Phân lập và định danh vi khuẩn lactic có khả năng ức chế nấm mốc sinh aflatoxin

Do đó, tôi đã thực hiện đề tài này nhằm phục vụ quá trình làm đồ án tốt nghiệp cũng như là tìm tòi, học hỏi, tích lũy các kinh nghiệm thực tiễn trong quá trình tham khảo, nghiên cứu các

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC

CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM MỐC SINH AFLATOXIN

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Gi ảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên th ực hiện : Nguyễn Trần Yến Tiên MSSV: 1311100092 L ớp: 13DSH01

TP H ồ Chí Minh, 2017

L ỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của

Tiến sĩ Nguyễn Hoài Hương khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi trường

của trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh

Những kết quả này hoàn toàn không sao chép từ các nghiên cứu khoa học khác dưới bất kì hình thức nào Các số liệu trích dẫn trong đồ án này đều hoàn toàn trung thực Tôi xin chịu trách nhiệm toàn bộ về đồ án của mình

Tp.HCM, ngày 09 tháng 08 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Trần Yến Tiên

L ỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành được đồ án “Phân lập và định danh vi khuẩn lactic có khả năng

ức chế nấm mốc sinh Aflatoxin” trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và trau dồi

kiến thức Cũng không ít lần gặp khó khăn trắc trở nhưng nhờ sự hướng dẫn tận tình

của Cô Nguyễn Hoài Hương nay em đã hoàn thành được đồ án của mình

Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ tận tình của Cô Nguyễn Hoài Hương Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM Chính nhờ Cô đã truyền tải kiến thức và những kỹ năng để em đạt được thành quả trong đồ án mà em thực hiện hôm nay

Chân thành gửi lời cám ơn sâu sắc đến các Thầy cô giảng viên và Ban lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM đã tạo điều kiện cho em tìm hiểu tài liệu để hoàn thành được đồ án

tốt nghiệp đúng thời gian quy định

Dù hoàn thành được đồ án nhưng cũng khó tránh khỏi những sai sót nhất định do khả năng hiểu biết hạn hẹp và thông tin tài liệu không mấy khả quan để

phục vụ quá trình thực hiện đồ án Kính mong có sự góp ý và hướng dẫn tận tình

của các thầy cô để em học hỏi thêm những kinh nghiệm, tích lũy cho quá trình học

tập rèn luyện và chuẩn bị hành trang bước sang một môi trường làm việc mới sau này

Kính chúc Cô Nguyễn Hoài Hương và các Thầy cô giảng viên, Ban lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM sức khỏe, thành công và may mắn

Em xin chân thành cảm ơn!

TP.HCM, ngày 09 tháng 08 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Trần Yến Tiên

M ỤC LỤC

DANH M ỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 4

DANH M ỤC CÁC BẢNG 5

DANH M ỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH 7

M Ở ĐẦU 10

1 Tính cấp thiết đề tài 10

2 Tình hình nghiên c ứu 11

3 M ục tiêu nghiên cứu 12

4 Nội dung nghiên cứu 12

5 Phương pháp nghiên cứu 12

5.1 Phương pháp luận 12

5.2 Phương pháp xử lý số liệu 13

6 K ết cấu đồ án 13

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 14

1.1 Tổng quan về nấm 14

1.1.1 Giới thiệu chung 14

1.1.2 Độc tố nấm 15

1.1.3 Tác h ại của nấm 17

1.1.4 M ột số chủng nấm gây độc trong thực phẩm 18

1.1.5 M ột số phương pháp khử nhiễm độc tố 19

1.2 T ổng quan về vi khuẩn lactic 21

1.2.1 Gi ới thiệu vi khuẩn lactic 21

1.2.2 Phân loại 22

1.2.3 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic 23

1.2.4 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 25

1.2.5 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 26

1.2.6 Quá trình trao đổi chất 28

1.2.7 Các y ếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và phát tri ển của vi khuẩn lactic 31

1.2.8 Ứng dụng của vi khuẩn lactic 32

1

1.2.9 Hoạt tính sinh học 33

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1 Địa điểm nghiên cứu 38

2.2 Th ời gian thực hiện 38

2.3 Vật liệu 38

2.3.1 Nguồn phân lập 38

2.3.2 Thiết bị và dụng cụ 38

2.3.3 Hóa chất 38

2.3.4 Giống nấm 40

2.4 Phương pháp luận 40

2.5 Phương pháp thí nghiệm 43

2.5.1 Thu thập mẫu 43

2.5.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic 43

2.5.3 Khảo sát hình thái, sinh lý, sinh hoá 45

2.6 Khảo sát khả năng tăng trưởng và lên men lactic 49

2.7 Kh ảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic bằng phương pháp in vitro 49

2.7.1 Khảo sát khả năng đối kháng nấm trực tiếp theo phương pháp in vitro 49 2.7.2 Kh ảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào 53

2.8 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic trong bảo quản hạt 55 2.8.1 Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 10 2 /12g hạt: 55 2.8.2 Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 10 1 /12g hạt: 57 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 60

3.1 Kết quả khảo sát hình thái, sinh lý, snh hoá 60

3.1.1 Thử nghiệm Catalase 61

3.1.2 Nhuộm Gram 62

3.1.3 Nhuộm bào tử 63

3.1.4 Khả năng lên men đường và khả năng sinh khí 64

3.1.5 Th ử nghiệm khả năng di động bằng phương pháp thạch mềm 66

2

3.2 Khảo sát khả năng tăng trưởng và lên men lactic 71

3.3 Kh ảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic bằng phương phap in vitro 73

3.3.1 Khảo sát khả năng kháng nấm trực tiếp của chủng vi khuẩn lactic 73

3.3.2 Khả năng sinh enzyme ngoại bào 76

3.4 Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 10 2 /12g hạt: 78

3.5 Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 10 1 /12g hạt: 87

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 94

4.1 K ết luận 94

4.2 Ki ến nghị 94

TÀI LIỆU THAM KHẢO 95

PHỤ LỤC 1

3

DANH M ỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

LAB lactic acid bacteria /Lactobacillales

VK Vi khuẩn

MRS de Man, Rogosa and Sharpe

PDA Potato Detrose Agar

ĐC Đối chứng

TN Thí nghiệm

4

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh trưởng của các chi vi khuẩn lactic 25

B ảng 1.2 Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) 34

B ảng 1.3 Các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic có tính kháng sinh (Holzapfel và cộng sự, 1995) 35

B ảng 1.4 Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB (Holzapfel và cộng sự, 1995) 37

B ảng 2.1: Kí hiệu các nguồn phân lập 43

Bảng 3.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập 61

Bảng 3.2 Trình bày hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các vi khuẩn phân lập 67

Bảng 3.3 Trình bày tóm tắt về các chủng phân lập có đặc điểm đặc trưng cho vi khuẩn lên men lactic 70

