Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy lên sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm ngọc linh trong nuôi cấy in vitro

Địa chỉ: 2374 Quốc lộ 1, phường Trung Mỹ Tây, quận 12 TP HCM Đề tài gồm 5 thí nghiệm lần lượt khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA, BA kết hợp nới NAA, Oligochito

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS Hà Thị Loan Sinh viên thực hiện : Phạm Thảo My MSSV: 1411100365 Lớp: 14DSH02

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP Hồ Chí Minh, Tháng 8 Năm 2018

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cha mẹ và gia đình tôi, đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể học tập tại Trường đại học Hutech thành phố Hồ Chí Minh Cảm ơn cha mẹ đã luôn động viên tôi để tôi có thể hoàn thành tốt khóa học của mình

Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh nói chung và phòng thực nghiệm cây trồng nói riêng đã cho phép

và hỗ trợ mọi mặt về cơ sở vật chất để tôi thực hiện được khóa luận tạ đây

Xin được gửi lời cơm ơn sâu sắc đến TS Hà Thị Loan và KS Đào Bá Uy những người đã hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt kiến thức, kỹ năng, tài liệu trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài Tôi cũng xin cảm ơn tất cả các anh chị trong phòng thực nghiệm cây trồng đã luôn sẵn sàng giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong công việc

và học tập

Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến trường Đại học Hutech thành phố Hồ Chí Minh, cảm ơn TS Nguyễn Thị Hoài Hương Viện Khoa học Ứng dụng Hutech đã tạo điều kiện cho tôi được gặp gỡ tiếp xúc với môi trường làm việc thực tế và được nghiên cứu đề tài tại Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh

Cuối cùng tôi xin kính chúc ban giám hiệu trường Đại học Hutech, ban lãnh đạo Trung tâm Công Nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh, TS Hà Thị Loan, KS Đào Bá Uy luôn dooif dào sức khỏe, gặt hái được nhiều thành công trong công việc, cuộc sống luôn tràn đầy niềm vui và hạnh phúc

Tp Hồ Chí Minh, ngày Tháng Năm 2018

Sinh viên thực hiện

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC HUTECH

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của TS Hà Thị Loan và KS Đào Bá Uy; Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây Những số liệu trong các bảng, Biểu đồ phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo

Ngoài ra, trong khóa luận còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác, đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung khóa luận của mình Trường Đại học Hutech không liên quan

đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tao gây ra trong quá trình thực hiện (nếu có)

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm2018

Tác giả

Phạm Thảo My

TÓM TẮT

Sinh viên thực hiện: Phạm Thảo My

Ngành: Công nghệ Sinh học Lớp: 14DSH02 MSSV:1411100365

Tên đề tài: “Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh

khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro”

Người hướng dẫn: TS Hà Thị Loan

Địa điểm: đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm thực nghiệm cây trồng Trung tâm Công nghệ Sinh học quận 12 thành phố Hồ Chí Minh

Địa chỉ: 2374 Quốc lộ 1, phường Trung Mỹ Tây, quận 12 TP HCM

Đề tài gồm 5 thí nghiệm lần lượt khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA, BA kết hợp nới NAA, Oligochitosan, của điều kiện nuôi cấy ánh sáng và nhiệt độ lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong

nuôi cấy in vitro

Sau 10 tuần nuôi cấy, ở thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của BA, BA và NAA, kết quả cho thấy mẫu được nuôi cấy ở môi trường MS có bổ sung 1mg/l BA

và 0,5m/l NAA (nghiệm thức đạt kết quả tốt nhất thí nghiệm 2) cho kết quả tốt hơn

so với phôi được nuôi cấy ở môi trường MS chỉ bổ sung 0,5mg/l BA (nghiệm thức đạt kết quả tốt nhất thí nghiệm 1) với Hệ số nhân sinh khối là 9,55 lần Bên cạnh đó đối với thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của Oligochitosan, kết quả cho thấy Oligochitosan không những không kích thích khả năng tăng sinh khối cho phôi sâm Ngọc Linh mà còn ức chế khả năng sinh trưởng phôi sâm Ngọc Linh Ở thí nghiệm ánh sáng, mẫu phôi sâm Ngọc Linh sinh trưởng mạnh nhất ở điều kiện nuôi cấy dưới ánh đèn LED phối hợp theo tỉ lệ 60 đỏ:40 xanh Và đồng thời qua kết quả thí nghiệm 4 chúng tôi nhận thấy mẫu phôi sâm Ngọc Linh thích hợp sinh trưởng trong

khoảng nền nhiệt từ 190C – 230C tuy nhiên trong đề tài này nhiệt độ tốt nhất là

230C

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH ii

TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC HUTECH ii

TÓM TẮT iii

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC BIỂU ĐỒ x

DANH MỤC HÌNH ẢNH xi

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa đề tài 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 3

2.1 Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật 3

2.1.1 Nuôi cấy mô tế bào thực vật là gì? 3

2.1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 4

2.1.3 Ứng dụng 5

2.2 Tổng quan về cây sâm Ngọc Linh 6

2.2.1 Lịch sử phát hiện 6

2.2.2 Nơi phân bố của sâm Ngọc Linh 7

2.2.3 Đặc điểm của sâm Ngọc Linh 7

2.2.4 Tình hình nghiên cứu sâm ngọc linh 9

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

3.1 Địa điểm và thời gian tiến hành 19

3.2 Vật liệu thí nghiệm 19

3.2.1 Vật liệu 19

3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ 20

3.2.3 Hóa chất 20

3.3 Phương pháp thí nghiệm 20

3.4 Bố trí thí nghiệm 21

3.4.1 Thí nghiệm 1: ảnh hưởng của BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro 21

3.4.2 Thí nghiệm 2: ảnh hưởng của NAA và BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro 22

3.4.3 Thí nghiệm 3: ảnh hưởng của ánh sáng lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro 23

3.4.4 Thí nghiệm 4: ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro 25

3.4.5 Thí nghiệm 5: ảnh hưởng của nồng độ chitosan lên sự nhân nhanh phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro 26

