cyp1a1, AhrR liên quan đến sự hoạt hóa thụ thể dioxin Aryl hydrocarbon receptor (Ahr) trong các mẫu máu đã thu

thập được

2.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Tối ưu hóa kỹ thuật real-time PCR để xác định sự biểu hiện của một

số gen trong con đường hoạt hóa thụ thể dioxin bằng primer đặc hiệu

-Tách chiết, tinh sạch RNA từ tế bào máu tổng số và tổng hợp cDNA (Bộ sưu tập mẫu máu người nhiễm dioxin với dữ liệu về mức độ nhiễm dioxin, lưu giữ tại Phòng Công nghệ ADN Ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học)

-Tiến hành tối ưu hóa phản ứng real time PCR với các cặp mồi đặc hiệu (nồng độ mồi, nhiệt độ bắt cặp)

Nội dung 2: Phân tích sự biểu hiện của các gen Cyp1b1, Cyp1a1, AhrR trong các

mẫu máu từ nhóm người phơi nhiễm dioxin và mẫu máu từ người khỏe mạnh

- Tiến hành phản ứng real time PCR cho các mẫu cDNA đã tổng hợp được

- So sánh, phân tích và tổng hợp số liệu

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Đề tài sẽ được tiến hành dựa trên các phương pháp nghiên cứu trong sơ đồ tổng quát sau:

Sơ đồ thí nghiệm xác định sự thay đổi biểu hiện gen AhrR, Cyp1b1, CYp1a1

trong máu tổng số người phơi nhiễm dioxin

2.4.1 Phương pháp tách RNA từ máu tổng số

Các mẫu máu được thu vào ống lấy máu BD Vacutainer có chứa heparin và lưu giữ ở -800C trước khi sử dụng cho thí nghiệm

- Loại bỏ hồng cầu từ máu toàn phần bằng ly tâm

- Tách chiết RNA tổng số bằng hóa chất Trizol™LS (Thermo# 10296010)

1000 ng RNA

tổng số

13µl H2O, 4µl 5x Master mix, 0.5µl F-primer (750 nM), 0.5µl R-primer (750 nM), 2 µl cDNA

MẪU MÁU

Bảo quản -80°C

ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN

AhrR, Cyp1b1, CYp1a1

So sánh mức độ biểu

hiện gen AhrR, Cyp1b1,

CYp1a1 so với nhóm đối

HỒ SƠ BỆNH ÁN

(Thermo)

+ Bổ sung 1 ml dung dịch để ly giải tế bào bằng cách đồng nhất hỗn hợp với pipet, ủ tại nhiệt độ phòng trong 5 phút

+ Bổ sung chloroform vào mỗi mẫu Sử dụng 0.2 ml chloroform cho mỗi 1

ml TriPure, lắc mạnh trong 15 giây, sau đó ủ tại nhiệt độ phòng trong 10 phút

+ Để phân dung dịch thành các lớp, ly tâm mỗi ống tại 12,000 vòng/phút trong 15 phút tại 4 độ C

+ Chuyển phần dung dịch không màu lớp trên cùng sang 1 ống eppendorf 1.5

ml mới

+ Thêm Isopropanol vào pha đã chuyển sang ống mới (sử dụng 0.5 ml isopropanol cho 1 ml TriPure đã dùng ban đầu)

+ Đậy nắp ống, sau đó invert vài lần để dung dịch được đồng nhất

+ Ủ mẫu tại nhiệt độ phòng trong 10 phút để RNA tủa

+ Ly tâm tại 12,000 vòng/phút trong 10 phút tại 4 độ C

+ Bổ sung 30µl nước khử nuclease vào mỗi mẫu

+ Loại bỏ DNA genome trong mẫu vừa thu được bằng DNase I (RNase-free) (New England Biolabs®,#M0303S)

- Định lượng RNA tổng số bằng máy đo quang phổ Nanodrop Lite

ứng RT-PCR sử dụng enzym phiên mã ngược và các vật liệu bổ sung là dNTPs, mồi ngẫu nhiên để phiên mã các sợi đơn mRNA thành sợi đôi cDNA Quy trình phản ứng gồm 2 bước theo bảng 2.1

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA (theo ThermoFisher, #K1621)

Nước khử nuclease Bổ sung nước đến tổng thể tích 10 µl

Hỗn hợp trên sau đó được ủ tại 650C trong 5 phút, sau đó bổ sung các thành phần đệm phản ứng, enzym, dNTPs vào hỗn hợp theo bảng 2.2 và thực hiện chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp cDNA theo bảng 2.3 Các phản ứng đối chứng được thực hiện nhằm kiểm tra sự tồn tại của DNA genome còn sót lại trong từng mẫu RNA đã tách chiết Thành phần phản ứng tương tự như bảng 2.1 và bảng 2.2 ngoại trừ việc

bổ sung enzyme RevertAid RT Phản ứng cũng được thực hiện theo chu trình ở bảng 2.3