Bảng 3.4: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của 11 chủng vi 71

khuẩn phân lập 71

Bảng 3.5: Phân nhóm các chủng vi khuẩn lactic 72

Bảng 3.6 Thống kê số liệu phần trăm tỉ lệ ức chế của 11 chủng vi khuẩn phân lập được với 2 chủng nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn 74

Bảng 3.7 Kết quả khả năng sinh enzyme của các chủng vi khuẩn 76

Bảng 3.8 Khả năng kháng nấm CĐP1 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 102bào tử/g đậu phộng 78

Bảng 3.9 Khả năng kháng nấm CĐP2 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 102bào tử/g đậu phộng 82

Bảng 3.10 Khả năng kháng nấm CĐP1 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 101bào tử/g đậu phộng 87

Bảng 3.11 Khả năng kháng nấm CĐP2 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 101bào tử/g đậu phộng 89

5

Bảng 3.12 Thời gian bắt đầu xuất hiện tơ nấm (ngày) của 11 chủng vi khuẩn với

mật độ cảm nhiễm 101bt/g đậu phộng và 102bt/g đậu phộng 90

Bảng 3.13 So sánh khả năng tăng trưởng, lên men lactic, kháng nấm in vitro và in

vivo của các chủng vi khuẩn phân lập 91

6

DANH M ỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Một số vi khuẩn lactic điển hình 24

Hình 1.2 Sơ đồ các con đường lên men lactose của vi khuẩn lactic 29

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn lactic 42

Hình 2.2: Cách pha loãng mẫu 44

Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn 50

Hình 2.4: Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế của phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn 52

Hình 2.5: Sơ đồ thí nghiệm khả năng sinh enzyme của các chủng LAB 53

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic 60

Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic trên môi trường có chứa chất chỉ thị 61 Hình 3.3: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn (Từ trái qua phải): Thử nghiệm âm tính của chủng vi khuẩn KC1A, Đối chứng âm là nước cất, thử nghiệm dương tính đối với Bacillus spp 62

Hình 3.4 Kết quả nhuộm gram của chủng vi khuẩn: A Vi khuẩn Bacillus subtilis bắt màu tím B Vi khuẩn E.coli bắt màu hồng C Vi khuẩn phân lập 63

Hình 3.5 Kết quả nhuộm bào tử của chủng vi khuẩn A Vi khuẩn Bacillus subtilis sinh bào tử B Vi khuẩn E.coli không sinh bào tử C Vi khuẩn phân lập không sinh bào tử 64

Hình 3.6 Thử nghiệm lên men đường Ống 1: Vi khuẩn không lên men đường Ống 2: Vi khuẩn lên men đường có sinh khí Ống 3: Vi khuẩn lên men đường nhưng không sinh khí 65

Hình 3.7 Vi khuẩn lactic phân lập được có khả năng lên men đường 66 Sau thử nghiệm lên men đường, thu được kết quả cho thấy trong số 11 chủng phân lập thì có 10 chủng là vi khuẩn lên men đồng hình, 1 chủng còn lại là lên men dị hình Các chủng phân lập từ Kim chi đều lên men đồng hình sinh acid lactic, còn với các chủng phân lập từ Nem chua có duy nhất 1 chủng là lên men dị hình, 4

7

chủng còn lại đều lên men đồng hình Chủng lên men dị hình đó thường mang lại cho Nem chua nhiều giá trị cảm quan hơn do hình thành sản phẩm phụ ngoài acid

lactic 66

Hình 3.8 Kiểm tra tính di động của vi khuẩn Ống a: Vi khuẩn có khả năng di động Ống b: Vi khuẩn không có khả năng di động Ống c: Vi khuẩn phân lập được không có khả năng di động 67

Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn %Acid tổng và sinh khối của 11 chủng vi khuẩn sau 24h nuôi cấy 72

Hình 3.10 Khả năng đối kháng nấm CĐP2 của chủng vi khuẩn phân lập 74

Hình 3.11 Khả năng đối kháng nấm CĐP1 của chủng vi khuẩn phân lập 74

Hình 3.12 Biểu đồ thể hiện phần trăm tỉ lệ ức chế nấm của các chủng vi khuẩn 75

Hình 3.13 Khả năng đối kháng CĐP1 của NC412 sau 3 ngày 75

Hình 3.14 Khả năng đối kháng CĐP2 của KC1A sau 3 ngày 75

Hình 3.15 Khả năng đối kháng CĐP1 của KC242 sau 3 ngày 76

Hình 3.16 Khả năng phân giải Tinh bột của chủng vi khuẩn KC13 77

Hình 3.17 Khả năng phân giải Protein của chủng vi khuẩn KC1B 77

Hình 3.18 Khả năng phân giải Chitin của chủng vi khuẩn KC1A 77

Hình 3.19 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7 Từ trên xuống: ĐC (-) – Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng Carbezim, Chủng VK KC211, Chủng VK KC1A 79

Hình 3.20 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7 Từ trên xuống: Chủng VK KC1B, KC13, KC106, KC242 80

Hình 3.21 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7 Từ trên xuống: Chủng VK NC2, NC12, NC172, NC412 81

Hình 3.22 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7, ngày 13, ngày 19 Từ trên xuống: ĐC (-) –

8

Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng Carbezim, Chủng VK KC211, Chủng VK KC1A 83

Hình 3.23 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7, ngày 13, ngày 19 Từ trên xuống: Chủng

VK KC1B, KC13, KC106, KC242 84

Hình 3.24 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7, ngày 13, ngày 19 Từ trên xuống: Chủng

VK NC2, NC12, NC172, NC412 85

Hình 3.25 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày (Từ trái sang: ngày 1, 2, 3, 4, 6

và 12 ngày Từ trên xuống: ĐC (-) – Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng

Carbezim, Chủng VK KC1A và chủng NC412 92

Hình 3.26 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày (Từ trái sang: ngày 1, 2, 3, 4, 6

và 12 ngày Từ trên xuống: ĐC (-) – Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng Carbezim, Chủng VK KC1A và chủng NC412 93

9

M Ở ĐẦU

1 Tính cấp thiết đề tài

Song song với sự phát triển về kinh tế, chính trị và xã hội thì bên cạnh đó lĩnh

vực Công nghệ sinh học cũng đang dần phát triển ngày càng rộng mở

Ngày nay con người ta đã ứng dụng các thành tựu khoa học công nghệ vào trong cuộc sống, áp dụng trên tất cả các loại hình từ công nghiệp, nông nghiệp, an ninh quốc phòng cho đến giải trí, v.v Công nghệ sinh học chính là kết quả của các quá trình nghiên cứu khoa học công nghệ