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Kết quả thí nghiệm 1: ảnh hưởng của BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro 28

4.2 Kết quả thí nghiệm 2: ảnh hưởng của NAA và BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro 31

4.3 Kết quả thí nghiệm 3: ảnh hưởng của ánh sáng lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro 35

4.4 Kết quả thí nghiệm 4: ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro 39

4.5 Kết quả thí nghiệm 5: ảnh hưởng của Oligochitosan lên khả năng nhân nhanh

sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro 43

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

5.1 Kết luận 46

5.2 Kiến nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC 50

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA lên khả năng

nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh 21 Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với

NAA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh 23 Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng lên khả năng nhân

nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh 24 Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng nhân

nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh 25 Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Oligochitosan lên

khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh 26 Bảng 4.1: so sánh ảnh hưởng của BA lên khả năng nhân phôi và chồi sâm Ngọc

Linh 28 Bảng 4.2: so sánh ảnh hưởng của BA lên khả năng nhân phôi và chồi sâm Ngọc

Linh 31 Bảng 4.3: so sánh ảnh hưởng của ánh sáng lên khả năng nhân phôi và chồi sâm

Ngọc Linh 35 Bảng 4.4: so sánh ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng nhân phôi và chồi sâm

Ngọc Linh 40 Bảng 4.5: so sánh ảnh hưởng của Oligochitosan lên khả năng nhân phôi và chồi

sâm Ngọc Linh 43

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1: Biểu đồ so sánh khối lượng phôi tươi và số chồi giữa các nồng độ

BA khác nhau 28 Biểu đồ 4.2: Biểu đồ so sánh khối lượng phôi tươi và số chồi giữa các nồng độ

BA và NAA khác nhau 32 Biểu đồ 4.3: Biểu đồ so sánh khối lượng phôi tươi và số chồi giữa các loại ánh

sáng khác nhau 36 Biểu đồ 4.4: Biểu đồ so sánh khối lượng phôi tươi giữa các mức nhiệt độ khác

nhau 40 Biểu đồ 4.5: Biểu đồ so sánh khối lượng phôi tươi và số chồi giữa các nồng độ

Oligochitosan khác nhau 43

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1: Hình ảnh cây sâm Ngọc Linh 6

Hình 2.2: Các bộ phận của cây sâm Ngọc Linh 8

Hình 2.3: Axit 2,4 dicloro - phenoxiaxetic(2,4D) 14

Hình 2.4: Naphthalene acetic acid (NAA) 14

Hình 2.5: Zeatin 14

Hình 2.6: Benzyladenine 14

Hình 2.7: GA3 15

Hình 3.1: Phôi sâm Ngọc Linh 2 tháng tuổi tại Trung Tâm Công Nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh 19

Hình 4.1: Ảnh hưởng của BA lên sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh ở giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần 29

Hình 4.2: Sự thay đổi số chồi giữa các nghiệm thức thí nghiệm 1 30

Hình 4.3: Hình ảnh số lượng chồi ở 4 nghiệm thức thí nghiệm 2 32

Hình 4.4: Ảnh hưởng của BA và NAA lên sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh ở giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi 33

Hình 4.5: Ảnh hưởng của ánh sáng lên sự nhân nhanh sinh khối phôi samm Ngọc Linh ở giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi 37

Hình 4.6: Sự khởi tạo lại phôi non xung quanh phôi già (thái hóa) trong thí nghiệm ánh sang 38

Hình 4.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự nhân nhanh phôi sâm Ngọc Linh ở giai

đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi 41 Hình 4.8: Màu sắc phôi sâm Ngọc Linh của các nghiệm thức thí nghiệm 42 Hình 4.9: Ảnh hưởng của Oligochitosan lên sự nhân nhanh phôi sâm Ngọc Linh ở

giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi 44

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Sâm Ngọc Linh là loại sâm thứ 20 được tìm thấy trên thế giới, chỉ mọc ở nơi

có độ cao từ 1200 mét trở lên, được phát hiện vào năm 1973 trên núi Ngọc Linh (tỉnh KonTum) Điều đáng bất ngờ ở đây sâm Ngọc Linh là một trong những loại sâm có chứa hàm lượng saponin (là một trong những thành phần hóa học của các loại thảo mộc, có tác dụng giảm cholesterol trong máu, chống ung thư, tăng cương sức khỏe của xương và kích thích hệ miễn dịch) nhiều nhất so với các loại sâm khác trên thế giới Những kết quả phân tích thân rễ và củ của sâm Ngọc Linh, các nhà khoa học đã xác định được có tới 52 loại Saponin

Ngoài ra, trong các công trình nghiên cứu khác người ta còn xác định được thành phần dược tính trong sâm Ngọc Linh có 17 acid amin, 20 chất khoáng vi lượng và hàm lượng tinh dầu là 0,1% Tất cả những điều đó khiến sâm Ngọc Linh trở thành một loại sâm quý, một loại “thần dược” mang tính Quốc Gia Tuy nhiên tình hình nhân rộng diện tích trồng sâm Ngọc Linh còn nhiều khó khăn và hạn chế,

do nguồn hạt giống khá hiếm hoi vì thời gian để một cây sâm Ngọc Linh ra quả là khá lâu khoảng từ 4 - 5 năm, cộng với việc giá của một cây con sâm Ngọc Linh lại quá cao, rơi tầm từ 150.000 - 200.000 đồng một cây Do đó việc nghiên cứu để

nhân giống sâm Ngọc Linh In vitro là một yêu cầu cần thiết

Hiện tại sâm Ngọc Linh vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu, nhân nhanh

giống In vitro, để phục vụ sản xuất cây giống và để sản xuất sinh khối thu hợp chất

thứ cấp saponin Do đó tôi quyết định làm đề tài “Ảnh hưởng của điều kiện nuôi

cấy lên sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro”

nhằm tìm ra điều kiện nuôi cấy thuận lợi nhất cho phôi sâm Ngọc Linh, tạo ra

nguồn mẫu In vitro lớn cho các nghiên cứu sau này và cung cấp nguồn cây giống

cho Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM và thị trường trong nước

