Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây cúc lá nhỏ pico (chrysanthemum sp

Đứng trước thực trạng đó, tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây cúc lá nhỏ Pico Chrysanthemum sp.” vì cúc Pico hiện nay chưa được ai nghiên cứu nhân giống in

VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG INVITRO

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS Hà Thị Loan

MSSV : 1411100170 Lớp : 14DSH01

TP Hồ Chí Minh, 2018

Tôi xin cam đoan mọi số liệu, nội dung, quy trình trong đồ án toàn bộ là của tôi được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Hà Thị Loan Toàn bộ đề tài được thực hiện tại phòng thực nghiệm cây trồng Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 12/2017-7/2018 Tất cả những nội dung, quy trình, số liệu trong đồ án chưa được công bố trên tạp chí, hội thảo hay những diễn đàn khoa học

Đồ án được thực hiện có sự tham khảo, trích dẫn một số tài liệu và đảm bảo đúng tác quyền theo chuẩn quốc tế APA Trong trường hợp nếu có thắc mắc về nội dung, số liệu trong đồ án tôi sẵn sàng xuất trình mọi dữ liệu có liên quan được lưu trữ tại nơi tôi thực hiện đề tài

TP Hồ Chí Minh, ngày 29 tháng 07 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Huỳnh Thị Anh Đài

Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu trường Đại học Công Nghệ TP HCM, đặc biệt là Quý thầy cô trong Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH Em biết rằng đề tài được thực hiện đã phản ánh phần nào kiến thức mà thầy cô đã biên soạn

và chỉ dạy cho em trong suốt 4 năm qua, những bài học, những kinh nghiệm mà thầy cô giảng dạy đã giúp em rất nhiều Trong suốt thời gian em làm đề tài, những giá trị này được lặp lại một lần nữa, chính vì thế em đã cảm nhận rõ hơn về một hệ thống kiến thức nền tảng

Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và cán bộ viên chức trong Trung tâm Công nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh đã tiếp nhận, tạo điều kiện để em có nơi thực hiện đề tài Và đặc biệt em muốn gửi lời tri ân sâu sắc đến TS Hà Thị Loan, nơi cô

em hiểu thế nào là sự tận tâm hướng dẫn, như thế nào là nghiên cứu khoa học Ngoài ra em khám phá ra được những lý thuyết thông qua cách cô giúp em từng bước giải quyết khó khăn Em nhận ra cô đã đồng hành cùng em như thế nào khi phân công anh kĩ sư Trịnh Bá Uy thường trực phòng thí nghiệm để hỗ trợ em

Con xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, mặc dù ba mẹ và các em đã không trực tiếp giúp con trong việc làm đề tài, nhưng bằng cách này hay cách khác gia đình đã luôn động viên, lắng nghe con chia sẽ mỗi khi con gặp khó khăn, khích

lệ con cố gắng, giúp đỡ con cả về tài chính và tinh thần, con xin mãi ghi khắc

Luận văn là thành quả khoa học đầu tiên của em, nên chắc chắc có những thiếu sót về nội dung Rất mong được quý thầy cô và những nhà khoa học nhận xét, đóng góp ý kiến để em được học hỏi, rèn luyện và trưởng thành hơn

Xin chân thành cảm ơn Quý thầy cô và toàn thể ân nhân Trân trọng

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC BIỂU ĐỒ v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật 4

1.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 4

1.1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 4

1.1.3 Hiện trạng nuôi cấy mô ở Việt Nam 5

1.1.4 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 5

1.1.4.1 Tính toàn năng của tế bào 5

1.1.4.2 Tính phân hóa và phản phân hóa của tế bào 6

1.1.5 Các giai đoạn nuôi cấy mô 7

1.1.5.1 Chuẩn bị cây mẹ, lựa chọn mẫu cấy: 7

1.1.5.2 Khử trùng mẫu cấy 7

1.1.5.3 Tạo thể nhân giống in vitro và tăng sinh mô 7

1.1.5.4 Ra rễ in vitro và tái sinh cây hoàn chỉnh 7

1.1.5.5 Chuyển cây con ra vườn ươm 8

1.1.5.6 Ra rễ ex vitro 8

1.1.6 Các kỹ thuật nhân giống in vitro 8

1.1.6.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và chồi bất định 8

1.1.6.2 Nuôi cấy tế bào đơn 9

1.1.6.3 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội 9

1.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô 10

1.1.8 Thành phần môi trường dinh dưỡng 11

1.1.9 Tổng quan về ánh sáng 13

1.2 Tổng quan về cây cúc 17

1.2.1 Phân loại khoa học 17

1.2.2 Nguồn gốc, lịch sử và phân bố 17

1.2.3 Đặc điểm thực vật học 19

1.2.4 Tình hình nhân giống cúc trên thế giới và Việt Nam 21

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.2 Vật liệu 23

2.2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 23

2.2.2 Trang thiết bị 23

2.2.3 Môi trường nuôi cấy 24

2.2.4 Điều kiện thí nghiệm 24

2.3 Phương pháp 25

2.3.1 Pha môi trường 25

2.3.2 Hấp khử trùng 25

2.4 Bố trí thí nghiệm 25

2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cúc Pico 26

2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico 27 2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến khả năng nhân chồi mẫu cúc 28

2.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng các loại đèn chiếu sáng đến sự nhân nhanh chồi mẫu cúc 29

2.4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NAA đến sự ra rễ của mẫu cúc 30 2.5 Thống kê và xử lý số liệu 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cây cúc Pico 32

3.2 Ảnh hưởng của BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico 34

3.3 Ảnh hưởng của nước dừa đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico 37

3.4 Ảnh hưởng của các loại đèn chiếu sáng lên sự nhân nhanh chồi cúc Pico 40 3.5 Ảnh hưởng của NAA đến sự ra rễ mẫu cúc Pico 43

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

4.1 Kết luận 47

4.2 Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

BA Benzyl adenyl

TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh

Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng

mẫu thân cúc Pico 27

Bảng 2.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến khả năng nhân chồi mẫu cúc 28

Bảng 2.3 Khảo sát nồng độ nước dừa thích hợp đến sự tái sinh chồi mẫu cúc 29

Bảng 2.4 Khảo sát loại đèn LED thích hợp đến sự tái sinh chồi mẫu cúc 30

Bảng 2.5 Khảo sát ảnh hưởng NAA đến sự ra rễ mẫu cúc 31

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cây cúc 32

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico 35

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nước dừa đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico 38

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của các loại đèn chiếu sáng lên sự nhân nhanh chồi cúc Pico 41

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của NAA đến sự ra rễ mẫu cúc Pico. 44

Biểu đồ 3.1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cây cúc Pico 33 Biểu đồ 3.2: Ảnh hưởng của BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico 35 Biểu đồ 3.3: Ảnh hưởng của nước dừa đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico 38 Biểu đồ 3.4: Ảnh hưởng của các loại đèn chiếu sáng lên sự nhân nhanh chồi cúc Pico 41 Biểu đồ 3.5: Ảnh hưởng của NAA đến sự ra rễ mẫu cúc Pico 45

LỜI MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đời sống con người ngày nay được cải thiện kéo theo không gian sống ngày càng chất lượng, người ta hướng tới cuộc sống đầy đủ tiện nghi và phong cách Đặc biệt là những thành phố lớn, nơi đời sống của người dân cao nhưng lại thiếu đi vẻ đẹp hoang sơ của thiên nhiên Chính vì thế, hoa được sử dụng như món quà tinh thần bù đắp lại thiếu sót đó Việc trưng bày hoa nơi công sở để bàn làm việc thêm sắc màu hay dùng hoa để thay lời nói trong những ngày lễ tết đã thu hút đam mê của nhiều người Trong đó, hoa cúc đã chiếm một vị trí khá lớn, theo (Đặng, 2006) cho biết, với màu sắc phong phú, kích cỡ và hình dáng đa dạng, dễ điều khiển cho

ra hoa tạo nguồn giống quanh năm khiến cho hoa cúc trở thành loài hoa được tiêu thụ đứng thứ hai trên thế giới chỉ sau hoa hồng

Ngày nay cúc được sử dụng rộng rãi trong cuộc sống, ngoài trang trí, cúc còn được dùng để làm cảnh, thờ cúng, dược liệu, trà,…Ở nhiều nơi, người ta còn tin rằng cúc là biểu tượng của sự sống, là niềm tin, là sự bắt đầu Cúc được đưa vào đời sống người dân như một món quà tinh thần không thể thiếu trong những ngày đặc biệt

Nhắc đến cúc ta không thể kể đến cúc lá nhỏ hay còn gọi là cúc Pico, tên khoa học Chrysanthemum sp., thuộc họ Asteraceae, nguồn gốc Châu Á, Châu Âu Cúc Pico là cây thân thảo, có quả bế, mọc trong bóng râm, chiều cao trung bình 20-50cm Hiện nay, cúc Pico được Dalat hasfarm nhập hạt giống về trồng, và Dalat hasfarm độc quyền với loại hoa này, ngoài ra còn có một số cơ sở nhỏ lẻ trồng bằng một vài biện pháp thủ công như giâm cành Việc làm này cho mức độ nhân giống không cao, cây con dễ nhiễm bệnh từ cây mẹ, ngoài ra nếu không có kỹ thuật tốt sẽ làm ảnh hưởng đến cây mẹ, dễ gây thoái hóa giống Vì thế cần chọn một biện pháp

để nhân nhanh cây mà lại giúp bảo tồn giống, không làm ảnh hưởng đến cây mẹ là một thách thức lớn hiện nay Hơn thế nữa, mức độ tiêu thụ cúc hiện nay khá mạnh,

nếu cứ duy trì những biện pháp thủ công này sẽ không đủ hàng để tiêu thụ vào các dịp lễ, tết

Đứng trước thực trạng đó, tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình nhân giống

in vitro cây cúc lá nhỏ Pico (Chrysanthemum sp.)” vì cúc Pico hiện nay chưa được

ai nghiên cứu nhân giống in vitro, trong khi nhân giống in vitro cho hệ số nhân

giống cao giúp chủ động được nguồn giống, cây con hoàn toàn sạch bệnh, không gây ảnh hưởng đến cây mẹ, cây sinh trưởng phát triển đồng đều, giúp người trồng

hoa đạt được hiệu quả kinh tế cao

2 Mục tiêu của đề tài

- Xác định thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cây cúc Pico

- Xác định nồng độ BA đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico

- Xác định nồng độ nước dừa đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico

- Xác định được loại đèn chiếu sáng thích hợp đến sự nhân chồi mẫu cúc Pico

- Xác định nồng độ NAA đến sự ra rễ của mẫu cúc

3 Nội dung của đề tài

- Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô

trùng mẫu thân cúc Chrysanthemum sp

- Nội dung 2: Khảo sát nồng độ BA đến sự nhân chồi cúc Chrysanthemum sp

- Nội dung 3: Khảo sát nồng độ nước dừa đến sự nhân chồi cúc Chrysanthemum

sp

- Nội dung 4: Khảo sát các loại đèn chiếu sáng đến sự nhân nhanh chồi cúc

Chrysanthemum sp

- Nội dung 5: Khảo sát nồng độ NAA đến sự ra rễ của cúc Chrysanthemum sp

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu

- Ý nghĩa thực tiễn

Việc nhân giống in vitro cây cúc lá nhỏ (Pico) thành công sẽ giúp chủ động nguồn giống, làm đa dạng hơn nguồn hoa cảnh của TP.HCM, nâng cao giá trị kinh

tế cho người trồng

5 Phương pháp nghiên cứu

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 chai, mỗi chai 10 mẫu Các số liệu thu thập được

xử lý bằng phần mềm SAS 8.2 và chương trình Microsoft Excel 2010

6 Kết quả đạt được của đề tài

- Thí nghiệm 1: Xác định thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô trùng mẫu thân cây cúc Pico

- Thí nghiệm 2: Xác định nồng độ BA đến sự nhân chồi của mẫu cúc Pico

- Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ nước dừa đến sự nhân chồi của mẫu cúc Pico

- Thí nghiệm 4: Xác định được loại đèn thích hợp đến sự nhân chồi của mẫu cúc Pico

- Thí nghiệm 5: Xác định nồng độ NAA đến sự ra rễ của mẫu cúc Pico

7 Kết cấu của đồ án

Đồ án bao gồm các chương sau:

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Vật liệu và phương pháp

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Hiện nay, có nhiều khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật, dưới đây là một

số khái niệm cơ bản:

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là áp dụng tất cả những kỹ thuật để nuôi cấy tế bào, mô, cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng trên môi trường đã xác định thành phần (Trần, 1997)

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là nuôi cấy vô trùng cơ quan, mô, tế bào thực vật trên môi trường được xác định rõ thành phần và đặt dưới điều kiện kiểm soát (Nguyễn T B., 2004)

Nuôi cấy mô tế bào thực vật, vi nhân giống hay nhân giống in vitro là phạm

trù cho tất cả các loại nguyên liệu từ thực vật, được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng (Trịnh A L., 2016)

1.1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Hiện nay có nhiều tác giả khái quát về lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật, gồm có các giai đoạn chính sau đây:

- Những người tiên phong trong lĩnh vực nuôi cấy mô

Cha đẻ của lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào Haberlandt 1 lần đầu tiên nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng không nhận biết rằng các tế bào quang hợp, phân sinh mô không biểu hiện một cách dễ dàng và cần các chất sinh trưởng để hoạt hóa Vì vậy, ông chọn các loại tế bào như

tế bào mô giậu, tế bào lõi, lông của nhị hoa để nuôi cấy trên môi trường hữu cơ chứa glucose trong điều kiện vô trùng, và tất cả các thí nghiệm này không thành công nhưng tồn tại trong vài tuần Từ đó cho biết, tế bào phân sinh mô là dị dưỡng

và cần chất điều hòa sinh trưởng để làm mất sự chuyên hóa

- Những người đóng góp cho lĩnh vực nuôi cấy mô

1

Từ năm 1934-1941 là những năm nghiên cứu để biết được thực vật duy trì cần được nuôi cấy trong môi trường chứa các chất dinh dưỡng bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng Như Kotte và Robbins (1922) đã đặt mẫu cấy vào môi trường chứa muối Pnop, glucose, và một số hỗn hợp nitrogen như asparagine, alanine và chất trích từ thịt Năm 1934, Went và Thimann xác định IAA là chất điều hòa sinh trưởng Năm 1935, Snow chứng minh khi thêm IAA và vitamin B trong môi trường nuôi cấy kích thích sự hoạt động của tượng tầng Năm 1937, Bonner khám phá trong yeast extract là vitamin B1 Năm 1941, Van Overbech sử dụng nước dừa để cấy phôi Datura