Các nhà khoa học, các nhà nghiên cứu, ứng dụng các kiến thức từ các tài liệu trên toàn Thế Giới và áp dụng các biện pháp kỹ thuật để cho ra đời các giống cây

trồng, vật nuôi, vi sinh vật có tính năng ưu việt hơn các loại giống hiện có Bên

cạnh đó còn có thể tạo ra những loại thức ăn mới, nghiên cứu ra các loại thuốc, chất xét nghiệm bệnh, những mầm móng mới có giá trị phục vụ đời sống, phát triển kinh

tế - xã hội và bảo vệ môi trường

Đặc biệt hơn là áp dụng trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm Các nghiên cứu Công nghệ sinh học cho ra đời các loại vi sinh vật dùng trong chế biến và bảo quản

thực phẩm, điều tiết các loại vi khuẩn, nấm mốc có trong thực phẩm Hạn chế mầm

bệnh và sự lây lan đến môi trường sống

Xã hội ngày càng phát triển nên con người luôn phải chạy theo sự phát triển

đó Cuộc sống của họ trở nên bận rộn hơn, họ bắt đầu “sống vội” hơn Thay vì sử

dụng các thực phẩm xanh, sạch thì con người lại chọn những thực phẩm chế biến

sẵn mà không biết hầu hết chúng đều được bảo quản bằng chất hóa học Bản thân

thực phẩm cũng có thể chứa các mầm bệnh là nguyên nhân trực tiếp gây ra các dịch

bệnh hiện nay Mặc dù áp dụng tiến bộ kỹ thuật trong công nghệ và quy phạm vệ sinh an toàn thực phẩm (GMP, HACCP…), nhưng nguy cơ nhiễm các vi sinh vật gây bệnh trong quá trình chế biến thực phẩm ngày càng gia tăng (Theo Besselink, et al., 2008)

Chính vì thế, các cơ sở sản xuất thực phẩm phải dùng đến các chất bảo quản hóa học Mặc dù, nếu chúng được sử dụng với liều lượng cho phép nhưng các chất

10

phụ gia này vẫn gây ra các tác dụng không mong muốn cho người tiêu dùng Nhưng còn có rất nhiều trường hợp, do lợi nhuận, các nhà sản xuất còn sử dụng các loại hóa chất bị nghiêm cấm để có thể tăng hương vị sản phẩm hoặc kéo dài được hạn sử

dụng hơn Có thể nói: Hiện nay con người dường như đang sống cùng hóa chất và

sức khỏe con người đang đứng trước bờ vực thẳm

Theo đó tôi đã dựa trên những nghiên cứu, những tài liệu mà các thầy cô cung

cấp, và tìm hiểu thêm trên các trang thông tin khoa học để thực hiện đề tài “Phân

lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic ức chế nấm mốc sinh Aflatoxin” Loại vi khuẩn này có khả năng kháng lại các loại nấm mốc dùng trong chế biến và bảo quản thực

phẩm Đảm bảo thực phẩm đạt chất lượng dinh dưỡng hợp lý, nâng cao chất lượng

sản phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trên thị trường nội địa lẫn quốc tế

Do đó, tôi đã thực hiện đề tài này nhằm phục vụ quá trình làm đồ án tốt nghiệp cũng như là tìm tòi, học hỏi, tích lũy các kinh nghiệm thực tiễn trong quá trình tham

khảo, nghiên cứu các ứng dụng của khuẩn lên men lactic cùng với các phương pháp

xử lý nguyên liệu và chế biến hợp lý nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm, tạo ra sự đồng nhất của sản phẩm sau khi lên men, kéo dài thời gian bảo quản góp phần vào

việc đáp ứng nhu cầu sử dụng đa dạng sản phẩm và đảm bảo hợp vệ sinh cho người

Phân lập và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sản sinh hợp chất

kháng khuẩn của Lactobacillus plantarum (Lê Ngọc Thùy Trang và cộng sự,

2014)

Phân lập, định danh và xác định các chủng Lactobacillus có tiềm năng

Probiotic từ người (Hoàng Quốc Khánh và cộng sự)

11

Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng trong chế biến và bảo quản thưc ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại (Đào Thị Lương

và các cộng sự, 2010)

Nghiên cứu đặc điểm và vai trò của Lactobacillus acidophilus trong chế

biến Probiotic (Trần Thị Ái Liên, 2011)

Ngoài ra còn có nhiều công trình nghiên cứu khác về vi khuẩn lactic trong và ngoài nước

3 M ục tiêu nghiên cứu

Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc gây nhiễm độc trên thực phẩm

4 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống như kim chi và nem chua

- Khảo sát khả năng tăng trưởng và lên men lactic của các chủng phân lập

- Khảo sát khả năng đối kháng nấm sinh aflatoxin in vitro

- Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của cac chủng phân lập

- Khảo sát khả năng kháng nấm in vivo qua thí nghiệm bảo quản đậu phộng

5 Phương pháp nghiên cứu

5.1 Phương pháp luận

- Lựa chọn nguồn phân lập là các loại thực phẩm lên men truyền thống như kim chi, nem chua, vì các nguồn này chứa các vi khuẩn sống và có tiềm năng kháng nấm cao

- Phân lập vi khuẩn lên men lactic bằng môi trường chuyên biệt có bổ sung NaN3và khăng định khả năng sinh acid bằng chỉ thị, dựa vào khoá phân loại của Bergey’s Manual (Theo Benson Lab Manual, 2001) và định danh sơ bộ

vi khuẩn lên men lactic

- Tuyển cho ̣̣n các chủng vi khuẩn phân lập qua khảo sát sinh khối và acid tổng tạo thành

12

- Tuyển cho ̣̣n các chủng vi khuẩn phân lập kháng nấm in vitro của các chủng phân lập áp dụng phương pháp đối kháng trực tiếp (cấy 2 đường vi khuẩn)

- Tuyển cho ̣̣n các chủng vi khuẩn phân lập qua kháng nấm in vivo qua thí nghiệm bảo quản đậu phộng

Chương 3: Kết quả và biện luận – nội dung chương đưa ra những kết quả

mà đề tài thực hiện được và đưa ra những biện luận cho kết quả thu được

Kết luận và kiến nghị – nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề tài đạt được và đề nghị cho những hướng cải thiện thêm trong đề tài

13

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về nấm

Giới Nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn dị dưỡng có thành tế bào bằng chitin Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các sợi đa bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium), một số nấm khác lại phát triển dưới dạng đơn bào Quá trình sinh sản (hữu tính hoặc vô tính) của nấm thường qua bào tử, được tạo ra trên những cấu trúc đặc biệt hay quả thể Một số loài lại mất khả năng tạo nên những cấu trúc sinh sản đặc biệt và nhân lên qua hình thức sinh sản sinh dưỡng

Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm lớn (nấm quả thể) Giới Nấm là nhóm sinh vật đơn ngành (monophyletic) mà có nguồn gốc hoàn toàn khác biệt với những sinh vật có hình thái tương tự như nấm nhầy (myxomycetes) hay mốc nước (oomycetes) Nấm có mối quan hệ gần với động vật hơn thực vật, cho dù thế thì môn học về nấm, hay nấm học, lại thường được xếp vào thành một nhánh của thực vật học