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Tìm ra nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật bổ sung và các điều kiện môi trường thích hợp (nhiệt độ, ánh sáng) cho quá trình nhân nhanh sinh khối phôi

sâm Ngọc Linh nhằm tạo ra số lượng lớn mẫu sâm Ngọc Linh In vitro

1.3 Nội dung nghiên cứu

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi

sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của NAA và BA lên khả năng nhân nhanh sinh

khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của ánh sáng lên khả năng nhân nhanh sinh khối

phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng nhân nhanh sinh khối

phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro

Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của Oligochitosan lên khả năng nhân nhanh sinh

khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro

1.4 Ý nghĩa đề tài

Thông qua đề tài nghiên cứu, có thể tìm được điều kiện nuôi cấy thích hợp nhất cho sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh Tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu về sâm Ngọc Linh sau này Đồng thời góp phần nghiên cứu để sản xuất cây giống sâm Ngọc Linh ở quy mô công nghiệp, làm nguồn nguyên liệu để nhân sinh khối, đáp ứng nhu cầu trong nước và nước ngoài

Giúp cho sinh viên hiểu và có nhiều kiến thức hơn về sâm Ngọc Linh Tìm hiểu và nắm rõ kiến thức về phương pháp nghiên cứu khoa học, thu thập, xử lý và phân tích số liệu Biết cách trình bày một nghiên cứu khoa học

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 2.1 Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.1.1 Nuôi cấy mô tế bào thực vật là gì?

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những kỹ thuật được sử dụng để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng với những thành phần đã xác định (Trần Văn Minh, 1997)

Theo ông Dương Công Kiên (2003) các kỹ thuật khác nhau trong nuôi cấy

mô tế bào thực vật có thể cung cấp những lợi thế nhất định so với phương pháp

nhân giống truyền thống, bao gồm:

 Tạo ra chính xác số cây nhân bản giúp tạo ra các loại hoa, quả chất lượng cao hoặc có những tính trạng mong muốn khác

 Tạo ra các cây trưởng thành một cách nhanh chóng

 Tạo ra hàng loạt các cây mà không cần đến hạt hoặc quá trình thụ phấn để tạo hạt

 Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các tế bào thực vật đã được biến đổi gen

 Tạo ra các cây trong điều kiện vô trùng, để có thể vận chuyển mà hạn chế tối

đa khả năng phát tán bệnh, sâu bệnh hoặc các nhân tố gây bệnh

 Có thể tạo ra các cây từ hạt mà nếu không có nuôi cấy mô thì thường có tỷ lệ nảy mầm thấp hoặc sinh trưởng yếu, ví dụ: hoa lan hoặc cây nắp ấm

 Làm sạch các cây bị nhiễm virus nhất định hoặc các nhân tố lây nhiễm khác

và nhân nhanh các cây này như là nguồn nguyên liệu sạch phục vụ đồng ruộng và nông nghiệp

Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên thực tế là rất nhiều các tế bào thực vật

có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh (còn gọi là totipotency – khả năng biệt hóa của tế bào đơn lẻ thành những tế bào chuyên biệt với số lượng không giới hạn) Các tế bào đơn lẻ, các tế bào thực vật không có thành tế bào (protoplast), các mảnh

lá, rễ hoặc thân, thường có thể được sử dụng để tạo ra các tế bào mới trên môi trường nuôi cấy bổ sung các chất dinh dưỡng và hormone thực vật (Dương Công Kiên, 2003)

Nguồn ảnh: https://hoc247.net

2.1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Năm 1902, nhà thông thái Haberlandt lần đầu tiên đưa ra ý tưởng cấy mô sinh vật ra ngoài cơ thể nhưng ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không thành công

Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua

Năm 1951, Skoog và Miller đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rọng rãi cho đến ngày nay

Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn Ông đã thành công trong việc chuyển cây non của cây sen cạn từ môi trường nuôi cấy tối thiểu Tuy nhiên, việc nhân giống cây vẫn chưa hoàn chỉnh Sau đó nhiều

nhà nghiên cứu đã khám phá ra những thành phần dinh dưỡng qua trọng cần thiết cho sự phát triển của các tế bào được nuôi cấy

Năm 1960 - 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên được thương mai hóa Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng thương mại hóa (Dương Công Kiên, 2003)

2.1.3 Ứng dụng

Nuôi cấy mô tế bào thực vật được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu thực

vật, lâm nghiệp, và đồng ruộng (BioMedia VN, 2016) Các ứng dụng bao gồm:

 Thương mại hóa sản xuất các loài thực vật sử dụng như là cây cảnh, trang trí phong cảnh và các lĩnh vực liên quan đến hoa, là thứ mà sử dụng nuôi cấy

mô phân sinh và chồi để tạo ra số lượng lớn các cá thể giống hệt nhau

 Bảo tồn các giống cây hiếm hoặc đang bị đe dọa

 Các nhà nhân giống có thể ưu tiên sử dụng nuôi cây mô để sàng lọc các tế bào hơn là sàng lọc cây trồng để tìm các tính trạng tốt, ví dụ kháng/chống chịu thuốc diệt cỏ

 Sinh trưởng quy mô lớn các tế bào thực vật trong môi trường lỏng trong các bioreactors để tạo ra các hợp chất có giá trị, giống như sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật và protein tái tổ hợp, được sử dụng như

là dược phẩm sinh học

 Lai xa các loài thực vật bằng cách bởi dung hợp protoplast và tái sinh các phép lai mới

 Nghiên cứu nhanh cơ sở phân tử của các cơ chế sinh lý, sinh hóa và sinh sản

ở thực vật, ví dụ như chọn lọc in vitro các cây chống chịu với các điều kiện bất lợi và các nghiên cứu quá trình ra hoa in vitro