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp cDNA

2.4.3 Phương pháp real time PCR

2.4.3.1 Nguyên tắc cơ bản của phương pháp real time PCR

Real time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ của phản ứng PCR

Các dữ liệu của phản ứng real time PCR được hiển thị ngay sau từng chu kỳ và được lưu lại ở chu kỳ thứ 40 Một số các thuật ngữ chính được sử dụng trong real time PCR như: Rn+: cường độ phát huỳnh quang của mẫu phản ứng; Rn- đối chứng âm; Threshold: ngưỡng của cường độ phát huỳnh quang; Baseline/threshold line: các chu trình ban đầu của PCR, có rất ít các tín hiệu huỳnh quang; Ct hoặc Cq (threshold cycle): chu kỳ mà huỳnh quang vượt ngưỡng thiết lập; no template control (NTC)- mẫu không có khuôn, đối chứng âm của phản ứng PCR Sự biểu hiện gen sẽ được tính toán dựa trên giá trị Ct của gen đích theo phương pháp so

sánh tương đối ∆∆Ct dùng gen β-actin là gen đối chứng nội chuẩn Đặc trưng của

real-time PCR là phát hiện sản phẩm khuếch đại trong quá trình chạy PCR khi sản phẩm khuếch đại từ DNA đích được nhân bản đạt đủ số lượng để làm cho ống phản ứng phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích Chính nhờ đặc trưng này mà người làm thí nghiệm có thể biết được số lượng bản DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng dựa vào sự xuất hiện huỳnh quang của ống phản ứng sớm hay muộn, tức là chu kỳ ngưỡng (Ct) của ống phản ứng nhỏ hay lớn Có hai cách định lượng tác nhân đích dựa vào mục đích định lượng mà người làm thử nghiệm quan tâm

Định lượng tuyệt đối

Người làm thử nghiệm sẽ sử dụng định lượng tuyệt đối nếu mục đích của xét nghiệm là định lượng để biết rõ số bản copy của tác nhân đích có trong mẫu thử hay trong bệnh phẩm Ví dụ xét nghiệm định lượng virus viêm gan B, hay viêm gan C, hay HIV trong mẫu máu của bệnh nhân để theo dõi hiệu quả điều trị đặc hiệu Phương pháp định lượng này đòi hỏi phải biết rõ lượng (thể tích, hay có thể là trong lượng) của mẫu thử

Hình 2.1 Đường biển diễn chuẩn xác định mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng (Ct)

với số lượng copies DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng

Để có thể thực hiện phương pháp định lượng tuyệt đối, nhà nghiên cứu hay người làm thí nghiệm phải thực hiện xét nghiệm real-time PCR của mẫu thử cùng lúc với các mẫu chuẩn đã biết trước số lượng rồi tính ra số copies DNA của tác nhân đích có trong ống phản ứng dựa vào đường biển diễn chuẩn xác định mối quan

hệ giữa chu kỳ ngưỡng (Ct) với số lượng copies DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng (hình 2.1) Cuối cùng xác định số copies tác nhân đích có trong mẫu thử hay bệnh phẩm dựa vào hệ số pha loãng mẫu và hệ số tách chiết DNA hay RNA của phương pháp chuẩn bị mẫu trước khi thực hiện PCR Cụ thể phương pháp tính toán

số copies của DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng dựa vào đường biểu diễn chuẩn như sau:

- Đường biểu diễn chuẩn cho được một hàm số biểu thị mối tương quan giữa chu kỳ ngưỡng (Y = Ct) với log10 của số lượng bản DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng (X = log10 Sq) Hàm số đó là: Y = [slope (X)] + intercept, và các thông số slope và intercept đều hiển thị trên biểu đồ chuẩn

- Hệ số tương quan (R2): Đánh giá độ chính xác của thao tác hút dung dịch mẫu chuẩn (pipetting) có đúng thể tích mong muốn hay không Trị số R2 phải đạt ≥ 0.90

có nghĩa là đường biểu diễn chuẩn phải đạt tuyến tính cao

- Từ hàm số này, người làm thí nghiệm sẽ tính toán hiệu suất khuếch đại

Định lượng tương đối (Phương pháp 2-DDCt của Livak )

Phương pháp này có thể dùng để nghiên cứu biểu hiện một gen trong mẫu cấy tế bào, so với mẫu cấy tế bào bình thường; hay cũng có thể nghiên cứu biểu hiện một gen nào đó trên cấy tế bào có thử chất gây ung thư X so với cấy tế bào không thử X như ví dụ trên Trong phương pháp này, người làm thí nghiệm sẽ định lượng không chỉ gen cần nghiên cứu (Target = Tg) mà cả một gen tham chiếu (reference = Ref) tức là gen mà các nghiên cứu trước đó đã xác định là có biểu hiện như nhau giữa hai mẫu tế bào (Thử: tế bào ung thư hay có thử chất X, gọi là mẫu T;

và Chứng: tế bào không ung thư hay không thử chất X, gọi là mẫu C) Như vậy ứng với mẫu T và mẫu C sẽ có các kết quả định lượng cho cả gen Tg và gen Ref qua các thông số:

- Ct(T/Tg): là chu kỳ ngưỡng của gen đích (Tg) trong mẫu thử (T),

- Ct(T/Ref): là chu kỳ ngưỡng của gen tham chiếu (Ref) trong mẫu thử (T),

- Ct(C/Tg): là chu kỳ ngưỡng của gen đích (Tg) trong mẫu chứng (C),

- Ct(C/Ref): là chu kỳ ngưỡng của gen tham chiếu (Ref) trong mẫu chứng (C) Dựa trên các thông số này, chúng ta sẽ thường hóa (normalized) chu kỳ ngưỡng của gen đích trên mẫu thử (T) và mẫu chứng (C) bằng cách tính hiệu số chênh lệch

Ct của gen đích với gen tham chiểu trên các mẫu: Mẫu thử: D Ct(T) = Ct(T/Tg) - Ct(T/Ref) Mẫu chứng: DCt(C) = Ct(C/Tg) - Ct(C/Ref) Sau đó sẽ thường hóa DCt mẫu thử bằng hiệu số chênh lệch DCt(T) với DCt(C) DDCt = DCt(T) - DCt(C) Từ

(1)

đó tính ra tỷ lệ biểu hiện của gen đích trên mẫu thử so với mẫu chứng, nếu hiệu quả PCR của cả hai đều đạt 100%, là R = 2 DDCt

2.4.3.2 Các bước thực hiện phản ứng real time PCR

- Phản ứng real-time PCR được thực hiện trên máy LightCycler, với 2 µl cDNA cho mỗi phản ứng có tổng thể tích là 20 µl, sử dụng bộ kit LightCycler FastStar DNA MasterPLUS SYBR GreenI (Life science, # 03515869001)

- Xác định chỉ số Ct của các mẫu bằng phần mềm LightCycler 4.0

- So sánh mức độ biểu hiện gen giữa các mẫu theo công thức Livak

2.4.4 Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng Realtime PCR

Mồi sử dụng để nhân các gen AhrR, Cyp1A1, Cyp1B1 và β-actin được thống

kê trong (bảng 2.4)

Bảng 2.4 Trình tự mồi các gen AhrR, Cyp1A1, Cyp1B1 và β-actin

sử dụng trong phản ứng real time PCR

2.4.5 Phương pháp thống kê, phân tích và xử lý số liệu

Số liệu được phân tích thống kê sử dụng phần mềm Excel Sự khác nhau

giữa các nhóm được phân tích bằng Student’s t-test với chỉ số p<0.05 được xem là

có ý nghĩa thống kê

Mối tương quan giữa các gen được kiểm định bằng phân tích tương quan Pearson với phần mềm (SPSS, Chicago, IL)

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Mười bốn mẫu máu của người phơi nhiễm dioxin ở khu vực gần sân bay Đà Nẵng và mười ba mẫu máu người khỏe mạnh được thu từ những người sống ở khu vực lân cận Hà Nội, nơi không bị ảnh hưởng bởi chất độc hóa học từ chiến tranh được sử dụng trong nghiên cứu này Đây là những mẫu nằm trong bộ sưu tập mẫu máu người phơi nhiễm dioxin với dữ liệu về bệnh lý và mức độ nhiễm dioxin, lưu giữ tại Phòng Công nghệ ADN Ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học Dữ liệu về tổng đương lượng độc các hợp chất dioxin xác định bằng phương pháp DR-CALUX (Dioxin Responsive Chemically Activated Luciferase gene Expression) được cung cấp bởi Học viện quân y (phụ lục 1) Hàm lượng dioxin trung bình trong máu của nhóm người nhiễm dioxin là 63.03 ± 32.61 BEQ/g mỡ, trong khi giá trị này ở nhóm người khỏe mạnh là 23.53 ± 13.12 BEQ/g mỡ Bên cạnh đó, sự biểu hiện của gen

Ahr ở tất cả các mẫu này đã được xác định bởi nhóm tác giả Nguyễn Hùng Chí và

cộng sự [44], cho thấy tất cả các mẫu máu của người phơi nhiễm dioxin sử dụng

trong nghiên cứu này đều có biểu hiện Ahr cao gấp 16.27 lần so với nhóm đối

chứng khỏe mạnh (phụ lục 2) Dựa trên những kết quả này, chúng tôi tiếp tục tìm

hiểu sự biểu hiện của các gen Cyp1a1, Cyp1b1 và AhrR được chứng minh là có liên

quan đến cơ chế hoạt hóa thụ thể Ahr để từng bước làm sáng tỏ con đường hoạt hóa này ở những người phơi nhiễm dioxin tại khu vực gần sân bay Đà Nẵng

3.1 Tách chiết RNA của nhóm người phơi nhiễm dioxin và nhóm đối chứng khỏe mạnh

Để chuẩn bị cho việc so sánh các gen quan tâm giữa hai nhóm đối tượng nghiên cứu, chúng tôi tiến hành tách RNA tổng số từ các mẫu máu thu thập được bằng dung dịch Trizol™LS (Thermo, Mỹ) Chất lượng và hàm lượng RNA được thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kiểm tra RNA tổng số tách chiết

từ các mẫu máu bằng dung dịch Trizol™LS