Trên Trái Đất, đa phần các nấm đều không thể nhìn thấy được bằng mắt thường, chúng sống phần lớn ở trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc ký sinh trên cơ thể động, thực vật và nấm khác Vi nấm đóng một vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các vật chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình chuyển hóa và trao đổi vật chất Một số loài nấm có thể nhận thấy được khi ở dạng quả thể, như nấm lớn và nấm mốc Nấm được ứng dụng rất rộng rãi trong đời sống lẫn sản xuất Nhiều loài được sử dụng trong công nghệ thực phẩm, sử dụng làm thức ăn hoặc trong quá trình lên men Nấm còn được dùng

để sản xuất chất kháng sinh, hoóc môn trong y học và nhiều loại enzyme Tuy vậy, nhiều loại nấm lại có chứa các chất hoạt động sinh học được gọi là mycotoxin như ancaloit và polyketit-là những chất độc đối với động vật lẫn con người Một số loại nấm được sử dụng để kích thích hoặc dùng trong các nghi lễ truyền thống với vai trò tác động lên trí tuệ và hành vi của con người Vài loại nấm có thể gây ra các

14

chứng bệnh cho con người và động vật, cũng như bệnh dịch cho cây trồng, mùa màng và có thể gây tác động lớn lên an ninh lương thực và kinh tế

Nấm mốc (hay còn gọi là vi nấm) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, là tế bào không có diệp lục tố, thường sinh sản thông qua bào tử hoặc sống dị dưỡng (hoại sinh, kí sinh, cộng sinh), quá trình sinh sản có thể là vô tính nhay hữu tính.Vách tế bào chủ yếu là chitin, có hoặc không có cenllulose và một số thành phần khác có hàm lượng thấp Nấm mốc thường thường phát triển dưới dạng sợi đa bào gọi là sợi nấm (hyphae) tạo hệ sợi (mycelium) Có 2 loại sợi: Sợi nấm dinh dưỡng: nằm trong lớp môi trường, làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng cho toàn bộ hệ nấm Sợi

nấm khí sinh: thường nhô ra môi trường, giữ vai trò sinh sản (tạo bào tử)

1.1.2 Độc tố nấm

1.1.2.1 Các loại độc tố do nấm tiết ra

Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có vú, cá, gia cầm và con người

Theo Nguyễn Thị Hiền (2009) hiện nay có khoảng 300 loài độc tố được phát

hiện và nghiên cứu Tuy nhiên chỉ có khoảng 20 loài độc tố có trong thực phẩm ở

mức độ nghiêm trọng và liên quan đến an toàn thực phẩm Được tạo bởi năm chi

nấm là Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaría và Claviceps, chúng bao gồm:

- Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), ochratoxin

A, stermatocystin, acid cyclopianxoic

- Các độc tố của Penicillium: Pautulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A và axit cyclopianzoic toxin, fumonisin, moniliformin, diacetocyscirpenon

- Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenon, nivalenon, zearalenon, T-2 toxin

- Các độc tố của Alternaria: Acid tenuazoic, alternarion, methyl ether alternarion

- Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà

Một số độc tố gây hội chứng chảy máu, triệu chứng ngưng kết hồng cầu hay

hiện tượng tiêu máu rất nguy hiểm thường gặp ở động vật và người bị nhiễm độc tố

15

Mycotoxin còn làm suy yếu hệ thống miễn dịch của cơ thể Nhiều độc tố như aflatoxin, ochratoxin, funomisin có thể là các chất gây biến dị, ung thư, quái thai

Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: Độc cấp tính, mãn tính, gây đột

biến và quái thai Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối loạn chức năng

hoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợp nặng Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết

Những bệnh do độc tố nấm mốc (Mycotoxin) gây nên trước tiên là biểu hiện

tổn thương ở gan và thận Có thể quan sát được sự xuất hiện các u gan, thoái hoá tế bào nhu mô gan, xơ hoá Mycotoxin còn phá hủy tế bào gan và thận, ảnh hưởng trực tiếp lên hệ miễn dịch, ăn mòn thành ruột và dạ dày Ngoài ra còn có các dấu

hiệu tăng ure huyết, albumin niệu và viêm cầu thận

1.1.2.2 Độc tố Aflatoxin

Độc tố gây độc chủ yếu và nguy hại nhất là Aflatoxin Chúng là độc tố vi

nấm do nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh, thường gây ô nhiễm

trên một số hạt (như lạc) Phản ứng gây độc của chúng chủ yếu là trong gan Nếu mức độ nhiễm độc thấp sẽ tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản của động vật và nặng hơn sẽ gây ung thư

Chúng có thể tạo khuẩn lạc và gây nhiễm vào hạt trước khi thu hoạch và trong quá

trình bảo quản Cây chủ rất dễ bị gây nhiễm bởi Aspergillus sau phơi nhiễm kéo dài

trong môi trường có độ ẩm cao hoặc bị tổn thương các điều kiện xấu như hạn hán

Các môi trường sống bản địa của Aspergillus là trong đất, thực vật mục nát và

ngũ cốc đang bị giảm sức đề kháng vi sinh vật và nó xâm nhập tất cả các loại chất hữu cơ mỗi khi có điều kiện được thuận lợi cho sự phát triển của nó Điều kiện thuận lợi bao gồm độ ẩm cao (ít nhất là 7%) và nhiệt độ cao

Các loại nông sản thường bị nhiễm aflatoxin là ngũ cốc (ngô, kê, lúa miến, gạo, lúa mì), hạt có dầu (lạc, đậu tương, hạt hướng dương, hạt bông), gia vị (ớt, hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ, gừng) và các loại quả hoặc hạt khác như hạt dẻ,

16

dừa…Aflatoxin cũng có thể xuất hiện trong sữa của động vật được cho ăn bằng thức ăn nhiễm aflatoxin

Ở người, aflatoxin gây ngộ độc cấp tính qua đường ăn uống và nhiễm ở liều lượng cao trong thời gian ngắn Những triệu chứng cấp tính chuyên biệt bao gồm: Xuất huyết, huỷ hoại gan cấp tính, phù nề, cản trở hấp thu các chất và tử vong Trong khi đó, nếu hấp thu ở liều lượng từ thấp đến trung bình trong một thời gian dài thì khó có thể nhận biết, một số triệu chứng có thể kể đến như là chuyển hoá thức ăn kém, sụt cân, nhưng rõ nhất chính là ngộ độc mãn tính trên gan và ung thư gan

Ở động vật, các triệu chứng nhiễm độc aflatoxin được nghiên cứu thông qua các vụ nhiễm độc tự nhiên và qua thí nghiệm trên động vật Sự nhiễm độc mãn tính aflatoxin có tính di truyền theo ba kiểu: Gây ung thư, quái thai, đột biến Hậu quả của việc nhiễm aflatoxin còn phụ thuộc vào tuổi, giới tính, loài, tình trạng dinh dưỡng và mức độ tiếp xúc Chẳng hạn như động vật càng non thì khả năng mẫn cảm

với tác nhân càng cao

Ngoài Aflatoxin, một số độc tố vi nấm thường gặp là ochratoxin Penicillium

do nấm Aspergillus tiết ra Độc tố zearalemon và tricothecenes chủ yếu do nấm Fusarium tiết ra Độc tố patulin lại do nấm Penicillium và Fumonisin tiết