 Lai - thụ phấn các loài xa nhau và sau đó nuôi cấy tế bào hợp tử được tạo thành (thường dễ bị chết nếu diễn ra trong tự nhiên) (cứu phôi)

 Các thể đột biến nhân đôi nhiễm sắc thể và sự hình thành của các thể đa bội,

ví dụ nhân đôi đơn bội, tứ bội và các dạng khác của thể đa bội có được tạo ra bằng cách áp dụng các chất chống phân bào (antimitotic) như là colchicine hoặc oryzalin

 Các mô tế bào nuôi cấy sau khi biến nạp có thể sử dụng để thử nghiệm ngắn hạn các cấu trúc di truyền (genetic constructs) hoặc tái sinh tạo các cây chuyển gen

 Các kỹ thuật nhất định như là nuôi cấy đỉnh phân sinh có thể được sử dụng

để tạo nguồn nguyên liệu thực vật sạch từ nguồn bị lây nhiễm virus như là khoai tây và rất nhiều các loài có quả mềm

 Có thể tạo ra các loài lai vô trùng giống hệt nhau

2.2 Tổng quan về c y s m Ngọc Linh

2.2.1 Lịch sử phát hiện

Năm 1973, đoàn Điều tra dược liệu Ban Dân Y khu 5 do dược sỹ Đào Kim

Long và Nguyễn Châu Giang hướng dẫn đã phát hiện được một loài Panax mọc

thành quần thể ở độ cao 1800m tại vùng Ngọc Lây, Huyện Đắc Tô, Tỉnh KonTum

và đặt tên là “sâm đốt trúc“ với tên khoa học sơ bộ xác định là Panax articulates L , họ Nhân sâm (Araliaceae)

Hình 2.1 hình ảnh cây sâm Ngọc Linh

(Nguồn: nhansamlinhchi.net.vn)

Trải qua hơn 30 năm sâm K5 còn gọi là sâm Ngọc Linh hay sâm Việt Nam,

một loài sâm đặc hữu của nước ta đã được thế giớ biết đến với tên khoa học là Panax vietnamenis Ha et Grushv (Hà Thị Dụng và Grushvisky, 1985)

2.2.2 Nơi ph n bố của sâm Ngọc Linh

Cây sâm được phát hiện ở độ cao từ 1200 m trở lên,có tài liệu cho biết cao

độ tìm thấy sâm Ngọc Linh là khoảng 1500m (Cam Lu – Trương Hiệu, 2003), đạt mật độ cao nhất ở khoảng từ 1700 - 2000m dưới tán rừng già, và cho tới nay chỉ có hai tỉnh KonTum và Quảng Nam là có cây sâm này

Sâm mọc tập trung dưới chân núi Ngọc Linh, một ngọn núi cao 2578m với lớp đất vàng đỏ trên đá Granit dày trên 50 cm, có độ mùn cao, tơi xốp và rừng nguyên sinh còn rộng, nên được gọi là sâm Ngọc Linh

Những nghiên cứu thực địa mới nhất cho thấy sâm còn mọc cả ở núi Ngọc Lum Heo thuộc Xã Phước Lộc, Huyện Phước Sơn, Tỉnh Quảng Nam, đỉnh núi Ngọc Am thuộc Quảng Nam, Đắc Glây thuộc KonTum, núi Langbian ở Lạc Dương Tỉnh Lâm Đồng cũng rất có thể có loại sâm này (báo Thanh Niên, 2006)

2.2.3 Đặc điểm của sâm Ngọc Linh

a) Đặc điểm hình thái

Đây là một loại cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 cm đến 100 cm, thoạt nhìn rất giống nhân sâm Triều Tiên, nhưng nhìn kỹ sẽ thấy thân rễ có sẹo và các đốt như đốt trúc do thân khí sinh rụng hàng năm để lại

Sâm Ngọc Linh có dạng thân khí sinh thẳng đứng, màu lục hoặc hơi tím, nhỏ, có đường kính thân độ 4 - 8 mm, thường tàn lụi hàng năm tuy nhiên thỉnh thoảng cũng tồn tại một vài thân trong vài năm

 Thân rễ: có đường kính 1 - 2 cm, mọc bò ngang như củ hoàng tinh trên hoặc dưới mặt đất độ 1 - 3 cm, mang nhiều rễ nhánh và củ

 Các thân mang lá và lá: tương ứng với mỗi thân mang lá là một đốt dài khoảng 0,5 - 0,7 cm, tuy nhiên sâm chỉ có một lá duy nhất không rụng suốt từ năm thứ 1 đến năm thứ 3 và chỉ từ năm thứ 4 trở đi mới có thêm 2 đến 3 lá Trên đỉnh của thân mang lá là lá kép hình chân vịt mọc vòng với 3 - 5 nhánh lá Cuống lá kép dài 6 - 12mm, mang 5 lá chét, lá chét ở chính giữa lớn hơn cả với độ dài 12 - 15 cm, rộng 3 - 4 cm Lá chét phiến hình bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, lá có lông

ở cả hai mặt

 Hoa: hình tán đơn mọc dưới các lá thẳng với thân, cuống tán hoa dài 10 -

20 cm có thể kèm 1 - 4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính Mỗi tán

có 60 - 100 hoa, cuống hoa ngắn 1 - 1.5 cm, lá đài 5, cánh hoa 5, màu vàng nhạt, nhị 5, bầu một ô với 1 vòi nhụy(đối với cây 4 - 5 tuổi)

 Quả: mọc tập trung ở trung tâm của tán lá, dài độ 0,8 cm - 1 cm và rộng khoảng 0,5 cm - 0,6 cm, sau hai tháng bắt đầu chuyển từ màu xanh đến xanh thẫm, vàng lục, khi chín ngả màu đỏ cam với một chấm đen không đều ở đỉnh quả Mỗi quả chứa một hạt, một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả

Hình 2.2 Các bộ phận của cây sâm Ngọc Linh

(Nguồn agi.gov.vn)

b) Đặc điểm sinh lí:

Mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban ngày từ 20°C - 25°C, ban đêm 15°C - 18°C, sâm Ngọc Linh có thể sống rất lâu, thậm chí trên 100 năm (Võ Tuấn, 2014, báo Lao Động), sinh trưởng khá chậm Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá và rễ con Vào đầu tháng 1 hàng năm, sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành có 1 tán hoa Từ tháng 4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9 Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng, để lại một vết sẹo ở đầu củ sâm và cây bắt đầu giai đoạn ngủ đông hết tháng 12 Chính căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mỗi mùa đông đến mà người ta có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi tức trên củ có một sẹo (sau 3 năm đầu sâm chỉ rụng một lá) mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5 năm tuổi Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân

rễ của sâm (Cam Lu – Trương Hiệu, 2003)

d)Dược tính

Theo tiến sĩ Nguyễn Bá Hoạt cán bộ Viện Dược liệu thì về mặt hoá học, thân

rễ và rễ củ sâm Ngọc Linh hiện nay (2007) đã phân lập được 52 saponin trong đó 26 sanopin thường thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật Trong lá và cọng đã phân lập được 19 saponin pammaran, trong đó có 8 saponin có cấu trúc mới Đã xác định được trong sâm Ngọc Linh 17 axít amin, 20 chất khoáng vi lượng và hàm lượng tinh dầu là 0,1% ( Võ Tuấn, 2014, báo Lao Động)

2.2.4 Tình hình nghiên cứu sâm ngọc linh

Hiện tại cả nước cả nước có 4 địa điểm nghiên cứu và sản xuất sâm Ngọc Linh chính đó là KonTum, Quảng Nam, Đà Lạt và Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Tp Hồ Chí Minh

Tại Đà Lạt có Nhà sư Thích Huệ Đăng ở chùa Thanh Quang được Cục Sở hữu trí tuệ của Bộ KHCN trao bằng “độc quyền sáng chế” với công trình: “Quy

trình trồng cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy mô” Thầy đã chọn phương pháp nhân giống vô tính cho cây Ngọc Linh bằng việc áp dụng nuôi cấy lan bằng giá thể vỏ cà phê sang việc nuôi cấy sâm Ngọc Linh với nguồn nguyên liệu sẵn có giúp giảm giá thành trong chi phí sản xuất Sau một thời gian huy động trí lực của khá nhiều người cùng với việc bỏ ra hàng tỉ đồng để lập phòng thí nghiệm và nuôi cấy mô, Cty TNHH xuất khẩu hoa lan Thanh Quang đã thành công trong việc nhân giống hàng loạt và trồng thử nghiệm thành công (tỉ lệ cây sống đạt khá cao – khoảng 60%) cây sâm Ngọc Linh tại Đà Lạt.

Nhóm nghiên cứu của GS.TS Dương Tấn Nhựt thuộc viện nghiên cứu khoa học Tây Nghiên đã nghiên cứu tạo nguồn cây giống chất lượng phục vụ cho công tác phát triển sản xuất quy mô lớn, tiến tới làm chủ nguồn giống, giảm sự phụ thuộc nguồn cây giống từ hạt trong tự nhiên đang được trồng như hiện nay tại 2 tỉnh

Quảng Nam và KonTum Kết quả tạo ra cây In vitro hoàn chỉnh, đảm bảo tỉ lệ sống

sau trồng hơn 80% Ông là người đầu tiên bắt cây sâm Ngọc Linh ra hoa đồng thời cũng là người đi đầu trong việc áp dụng đèn LED đơn sắc trong việc nhân giống vô tính sâm Ngọc Linh (báo Lâm Đồng, 2017)

TS.Nguyễn Hữu Hổ, Viện Sinh học Nhiệt Đới đã nghiên cứu thành công đề

tài “Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất sinh khối tế bào và rễ Sâm Ngọc Linh

in vitro” Nhóm nghiên cứu của ông đã thực hiện thành công quy trình nuôi cấy

nhân giống các loại mô sâm mang tính mới cao đó là nuôi nhân mô phôi vô tính, rễ

bất định, nhân rễ bằng bioreactor sục khí , sánh kịp các nước trong khu vực và thế

giới về trình độ khoa học – công nghệ Hơn nữa, do thao tác nuôi cấy không phức tạp; sinh khối thu được có thể đáp ứng cho nhiều mục đích sử dụng khác nhau như thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và y dược; và điều kiện nuôi không chịu sự chi phối của môi trường bên ngoài (Nguyễn Hữu Hổ, 2014)

Nghiên cứu tạo và nuôi nhân mô sẹo có khả năng sinh phôi soma từ mô sẹo

lá trong môi trường lỏng; tạo mô phôi soma từ mô sẹo có khả năng sinh phôi, sự phát sinh hình thái chồi/rễ của mô phôi soma trong nuôi cấy và nuôi nhân phôi

soma sâm Ngọc Linh trong môi trường lỏng tạo kết quả tiền đề cho nghiên cứu nhân sinh khối quy mô lớn hai loại mô có khả năng sản sinh hàm lượng hợp chất thứ cấp cao do chúng đã mang ít nhiều trạng thái biệt hóa (Nguyễn Hữu Hổ, 2014)

Tại Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố Hồ Chí Minh nhóm nghiên

cứu Hà Thị Loan đã nghiên cứu thành công đề tài “nghiên cứu tạo rễ tóc sâm ngọc linh Panax vietnamensis bằng phương pháp chuyển gen rol nhờ vi khuẩn agrobacterium rhizogenes” Vì sâm Ngọc Linh có hàm lượng saponin trong thân rễ cao hơn so với những loài sâm cùng chi Panax Biến nạp gen nhằm thay đổi thông

tin di truyền giúp cải thiện tạo được những hoạt chất sinh học có giá trị, đặc biệt là

dùng vi khuẩn đất Agrobacterium rhizogenes chứa gen rol cảm ứng tạo rễ tóc (Tạp

chí sinh học, 2014)