Từ năm 1950-1957: là những năm đánh dấu sự thành công trong nuôi cấy mô như vào năm 1947, Lauren cấy cây một lá mầm thành công từ phôi nhũ Bắp Năm

1953, Muir và cs tạo ra phương pháp cấy tế bào treo trong môi trường lỏng Năm

1957, Muir phát triển kỹ thuật dùng giấy để cấy tế bào đơn

Năm 1962, Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật (môi trường MS)

Năm 1964-1998: hàng loạt các công trình thành công trong nuôi cấy mô như nuôi cấy tế bào trần , chứng minh được tính toàn năng của tế bào vô tính, chuyển gen, tạo cây lai từ tế bào chất bằng dung hợp tế bào trần

Và trong giai đoạn hiện nay, các nghiên cứu được ứng dụng vào đời sống để sản xuất các hợp chất thứ cấp, nghiên cứu di truyền thực vật bậc cao

1.1.3 Hiện trạng nuôi cấy mô ở Việt Nam

Vào khoảng những năm 1977, Phân Viện Khoa học TP.HCM bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật Hiện nay, Đà Lạt là nơi tập trung nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của tư nhân phục vụ công tác nhân giống hoa cảnh và rau củ (Nguyễn T B., 2004)

1.1.4 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo (Sáng, 2017), kỹ thuật nhân giống in vitro dựa trên cơ sở khoa học là

tính toàn năng, sự phân hóa và phản phân hóa

1.1.4.1 Tính toàn năng của tế bào

Vào năm 1902, Haberlandt đã đưa ra quan niệm là mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Còn ngày nay, theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi một tế bào chuyên hóa đều chứa một lượng thông tin di truyền của một cơ thể trưởng thành Từ

đó có thể thấy, từ xưa đến nay tính toàn năng của tế bào đều có điểm chung là một

tế bào bất kì có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh trong điều kiện nhất định

Đó cũng là cơ sở khoa học của kỹ thuật nhân giống vô tính Người ta có thể biến một tế bào (hay một mẫu mô) thành một cơ thể hoàn chỉnh khi nuôi cấy dưới môi trường thích hợp để tế bào thực hiện quá trình phân hóa và phản phân hóa

1.1.4.2.Tính phân hóa và phản phân hóa của tế bào

Tính phân hóa của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành tế bào của mô chuyên hóa đảm nhiệm các chức năng khác nhau

Tính phản phân hóa của tế bào là các tế bào khi đã được phân hóa thành các

mô riêng biệt với các chức năng khác nhau nhưng trong điều kiện nhất định chúng

có thể quay trở về trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào

Sự phân hóa và phản phân hóa giữa tế bào phôi sinh và tế bào chuyên hóa được biểu diễn theo sơ đồ sau

Về bản chất sự phân hóa và phản phân hóa là quá trình hoạt hóa gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể thì một số gen được hoạt hóa và một số gen khác bị ức chế Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử AND Khi nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh giữa các tế bào

có sự ức chế lẫn nhau, nhưng khi được tách rời các gen được hoạt hóa dễ dàng hơn dưới điều kiện nhất định nên chúng có khả năng mở các gen để hình thành cá thể mới Đây là nền tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hóa

Phân hóa tế bào

Phản phân hóa

1.1.5 Các giai đoạn nuôi cấy mô

Theo (Trịnh A L., 2016), có các giai đoạn sau:

1.1.5.1 Chuẩn bị cây mẹ, lựa chọn mẫu cấy:

Cây mẹ được lựa chọn phải sạch bệnh, sinh trưởng và phát triển tốt, không dị dạng Khi lấy mô cấy cần chú ý đến tuổi sinh lý của cơ quan lấy mẫu; chất lượng, vị trí, kích thước của cơ quan lấy mẫu

1.1.5.2 Khử trùng mẫu cấy

Mẫu cấy sau khi lựa chọn được rửa sạch bằng xà phòng, sau đó khử trùng bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypochloride, chlorua, thủy ngân,… Khử trùng bên ngoài tủ cấy Sau đó đưa mẫu cấy vô tủ cấy vô trùng và khử trùng bên trong tủ cấy

- Tạo thể nhân giống

Mẫu sau khi được khử trùng được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống

Có 2 thể nhân giống là thể chồi và thể cắt đốt

Đối với loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo

- Tăng sinh mô: gồm có các phương pháp sau đây

Tạo phôi sôma

Tăng cường sự phát triển chồi bên

Sự phát triển chồi bất định

- Nhân giống in vitro

Vật liệu nuôi cấy là thể chồi, môi trường nuôi cấy giống môi trường tạo thể chồi, nồng độ chất điều hòa sinh trưởng cần giảm thấp để quá trình nhân giống kéo dài

Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cây trẻ hóa, quá trình tăng sinh diễn ra nhanh

- Ra rễ in vitro và điều kiện ra rễ

Sau khi nhân giống đủ số lượng chồi, ta tách chồi ra nuôi cấy sang môi trường

ra rễ có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng, khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin,… và nuôi dưỡng ở điều kiện thích hợp để tái sinh cây hoàn chỉnh

- Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh

Đây là giai đoạn cây có đầy đủ thân, lá, rễ để chuyển ra vườn Cây cần khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường

Ở giai đoạn này, các chất có tác dụng tạo chồi loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích ra rễ Điều kiện nuôi cấy gần giống với bên ngoài môi trường

Cây có đủ bộ phận được chuyển qua phòng huấn luyện cây con, với điều kiện, nhiệt độ gần giống với môi trường tự nhiên để cây thích nghi Sau đó, cây trong bình nuôi cấy khi lấy ra được rửa sạch agar và đặt trong rổ có lót giấy báo, phun thuốc diệt nấm, đặt nơi thoáng mát, độ ẩm cao, độ chiếu sáng thấp,…

Đây là giai đoạn quan trọng, vì cây chuyển từ in vitro ra vườn ươm rất dễ chết

do sự khác biệt về điều kiện sống

1.1.5.6 Ra rễ ex vitro

Trong nhiều trường hợp các loài đã nhân chồi thành công trong điều kiện in vitro, dễ ra rễ trong điều kiện tự nhiên thì rút ngắn các giai đoạn của vi nhân giống

mà vẫn đảm bảo tỷ lệ cây con sống sót cao khi chuyển ra vườn ươm, có thể chuyển

các chồi in vitro ra điều kiện ex vitro, cấy chồi vào các cơ chất ẩm như: than bùn, vỏ

cây, khoáng chất, đất, cát,… để giúp chồi ra rễ

1.1.6 Các kỹ thuật nhân giống in vitro

Theo (Kiên, 2003) có các kỹ thuật sau:

1.1.6.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và chồi bất định

Một trong những phương thức sinh trưởng để đạt được mục tiêu trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh

và chồi bên) Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có

bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp…Từ đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thành cây hoàn chỉnh Cây con được chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thường

- Nuôi cấy chồi bất định

Hệ thống nuôi cấy này có những yêu cầu tương tự với nuôi cấy mô phân sinh đỉnh, nó chỉ khác về nguồn mẫu vật và nguồn gốc bất định của các chồi mới Đỉnh chồi bất định mới có thể phát triển hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô sẹo, mà mô sẹo này hình thành trên vết cắt của mẫu vật

- Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của tế bào đã phân hóa Mô sẹo sẽ phát triển nhah khi môi trường có sự hiện diện của auxin Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo

1.1.6.2 Nuôi cấy tế bào đơn

Khi mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẻ gọi là tế bào đơn

Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách ra và trải trên môi trường thạch Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành cụm tế bào mô sẹo Khi trên môi trường thạch có tỷ lệ auxin/cytokinin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh

1.1.6.3 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn đã phát triển và hoàn thiện nhờ công trình nghiên cứu của Bourgin và Nitsch (1967) trên cây thuốc lá, Niizeki và Oono (1968) trên lúa Từ cuối những năm 1970 đã nhận được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn trên

30 loại cây Hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong

điều kiện nuôi cấy in vitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông

qua tạo mô sẹo và tạo cơ quan Phương pháp tạo cây đơn bội kép và phương pháp chọn lọc tạo giống có hiệu quả chọn lọc rất cao

1.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô

Theo (Nguyễn A P., 2011), có các yếu tố sau:

- Kiểu di truyền:

Cây hai lá mầm tái sinh tốt hơn cây một lá mầm, hạt trần rất khó tái sinh

Trong một số cây hai lá mầm thì Solanaceae, Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriacea và Cruciferae là những họ thực vật dễ tái sinh nhất Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong môi trường tự nhiên thì chúng hầu như dễ tái sinh trong in vitro Cũng có trường hợp ngoại lệ như những đoạn cắt từ lá của cây Kalanchoe farinacea hầu như không có khả năng hình thành chồi bất định in vivo nhưng có thể thực hiện trong điều kiện in vitro, điều này có thể do sự hấp thu các chất điều hòa

sinh trưởng có trong môi trường nuôi cấy

- Tuổi của cây:

Khi cây già đi, khả năng tái sinh cũng giảm theo, các mô ở cây non có khả năng tái sinh mạnh hơn Khi mô phân sinh và chồi đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ đặc tính già hay non Đôi khi qua nhiều lần cấy chuyền, mô phân sinh già được trẻ hóa do tăng khả năng tái sinh và phân chia tế bào

- Tuổi của mô và cơ quan:

Những mẫu non và mềm dễ nuôi cấy hơn mô cứng, nhưng cũng có trường hợp ngoại lệ Mẫu cấy từ cuống lá non tái sinh tốt hơn mẫu cấy từ cuống lá già Khả năng tái sinh của những loài khác nhau thì khác nhau

- Tình trạng sinh lý:

Các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh hơn trong giai

đoạn sinh sản Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đông khó nuôi cấy in vitro hơn

các chồi đã vượt qua giai đoạn này

- Vị trí của mẫu cấy trên cây:

Những chồi tách từ vị trí thấp trên cây dễ tái sinh trên môi trường in vitro hơn,

chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn chồi nách Mô sẹo phát sinh từ những phần khác

của cây đều có phản ứng in vitro giống nhau

- Kích thước mẫu cấy:

Tế bào, cụm tế bào, mô phân sinh khó cảm ứng để tăng trưởng hơn thân, lá,

củ Các phần tách khỏi cây tự cung cấp chất dinh dưỡng và hormone, do đó mẫu càng lớn càng dễ tái sinh và phát triển Củ, thân là những nơi dự trữ nhiều chất dinh

dưỡng dễ tái sinh trên môi trường in vitro hơn những mẫu có ít chất dinh dưỡng Ở

những mẫu bị cắt, phần trăm tổn thương cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh

- Các loại muối khoáng

- Nguồn cacbon hữu cơ

- Vitamin

- Chất điều tiết sinh trưởng

- Nhóm chất tự nhiên

- Chất làm đông môi trường

a Các loại muối khoáng

Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô, tế bào thực vật được phân chia thành hai nhóm theo hàm lượng sử dụng: nhóm nguyên

tố đa lượng và nhóm nguyên tố vi lượng

Các nguyên tố khoáng đa lượng

Bao gồm các nguyên tố khoáng có trong thành phần dinh dưỡng của môi trường với nồng độ trên 30 ppm (part per million) Gồm những nguyên tố: N, P, K,

S, Mg, Ca

Các nguyên tố vi lượng:

Bao gồm các nguyên tố có trong thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy với nồng độ thấp hơn 30ppm Đó là các nguyên tố: Fe, B, Mn, Mo, Co, Ni

b Nguồn carbon hữu cơ:

Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức

dị dưỡng, cũng có thể sống bán dị dưỡng nhờ vào khả năng quang hợp trong điều kiện ánh sáng nhân tạo, nhưng rất yếu nên không đủ nguồn carbon hữu cơ cho sự sinh trưởng phát triển của cây Vì vậy, trong môi trường nuôi cấy cần được bổ sung nguồn carbon hữu cơ và thường dùng saccaroza với liều lượng 2-3% Trong một số trường hợp đặc biệt như nuôi cấy bao phấn lúa, nuôi cấy tế bào trần…có thể dùng glucoza, maltoza, galactoza…

c Vitamin

Mặc dù mô và tế bào nuôi cấy in vitro đều có khả năng tự tổng hợp được các

loại vitamin cần thiết, nhưng thường không đủ về lượng, do đó phải bổ sung thêm

từ bên ngoài vào, đặc biệt là vitamin thuộc nhóm B với nồng độ khoảng 1ppm

Người ta đã bổ sung vào môi trường một số nhóm chất tự nhiên nhằm làm gia tăng thành phần dinh dưỡng và cũng có cả các chất có hoạt tính sinh lý nên kích thích sự

sinh trưởng phát triển của cây in vitro Như:

- Nước dừa: theo kết quả phân tích thành phần nước dừa của Tulecke và ctv (1961) cho thấy trong nước dừa có nhiều nhóm chất cần thiết cho sự sinh trưởng của tế bào như: axit amin, axit béo, axit hữu cơ, đường, ARN, AND, myo inositol, các chất có hoạt tính auxin, các glucosit của xytokinin

- Dịch chiếc nấm men: White (1934) lần đầu tiên đã nuôi cấy thành công rễ cây cà chua trong môi trường có dịch chiết nấm men Thành phần của dịch chiết nấm men gồm có: đường, nucleic axit, amino axit, vitamin, auxin, khoáng Tác dụng của dịch chiết nấm men cho sự sinh trưởng của rễ rất tốt nhưng với mô sẹo thì không tốt

- Dịch chiết mầm lúa mì (mạch nha): chứa chủ yếu một số đường, vitamin và một số chất có hoạt tính điều tiết sinh trưởng

- Dịch chiết một số loại rau, quả tươi (khoai tây, chuối, cà rốt…) thành phần

có đường, axitnucleic, axit amin, vitamin, khoáng…

e Chất làm đông môi trường (Agar)

Agar-là một loại polysacarit của tảo (chủ yếu tảo hồng-Rodophyta) Agar khi ngâm nước ở 800C sẽ chuyển sang dạng sol và 400C thì trở về trạng thái gel Khả năng ngậm nước của agar cao (6-12g/l nước) Tuy ở trạng thái gel nhưng agar vẫn đảm bảo cho các ion vận chuyển dễ dàng Vì vậy, thuận lợi cho sự hút dinh dưỡng của cây trong nuôi cấy mô

f Chất điều tiết sinh trưởng

- Các chất thường dùng trong nuôi cấy mô: nhóm auxin (IAA, NAA, 2,4D, ), nhóm cytokinin (BA, GA3, IBA)

- Các chất ít sử dụng trong nuôi cấy mô: nhóm auxin (IBA), nhóm cytokinin (TDZ, kinetin), abscisic acid, ethylen, polyamin, jasmonic acid

1.1.9 Tổng quan về ánh sáng

Ánh sáng có tác dụng vô cùng quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây xanh Bất cứ một loài thực vật nào cũng phải dựa vào lá để hấp thu ánh sáng, tiến hành quang hợp, tạo ra dinh dưỡng cần thiết Ánh sáng đầy đủ, tác dụng quang hợp mạnh, cây cảnh sẽ sinh trưởng khỏe, mọc nhiều hoa, hoa to; ngược lại, thiếu ánh sáng cây cảnh sinh trưởng chậm Trước đây, người ta thường sử dụng đèn huỳnh quang trong nuôi cấy mô, mà đèn huỳnh quang thì chủ yếu lại được sử dụng cho sinh hoạt của con người Ánh sáng đèn huỳnh quang là sự phối trộn của nhiều vùng quang phổ từ những vùng ánh sáng có bước sóng ngắn 320 nm đến bước sóng dài 800 nm Có những vùng có bước sóng ngắn không có lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật

Hình 1.1 Phổ hấp thụ ánh sáng của thực vật (Nguồn: http://fakita.com/den-trong-cay.html)

a Ưu và nhược điểm của đèn LED

Theo GS.TS Phan Hồng Khôi, Giám đốc điều hành dự án chiếu sáng công cộng hiệu suất cao tại Việt Nam: Đèn led là một loại đi-ốt bán dẫn đặc biệt có thể phát ra ánh sáng phổ hẹp, rời rạc khi bị kích thích Màu sắc của ánh sáng đèn led có thể là hồng ngoại, cận cực tím hoặc ánh sáng nhìn thấy, phụ thuộc vào vật liệu bán dẫn sử dụng và điều kiện hoạt động

Thông thường người ta sử dụng hai chùm sáng màu đỏ (R) và màu xanh (B)

có đỉnh cực đại ở độ dài sóng 662nm và 430nm Lúc đó, quang phổ đèn led gần trùng với quang phổ hấp thụ của các diệp lục tố của cây trồng

Chiếu sáng cho cây trồng bằng đèn led còn có ưu điểm khác như: thân thiện môi trường, không chứa thủy ngân và các chất độc khác; dễ điều khiển bằng kỹ thuật số với khả năng thay đổi độ sáng 100%; chi phí bảo hành và thay thế hệ thống thấp; dễ dàng thay đổi nhiệt độ màu khi cần thiết Rào cản duy nhất của công nghệ chiếu sáng này là giá thành của led, nhưng với tốc độ phát triển mau chóng, rào cản này sẽ được dỡ bỏ

- Những nghiên cứu trong và ngoài nước về đèn

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Nhựt và đồng tác giả (2003) đã chứng minh được cây dâu tây in vitro phát

triển tốt nhất khi được nuôi cấy với nguồn chiếu sáng đèn LED (70% ánh sáng LED

đỏ + 30% ánh sáng LED xanh) với cường độ chiếu sáng là 60 µmol/m2.s Nhut (2005) đã chứng minh được cây con Lan Ý được nuôi cấy trong hộp CPRW (Culture Pack – Rockwool), sục khí CO2 (3.000 μmol.mol-1), có hệ thống nuôi cấy

sử dụng đèn LED và film thoáng khí thích hợp trong vi nhân giống cây Lan Ý và cho chất lượng cây tốt nhất Tanaka và đồng tác giả (1998) đã chứng minh được sự sinh trưởng của Cymbidium có thể được cải thiện sinh trưởng khi được nuôi cấy bằng phương pháp quang tự dưỡng không bổ sung đường dưới sự chiếu sáng của đèn LED ( ánh sáng LED đỏ và ánh sáng LED xanh kết hợp) Wang và cộng sự (2001) đã chứng minh trong nuôi cấy lông rễ của cây Artemisia annua L cho thấy sinh khối lông rễ và hàm lượng artemisia dưới ánh sáng đỏ cao hơn 17% đến 67%

so với dưới ánh sáng trắng Linan và đồng tác giả (2002) đã nghiên cứu về sự phát sinh hình thái và sự sinh trưởng của vảy củ Lilium với nguồn chiếu sáng đèn LED

đỏ, LED xanh và LED đỏ kết hợp với LED xanh Gần đây, trong nghiên cứu của Heo và đồng tác giả (2006) cũng cho thấy với nguồn chiếu sáng đèn LED cây nho tăng khả năng sinh trưởng và tổng hợp carbohydrate Trong năm 2012, Huiminli và

cs cũng đã nghiên cứu về những tác động của nguồn ánh sáng khác nhau đến tốc độ tăng trưởng và chất lượng của cây cải Bắp Trung Quốc (Brassica campestris L.) Tác động của các nguồn ánh sáng khác nhau (màu xanh, màu xanh kết hợp với màu

đỏ, màu đỏ), đèn huỳnh quang, ánh sáng mặt trời, sự tăng trưởng và hàm lượng vitamin C, protein hòa tan, sucrose, đường, tinh bột và nồng độ sắc tố trong không gian của cây Bắp cải Cho ra kết quả khối lượng khô của chồi và khối lượng khô của rễ cao nhất trong cây con trồng dưới ánh sáng đèn LED màu đỏ với ánh sáng yếu Khối lượng tươi của rễ có tinh bột cao nhất dưới đèn LED màu đỏ Hàm lượng chlorophyll và vitamin C cao nhất là dưới đèn LED màu xanh Đèn LED màu xanh cộng với màu đỏ hỗ trợ tăng trưởng sinh sản ở cây Bắp cải Trung Quốc, nguồn ánh sáng có thể được lựa chọn để đáp ứng các yêu cầu của giai đoạn phát triển khác nhau của thực vật

Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong năm 2014, Nguyễn Bá Nam và cs đã nghiên cứu trong đèn LED với sự phối trộn giữa hai LED xanh và LED đỏ với các tỉ lệ lần lượt: 100% LED đỏ; 90% LED đỏ kết hợp với 10% LED xanh; 80% LED đỏ kết hợp với 20% LED xanh; 70% LED đỏ kết hợp với 30% LED xanh; 60% LED đỏ kết hợp với 40% LED xanh; 50% LED đỏ kết hợp với 50% LED xanh được sử dụng để chiếu sáng bổ sung vào ban đêm nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của chúng lên sự sinh trưởng và phát triển của ba giống Cúc (Đóa vàng, Sapphire và Kim cương) được trồng trong nhà kính Đèn compact 3U được sử dụng làm nghiệm thức đối chứng Kết quả cho thấy, tỉ lệ 70% LED đỏ kết hợp với 30% LED xanh phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Cúc giống Sapphire và Kim cương Trong khi đó, tỉ lệ 60% LED

đỏ kết hợp với 40% LED xanh phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Cúc giống Đóa vàng Nguyễn Thanh Phương và cs (2014) nghiên cứu về tác động của phổ ánh sáng trên các loại bình nuôi cấy đến sự sinh trưởng, phát triển của giống cẩm chướng Hồng Hạc đã được tiến hành trong giai đoạn nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh Kết quả đèn LED 13R-4B-3W cho cây sinh trưởng chiều cao tốt,

tuy nhiên đèn LED 17R-3B lại có tác dụng kích thích cây tăng số lá, số chồi cao

hơn và cho chất lượng cây giống hoàn chỉnh

Năm 2014, Nguyễn Thanh Sang và cs cũng đã nghiên cứu về tác động của các

điều kiện chiếu sáng khác nhau đến sự nhân chồi; sinh trưởng, phát triển và tổng

hợp chlorophyll a và b của cây cúc in vitro Các đốt thân và các chồi đỉnh cúc được

nuôi cấy dưới các điều kiện chiếu sáng khác nhau bao gồm LED đỏ, LED xanh,

LED vàng, LED xanh lá cây, LED trắng và LED đỏ kết hợp với LED xanh theo

nhiều tỷ lệ khác nhau (10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 và

90:10) Kết quả thu được sau 4 tuần nuôi cấy cho thấy chiều dài lá, chiều rộng lá,

khối lượng tươi và khối lượng khô của chồi đạt tốt nhất ở 50% LED đỏ và 50%

LED xanh Sau 6 tuần nuôi cấy cho thấy khối lượng tươi, khối lượng khô, chiều dài

lá và chiều rộng lá của cây đạt tốt nhất ở 70% LED đỏ và 30% LED xanh Bên cạnh

đó, hàm lượng chlorophyll a và chlorophyll b của cây đạt cao nhất ở 70% LED đỏ

và 30% LED xanh Như vậy, kết quả từ nghiên cứu cho thấy khả năng nhân chồi tốt

nhất là các đốt thân được nuôi cấy ở 50% LED đỏ và 50% LED xanh và sự hình

thành cây tốt nhất là các chồi đỉnh nuôi cấy ở 70% LED đỏ và 30% LED xanh

Cây hoa cúc có tên khoa học là Chrysanthemum, được định nghĩa từ Chiysos

(vàng) và themum (hoa) bởi Linnde năm 1973 Hoa cúc có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản và một số nước châu Âu Theo Zenhua, Shouhe hoa cúc được trồng

ở Trung Quốc cách đây 3000 năm, có nguồn gốc từ một số loài hoang dại thuộc loại cúc (Dendranthema), trải qua quá trình trồng trọt, lai tạo và chọn lọc từ những biến

dị để trở thành những giống cúc như ngày nay Các nhà khảo cổ học Trung Quốc đã chứng minh rằng từ đời Khổng Tử người ta đã dùng hoa cúc trong các lễ mừng thắng lợi và cây hoa cúc đã đi vào các tác phẩm hội họa, điêu khắc từ đó Từ những năm 1930, việc trồng hoa cúc được coi trọng, được bảo hộ và đề cao, đến những năm 1980, hoa cúc được phát triển mạnh Năm 1982, Trung Quốc đã tổ chức triển lãm hoa cúc đầu tiên ở Thượng Hải với hơn một nghìn giống cúc, đánh dấu bước chuyển biến quan trọng trong việc trồng hoa cúc Các năm sau đó các nhà khoa học Trung Quốc đã thu thập mô tả chụp ảnh hàng nghìn màu giống và tiếp tục tổ chức các cuộc triển lãm hoa cúc

Ở Nhật Bản, cây hoa cúc được di thực từ Trung Quốc sang, nó được đánh giá rất cao và được mệnh danh là “Hoàng thất quốc hoa” Năm 1889 Edsmit đã bắt đầu lai tạo thành công nhiều loại cúc và ông đặt tên cho hơn 100 giống cúc của các thế

hệ sau đó, một số khác ngày nay vẫn còn duy trì và được trồng cho đến ngày nay Năm 1843, nhà thực vật học người Anh Fortune mang từ Trung Quốc giống cúc Chusan Daisy lai tạo ra các loại hình cầu và hình tán xạ ngày nay

Năm 1789 nước Pháp nhập từ Trung Quốc 3 loại cúc đại đóa, đến năm 1927 Bemct đã thành công trong việc lai tạo giống cúc mới dẫn đến một sự cải tiến rất mạnh mẽ về giống cúc ở Châu Âu

Ở Mỹ, từ đầu thế kỷ 18 hoa cúc đã được trồng nhiều, đến năm 1860 hoa cúc trở thành hàng hóa và được trồng trong nhà lưới Ở Việt Nam hoa cúc được nhập vào từ thế kỷ 15, người Việt Nam coi hoa cúc là biểu tượng của sự thanh cao, là một trong những loài hoa mộc được xếp vào hàng tứ quý “tùng, cúc, trúc, mai” hoặc

“mai, lan, cúc, trúc”

Hoa cúc được trồng nhiều nhất ở các nước Nhật Bản, Pháp, Mỹ, Trung Quốc

và được ưa chuộng bởi sự đa dạng, phong phú về màu sắc, kiểu dáng, kích cỡ hoa, hương thơm kín đáo của hoa

1.2.3 Đặc điểm thực vật học

- Rễ:

Rễ của cây hoa Cúc là loại rễ chùm, phần lớn phát triển theo chiều ngang, phân bố ở tầng mặt đất mặt từ 5-20cm Kích thước các rễ trong bộ rễ Cúc chênh lệch nhau không nhiều, số lượng rễ rất lớn do vậy khả năng hút nước và dinh dưỡng rất mạnh Cúc chủ yếu trồng bằng nhân giống vô tính nên rễ không phát sinh từ mầm rễ của hạt mà từ những rễ mọc ở mấu của thân (gọi là mắt) ở những phần ngay sát mặt đất

- Thân:

Cây thuộc thân thảo nhỏ, có nhiều đốt giòn dễ gãy càng lớn càng cứng, cây dạng đứng hoặc bò Kích thước thân cao hay thấp, to hay nhỏ, cứng hay mềm phụ thuộc vào từng giống và thời vụ trồng Những giống nhập nội thân thường to, mập, thẳng và giòn, ngược lại những giống Cúc dại hay giống cổ truyền Việt Nam thân nhỏ mảnh và cong Thân có ống tiết nhựa mủ trắng, mạch có bản ngăn đơn

- Lá:

Thường là lá đơn không có lá kèm, mọc so le nhau, bản lá xẻ thùy lông chim, phiến lá mềm, mỏng có thể to hoặc nhỏ, màu sắc xanh đậm hay nhạt phụ thuộc vào từng giống Mặt dưới phiến lá bao phủ một lớp lông tơ, mặt trên nhẵn, gân hình mạng Trong một chu kì sinh trưởng cây có từ 30-50 lá trên thân

- Hoa, quả:

Hoa cúc chủ yếu có 2 dạng:

Dạng lưỡng tính: trong hoa có cả nhị đực và nhụy cái

Dạng đơn tính: trong hoa chỉ có nhị đực hoặc nhụy cái, đôi khi có loại vô tính (không có cả nhụy, nhị, hoa này thường ở phía ngoài đầu) Mỗi hoa gồm rất nhiều hoa nhỏ gộp lại trên một cuống hoa hình thành hoa tự đầu trạng mà mỗi

đầu trạng là một bông hoa Trong thực tế tùy theo mục đích sử dụng mà người

ta để một bông trên một cành hay nhiều bông trên một cành

Màu sắc của hoa cúc rất khác nhau, hầu như có tất cả các màu tự nhiên: trắng, vàng, đỏ, tím, hồng, nâu, xanh Trong đó, trên mỗi bông hoa có thể có một màu duy nhất, có thể có vài màu riêng biệt hoặc có rất nhiều màu pha trộn, tạo nên một thế giới màu sắc vô cùng phong phú và đa dạng

Tùy theo cách sắp xếp của cánh hoa mà người ta phân ra thành nhóm hoa kép (có nhiều vòng hoa sắp xếp trên một bông) và nhóm hoa đơn (chỉ có một vòng hoa trên bông) Những cánh hoa nằm ở phía ngoài có màu sắc đậm hơn, xếp nhiều tầng, sít nhau, chặt hay lỏng tùy từng giống, cánh hoa có nhiều hình dáng khác nhau: cong hoặc thẳng, có loại cánh ngắn, có loại cánh dài, cuốn ra ngoài hay cuốn vào trong

Đường kính của bông hoa phụ thuộc vào giống, giống hoa to có đường kính 10-12cm, loại trung bình 5-7cm và loại nhỏ 1-2cm

Hoa có 4-5 nhị đực dính vào nhau làm thành 1 ống bao xung quanh vòi nhụy, bao phấn nở phía trong theo khe nứt dọc, khi phấn nhị đực chín, bao phấn nở tung hạt phấn ra ngoài nhưng lúc này nhụy chưa đến tuổi trưởng thành, chưa có khả năng tiếp nhận hạt phấn vì vậy sự thụ phấn, thụ tinh không thành, dẫn đến quả không hạt, muốn có hạt giống phải thụ phấn nhờ sâu bọ hoặc thụ phấn nhân tạo cho hoa

Quả bế, đóng, chứa một hạt, quả có chùm lông do đài tồn tại để phát tán hạt,

có phôi thẳng mà không có nội nhũ

Hình 1.3 Một số hình ảnh cúc Pico

1.2.4.Tình hình nhân giống cúc trên thế giới và Việt Nam

Tình hình trồng hoa cúc trên thế giới

Hiện nay, ngành sản xuất hoa cúc trên thế giới đang phát triển mạnh và mang tính thương mại cao Sản xuất hoa đã mang lại lợi ích kinh tế to lớn cho nền kinh tế các nước trồng hoa trên thế giới nhất là đối với các nước đang phát triển Hoa cúc được trồng nhiều nhất ở các nước Nhật Bản, Pháp, Mỹ, Trung Quốc và được ưa chuộng bởi sự đa dạng, phong phú về màu sắc, kiểu dáng, kích cỡ hoa, hương thơm kín đáo của hoa

Hà Lan là một trong những nước lớn nhất thế giới về xuất khẩu hoa, cây cảnh nói chung và xuất khẩu cúc nói riêng Diện tích trồng cúc của Hà Lan chiếm 30% tổng diện tích trồng hoa tươi Năng suất hoa tươi từ năm 1990–1995 tăng trung bình

từ 10-15%/ha Hàng năm Hà Lan đã sản xuất hàng trăm triệu cành hoa cắt và hoa chậu phục vụ cho thị trường tiêu thụ rộng lớn gồm trên 80 nước trên thếgiới Năm

1998, Hà Lan sản xuất 866 triệu cành và năm 1999, sản xuất 1046 triệu cành hoa cúc cắt

Một trong những nguyên nhân quan trọng góp phần tạo ra sự thành công của

Hà Lan là sử dụng phương pháp nhân giống invitro để sản xuất cây con Sau Hà Lan là Colombia–năm 1990 thu được 150 triệu USD từ việc xuất khẩu hoa cúc, đến năm 1992 đã lên đến 200 triệu USD

Nhật Bản có nhu cầu sử dụng hoa cúc rất lớn Diện tích trồng hoa cúc chiếm 2/3 tổng diện tích trồng hoa Năm 1991 diện tích trồng hoa cúc ở Nhật Bản và 614

ha ngoài trời và 1150 ha nhà kính Tuy vậy hàng năm Nhật Bản vẫn phải nhập một lượng lớn hoa cúc từ Hà Lan và một số nước khác trên thếgiới Năm 1996 Nhật Bản

đã chọn Việt Nam là một trong số những nước sẽ xuất khẩu hoa cúc cho Nhật Bản Một số nước khác như Thái Lan, cúc đã được trồng quanh năm với số lượng cành cắt hàng năm là 50.841.500 Trung Quốc cũng là nơi có nguồn hoa cúc phong phú, việc xuất khẩu hoa cúc được chú trọng ở màu sắc hoa và hình dạng hoa Đây cũng là nước có kỹ thuật tiên tiến trong việc sản xuất hoa cúc khô

Tình hình trồng hoa cúc ở Việt Nam

Hoa cúc được du nhập vào Việt Nam từ thế kỷ15, đến đầu thế kỷ19 đã hình

thành một sốvùng chuyên nhỏ cung cấp cho nhân dân Một phần để chơi, một phần

phục vụ việc cúng lễ và một phần dùng làm dược liệu Nếu xét về cơ cấu chủng loại

tất cả các loại hoa thì trước những năm 1997 diện tích hoa hồng nhiều nhất chiếm

31% nhưng từ 1998 trở lại đây diện tích hoa cúc đã vượt lên chiếm 42%, trong đó

hoa hồng chỉ còn 29,4% Riêng ở Hà Nội tổng sản lượng hoa cúc năm 1999 đạt 41,3

tỷ đồng, xuất khẩu sang Trung Quốc 3,6 tỷ đồng, tốc độ tăng hàng năm khoảng

10% Hiện nay hoa cúc được trồng khắp nước ta, nó có mặt ở mọi nơi từ núi cao

đến đồng bằng, từ nông thôn đến thành thị nhưng chủ yếu tập trung ở các vùng hoa

truyền thống của thành phố, khu công nghiệp, khu du lịch, nghỉ mát như Ngọc Hà,

Quảng An, Nhật Tân (Hà Nội), Đằng Hải, Đằng Lâm (Hải Phòng), Hoành Bồ, Hạ

Long (Quảng Ninh), Triệu Sơn, thành phố Thanh Hoá (Thanh Hoá), Gò Vấp, Hóc

Môn (thành phố Hồ Chí Minh), thành phố Đà Lạt (Lâm Đồng) với tổng diện tích

trồng hoa khoảng 2000 ha Riêng Hà Nội và Đà Lạt là những nơi lý tưởng cho việc

sinh trưởng và phát triển của hầu hết các giống cúc được nhập từ nước ngoài vào

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đồ án

2.1.1.Địa điểm

Đề tài được thực hiện tại phòng Thực nghiệm Cây trồng Trung tâm Công nghệ

Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Địa chỉ: 2734 Quốc lộ 1A, Trung Mỹ Tây,

Quận 12, TP.HCM

2.1.2.Thời gian

Đề tài được thực hiện từ tháng 1 năm 2018 đến tháng 7 năm 2018

2.2 Vật liệu

2.2.1.Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: cây cúc Pico được mua tại Dalat hasfarm

- Vật liệu nghiên cứu: thân cúc Pico

b Thiết bị-dụng cụ

- Dao cấy, kẹp cấy

- Ống nghiệm, chai thủy tinh 500ml

2.2.3.Môi trường nuôi cấy

Môi trường khoáng MS (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung thêm 30 g/l sucrose, 8,5 g/l agar, pH= 5,8 và chất điều hòa sinh trưởng gồm 2 nhóm auxin và

cytokinin, nước dừa tuỳ theo từng thí nghiệm

2.2.4.Điều kiện thí nghiệm

Để đảm bảo cây sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện phòng nuôi, cần

có các điều kiện nuôi cấy sau đây:

- Nhiệt độ: 25±20C

- Độ ẩm trung bình: 50-60%

- Cường độ chiếu sáng: 500-2500 lux (tùy theo từng thí nghiệm)

- Thời gian chiếu sáng: 12 giờ/ngày

Thời gian chiếu sáng và độ ẩm có thể khác nhau tùy thuộc vào mục đích và điều kiện thí nghiệm

có thể bảo quản ở ngăn mát tủ lạnh

b Cách pha môi trường cấy

- Bước 1: cân các chất như đường, agar, hút dung dịch mẹ, khoáng đa lượng, khóa vi lượng, FE-EDTA và vitamin hòa vào nước

- Bước 2: cân các chất điều hòa sinh trưởng phù hợp với từng thí nghiệm cho vào dung dịch trên Đo pH từ 5,7-5,8 (điều chỉnh bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N)

- Bước 3: cho agar vào và khuấy đều

- Bước 4: phối môi trường vào ống nghiệm hay vào các chai 500ml tùy theo thí nghiệm

- Bước 5: đóng nút, ghi rõ ngày tháng, tên môi trường để tránh nhầm lẫn với nhau

C

2.4 Bố trí thí nghiệm

2.4.1.Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến

sự vô trùng mẫu thân cúc Pico

- Mục tiêu của thí nghiệm: xác định được thời gian khử trùng thích hợp ở nồng

độ 5% Javel cho quá trình vô mẫu thân cúc

- Tạo vật liệu vô trùng: trong nội dung này sử dụng những cây cúc Pico không sâu bệnh, không dị dạng, sinh trưởng và phát triển tốt làm vật liệu tiến hành thí nghiệm

- Cách tiến hành:

Khử trùng sơ bộ: các thân thu được sẽ được rửa qua nước xà phòng pha loãng trong 5 phút, sau đó rửa lại với nước, lặp lại thao tác 3 lần Ngâm thân trong dung dịch Javel pha loãng 5% trong 5 phút để loại bỏ bớt nấm và

vi khuẩn Tiếp theo để những mẫu thân này dưới vòi nước chảy trong 30 phút Đổ hết nước, cho những mẫu thân này vào erlen vô trùng và đưa vào

tủ cấy

Khử trùng trong tủ cấy: mẫu đưa vào được rửa nhanh qua nước cất vô trùng

3 lần Sau đó ngâm trong cồn 700

trong 30 giây, rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần cho sạch cồn Tiếp theo cho Javel với các nồng độ bố trí như bảng dưới vào và lắc đều trong 5 phút Sau đó rửa lại 5-6 lần với nước cất, mỗi lần 5 phút cho thật sạch

Cấy mẫu: các mẫu sau khi được khử trùng sạch được đặt trên giấy cấy, cắt

bỏ những phần bị tổn thương và cấy vào ống nghiệm chứa môi trường MS

bổ sung 30g/l đường, 8,5g/l agar, pH=5,8 và nồng độ BA được bố trí trong bảng 2.1

- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 chai, mỗi chai 10 mẫu

Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng Javel 5% đến sự vô

trùng mẫu thân cúc Pico

Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến khả năng nhân chồi mẫu cúc

- Mục tiêu thí nghiệm: Xác định được nồng độ BA thích hợp đến khả năng nhân chồi mẫu cúc

- Cách tiến hành: các cây cúc sống, sinh trưởng và phát triển khỏe, không bị dị dạng được chọn làm vật liệu thí nghiệm Các cây cúc được cắt đốt 1-1,5cm được cấy vào môi trường MS bổ sung 30g/l đường, 8,5g/l agar, pH=8,5 và bổ sung BA với nồng độ như bảng 2.2

- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm

có 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 chai, mỗi chai 10 mẫu

Bảng 2.2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến khả năng nhân chồi mẫu cúc

- Chỉ tiêu theo dõi sau 6 tuần nuôi cấy:

Tỷ lệ tái sinh chồi (%)

Số chồi/mẫu

Chiều cao chồi

2.4.3.Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến khả năng nhân chồi mẫu cúc

- Mục tiêu của thí nghiệm: xác định được nồng độ nước dừa thích hợp đến khả năng nhân chồi mẫu cúc

- Cách tiến hành: các cây cúc sống, sinh trưởng và phát triển khỏe, không bị dị dạng được chọn làm vật liệu thí nghiệm Các cây cúc được cắt đốt 1-1,5cm được cấy vào môi trường MS bổ sung 30g/l đường, 8,5g/l agar, pH=8,5 và bổ sung nước dừa với nồng độ như bảng 2.3

- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm

có 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 chai, mỗi chai 10 mẫu

Bảng 2.3 Khảo sát nồng độ nước dừa thích hợp đến sự tái sinh chồi mẫu cúc

- Chỉ tiêu theo dõi sau 6 tuần nuôi cấy:

Tỷ lệ tái sinh chồi (%)

Số chồi/mẫu

Chiều cao chồi

2.4.4.Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng các loại đèn chiếu sáng đến sự nhân nhanh chồi mẫu cúc

- Mục tiêu thí nghiệm: xác định được loại đèn chiếu sáng thích hợp đến khả năng nhân chồi mẫu cúc

- Cách tiến hành: các cây cúc sống, sinh trưởng và phát triển khỏe, không bị dị dạng được chọn làm vật liệu thí nghiệm Các cây cúc được cắt đốt 1-1,5cm được cấy vào môi trường MS bổ sung 30g/l đường, 8,5g/l agar, pH=8,5, BA=1,5 sau khi cấy nuôi cấy dưới các loại đèn chiếu sáng với các màu bố trí dưới bảng 2.4

Bảng 2.4 Khảo sát loại đèn chiếu sáng thích hợp đến sự tái sinh chồi mẫu cúc

- Chỉ tiêu theo dõi sau 6 tuần nuôi cấy:

Tỷ lệ tái sinh chồi (%)

Số chồi/mẫu

Chiều cao chồi

2.4.5.Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NAA đến sự ra rễ của mẫu cúc

- Mục tiêu thí nghiệm: xác định được nồng độ NAA thích hợp đến sự ra rễ của

mẫu cúc

- Cách tiến hành: các cây cúc sống, sinh trưởng và phát triển khỏe, không bị dị

dạng được chọn làm vật liệu thí nghiệm Các cây cúc được cắt đốt 1-1,5cm được cấy vào môi trường MS bổ sung 30g/l đường, 8,5g/l agar, pH=8,5, nồng

độ NAA được bố trí như bảng 2.5

Bảng 2.5 Khảo sát ảnh hưởng NAA đến sự ra rễ mẫu cúc