1.1.3 Tác h ại của nấm

1.1.3.1 Tác h ại của nấm gây ra cho thực vật

Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng có thể gây thiệt hại lớn cho ngành nông nghiệp và lâm nghiệp Ví dụ như nấm đạo ôn (Magnaporthe oryzae) gây

bệnh cho lúa Những loài gây bệnh cho cây thuộc các chi Fusarium, Ustilago, Alternaría và Cochliobolus Chúng làm thối rễ, tổn thương các bộ phận của cây trồng, hoa, quả, làm giảm năng suất hoặc chất lượng sản phẩm nông nghiệp do bị

ẩm mốc,

1.1.3.2 Tác h ại của nấm gây ra cho người và động vật

Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hoặc tiếp xúc với nấm: Có khoảng 70 loài nấm sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng Chúng có thể là nấm mốc trong nhà hay

17

ngoài trời, đa phần là nấm sợi như các chi Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Helminthosporium, Epicoccum, Penicillium, Fusarium , chỉ có vài loài là nấm đơn

bào như Candida, Rhodotorula, có một số loài là nấm lớn như Agaricus, Coprinus, Fomes, Ganoderma Bào tử nấm có thể gây ra những chứng như hen suyễn, viêm mũi dị ứng, các bệnh nấm dị ứng phế quản phổi và viêm phổi quá mẫn Ngộ độc do

ăn phải nấm độc, có thể từ rối loạn tiêu hoá, ảo giác, hoặc trầm trọng có thể tử vong Nấm kí sinh trên cơ thể người gây bệnh trực tiếp: Những loài có thể gây bệnh

cho người thuộc các chi như Aspergillus, Candida, Cryptococcus, Histoplasma và Pneumocystis Chúng có thể gây ra các bệnh ngoài da ở người như nấm chân, nấm móng, nấm tóc, hắc lào, lang ben,… cho đến những bệnh nguy hiểm có thể gây chết

người như viêm màng não (nấm Cryptococcus) hay viêm phổi do nấm

Pneumocystis carinii

Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên hiện có 3 chủng nấm mốc chiếm

ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus, Fusarium và Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm vào khoảng thời gian trước, trong và sau khi thu hoạch ngũ cốc, hạt có dầu,… Một trong những nguyên nhân được nhắc đến là do con người đã ăn thực phẩm có nấm mốc chứa aflatoxin, một độc tố vi nấm đã được chứng minh có thể gây ung thư gan trên thực nghiệm

Bệnh do nhiễm aflatoxin cấp tính với các biểu hiện chính là suy chức năng gan cấp, xơ gan và hoại tử nhu mô gan Nhưng cơ chế tác động của aflatoxin gây ung thư gan ở người cũng còn rất nhiều tranh cãi Tuy nhiên ở một số nghiên cứu, các nhà khoa học đã tìm thấy có sự gắn kết của aflatoxin B1 với DNA của tế bào gan cũng như có sự đột biến gen mà đặc biệt là gene p53 – một gene kiểm soát sự chết

tế bào, ở những bệnh nhân mắc ung thư gan

18

hạt nổi nhưng không chứa mycotocxin

Phân hủy aflatoxin bằng không khí nóng: Dùng không khí nóng thổi qua nguyên liệu có chứa aflatoxin để làm giảm thiểu lượng aflatoxin đã được nhiều tác

giả nghiên cứu, phương pháp này đã đem lại nhiều kết quả đáng kể Nếu nhiệt độ không khí nóng đưa vào là 100°C - 145°C ở ngô hạt thì lượng aflatoxin B1 có thể

giảm từ 877 ppb còn 452 ppb, từ 378 ppb còn 213 ppb Nếu tăng nhiệt độ lên tới 165°C có thể làm cho lượng aflatoxin B1 giảm đến 65% (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị

Ngọc Diệp, 2003)

Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: Phương pháp hấp ướt ở nhiệt

độ cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn Quá trình này phá hủy nhanh chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin Theo Rehana (1979)

nhận thấy nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 120°C (thêm nước vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến 68% Ở đậu phộng có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở 120°C trong 4 giờ giảm còn 370 ppb Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760ppb) được

hấp ở 1,5 atm trong vòng một giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin (Theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: Đây là phương pháp có thể áp dụng đối

với thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, do ít có khả năng tạo sản phẩm khác có hoạt tính từ aflatoxin và có thể thu hồi được dung môi mà không ảnh hưởng đến thành phần dinh dưỡng của thức ăn Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan-methanol,

19

hexan-ethanol, hexan-ethanol-nước và hexan-acetone-nước Hệ thống bao gồm 54% acetone, 44% hexan và 2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhất được tìm thấy có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư lượng lipid gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 μg/kg

1.1.5.2 Phương pháp hóa học

Phương pháp sử dụng các chất oxi hóa-khử: Các chất oxy hóa-khử như Natri Hypochlorite (NaOCl), Hydrogen Peroxide (H2O2) được sử dụng để làm mất độc tính của aflatoxin Tuy nhiên sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin có thể làm mất màu sắc của hạt và biến chất các acid amin Khí ozone (O3) cũng được thử nghiệm về khả năng phân hủy aflatoxin trong mẫu và đạt được hiệu quả tốt, song có

bằng chứng là chất lượng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein, vitamin

Phương pháp sử dụng khí NH3: Nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả của

việc dùng khí NH3 làm vô hoạt aflatoxin Xử lý ngô bằng khí NH3 được đặc biệt quan tâm ứng dụng hơn cả Người ta nhận thấy, nếu hàm lượng NH3 là 0,5 - 1,5%

và nhiệt độ bên ngoài là 25°C, trong 14 ngày tiếp xúc, lượng aflatoxin từ 200ppb có

thể giảm xuống còn 10 ppb (theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

1.1.5.3 Phương pháp sinh học

Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo

áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên nông sản ở mức độ cao quá giới hạn là không thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lượng lương

thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản được chứng minh là các phương pháp

1.2 T ổng quan về vi khuẩn lactic

1.2.1 Gi ới thiệu vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic (LAB) có vai trò rất quan trọng trong cuộc sống của chúng ta Chúng tạo ra các thực phẩm lên men và bảo quản thực phẩm khỏi bị hư hỏng Từ đầu thế kỷ 20, Elie Metchnikoff (1845-1916) đã đề xuất sử dụng các LAB cho mục đích chữa bệnh Từ đó, lĩnh vực nghiên cứu probiotic đã ra đời và phát triển Đến nay, những nghiên cứu về probiotic đã không ngừng cung cấp những bằng chứng có tính khoa học về hiệu quả thực sự của probiotic đối với sức khỏe con người Bên cạnh đó, các sản phẩm chức năng sử dụng các vi khuẩn probiotic xuất hiện ngày càng nhiều ở Châu Âu, Nhật, Mỹ… Hiện nay, một số sản phẩm probiotic cũng được bày bán trên thị trường Việt Nam như: sữa bột Gain IQ (Abbott Laboratories), (Hoàng Quốc Khánh và cộng sự)

Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các loại thức ăn chua (sữa chua, muối dưa, muối cà, ), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc

để sản xuất acid lactic và các loại muối của acid lactic Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hóa học người Thụy Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic 21 năm sau đó (1878), Lister đã phân lập được vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus lactic) và đến năm 1881 ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã được hình thành

Vi khuẩn lên men lactic gọi là vi khuẩn lactic, chúng được Pasteur tìm ra từ

sữa bị chua và hiện nay chúng được công nhận là an toàn sinh học (generally recognized as safe - GRAS), được sử dụng thường xuyên trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ vi sinh vật có ích của con người

Một đặc tính quan trọng khác của vi khuẩn lactic là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin, có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm (Theo Batt, 1999; Dubernet et al., 2002)

21

Vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn diện rộng do có khả năng sản xuất

ra các chất ức chế: như một số acid hữu cơ, hydrogen peroxide, diacetyl, các chất

có khối lượng phân tử thấp và bacteriocin là chất có khả năng ức chế cả vi khuẩn gram (+) và vi khuẩn gram (-) Các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sản sinh acid

hữu cơ, đặc biệt là acid lactic trong quá trình sinh trưởng và phát triển Đối với hydroxy peroxide thì khả năng kháng khuẩn là do việc tạo ra các chất oxy hóa

mạnh như oxygen nguyên tử, các gốc tự do superoxide và các gốc tự do hydroxyl Đối với bacteriocin, cơ chế kháng khuẩn do vi khuẩn lactic tổng hợp đã được nghiên cứu đầu tiên ở nisin, bacteriocin gram (+) (Theo Thomas L V et al,2002)

Dựa trên bản chất cation và tính kị nước, hầu hết các peptide hoạt động như màng tế bào thấm Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn

có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào lớp peptidoglycan để làm suy

yếu thành tế bào (Theo Rattanachaikunsopon P et al, 2010)

Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaccae và được xếp vào năm giống: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc, Aerococcus Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng khác nhau, chẳng hạn như chúng là trực khuẩn ngắn hay que (rod) dài ở dạng đơn, đôi hoặc xếp thành chuỗi và cầu khuẩn (cocci) Theo bảng phân loại được sửa đổi hiện nay, vi khuẩn lactic gồm

khoảng 20 giống thuộc họ Lactobacillaceae, chúng thường có dạng hình cầu (hoặc ovan) và hình que, trong đó các giống chủ yếu nhất là: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weisslella Việc phân loại vi khuẩn lactic vào các chi khác nhau phần lớn là dựa trên hình thái sinh học, chế độ và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình sản xuất acid lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu được acid hoặc kiềm Phân loại theo con đường hóa học như thành phần acid béo và các thành phần của thành

tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại cũng được sử dụng trong phân loại

22

1.2.3 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacteria – LAB) là vi khuẩn Gram dương, chịu acid, không hình thành bào tử, không có khả năng di động, hình que hoặc hình cầu (Nguyễn Đức Lượng, Vi sinh công nghệ, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2004.) Vi khuẩn lactic phát triển tốt nhất với pH 5.5 – 5.8 và có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp đối với các amino acid, peptide, vitamin, khoang, acid béo và carbonhydrate (Nguyễn Lân Dũng và cs, Vi sinh vật học, NXB Giaó Dục, 2002.)

Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic tròn nhỏ, trong bề mặt bóng, màu trắng đục

hoặc màu vàng kem, hoặc khuẩn lạc có kính thước to hơn tròn lồi trắng đục Đặc

biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid

Về kích thước tế bào thì đối với các dạng cầu khuẩn là từ 0.5 – 1.5μm Các

tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau Còn với trực khuẩn thì từ 1 - 8μm Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi

 Đặc điểm hình thái giống vi khuẩn lactic điển hình:

Trong số các vi khuẩn lactic, giống Lactobacillus được xem là đại diện cho

• Giống: Lactobacillus

Hình 1.1: Một số vi khuẩn lactic điển hình

Chi Lactobacillus hiện bao gồm hơn 125 loài như: L acidophilus, L brevis,

L casei, L fermentum, L plantarum, L bulgaricus …

Tế bào có dạng hình que nhưng hình dạng của chúng có thể thay đổi tùy vào điều kiện của môi trường sống, có thể là dạng que ngắn hoặc dài, xếp thành chuỗi

hay đứng riêng lẻ hoặc ở dạng que kép Lactobacillus là vi khuẩn Gram dương,

không di động, không sinh bào tử, âm tính với catalase, kỵ khí chịu oxy, có khả năng chịu được môi trường có pH thấp Một số loài có thể phát triển ở môi trường

nghèo chất dinh dưỡng, và chịu được nhiệt độ cao Ngoài trừ loài L.plantarum thì

những loài khác không có khả năng chuyển hóa nitrate khi ở điều kiện nhất định

Các loài Lactobacillus thường được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và

hệ sinh dục người Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức

năng cũng có chứa các vi khuẩn này như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, Lactobacillus plantarum

24

Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa theo các sản phẩm của quá trình trao

đổi chất của chúng Vì vậy có thể chia các loài Lactobacillus thành 3 nhóm như

sau:

- Nhóm I (Lên men đồng hình bắt buộc): Chúng được gọi là Thermobacterium, có fructose - 1,6 - diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng không có phosphoketolase Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không lên men được pentose, thường phát triển ở 45oC

- Nhóm II (Lên men dị hình tùy nghi): Chúng được gọi là Streptobacterium (có FDP aldolase và cảm ứng phosphoketolase) Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acid acetic

- Nhóm III (Lên men dị hình bắt buộc): Chúng được gọi là Betabacterium (có phosphoketolase nhưng không có FDP aldolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình

Trên thực tế, đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Lactobacillus rất hữu ích trong việc điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng ruột kích thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy do nhiễm khuẩn Clostridium difficile, cơ thể không phân giải được lactose, bệnh về da như: ban đỏ do sốt, chàm, viêm loét da và ngăn ngừa nhiễm trùng đường hô hấp

1.2.4 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa

Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh trưởng của các chi vi khuẩn lactic

thái tế bào

Lên men lactic

Nhiệt độ tăng trưởng, o

Lactic aicd isomer

Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau Ngoài các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như carbon, nitơ một phần dưới dạng các acid amin, photphat và lưu huỳnh chúng còn cần một số chất cần thiết khác như vitamin, muối

vô cơ, các chất sinh trưởng để sinh trưởng một cách bình thường

- Nhu cầu dinh dưỡng carbon: Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrate carbon từ các monosaccaride (glucose, fructose, manose), các disaccharide (saccharose, lactose, maltose) cho đến các polysaccharide (tinh bột, dextrin) Chúng

sử dụng nguồn carbon nhằm cung cấp năng lượng, xây dựng cấu

trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic,

- Nhu cầu dinh dưỡng Nitơ: Đa số vi khuẩn lactic không thể tự tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ mà phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi

26

trường Các nguồn nitơ có thể sử dụng như: cao thịt, pepton, cao nấm men, trypton,

dịch thủy phân casein từ sữa,…

- Nhu cầu dinh dưỡng Vitamin: Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men…

- Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác: Ngoài các acid amin và vitamin,

vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các baz nitơ hay các acid hữu cơ Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrate, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quả các chủng vi khuẩn lactic Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào Nên người

ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng các muối acetate để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic

- Nhu cầu các muối vô cơ khác: Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào

- Nhu cầu dinh dưỡng oxi: Lactobacilli là những vi khuẩn vi hiều khí

(microaerophile), sinh trưởng trên bề mặt môi trường thạch ở điều kiện kỵ khí, một

số loài là vi khuẩn kỵ khí (Theo Wood B.J.B and Holzapfel W.H 1995) Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy, vừa sống được trong môi trường không có oxy Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn

sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí

27

1.2.6 Quá trình trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua

việc lên men lactic LAB có khả năng lên men các loại đường hexose (glucose, mannose, galactose, fructose…), disaccharide (lactose, saccharose…); pentose (arabinose, xylose, ribose…) và các hợp chất liên quan Chúng chỉ sử dụng được các loại đường ở dạng đồng phân D Tuy nhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau làm thay đổi cách thức trao đổi chất và dẫn đến các sản phẩm

cuối cùng tạo ra cũng khác nhau

Quá trình lên men lactic có thể đồng hình hoặc dị hình Lên men đồng hình

gồm con đường EMP chuyển hóa đường thành pyruvate, sau đó pyruvate bị khử thành lactic acid 90% đường được chuyển hóa thành acid lactic Trong khi đó ở lên men lactic dị hình chỉ 50% đường được chuyển hóa thành acid lactic, còn lại là CO2, acetaldehyde, ethanol

28

Hình 1.2 Sơ đồ các con đường lên men lactose của vi khuẩn lactic

A) Lên men đồng hình B) Lên men dị hình

- Lên men lactic đồng hình

Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol, di-acetiyl Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men:

29

C6H12O 2CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J

Con đường Glycolysis hay con đường EMP (Embden-Meyerhof-Parnas pathway) được sử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ leuconostocs, nhóm III Lactobacilli, Oenococci và Weissellas) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và nhờ FDP aldolase để tiếp tục chuyển thành dihydroxyacetonephosphate (DHAP)

và glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) đối với những chất có mức phosphoryl hóa ở 2 vị trí, sau đó tạo thành pyruvate Trong điều kiện có nhiều đường và hạn chế oxy, pyruvate bị khử thành acid lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+, do đó NADH đã được oxy hóa trước đó, khi thế oxy hóa khử được cân bằng, sản phẩm cuối cùng được tạo ra chủ yếu là acid lactic và quá trình này

được gọi là lên men lactic đồng hình ( Hình 1.7A)

- Lên men lactic dị hình

Đặc điểm của con đường này là sự khử hidro ngay từ bước đầu tạo phosphogluconate Theo sau đó là sự tách carbon tạo pentose-5-phosphate và tiếp tục chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) và acetyl phosphate GAP được tạo thành tương tự như trong con đường glycolysis và kết quả là tạo ra acid lactic

6-Trong điều kiện không có mặt của các chất nhận điện tử, acetyl phosphate sẽ

bị khử tạo thành ethanol thông qua CoA và acetaldehyde Khi quá trình này ngoài sản phẩm acid lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như CO2, ethanol, acid acetic, acid succinic thì nó được gọi là lên men lactic dị hình

Phương trình chung biển diễn quá trình lên men:

C6H12O6  CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH +CO2

Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic và acid acetic 10% các loại khí 20% đôi khi không có các khí mà thay vào

đó là sự tích luỹ một lượng ít acid foocmic

30

1.2.7 Các y ếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng

và phát tri ển của vi khuẩn lactic

Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ (Theo Lương Đức Phẩm, 2004) Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này

- Thành phần môi trường nuôi cấy

Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng Nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với môi trường bên ngoài Thành phần môi trường MRS để nuôi cấy vi khuẩn lactic có chứa nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng làm nguồn carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối khoáng và các yếu tố vi lượng

- Yếu tố môi trường

• Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng, ảnh hưởng đến enzyme của tế bào vi sinh vật Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzyme, dẫn đến ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng mạnh Phần lớn vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 40oC Một số có thể sinh trưởng dưới 15oC và thậm chí một số dòng có thể sinh trưởng dưới 5oC (Wood B.J.B and Holzapfel W.H, 1995)

• Ảnh hưởng của pH

Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh acid làm pH môi trường giảm và khi nó giảm tới mức nào đó nó sẽ ảnh hưởng lên sự phát triển của vi khuẩn lactic

31

Do đó, cần phải luôn điều chỉnh pH về khoảng tối thích cho vi khuẩn trong suốt quá trình nuôi, pH tối ưu phải giữa 5.5 và 6.0

• Ảnh hưởng của nồng độ acid

Acid là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi khuẩn lactic tạo nên Các vi khuẩn này chịu được acid, tuy nhiên với lượng acid tích lũy trong môi trường ngày một nhiều sẽ ức chế chúng Để giúp vi khuẩn lactic phát triển bình thường không bị chính sản phẩm do hoạt động của chúng để tạo ra, người ta cho vào môi trường các chất đệm thích hợp với một lượng đủ để trung hòa lượng acid sinh ra thông thường chất đệm này là CaCO3

• Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men

Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở những mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men

Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrate khác nhau, hoạt tính kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như:

- Thực phẩm: Chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ xử lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực

phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan

và dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có tính

cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối đồng thời kéo dài được thời gian bảo quản của các sản phẩm thực phẩm như bánh mì

- Công nghiệp: Vi khuẩn lactic là nguồn để lên men sản xuất acid lactic, đem lại nguồn thu hàng tỷ đô vì đây là chất được sử dụng rất rộng rãi ở nhiều lĩnh

vực khác nhau

- Y học: Chữa các bệnh đường ruột, cải thiện hệ tiêu hoá…

32

- Nông nghiệp và môi trường: Vi khuẩn lactic hạn chế sự phát triển của

nấm Fusarium, Aspergillus, chế phẩm EM có vai trò cải tạo đất và không gây ô

nhiễm, ức chế một số vk gây bệnh trên các loài thuỷ hải sản Ngoài ra còn được ứng dụng trong bảo quản hạt giống do sự phát triển của nấm mốc như: bắp, đậu

phộng,…

1.2.9 Hoạt tính sinh học

Các vi khuẩn lactic (LAB) có thể sản xuất một số chất kháng sinh như acid lactic và reuterin, ngoài ra còn có các acid hữu cơ, peroxit hydro, bacteriocin kháng khuẩn và các loại peptide kháng nấm LAB đã được biết đến trong nhiều năm và đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất của một loạt các thực phẩm lên men Lợi ích sức khỏe của LAB được biết là ảnh hưởng tích cực nhất định trong đường

tiêu hóa của con người (Cogan và cộng sự năm 1995, Hafidh và cộng sự, 2010)

1.2.9.1 Kh ả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic

Giống Lactobacillus đã được nghiên cứu là có hoạt tính kháng nấm khi đánh

giá bằng khảo nghiệm thạch lớp phủ chống lại loạt các nấm hư hỏng Hoạt động kháng nấm của L.coryniformis cornyformis subsp ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt

độ cao và độ pH 3-4,5 (Magnusson và Schnurer, 2001)

Hầu hết các nghiên cứu khả năng kháng nấm của LAB là do việc sản xuất một loại protein kháng nấm hoặc hợp chất proteinaceous và một số các LAB như L.Plantarum và L.Sanfrancisco đặc biệt sản xuất acid hữu cơ với các đặc tính kháng nấm (Corsetti và cộng sự năm 1998; Lavermicocca và cộng sự, 2003.) Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học (biopreservative) duy nhất - nisin

có thể được thêm vào thực phẩm sản phẩm của vi khuẩn acid lactic (Theo Gardiner và cộng sự, 2000; Corcoran và cộng sự, 2004.)

33

B ảng 1.2 Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm

Cyclo(Gly-Leu) methylhydantoin

mevalonolactone

Lactobacillus plantarum

VTTE-78076 Caproic-, propionic-, buturic-, acetic-,

formicand n- valeric acid

Lactibacillus sanfranciscensis CB1

Roy và cộng sự đã phân lập được 2100 khuẩn lạc lactic từ phô mai cũ và

sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus NCIM 555, A.parasiticus

NCIM 898 và Fusarium sp Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng

cho chủng lactic này (Roy và cộng sự, 1996)

Chi Lactobacillus thường được phân lập và nghiên cứu nhiều nhất Các chủng kháng nấm được phân lập từ các sản phẩm khác nhau như bột nhào chua (Corsetti và cộng sự, 1996), xúc xích (Coloretti và cộng sự, 2007), thức ăn ủ chua (Magnusson và Schnurer, 2001), phô mai và sữa (Roy và cộng sự, 1996)

Vi khuẩn lactic có khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm có tính acid và các hợp tố khác với hoạt tính kháng nấm mạnh Đa số các chất kháng nấm được xác định đều có trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid hữu cơ, H2O2, hợp chất proteinaceous, acid béo hydroxyl,…

34

B ảng 1.3 Các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic có tính kháng sinh

(Holzapfel và cộng sự, 1995)

Ngoài sự ức chế tăng trưởng thực tế của nấm, LAB cũng có thể ức chế sản phẩm đặc biệt của độc tố nấm mốc (Theo Gourama và Bullerman, 1997) hoặc làm bất động độc tố thông qua liên kết với bề mặt của chúng (Theo El-Nezami và cộng

khuẩn gây thối rữa

làm từ sữa)

dương

Reuterin(3-OH-propionaldehyde) Nấm mốc, nấm men

Bacteriocin

Nisin Một số loài vi khuẩn lactic, vi

khuẩn gram dương, các thể nội bào tử

1 số loại khác Vi khuẩn gram dương

35

động vật, và trong công tác phòng chống nấm mọc trong thực phẩm và các vật liệu khác Các phương thức hoạt động của kháng sinh chống nấm hiện nay là rất quan trọng cho sự ức chế nấm

Nhiều chất trong số các chất này được dành riêng cho sử dụng lâm sàng nhưng một số đang được sử dụng trong sự kiểm soát của nấm gây bệnh thực vật Thuốc kháng sinh được xác định là chất được sản xuất bởi các vi sinh vật có tác dụng diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật khác ở nồng độ thấp

1.2.9.2 Khả năng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn lactic

LAB cũng ức chế sự phát triển của ci sinh vật có hại gây thối rửa thong qua các sản phẩm chuyển hoá như hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl và đặc biệt là bacteriocin

- Bacteriocin: Bacteriocin là protein có hoạt tính sinh học do vi khuẩn

tiết ra, có thể tiêu diệt hoặc ức chế sự tăng trưởng của các vi khuẩn khác có quan hệ

họ hàng với chúng (Theo Hikmate Abriouel, 2007) Bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn, được sản sinh ra bởi nhiều nhóm vi khuẩn đa dạng, có thể khác nhau bởi phương thức và phổ hoạt động, phân tử lượng, đặc điểm sinh hóa và nguồn gốc gene (Theo Klaenhamme, 1993)

Ưu điểm của bacteriocin là có hoạt tính kháng khuẩn cao ngay cả khi ở

nồng độ rất thấp Tuy nhiên, bacteriocin thường có phổ kháng khuẩn hẹp hơn kháng sinh Khác với chất kháng sinh, bacteriocin thường được dùng trong thực phẩm và không có ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn còn chất kháng sinh chỉ được dùng trong y tế và có ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn Trên thế giới bacteriocin được sản xuất bằng công nghệ lên men vi sinh bởi vi khuẩn lactis

Bacteriocin còn có một số hạn chế như: ít được biết đến hơn chất bảo quản hoá học Bị thoái biến nhanh chóng bởi các enzyme phân giải protein

Bacteriocin được ứng dụng: Bổ sung bacteriocin tinh chế hay bán tinh

chế như là các chất bảo quản thực phẩm, dùng màng polyethylen hoạt tính bacteriocin cho đóng gói thực phẩm

36

- Sản phẩm chuyển hoá của LAB sử dụng để chống lại các vi sinh vật gây thối rữa và chức năng hoá có thể ức chế vi sinh vật của chúng được tóm tắt như sau:

B ảng 1.4 Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB

(Holzapfel và cộng sự, 1995)

Sản phẩm Các sinh vật ảnh hưởng

Acid lactic Vi khuẩn gram âm, 1 vài loài nấm

Acid acetic N ấm men, nấm, vi khuẩn gây thối rửa

H 2 O 2 Sinh v ật gây bệnh, đặc biệt trong thức ăn

giàu protein

H ệ thống lactoperoxidase với H 2 O 2 Vi khuẩn gây bệnh (sữa và các sản phẩm

làm từ sữa) Lysozyme Vi khu ẩn gram dương

Reuterin (3-OH- propoonaldehyde) N ấm mốc, nấm men

Diacetyl Vi khuẩn gram âm

Acid béo Các lo ại vi khuẩn khác nhau

37