GS.TS Dương Tấn Nhựt tạo mô sẹo sâm Ngọc Linh bằng cách lấy mảnh lá (0,5 x 0,5 cm) được nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo MS có 2 mg/l 2,4-D Mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường MS + 1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l NAA + 0,2 mg/l kinetin + 10% nước dừa để tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi và môi trường MS½ + 0,2 mg/l 2,4-D + 10% nước dừa để tạo mô phôi Mô sẹo có khả năng sinh phôi tăng nhanh sinh khối qua nuôi cấy trong môi trường lỏng MS + 0,5 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l NAA Mô phôi có khả năng tăng sinh nhanh trong môi trường lỏng MS½ + 0,2 mg/l NAA + 0,2 mg/l BA Tùy môi trường nuôi cấy ban đầu và ở các giai đoạn tiếp theo, mô phôi phát triển theo hướng tạo chồi hoặc rễ tạo quần thể chồi hoặc rễ (Dương Tấn Nhựt, 2012)

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo ông Dương Công Kiên (2003) Nuôi cấy mô thực vật (tập 1, 2, 3) NXB ĐHQG TP.HCM nuôi cấy mô tế bào thực vật bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, bao gồm:

a) Khoáng đa lượng:

- Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên

- Ảnh hưởng do sự có mặt của khoáng vi lượng không quan trọng bằng khoáng đa lượng Nếu thiếu khoáng đa lượng sẽ ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của cây

- Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là N, P, K, Ca, Mg

c) Carbon và nguồn năng lượng:

- Đường là một thành phần không thể thiếu trong bất cứ môi trường nuôi cấy nào, nó được sử dụng làm nguồn carbon cung cấp năng lượng chủ yếu trong môi trường nuôi cấy nhiều loài thực vật Ngoài ra, đường còn đóng vai trò

thẩm thấu chính của môi trường

- Hai dạng đường thường được sử dụng nhất trong nuôi cấy mô là glucose và sucrose với nồng độ sử dụng là 1 – 8%

- Các nguồn carbonhydrate khác cũng được tiến hành thử nghiệm như lactose, galactose, maltose và tinh bột nhưng các carbonhydrate này có hiệu quả kém hơn so với glucose và sucrose

d) Vitamin:

- Vitamin có vai trò xúc tác các quá trình trao đổi chất diễn ra trong tế bào Hầu hết các mô nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp các vitamin cần thiết nhưng không đầy đủ về số lượng, vì vậy để đạt được sự sinh trưởng tối ưu

người ta thường bổ sung thêm một số loại vitamin

- Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic, pyridoxine (B6) và myo-inositol

- Các vitamin thường được dùng ở nồng độ 0,1 – 1mg/L

e) Chất điều hoà sinh trưởng thực vật:

Là chất hữu cơ có mặt trong cây với hàm lượng rất nhỏ, được vận chuyển đến các bộ phận của cây để điều tiết và đảm bảo sự hài hoà các hoạt động sinh

trưởng

Phân loại: Gồm 2 nhóm:

 Nhóm chất kích thích sinh trưởng: auxin, cytokinin và gibberellin

 Nhóm các chất ức chế sinh trưởng: acid abscisic và ethylene

Các chất kích thích sinh trưởng thực vật (phytohormone)

 Auxin (IAA, NAA, IBA, 2,4,5-T, phenoxyacetic acid,…)

 Cytokinin (zeatin, 2i-P, BA, kinetin, TDZ,…)

Tỷ lệ auxin/cytokinin (A/C) xác định dạng phân hoá cơ quan của tế bào thực vật nuôi cấy:

- Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao: kích thích ra rễ,

- Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp: kích thích sự tạo chồi,

- Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin gần bằng một: kích thích sự tạo mô sẹo

Auxin: là nhóm chất điều hoà sinh trưởng của thực vật thường gặp trong thiên nhiên, có ở mô phân sinh chồi, là mầm và rễ Auxin vận chuyển hướng cực: từ đỉnh chồi ngọn tới cơ quan khác

- Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô

- Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ, nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng của các sơ khởi này

Vai trò của Auxin:

- Thúc đẩy sự tăng trưởng và giãn nở của tế bào

- Tăng cường quá trình sinh tổng hợp và trao đổi các chất

- Kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính,…

- Kích thích sự hình thành rễ

- Gây ra tính hướng động

- Ưu thế ngọn

- Sinh trưởng quả và tạo quả không hạt,…

Cytokinin: có mặt ở tất cả các loại cây trồng, hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ Cytokinin vận chuyển không hướng cực, có thể hướng ngọn hoặc hướng gốc

- Kích thích tế bào phân chia (với điều kiện có auxin)

- Cytokinin tác động trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào

Hình 2.5 zeatin Hình 2.6 Benzyladenine

Hình 2.3 Axit 2,4 dicloro -

phenoxiaxetic(2,4D)

Hình 2.4 Naphthalene acetic acid (NAA)

Vai trò của nhóm Cytokinin:

- Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng chồi in vitro

- Ức chế sự tạo rễ và sự sinh trưởng của mô sẹo (auxin kích thích tạo rễ)

- Tăng sự phát sinh phôi vô tính

- Sự phân hoá các cơ quan (nhất là sự phân hoá chồi)

- Sự nảy mầm

- Quá trình trao đổi chất

- Ngăn chặn sự già hoá,…

Gibberellin (GA): gây ra sự tăng dài nhanh chóng bằng cách kích thích sự phân cắt tế bào và sự tăng dài của tế bào, kích thích hay ức chế sự ra hoa, kết trái của một số loài

Sự khác nhau trong vài trò của gibberellin và auxin:

- Gibberellin được vận chuyển qua mô gỗ và mô libe, trong khi auxin được di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác một chiều

- Gibberellin có ảnh hưởng trên toàn bộ của cây chứ không phải trên từng vùng như ở auxin

- Gibberellin được tạo ra trong những mô còn non của thân và trong hạt đang phát triển còn auxin ở các mô phân sinh chồi, lá mầm và rễ

Các chất ức chế sinh trưởng thực vật (phytohormone)

- Acid adscisic (ABA)

- Ethylene

Hình 2.7 GA3

Acid adscisic: ức chế tăng trưởng, kiểm soát sự rụng lá, cảm ứng trạng thái ngủ chồi và hạt vào mùa thu để đợi đến mùa xuân; giúp đóng các khí khẩu khi cây chịu khô hạn

Acid adscisic được tạo ra từ lá trưởng thành và được vận chuyển qua mô libe

Ethylene: gia tăng sự rung lá và trái, sự lão hoá; phá vỡ sự ngủ của chồi và hạt của một số loài; kích thích trổ hoa ở một số loài thực vật khác như khóm

Ethylene được tổng hợp trong các mô đang xảy ra sự lão hoá hay sắp chín như ở trái

f) Các chất hữu cơ không xác định:

Bổ sung nhiều chất trích hữu cơ khác nhau vào môi trường nuôi cấy thường mang lại kết quả thuận lợi cho sự tăng trưởng của mô

Các chất bổ sung này là: Protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mạch, nước cam, nước cà chua,…

g) Nguồn cung cấp nitrogen:

Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết nhưng sự

bổ sung các amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của

tế bào

Các nguồn nitrogen hữu cơ thường sự dụng là hỗ trợ amino acid như casein hydrolysate, L-glutamine, L-asparine và adenine

h) Yếu tố làm đặc (tạo gel) môi trường:

- Agar là chất thường sử dụng để tạo môi trường đặc hay môi trường bán rắn trong nuôi cấy mô thực vật

- Agar không phản ứng với các chất trong môi trường Độ cứng của agar quyết định bởi nồng độ agar sử dụng và pH của môi trường

- Ngoài agar trong nuôi cấy mô tế bào thực vật còn sử dụng một số tác nhân tạo gel khác như: alginate, phytagel, methacel và gel-rite,…

- Một số môi trường được sử dụng chủ yếu để nuôi cấy mô và tế bào thực vật như môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962), B5 (Gambog và cộng sự, 1969),

SH (Schenk và Hilderbrandt, 1972) có hàm lượng khoáng đa lượng cao và một số môi trường khác được phát triển bởi White , Gautheret, Nitsch, Loyd và Mc Cown

có hàm lượng khoáng đa lượng thấp hơn

2.4 Sơ lược về Oligochitosan

2.4.1 Oligochitosan

Chitosan là một polysacarit mạch thẳng được cấu tạo từ các D – glucosamine (đơn vị đã deaxetyl hóa) và N – acetyl – D Glucosamine (đơn vị chứa nhóm acetyl) liên kết tại vị trí β-(1-4) Nó được sản xuất từ quá trình xử lý vỏ các loại giáp xác (ví

dụ vỏ tôm, cua) với dung dịch kiềm NaOH

Oligochitosan là sản phẩm từ Chitosan được cắt mạch và có khối lượng trung bình khoảng 20kDa Trong đó phần olichitosan tan ở pH 7 có khối lượng phân tử thường nhỏ hơn 5kDa (Nguyan Thi Hieu & Đang Van Luyen,1999) trong đề tài này Oligochitosan có khối lượng phân tử là 3kDa

2.4.2 Ứng dụng của Oligochitosan

Oligochitosan thể hiện một số hoạt tính sinh học như tính chống oxi hóa, kích thích hệ miễn dịch chống nhiễm bệnh đối với vật nuôi, cây trồng (jeon, Park & Nishi, 1997)

Oligochitosan có khả năng tan trong nước, kìm hãm quá trình sinh sản của vi sinh vật gây bệnh và nấm độc nên được sử dụng để bảo quản đóng gói thức ăn, bảo quản thực phẩm, hoa quả, rau tươi (Hirano, 1996; Shahidi, Arachchi & Jeon, 1999)

Đặc biệt trong y dược dùng làm thuốc điều trị suy giảm miễn dịch, có khả

năng hạn chế sự phát triển của tế bào u, tế bào ung thư Ngoài ra Oligochitosan còn

được dùng làm vạt liệu y sinh như màng sinh học, chất nền cho da, mô cấy ghép

(Huang & cs, 2007; Luo, Cai, He, Xue, Wu & Cao, 2009; Suzuki, 1996; Yin ,Zhao

& Du, 2010)

2.4.3 Vai trò của Oligochitosan trong nuôi cấy mô

Với khả năng kháng khuẩn, diệt nấm, kích thích hệ miễn dịch Oligochitosan

là một chất điều hòa sinh trưởng tiềm năng và khá mới mẻ hiện vẫn đang được

nghiên cứu để đánh giá khả năng ảnh hưởng của nó lên sự sinh trưởng và phát triển

của thực vật trong nuôi cấy in vitro

Lê Hồng Giang và Nguyễn Bảo Toàn (2012) Trường đại học Cần Thơ đã

làm thí nghiệm khảo sát hiệu quả của Oligochitosan lên sự sinh trưởng của cụm

chồi và cây con lan Hồ Điệp (Phalaenopsos sp.) in vitro Kết quả cho thấy môi

trường ½ MS bổ sung 5 - 25 mg/l chitosan có hiệu quả lên sự sinh trưởng của cụm

chôi lan Hồ Điệp với số chồi, chiều cao chồi gia tăng tương đối và tỷ lệ tạo rễ đều

đạt nhiều giá trị cao Nồng độ 15mg/l và 25mg/l có hiệu quả lên sự gia tăng chiều

cao và sự hình thành rễ mới của cây con lan Hồ điệp in vitro, với chiều cao gia tăng

tương đối đạt 67,4% và 66,5%, tỷ lệ tạo rễ mới đạt 66,7% và 83,3%

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian tiến hành

Địa điểm: đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm thực nghiệm cây trồng

Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học quận 12 thành phố Hồ Chí Minh

Địa chỉ: 2374 Quốc Lộ 1, phường Trung Mỹ Tây, quận 12, TP HCM

Đề tài được tiến hành từ tháng 12 năm 2017 đến tháng 7 năm 2018

3.2 Vật liệu thí nghiệm

3.2.1 Vật liệu

Đối tượng nghiên cứu là phôi sâm Ngọc Linh (Panax vietnamenis) tại phòng

thí nghiệm thực nghiệm cây trồng Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố Hồ

Chí Minh

Ghi chú: (a) hình ảnh phôi sâm Ngọc Linh 2 tháng tuổi trong bình thí nghiệm; (b)

Lượng mẫu phôi sâm Ngọc Linh ban đầu (1 gram) dùng để cấy nghiệm thức thí

nghiệm

Hình 3.1 Phôi sâm Ngọc Linh 2 tháng tuổi tại Trung Tâm Công Nghệ

sinh học thành phố Hồ Chí Minh

Lựa phôi sâm sinh trưởng và phát triển tốt, không bị hiễm nấm, bệnh chọn làm nguồn mẫu ban đầu

3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ

 Ống đong (1000 mL, 100 mL)

 Pipet (1 mL, 2mL, 5mL)

 Dao cấy (số 11), cán dao

 Đèn cồn, đĩa cấy, bông thấm

 Cân điện tử 2 số lẻ (Denver Instrument TP 1502 - Đức)

 Máy đo pH (Schott Lab 860 - SI Analytic - Đức)

 Máy cất nước 2 lần (Bibby Scientific (Stuart) - A4000D - Anh)

 Tủ sấy (Member t UNE 550 - Đức)

 Tủ cấy vô trùng (ESCo LHC - A41 - Indonesia)

 Nồi hấp tiệt trùng (Autoclave) (CL - 40M - Nhật Bản)

Thu thập số liệu và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và SAS (Statistical Analysis Software), kiểm định Least-Significant Difference (LSD) ở mức ý nghĩa 5%

3.4 Bố trí thí nghiệm

3.4.1 Thí nghiệm 1: ảnh hưởng của BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối

phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro

Mục đích: khảo sát khả năng nhân phôi sâm Ngọc Linh trên môi trường MS

Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA lên khả năng

nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh

Mẫu được nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 190C ± 20C, trong điều kiện ánh sáng phòng, độ ẩm trung bình 55 - 60% Sau đó tiến hành quan sát, xử lí số liệu và nhận xét

 Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát sau 10 tuần

 Khối lượng mẫu thu được từ các nghiệm thức thí nghiệm

 Số lượng chồi

 Màu sắc của phôi

 Xem sự khác biệt của phôi theo từng tuần

 Ghi chú các biểu hiện bất thường của phôi

3.4.2 Thí nghiệm 2: ảnh hưởng của NAA và BA lên khả năng nhân nhanh sinh

khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro

Mục đích: khảo sát khả năng nhân nhanh sinh khối phôi của sâm Ngọc Linh trên môi trường MS có bổ sung thêm NAA và BA.Từ đó đưa ra được nồng độ thích hợp nhất cho sâm

Vật liệu: Phôi sâm Ngọc Linh khoảng 2 tháng tuổi

Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với

NAA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh

 Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát sau 10 tuần

 Khối lượng mẫu thu được từ các nghiệm thức thí nghiệm

 Số lượng chồi

 Màu sắc của phôi

 Xem sự khác biệt của phôi theo từng tuần

 Ghi chú các biểu hiện bất thường của phôi

3.4.3 Thí nghiệm 3: ảnh hưởng của ánh sáng lên khả năng nhân nhanh sinh

khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro

Mục đích: khảo sát khả năng nhân phôi của sâm Ngọc Linh đối với nhiều loại sánh sáng khác nhau

Vật liệu: Phôi sâm Ngọc Linh khoảng 2 tháng tuổi

 Môi trường:

Từ kết quả thí nghiệm 2 tiến hành chọn được môi trường tối ưu nhất để nuôi cấy phôi là:

Môi trường MS có bổ sung thêm 1 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 30g/l đường, 9g/l agar với pH được điều chỉnh về 5,7 - 5,8 trước khi hấp khử trùng môi trường

 Tiến hành thí nghiệm :

Thao tác được tiến hành trong tủ cấy vô trùng, phôi sâm Ngọc Linh được cắt thành những khối vuông nhỏ có trọng lượng khoảng 0,3g Mẫu phôi được cấy vào bình tam giác có chứa 60 mL và được nuôi cấy ở điều kiện ánh sáng theo bảng 3.3

Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng lên khả năng

nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh Nghiệm

thức Điều kiện ánh sáng Thời gian chiếu

Nuôi cấy và tiến hành quan sát nhận xét kết quả

 Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát sau 10 tuần

 Khối lượng mẫu thu được từ các nghiệm thức thí nghiệm

 Màu sắc của phôi

 Xem sự khác biệt của phôi theo từng tuần

 Ghi chú các biểu hiện bất thường của phôi

3.4.4 Thí nghiệm 4: ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự nhân nhanh sinh khối phôi

sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro

Mục đích: khảo sát khả năng nhân phôi của sâm Ngọc Linh đối từng điều kiện nhiệt độ khác nhau

Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng

nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh

 Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát sau 10 tuần

 Khối lượng mẫu thu được từ các nghiệm thức thí nghiệm

 Màu sắc của phôi

 Xem sự khác biệt của phôi theo từng tuần

 Ghi chú các biểu hiện bất thường của phôi

3.4.5 Thí nghiệm 5: ảnh hưởng của nồng độ chitosan lên sự nhân nhanh phôi

sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro

Mục đích: khảo sát khả năng nhân phôi của sâm Ngọc Linh đối từng điều kiện nhiệt độ khác nhau

Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chitosan lên khả

năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh