Ứng dụng vi khuẩn lên men lactic xử lý hạt giống đậu phộng

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển trên nông sản được bảo quản trong khotàng , bao bì..., nấm mốc làm giảm nghiêm trọng chất lượng của các loại nông sảnđược bảo quản.. Nấm mốc làm

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC XỬ LÝ

HẠT GIỐNG ĐẬU PHỘNG

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC XỬ LÝ

HẠT GIỐNG ĐẬU PHỘNG

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP Hồ Chí Minh, 8/2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêutrong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nàokhác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đượccám ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Sinh viên thực hiện luận văn

Nguyễn Thanh Hiếu

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Công nghệ

TP HCM đã tạo điều kiện cho chúng em được học tập tại Trường Em cũng xin chânthành biết ơn sự dạy dỗ tận tình của toàn thể quý thầy cô Viện Khoa học Ứng dụngHutech, Trường Đại học Công nghệ TP HCM đã cho chúng em những kiến thức quantrọng trong suốt thời gian qua, nhờ vậy chúng em mới có được những tri thức quý giá

để làm hành trang cho con đường sự nghiệp phía trước

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Hoài Hương đã trang bị cho

em những kiến thức bổ ích và luôn theo sát quá trình làm việc của em để kịp thờihướng dẫn cũng như khắc phục những lỗi sai để công việc đạt kết quả tốt nhất Côluôn chia sẽ cũng như động viên em khi công việc chưa ổn và giúp em tìm được niềmvui khi thấy được thành quả mình sắp gặt hái được

Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình đã tiếp cho em nghị lực, sựbình yên trong tâm hồn, luôn bên em những lúc khó khăn Em cũng xin được cảm ơntới những người bạn đã gắn bó, động viên và giúp đỡ em suốt quãng thời gian thựchiện đồ án tốt nghiệp

Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy/Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dành thờigian đọc và nhận xét đồ án tốt nghiệp này Em xin gửi đến Thầy/Cô lời chúc sức khỏe

va Trong quá trınh̀ làm đồ án, do kinh nghiệm còn thiếu và kiến thức chưa đầy đủ, nên

có nhiều thiếu sót, mong các Thầy Cô bỏ qua

TP HCM, ngày 3 tháng 08 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thanh Hiếu

MỤC LỤC

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Tình hình nghiên cứu 2

2.1 Ngoài nước: 2

2.2.Trong nước: 3

3.Mục đích nghiên cứu: 3

4.Mục tiêu nghiên cứu: 3

5 Nội dung nghiên cứu: 3

6 Phương pháp nghiên cứu: 4

6.1.Phương pháp luận: 4

6.2.Phương pháp xử lý số liệu: 4

7 Kết quả đạt được: 4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 5

1 Tổng quan về xử lý hạt giống: 5

1.1 Giới thiệu chung: 5

1.2 Các phương pháp khử nhiễm độc tố: 6

1.2.1 Phương pháp vật lý: 6

1.2.2 Phương pháp hóa học: 9

1.2.3 Phương pháp sinh học: 9

2 Các vi sinh vật hỗ trợ tăng trưởng cây trồng: 12

2.1 Khả năng phân giải lân: 12

2.1.1 VSV phân giải lân hữu cơ 13

2.1.2 VSV phân giải lân vô cơ 14

2.2 Tạo màng sinh học biofilm 15

2.3 Khả năng sinh Indole-3-acetic acid (IAA) 17

3 Tổng quan về vi khuẩn lactic. 19

3.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus sp. 19

3.2 Đặc điểm sinh lý 20

3.3 Đặc điểm sinh hóa 20

3.4 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 21

3.5 Quá trình trao đổi chất 23

3.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic 28

3.7 Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic 29

3.7.1 Khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn lactic 29

3.7.2 Các hợp chất kháng nấm 30

3.7.3 Các hợp chất kháng khuẩn khác 37

3.8 Ứng dụng của vi khuẩn lactic 40

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42

2.1 Địa điểm nghiên cứu 42

2.2 Thời gian thực hiện 42

2.3 Vật liệu nghiên cứu 42

2.3.1 Vật liệu 42

2.3.2 Hóa chất sử dụng 42

2.3.3 Thiết bị 43

2.3.4 Dụng cụ 43

2.4 Phương pháp luận 44

2.4.1 Mục tiêu đồ án 44

2.4.2 Nội dung 44

2.5 Phương pháp nghiên cứu 45

2.5.1 Sơ đồ nghiên cứu 45

2.5.2 Khảo sát độ thuần khiết của vi khuẩn lactic 46

2.5.2.1 Nhuộm gram 47

2.5.2.2 Nhuộm bào tử 48

2.5.2.3 Thử nghiệm Catalase 49

2.5.2.4 Thử nghiệm khả năng lên men đường 49

2.5.2.5 Khả năng di động 50

2.5.3 Khả năng phân giải lân 51

2.5.4 Khả năng sinh IAA 52

2.5.5 Khả năng tạo màng Biofilm 53

2.5.6 Chủng nấm mốc Aspergillus sp CĐP1. 54

2.5.6.1 Khảo sát sự phát triển trên các loại môi trường 55

2.5.6.2 Khảo sát hình thái 55

2.5.7 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với nấm mốc Aspergillus sp CĐP1 56

2.5.8 Phương pháp khảo sát môi trường lên men thích hợp cho vi khuẩn lactic 56

2.5.9 Xác định acid lactic 57

2.5.10 Xác định mật độ vi khuẩn 57

2.5.11 Phương pháp khảo sát khả năng bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc Aspergillus sp CĐP1 60

2.5.12 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp L5, L3, L2N đối với sự phát triển của hạt giống. 68

2.5.12.1 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp L5, L3, L2N đối với sự nảy mầm của hạt. 68

2.5.12.2 Ảnh hưởng của vi khuẩn Lactobacillussp L5, L3, L2N đến độ khỏe mầm ở

cây đạu phộng 69

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 70

3.1 Khảo sát sinh lý – sinh hoá của chủng vi khuẩn lactic: 70

3.1.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc: 70

3.1.2 Nhuộm Gram: 71

3.1.3 Nhuộm bào tử: 71

3.1.4 Thử nghiệm Catalase: 72

3.1.5 Thử nghiệm tính di động: 73

3.1.6 Thử nghiệm lên men các loại đường 74

3.2 Khảo sát sự phát triển của chủng nấm Aspergillus sp CĐP1 76

3.3 Khảo sát môi trường lên men thích hợp. 78

3.3.1 Khảo sát khả năng sinh acid lactic và mật độ tế bào của các chủng Lactobacillus spp L5, L2N, L3 79

3.3.2 Khảo sát khả năng tạo màng sinh học biofilm của các chủng Lactobacillus spp L5, L2N, L3 83

3.3.3 Đánh giá khả năng phân giải lân của các chủng Lactobacillus spp L5, L2N, L3 86

3.3.4 Đánh giá khả năng sinh IAA của các chủng Lactobacillus spp L5, L2N, L3. 91 3.3.5 Đánh giá khả năng kháng nấm invitro của các chủng vi khuẩn lactic 93

3.5.6 Khảo sát khả năng bảo quản hạt đậu phộng 96

3.3.7 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5, L2N, L3 tới sự phát triển của hạt giống. 100

3.3.7.1 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5, L2N, L3 tới khả năng phát triển của cây đậu phộng 7 ngày sau nảy mầm. 100

3.3.7.2 Khảo sát khả năng ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5, L2N,

L3 tới cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm 104

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 110

4.1 Kết luận 110

4.2 Kiến nghị 110

TÀI LIỆU THAM KHẢO 111

EPS Extracellular polymeric substance

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn 10

Bảng 1.2: Một số sản phẩm chuyển hóa của LAB và phương thức hoạt động 27

Bảng 1.3: Một số hợp chất tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men 30

Bảng 1.4: Cơ chế kháng nấm của một số hợp chất 34

Bảng 1.5: Một số bacteriocins được sử dụng rộng rãi (M P Zacharof, 2012) 38

Bảng 1.6: Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng vi khuẩn LAB 39

Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm bảo quản trong chai 67

Bảng 3.1 Khả năng lên men đường của các chủng L5, L3, L2N. 75

Bảng 3.3 Thống kê xếp hạng OD 550nm của các chủng vi khuẩn lactic. 84

Bảng 3.3 Khả năng phân giải lân của ba chủng vi khuẩn lactic ở ngày 3 90

Bảng 3.4: Hàm lượng IAA do 3 chủng vi khuẩn tổng hợp. 92

Bảng 3.5: Tỷ lệ ức chế của 3 chủng vi khuẩn trên các loại môi trường với chủng nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. 94

Bảng 3.6: Ngày xuất hiện tơ nấm trong thí nghiệm bảo quản hạt đậu phộng 98

Bảng 3.7: Thành phần các nghiệm thức ngâm đậu phộng. 100

Bảng 3.8: Tỷ lệ nảy mầm và độ khoẻ mầm trên các nghiệm thức của đậu phộng 101

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn đến chiều dài và sinh khối rễ, thân 7 ngày sau nảy mầm. 103

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đối với chiều dài của cây đậu phộng sau 14 ngày nảy mầm 104

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Một số loại auxin phổ biến 18

Hình 1.2: Con đường lên men Glucose 26

Hình 1.3: Cấu trúc phân tử của các hợp chất kháng nấm 33

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 45

Hình 2.2: Sơ đồ khảo sát độ thuần khiết của vi khuẩn lactic 46

Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát khả năng phát triển của chủng nấm CĐP1 53

Hình 2.4: Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với nấm mốc Aspergillus sp CĐP1 55

Hình 2.5: Sơ đồ xác định mật độ vi khuẩn 58

Hình 2.6: Sơ đồ khảo sát khả năng bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1 60

Hình 2.7: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp L5, L3, L2N đối với sự phát triển của hạt giống 68

Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc các chủng Lactobacillus spp trên môi trường MRS agar 70 Hình 3.2: Kết quả nhuộm gram của các vi khuẩn 71

Hình 3.3: Kết quả nhuộm bào tử của các vi khuẩn 72

Hình 3.4: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 73

Hình 3.5: Thử nghiệm tính di động của chủng Lactobacillus sp L5 và chủng vi khuẩn đối chứng Bacillus subtilis. 74

Hình 3.6: Khả năng lên men các loại đường của vi khuẩn 75

Hình 3.7: Khả năng phát triển của chủng nấm Aspergillus sp CĐP1 trên môi trường MRS Agar cải tiến 77

Hình 3.8: Hình thái nấm nấm Aspergillus sp CĐP1 78

Hình 3.9: Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào của chủng vi khuẩn lactic sp L5 79

Hình 3.10: Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào của chủng vi khuẩn lactic L2N 80

Hình 3.11: Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào của chủng vi khuẩn lactic L3 80

Hình 3.12: Hàm lượng acid tổng của chủng L5 trên các môi trường 81

Hình 3.13: Hàm lượng acid tổng của chủng L2N trên các môi trường 82

Hình 3.14: Hàm lượng acid tổng của chủng L3 trên các môi trường 82

Hình 3.15: Biểu đồ đánh giá khả năng tạo màng biofilm của ba chủng vi khuẩn lactic trên các môi trường. 84

Hình 3.16: Vi khẩn tạo màng biofilm trên thành ống nghiệm 86

Hình 3.17: Khả năng phân giải lân của chủng vi khuẩn lactic L5 87

Hình 3.18: Khả năng phân giải lân của chủng vi khuẩn lactic L2N 88

Hình 3.19: Khả năng phân giải lân của chủng vi khuẩn lactic L3 89

Hình 3.20: Biều đồ so sánh khả năng phân giải lân tổng cộng của ba chủng vi khuẩn lactic trên 3 môi trường theo ngày. 89

Hình 3.21: Biểu đồ thể hiện khả năng phân giải lân của ba chủng vi khuẩn lactic trên ba môi trường ở ngày 3. 90

Hình 3.22 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh IAA của 3 chủng vi khuẩn. 92

Hình 3.23: Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn trên môi trường khác nhau 94

Hình 3.24: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ kháng nấm của 3 chủng vi khuẩn trên 3 môi trường khác nhau 95

Hình 3.25: Hình ảnh bảo quản đậu phộng trong chai sau 25 ngày 97

Hình 3.26: Cây đậu phộng 7 ngày sau nảy mầm 101

Hình 3.27: Tỷ lệ nảy mầm và độ khoẻ của mầm trên các nghiệm thức của hạt đậu phộng 102

Hình 3.28: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn của 3 nghiệm thức TN1-TN1, TN3-NT8 và TN1-NT12 đến chiều dài và sinh khối rễ, thân 7 ngày sau nảy mầm 103

Hình 3.29: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng dịch nuôi cấy của 3 nghiệm thức NT1, NT12, TN3-NT8 cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm. 105

TN1-Hình 3.30: Cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm. 106

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Vệ sinh an toàn thực phẩm đang là vấn đề xã hội cần giải quyết kịp thời để bảo vệsức khoẻ con người Ở nước ta, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm trongkhông khí thường cao, là điều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc

tố cho thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, gây độc cho người và gia súc, gây tổn thươnggan (ung thư gan…) Tình trạng phơi nhiễm của nấm mốc ảnh hưởng đến 25 % mùamàng trên toàn thế giới, làm tổn thất trung bình 418 triệu đô và ảnh hưởng trên gia súc

472 triệu đô mỗi năm (theo Bô Nông Nghiệp Mỹ, 2009) Tại Việt Nam, mỗi năm bị ảnh hưởng khoảng 13-16 % lượng nông sản tuỳ loại

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển trên nông sản (được bảo quản trong khotàng , bao bì ), nấm mốc làm giảm nghiêm trọng chất lượng của các loại nông sảnđược bảo quản Nhiều loài nấm mốc phát triển trên nông sản (thóc, ngô, lạc, đậutương ) làm cho sản phẩm nông nghiệp biến đổi màu sắc, mùi vị, giảm chất lượng,đặc biệt là các chất dinh dưỡng như tinh bột, đường, protein, acid amin, lipid, vitamin

và các khoáng chất Nấm mốc làm thối rữa các sản phẩm nông nghiệp như hoa quả,rau, hạt ngũ cốc và tạo điều kiện cho nhiều loại vi khuẩn khác phát triển và gây hại làmảnh hưởng đến chất lượng hạt, sản lượng thu hoạch và gây thiệt hại cho người sử dụng.Bên cạnh sử dụng các biện pháp trong lúc trồng trọt như canh tác ruộng đất, bónphân, phun thuốc, thì một trong những xu hướng hiện nay là xử lý hạt giống Xử lýnguồn bệnh tồn tại trên hạt giống trước khi gieo trồng là một trong những điều quantrọng trong việc đảm bảo chất lượng hạt giống, vừa tăng khả năng chống chọi của hạtkhỏi những tác nhân gây bệnh, ngăn ngừa nguồn bệnh lan truyền từ hạt sang đồngruộng, vừa làm tăng sản lượng thu hoạch có lợi cho người nông dân, góp phần pháttriển nền nông nghiệp bền vững, không ảnh hưởng môi trường

Xử lý hạt giống bằng hóa chất ngày nay được sử dụng rộng rãi để phòng trừ sâubệnh hại cây trong nông nghiệp với những ưu điểm tác dụng nhanh, tương đối đơngiản, đem lại hiệu quả kinh tế cao,…nhưng các hợp chất hóa học dần có những yếuđiểm độc hại với môi trường gây ô nhiễm đất, nguồn nước và không khí, hình thànhcác loài kháng thuốc, ảnh hưởng đến quần thể sinh vật và đăc biệt ảnh hưởng đến sứckhỏe con người Do đó, các hợp chất sinh học được thay thế mang lại hiệu quả và thânthiện, an toàn với môi trường đặc biệt các hợp chất sinh học từ các loài vi sinh vât Mộttrong những chủng được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất chính là các chủng sinhacid lactic Vi khuẩn dạng này có hoạt tính sinh học khá cao, an toàn, có khả năng tiêudiệt vi sinh vật có hại và là nguồn vi sinh vật hữu ích, duy trì hệ cân bằng vi khuẩnđường ruột Nhận thấy đây là những lý do cần thiết cho đời sống của con người và đó

là lý do chúng tôi thực hiện đề tài “Ứng dụng vi khuẩn lên men lactic xử lý hạt giống

“Khả năng kháng nấm của 2 chủng Lactobacillus plantarum với mốc Fusarium in

vitro và trong nấu mạch nha lúa mạch” của A Laitila và công sự (2002)

Năm 2004, Cassandra De Muynck và công sự nghiên cứu “Khả năng kháng nấmcủa vi khuẩn sinh acid lactic trong sản xuất hợp chất kháng nấm trong thực phẩm”.Kim Jeong Dong với “Nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic phân

lập từ kimchi kháng Aspergillus fumigatus” năm 2005.

RMuñoz và cộng sự với nghiên cứu “Ngăn cản sự sản xuất độc tố của Aspergillus nomius vsc 23 của vi khuẩn sinh acid lactic và Saccharosemyces cerevisae” năm 2010.

“Độc tố aflatoxin bị ức chế bởi các vi khuẩn lactic như Lactobacillus casei có hoạtđộng mạnh chống sự phát triển của nấm và sự nảy mầm của bào tử nấm” Kim, 2005

xạ khuẩn Streptomyces ưa ấm sinh tổng hợp mạnh các enzym ngoại bào, có khả năng

sinh kháng sinh ức chế nấm mốc, vi khuẩn Gram âm

“Khả năng giảm hàm lượng Aflatoxin từ nấm mốc của vi khuẩn lactic và nấm

Trichoderma” của Lương Thị Phương Thảo (2015).

Chế phẩm vi sinh SB2 của công ty Công nghệ Cát Tường có công dụng phòngtrừ tác nhân gây bệnh cho cây trồng như nấm, vi khuẩn, virus, xạ khuẩn,…

Vi khuẩn lactic chưa được ứng dụng rộng rãi trong xử lý hạt giống trong các nghiêncứu trong nước ta hiện nay

3 Mục đích nghiên cứu:

Nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn lên men lactic tạo chế phẩm sinh học bảo quản và

xử lý hạt giống

4 Mục tiêu nghiên cứu:

Khảo sát khả năng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp L5, L3, L2N trong

bảo quản và phát triển của hạt đậu phộng

5 Nội dung nghiên cứu:

Hoạt hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5, L2N, L3 và chủng nấm Aspergillus

sp CĐP1

Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5, L2N,

L3

Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp L5, L2N, L3 với các chủng nấm Aspergillus sp.CĐP1

Khảo sát môi trường lên men thích hợp của chủng Lactobacillus sp L5, L2N, L3 Ứng dụng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp L5, L2N, L3 trong bảo quản

và xử lý hạt đậu phộng

Xây dựng quy trình sản xuất hạt giống đã xử lý

6 Phương pháp nghiên cứu:

6.1 Phương pháp luận:

Để ứng dụng vi khuẩn lactic xử lý hạt giống đậu phộng thay cho chất hóa học, vikhuẩn lactic có nguồn phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống được khảo sáttuyển chọn theo khả năng sinh acid, tạo sinh khối, tạo màng biofilm, đối kháng nấm,phân giải lân và sinh hoocmon tăng trưởng thực vật IAA Đồng thời ảnh hưởng của cácmôi trường lên men lên các tính chất này cũng được khảo sát Sau khi chọn được môitrường lên men thích hợp, thí nghiệm xử lý hạt đậu phộng và nảy mầm được tiến hành

để so sánh độ khỏe mầm của hạt đậu phộng xử lý và không xử lý

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1 Tổng quan về xử lý hạt giống:

Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại thuốc xử lý hạt giống với nhiều thươnghiệu khác nhau của các công ty thuốc BVTV Nông dân bắt đầu làm quen với lợi íchcủa việc xử lý hạt giống trong bảo vệ cây trước sự tấn công của sâu bệnh, côn trùng, vikhuẩn, nấm gây hại

Trước kia việc xử lý giống chỉ có mục đích duy nhất là giúp giữ giống không bịnấm bệnh hại tấn công Các hạt giống được áo các loại thuốc trừ nấm như captan,thiram hay là carbendazim để trừ nấm bệnh trên bề mặt hạt giống Sau đó hạt giốngnày được nhuộm phẩm màu đỏ để cảnh báo người tiêu dùng không được sử dụng làmthực phẩm Nhưng carbendazim cùng một số hoạt chất khác bị cấm sử dụng hiện nay

vì là hoạt chất hóa học có độc tính cao, với nhiều tác động tới môi trường, hệ sinh tháicũng như sức khỏe con người

Thuốc trừ nấm bảo vệ hạt giống đang nảy mầm và tránh khỏi bị sâu bệnh trong đấttấn công, giúp tăng tỷ lệ nảy mầm, mọc đều ngay cả trong điều kiện bất lợi như thiếuhoặc thừa nước Lợi ích của xử lý hạt giống:

- Giúp hạt giống nảy mầm nhanh, bắt rễ sớm

- Giúp hình thành nốt sần ở cây họ đậu

- Tiệt kiệm lượng thuốc và công lao động trên cùng đơn vị diện tích so với phân bón gốc và phân bón lá

- Dễ áp dụng hơn phân bón gốc và phân bón lá, chỉ trộn thuốc xử lý hạt vớigiống gieo sạ

Việc xử lý hạt giống còn mở ra nhiều triển vọng mới như :

Tăng cường tính kháng bệnh: Kích thích tính kháng bệnh ở cây trồng (kích kháng)

là phương pháp giúp cho giống cây bị nhiễm bệnh trở nên có khả năng kháng bệnh ởmức độ nào đó sau khi được xử lý chất kích kháng Kích kháng không tác động trực

tiếp lên mầm bệnh mà nó kích thích quá trình tự vệ của cây trồng Chất kích kháng cóthể có nguồn gốc hóa học hoặc vi sinh vật.

Tăng cường chịu điều kiện bất lợi: Các vi khuẩn sống vùng rễ lúa cố định đạm như

Azospirillum lipoferum, Azospirillum lipoferum; vi khuẩn Pseudomonas sp, Baccilus sp đều kích thích khả năng tổng hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như Auxin và

Gibberelin giúp bộ rễ cây trồng phát triển tốt hơn, gia tăng diện tích tiếp xúc của rễ vớiđất Các vi khuẩn này vừa tăng cường cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng, vừa tăngcường chống chịu điều kiện bất lợi

Các chất ly trích thực vật như Lychnis viscaria, xoan Melia azedarach đều có tácdụng kích hoạt tăng cường cây trồng chống chịu điều kiện bất lợi khi gieo sạ như ngậpúng, hạn hán…

Phòng trừ sâu bệnh: Đây là xu thế phổ biến hiện nay của phần lớn các sản phẩm xử

lý hạt giống trên thị trường Điển hình là thuốc xử lý hạt giống Cruiser có chứa chấtThiamethoxam là hoạt chất chuyên trên rầy nâu và bọ trỉ, chất Defenoconazole thuốctrừ nấm phổ rộng ức chế tổng hợp màng tế bào nấm, chất Fludioxonil là hoạt chất trừnấm trên hạt không lưu dẫn, chủ yếu trên bệnh lúa von

Ngoài ra còn có Gaucho chứa hoạt chất imidacloprid là thuốc trừ sâu ức chế thầnkinh trừ bọ trỉ, rầy nâu Sunato chứa hoạt chất Fipronil là thuốc trừ sâu thuộc nhómphenylpyrazole bảo vệ lúa 7-14 ngày sau khi sạ, cùng với Isotianil là thuốc trừ sâuthuộc nhóm Cloronicotinyl chuyên trừ rầy nâu, bọ trỉ

1.2 Các phương pháp khử nhiễm độc tố:

1.2.1 Phương pháp vật lý:

Phân hủy aflatoxin bằng không khí nóng: Dùng không khí nóng thổi qua nguyênliệu có chứa aflatoxin để làm giảm thiểu lượng aflatoxin đã được nhiều tác giả nghiêncứu, phương pháp này đã đem lại nhiều kết quả đáng kể Nếu nhiệt độ không khí nóngđưa vào là 100 °C – 145 °C ở ngô hạt thì lượng aflatoxin B1 có thể giảm từ 877 ppb

còn 452 ppb, từ 378 ppb còn 213 ppb Nếu tăng nhiệt độ lên tới 165°C có thể làm cholượng aflatoxin B1 giảm đến 65% (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).

Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: Phương pháp hấp ướt ở nhiệt độ caodưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn Quá trình này phá hủy nhanhchóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin Theo Rehana (1979) nhận thấynếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 120°C (thêmnước vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến 68% Ở đậu phộng

có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở 120°C trong 4 giờ giảmcòn 370 ppb Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760 ppb) được hấp ở 1,5 atm trong vòng mộtgiờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: Các chất hấp phụthường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt cao.Các chất có khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: Than hoạt tính, một số polymer hữu vô

cơ có bản chất aluminosilicat như bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calciumalumino-silicate), một số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một

số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinylpolypyrrolidone) Những chất này không được hấp phụ qua ruột mà được bài thải rangoài (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: Đây là phương pháp có thể áp dụng đối vớithức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, do ít có khả năng tạo sản phẩm khác cóhoạt tính từ aflatoxin và có thể thu hồi được dung môi mà không ảnh hưởng đến thànhphần dinh dưỡng của thức ăn Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằngviệc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan-methanol, hexan-ethanol, hexan-ethanol-nước và hexan-acetone-nước Hệ thống bao gồm 54% acetone, 44% hexan và2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhất được tìm thấy có thể đồngthời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư lượng lipid gầnbằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 μg/kg.g/kg

Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: Phương pháp hấp ướt ở nhiệt độ caodưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn Quá trình này phá hủy nhanhchóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin Theo Rehana (1979) nhận thấynếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 120 °C (thêmnước vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến 68% Ở đậu phộng

có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở 120 °C trong 4 giờ giảmcòn 370 ppb Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760 ppb) được hấp ở 1,5 atm trong vòng mộtgiờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: Các chất hấp phụthường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt cao.Các chất có khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: Than hoạt tính, một số polymer hữu vô

cơ có bản chất aluminosilicat như bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calciumalumino-silicate), một số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một

số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinylpolypyrrolidone) Những chất này không được hấp phụ qua ruột mà được bài thải rangoài (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: Đây là phương pháp có thể áp dụng đối vớithức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, do ít có khả năng tạo sản phẩm khác cóhoạt tính từ aflatoxin và có thể thu hồi được dung môi mà không ảnh hưởng đến thànhphần dinh dưỡng của thức ăn Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằngviệc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan-methanol, hexan-ethanol, hexan-ethanol-nước và hexan-acetone-nước Hệ thống bao gồm 54% acetone, 44% hexan và2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhất được tìm thấy có thể đồngthời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư lượng lipid gầnbằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 μg/kg.g/kg

Phân hủy aflatoxin bằng các tia bức xạ: Aflatoxin rất mẫn cảm với tia cực tím Ởbước sóng 365 nm, khả năng hấp phụ của aflatoxin đạt cực đại Okonkwo (1978) nhận

thấy, lượng aflatoxin ở bắp (150 ppb và 250 ppb) có thể giảm tới 30% và 16% trong 10giờ tiếp xúc với ánh nắng mặt trời (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).

1.2.2 Phương pháp hóa học:

Phương pháp sử dụng các chất oxi hóa-khử: Các chất oxy hóa-khử như NatriHypochlorite (NaOCl), Hydrogen Peroxide (H2O2) được sử dụng để làm mất độc tínhcủa aflatoxin Tuy nhiên sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin có thể làm mấtmàu sắc của hạt và biến chất các acid amin Khí ozone (O3) cũng được thử nghiệm vềkhả năng phân hủy aflatoxin trong mẫu và đạt được hiệu quả tốt, song có bằng chứng

là chất lượng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein, vitamin

Phương pháp sử dụng các chất kiềm: Ammonium Hydroxide (NH4OH) và NatriHydroxide (NaOH) là 2 chất kiềm được sử dụng làm vô hoạt aflatoxin Các chất nàyđều có hoạt tính mạnh, có thể phá vỡ vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin.Phương pháp sử dụng khí NH3: Nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả của việcdùng khí NH3 làm vô hoạt aflatoxin Xử lý ngô bằng khí NH3 được đặc biệt quan tâmứng dụng hơn cả Người ta nhận thấy, nếu hàm lượng NH3 là 0,5 - 1,5% và nhiệt độbên ngoài là 25 °C, trong 14 ngày tiếp xúc, lượng aflatoxin từ 200 ppb có thể giảmxuống còn 10 ppb (theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

1.2.3 Phương pháp sinh học:

Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo ápdụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên nông sản ở mức độ cao quá giới hạn là không thểtránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằngcon đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóachất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lượng lương thực nên khó áp dụng vàothực tiễn bảo quản được chứng minh là các phương pháp hứa hẹn nhất

Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được định nghĩa như

sự phân giải bằng enzyme hay chuyển hóa sinh học của các độc tố nấm mốc trực tiếp

nhờ vi sinh vật Một số vi khuẩn có khả năng khử nhiễm độc tố aflatoxin được trình

bày trong bảng 1.1.

Bảng 1.1: Các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn

Tên vi khuẩn Đối tượng Cơ chế khử nhiễm Tác giả

Sử dụng các sản phẩm traođổi chất ngoại bào, sinh ra

Aspergillus trong quá trình nuôi cấy B. C Munimbazi và

Bacillus pumilus pumilus, ức chế sự phát triển

Achromobacter Aspergillus 1 cyclodipeptide, ức chế sự PS Yan và cộng sự,

xylosoxidans parasiticus phát triển và sự tổng hợp 2004

aflatoxin của nấm Asp.

parasiticus.

Lactobacillus Aspergillus Sử dụng các sản phẩm trao I Chang và JD

casei flavus đổi chất ngoại bào, sinh ra Kim, 2007.

trong quá trình nuôi cấy L.

Bacillus subtilis protease, chitinase,

glucanase làm ức chế sự phát

triển của nấm Asp flavus.

Các loại nông sản Việt Nam được thế giới biết đến càng nhiều như lúa gạo, càphê, tiêu, điều, thanh long, vú sữa xuất khẩu đậu phộng của Việt Nam, bao gồmnguyên vỏ, bóc vỏ và hạt cao (số liệu này không bao gồm thương mại biên giới vớiTrung Quốc) Các thị trường xuất khẩu chính của Việt Nam là Đài Loan, Hồng Kông,Thái Lan, Nga, Malaysia và một số nước khác Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA) điềuchỉnh ước tính cho xuất khẩu đậu phộng của Việt Nam trong vụ 2016/17 lên 10 nghìntấn, bao gồm xuất khẩu đậu phộng thông qua thương mại biên giới và xuất khẩu đậu đãqua chế biến Để đạt được năng suất ấy, người nông dân sử dụng rất nhiều phân bónhóa chất khác và không ít các loại thuốc bảo vệ thực vật Hệ quả không chỉ nông dânphải mất nhiều tiền vào hóa chất mà hệ sinh vật đất và chất lượng đất bị tàn phánghiêm trọng Phương pháp sinh học sử dụng cho cây trồng đang được các nhà khoahọc khuyến khích sử dụng vì chúng có những ưu điểm sau:

- Không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồng như thuốc bảo vệ thực vật từ hóa chất.

- Cân bằng hệ sinh thái trong môi trường đất nói riêng và môi trường nói chung

- Không làm thoái hóa đất mà còn góp phần tăng độ phì nhiêu của đất

- Cây trồng hấp thu chất dinh dưỡng dễ hơn, góp phần tăng năng suất và chất lượng nông phẩm

- Tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề khángbệnh của cây trồng mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các loạithuốc BVTV có nguồn gốc hóa chất Tác dụng của CPSH đến từ từ chứkhông nhanh như các loại hóa chất nhưng tác dụng dài lâu

- Có khả năng phân hủy, chuyển hóa các phế thải sinh học, phế thải nông nghiệp, công nghiệp, góp phần làm sạch môi trường

- Các chủng nấm sinh độc tố sẽ không thể hình thành cơ chế kháng

2 Các vi sinh vật hỗ trợ tăng trưởng cây trồng:

Vi khuẩn phân giải lân khó tan đã được sử dụng như phân bón sinh học thương mại

để cải thiện tình trạng nông nghiệp Nhóm vi khuẩn phân giải lân được coi là phân bónsinh học có triển vọng nhất vì rất nhiều loại đất giàu lân tổng số nhưng lại thiếu hụttrầm trọng lân dễ tan cung cấp cho cây trồng Các vi khuẩn phân giải lân lại rất có tiềmnăng để sản xuất phân vi sinh đa chức năng vì có thể tương tác kết hợp tốt với các vi

khuẩn có lợi khác như Azospirillum và Azotobacter Ngoài vai trò cung cấp lân dễ tan

cho cây trồng, các vi khuẩn hòa tan lân còn có khả năng sinh các yếu tố có vai trò nângcao hiệu suất tăng trưởng như cố định đạm, sinh tổng hợp các phytohormone, khángsinh hay các enzyme chitinase, cellulase giúp cây trồng phát triển tốt hơn, chống chịutốt hơn đối với điều kiện bất lợi từ bên ngoài

VSV phân giải lân thúc đẩy sự tăng trưởng của thực vật, làm tăng lượng lân có giátrị cho cây trồng Hòa tan lân là một hiện tượng phức tạp, phụ thuộc vào nhiều yếu tốnhư dinh dưỡng, điều kiện sinh lý và phát triển của các VSV Trong đất, các VSV làtrung tâm của chu trình chuyển hóa lân và đóng vai trò trung gian quan trọng trong việcchuyển hóa lân vô cơ và hữu cơ, sau đó giải phóng lân có giá trị cung cấp cho câytrồng.

Trong quần thể VSV đất, VSV phân giải lân có thành phần loài khác nhau và thayđổi tùy từng loại đất VSV phân giải lân được phân lập từ vùng rễ của các cây trồngkhác nhau Số lượng VSV phân giải lân hiện diện ở vùng rễ nhiều hơn so với đất ngoàivùng rễ Các VSV phân giải lân chiếm 0,1-0,5 % của tổng số vi khuẩn và nấm VSV

phân giải lân phát triển ở cả vùng đất màu mỡ giàu lân và đất thiếu lân Penicillium sp.

và Aspergillus sp là hai loại nấm chủ yếu chi phối khả năng phân giải lân trong vùng

rễ Các vi khuẩn phân giải lân quan trọng nhất là Pseudomonas, Bacilllus, Rhizobium, Burkholderia, Achromobacter, Agrobacterium,Microccocus, Flavobacterium và Erwinia.

Theo Babenko và cộng sự (1984), lượng lân hòa tan tăng tuyến tính cùng với sựtăng trưởng của vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy, lượng lân hòa tan tăng tại cácđiểm khác nhau trong những giai đoạn tăng trưởng (không phải trong suốt thời giannuôi cấy)

Rodríguez và Fraga (1999) cũng so sánh khả năng phân giải lân của 13 chủng vi

khuẩn khác nhau và nhận thấy rằng Rhizobium, Pseudomonas và các loài vi khuẩn Bacillus là những chủng mạnh nhất trong việc phân giải lân.

2.1.1 VSV phân giải lân hữu cơ

Các chất hữu cơ chứa lân sẽ được vô cơ hóa do các enzyme tiết ra từ VSV trongđất Trong quá trình sống, VSV cần phân hủy các chất hữu cơ thành các đường đơn đểlấy carbon cho sự phát triển của chúng Trong quá trình phân hủy này, nhờ các men

của VSV tiết ra, các hợp chất hữu cơ có chứa lân đã phóng thích lân dưới dạngphosphate.

Chủng Bacillus: B megaterium, B subtilis, B malaberensis không những có khả

năng phân giải hợp chất lân vô cơ mà còn có khả năng phân giải hợp chất lân hữu cơ(Bạch Phương Lan, 2004) Đồng thời B megaterium còn có khả năng hình thành bào

tử nên sức sống rất mạnh (Nguyễn Hữu Hiệp, 2009) Ngoài ra còn có Serratia, Proteus, Arthrobscter, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Cunnighamella, Streptomyces Cơ chế phân giải: sự chuyển hóa các hợp chất lân hữu cơ thành muối

của H3PO4 theo sơ đồ sau:

1. Nucleoprotein → Nuclein → Acid nucleic → Nucleotic → H3PO4

2.1.2 VSV phân giải lân vô cơ

Trong đất, lân vô cơ khó tan có thể được VSV chuyển hóa thành lân dễ tan Phầnlớn VSV trong đất đều có khả năng này Có đến 1/10 đến 1/2 chủng vi khuẩn phân lậpđược từ đất có khả năng chuyển hóa lân khó tan thành lân dễ tan Theo Katznelson vàcộng sự (1984), VSV phân giải những hợp chất lân khó tan thuộc nhiều nhóm, nhiềuloại khác nhau, có thể chiếm khoảng 10- 15% hệ VSV đất, vi khuẩn phân giải nhữnghợp chất lân vô cơ khó tan thường gặp gồm các giống: Pseudomonas denitrificans,Alcaligenes faecalis, Achromobacter delicatulus,

Agrobacterium radiobacter, Aerobacter aerogenes, Escherichia freundi,Brevibacterium, micrococus, Flavobacterium aurantiacus, Chlorobacteriumdenitrificans, Mycobacterium cyaneum, Sarcina flava, Bacillus megaterium var

phosphaticum Người ta dùng chúng làm phân bón vi sinh phân giải lân Bên cạnh các

vi khuẩn, xạ khuẩn, các chủng nấm như Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Sclerotiumcũng có tác dụng trong quá trình hòa tan hợp chất lân khó tan

Đại đa số nghiên cứu đều cho rằng, sự phân giải Ca3(PO4)2 có liên quan mật thiếtvới sự sản sinh acid trong quá trình sống của VSV Trong đó, acid carbonic đã làm cho

Ca3(PO4)2 phân giải

Ca3(PO4)2 + H2CO3 + H2O → Ca(PO4)2.H2O + Ca(HCO3)2

Trong đất, vi khuẩn nitrat hóa và vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh cũng có tácdụng quan trọng trong việc phân giải Ca3(PO4)2 Vì trong quá trình sống, các vi khuẩnnày tích lũy trong đất HNO3 và H2SO4 Quá trình hòa tan có thể biểu thị theo phươngtrình sau:

Ca3(PO4)2 + 4HNO3 → Ca(H2PO4)2 + 2Ca(NO3)2

Ca3(PO4)2 + 2H2SO4 → Ca(H2PO4)2 + 2CaSO4

Các nghiên cứu cho thấy sự xuất hiện các acid này xảy ra cùng lúc với sự xuấthiện lân hòa tan Có nghĩa là ngay sau khi VSV tiết ra các acid thì chúng tác dụng lênlân khó tan và cho ra ngay lân hòa tan Mặt khác các dạng lân bị cố định trong đất nhưphosphate sắt và phosphate nhôm cũng được chuyển hóa sang dạng dễ tan dưới tácdụng của VSV trong đất Một số vi khuẩn có khả năng sinh ra H2S tác dụng lênphosphate sắt hoặc nhôm và phóng thích ra dạng phosphate dễ tan Hiện tượng này xảy

ra trong điều kiện thiếu oxy Cơ chế của hiện tượng này chưa được giải thích rõ

Ở đất phèn trồng lúa, hầu hết lân đều ở dạng phosphate sắt hoặc nhôm, lúakhông hấp thu được Trong điều kiện này việc bón phân chuồng hoặc chôn vùi rơm rạkết hợp với bón đạm và vôi để giúp VSV phát triển sẽ giúp chuyển lân cố định sangdạng dễ tan và cung cấp cho lúa Sự chuyển hóa này hơi chậm nên tự nó không cungcấp lân đủ cho nhu cầu của lúa nên phải kết hợp thêm lân trong phân bón hóa họcnhưng với liều lượng ít hơn

2.2 Tạo màng sinh học biofilm

Các tế bào vi khuẩn sinh sống trôi nổi trong môi trường lỏng (dạng phù du) vô tìnhbám vào một bề mặt nào đó, và nếu sau một thời gian chúng không chịu tác động dichuyển đi nơi khác, quá trình sinh trưởng vẫn cứ tiếp tục, dần sẽ hình thành một kiểukhuẩn lạc trên bề mặt đó, đây là giai đoạn đầu của sự hình thành màng sinh học Kế đến

vi khuẩn sẽ bắt đầu thay đổi thay đổi kiểu hình, khả năng sinh hóa mới để thuận lợi hơn

trong việc tổng hợp nên cơ chất ngoại bào - extracellular polymeric substance (EPS).Phân tích về mặt hình thái học kết hợp với di truyền học, người ta xác định rằng các tếbào xuất hiện cấu trúc tua, nhung mao hoặc tiêm mao sẽ tăng thêm độ vững chắc củamàng sinh học Giai đoạn cuối của sự hình thành màng sinh học, các tế bào sẽ một lầnnữa biến đổi quay lại dạng phù du, tách ra khỏi màng sinh học để tìm địa điểm định cưkhác, giai đoạn này gọi là giai đoạn phát tán Khả năng tạo màng sinh học như là mộtcách thức tồn tại, phát triển của vi sinh vật trong những điều kiện dinh dưỡng thấp củamôi trường

EPS là các polymer sinh học có trọng lượng phân tử cao được vi sinh vật tiết rangoài môi trường sống xung quanh chúng EPS là thành phần chính, đồng thời quyếtđịnh tính hóa lý của màng sinh học EPS chiếm từ 50 – 90% tổng lượng chất hữu cơcủa một màng sinh học EPS là vật liệu giúp cho tế bào vi khuẩn bám dính lên một bềmặt nào đó và đồng thời liên kết với các tế bào khác

Trong màng sinh học, các tế bào liên kết với nhau bằng mạng lưới do chúng tự tổnghợp nên EPS EPS không chỉ bao gồm polysaccharides do tế bào tổng hợp ra, mà còncác thành phần từ môi trường xung quanh như các ion khoáng, bụi bẩn, hồng cầu,fibrin, protein và các acid nucleic Xen kẽ với mạng lưới EPS còn có các kênh nước,giúp vận chuyển chất dinh dưỡng và tín hiệu giữa các tế bào

EPS sẽ bao phủ tế bào vi khuẩn, nhưng vẫn tạo điều kiện cho các tế bào trao đổi tínhiệu sinh hóa cũng như trao đổi gen với nhau EPS chính là chìa khóa quan trọng choviệc sự hình thành, phát triển của màng sinh học EPS còn có chức năng giữ cho các

enzyme ngoại bào gần với tế bào, giúp hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn ổn địnhhơn.

Nghiên cứu về màng sinh vật (Biofilm) góp phần tạo ra những sản phẩm ứng dụngcao trong cuộc sống như tạo các công nghệ sinh học xử lý ô nhiễm môi trường, ứngdụng trong nghiên cứu phòng bệnh cho cây trồng cũng như các nghiên cứu trong côngnghiệp thực phẩm, hóa mỹ phẩm,…

Indole-3-acetic acid (IAA) hay còn goi là Auxin, là chất điều hòa chủ yếu của sựsinh trưởng thực vật IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài tế bào, sự phân sinh

mô, sự phát triền trái và hạt , chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng(Theologis và Gay 1982)

Auxin là những hợp chất có nhân indol, được tổng hợp từ tryptophan trong môphân sinh (ngọn, lóng) và lá non Sau đó, auxin sẽ di chuyễn đến rễ và tích tụ trong rễ

Có nhiều loại auxin khác nhau với cấu trúc hoá học khác nhau Loại auxin quantrọng nhất là β-indol-acetic acid (IAA), ngoài ra một số auxin khác cũng khá phổ biến

là napthalen-acetic acid (NAA), phenyl-acetic acid (PAA)

Hình 1.1: Một số loại auxin phổ biến

Với nhiều thí nghiệm khác nhau của nhiều nhà khoa học đã chứng minh được vaitrò của IAA do vi sinh vật tạo ra đối với cây trồng như kích thích sự kéo dài rễ, tăng sốlượng rễ phụ, làm tăng khả năng nẩy mầm của hạt

Đánh giá khả năng sinh IAA của các chủng VSV dựa trên nồng độ IAA có trongdịch chiết nuôi cấy vi khuẩn Nồng độ IAA có trong dịch chiết càng cao chứng tỏ khảnăng sinh IAA của VSV càng mạnh Nồng độ IAA được xác định bằng phương pháp

so màu trên máy quang phổ với thuốc thử Salkowski ở bước sóng 530nm

3 Tổng quan về vi khuẩn lactic.

3.1. Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus sp.

Vi khuẩn lactic có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu trong khoảng 25 – 35 °C Chúng chịuđược trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và etylic, nhiều loài vẫn sống được trongmôi trường 10-15 % cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl, có thể sốngtrong môi trường từ 7-10 % NaCl Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease phân hủyprotein thành peptide, acid amin, hoạt tính này ở các loài khác nhau thì khác nhau,thường ở trực khuẩn là cao hơn

Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hìnhcầu và hình que, đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5 μg/kg.m Các tế bàohình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau Kích thước tế bào trựckhuẩn lactic từ 1 – 8 μg/kg.m Trực khuẩn đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi Kích thướccủa chúng thay đổi tùy từng loài

Phân loại khoa học giống Lactobacillus:

Các loài Lactobacillus được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật,

đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong ruột, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinhdục người Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng cóchứa các vi khuẩn này

Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum.

3.2 Đặc điểm sinh lý

Lactobacillus spp thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi Các loài trong chi không

có khả năng di động, không sinh bào tử

Phổ nhiệt tăng trưởng từ 2 – 53o

C, nhưng tối ưu ở khoảng 30 – 40o

C Tăng trưởngtốt trong điều kiện môi trường acid, pH tối ưu khoảng 5.5 – 6.2, nhưng vẫn có thể chịuđược mức pH 5.0 hoặc thấp hơn Tốc độ tăng trưởng giảm trong điều kiện pH môi

trường trung tính hoặc kiềm Vì Lactobacillus spp có khả năng chịu được môi trường

có pH cao, nên việc tiết ra acid lactic chính là yếu tố cạnh tranh của chúng đối vớinhững vi khuẩn khác trong cùng một môi trường

Thường được tìm thấy trong các sản phẩm có nguồn gốc từ sữa, ngũ cốc, thịt, cá,bia, rượu, trái cây, nước trái cây, rau củ muối chua, bã thực phẩm, dưa cải bắp, cỏ ủ,bột nhào chua, nước, đất, chất thải Chúng cũng xuất hiện trong cơ quan sinh dục nữ,khoang miệng, hệ tiêu hóa ở người và nhiều động vật khác Đây là những môi trườngđược cung cấp thường xuyên nguồn carbohydrate và một số chất dinh dưỡng khác.Chính là nơi thích hợp để chúng thực hiện các phản ứng lên men và cho ra sản phẩmchính là acid lactic

3.3 Đặc điểm sinh hóa

Lactobacillus spp âm tính với thử nghiệm nitrate, một số trường hợp hiếm dương

tính chỉ xảy ra khi pH môi trường cân bằng ở 6.0 trở lên hoặc bổ sung sắc tố đỏ hemebào môi trường nuôi cấy Không có khả năng phân giải gelatin, casein Thử nghiệmIndole, Citrate và khả năng sinh H2S âm tính Thử nghiệm catalase âm tính

Lactobacillus spp thường sinh ra mùi đặc trưng khi có mặt trong thực phẩm Một

nửa sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men là lactate Ngoài ra quá trình lên mencòn sinh các sản phẩm khác như là: diacetyl, acetic acid, và acetaldehyde Bên cạnh đóquá trình dị hóa amino acid sẽ sinh ra H2S, amines, hợp chất carbonyl, cresol, skatol,

benzaldehyde, và methanethiol Tất cả những sản phẩm của quá trình trao đổi chất này

đã tạo ra nhiều loại hương đặc trưng của sản phẩm lên men

Lactobacillus spp thường không có khả năng gây bệnh, ngoài trừ một số ít trường

hợp có bệnh tiềm ẩn bởi khả năng sinh ra acid khử khoáng men răng

Đa số các loài trong chi Lactobacillus đều có khả năng tổng hợp EPS, nhưng chia

thành hai dạng Homopolysaccharides là dạng EPS được tổng hợp từ carbohydrate chủyếu là dextran, glucan và levan Trong khi dạng Heteropolysaccharides được tổng hợp

từ nucleotide Homopolysaccharides chủ yếu được tổng hợp từ loài lên men dị hình

như L pontis, L frumenti, L sanfranciscensis và L reuteri Heteropolysaccharides được tổng hợp với số lượng ít, khoảng 0.1 – 1.5 g/l bởi những loài lên men đồng hình như L kefiranofaciens, L delbrueckii subsp bulgaricus, L paracasei, L rhamnosus,

L helveticus, và L sakei

Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao Các loại vi khuẩnlactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau

Để sinh trưởng bình thường chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứacác nguyên tố cơ bản như carbon, nitơ một phần dưới dạng các acid amin, photphat vàlưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ,các chất sinh trưởng…

3.4.1 Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại carbohydrate từ các monosaccharide(glucose, fructose) và các disaccharide (saccharose, lactose, maltose) cho đến cácpolysaccharide (tinh bột, dextrin)

Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tếbào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric,lactic, pyruvic, fumaric, acetic,

3.4.2 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ

Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau Phần lớn vikhuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ.

Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồnnitơ có sẵn trong môi trường Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: caothịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, peptone… Hiện nay cao nấmmen là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất tuy nhiên ở quy môcông nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém

3.4.3 Nhu cầu về vitamin

Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nênrất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khảnăng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin Cácchất chứa vitamin thường được sử dụng như dịch chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt haydịch tự phân nấm men

3.4.4 Nhu cầu các chất hữu cơ khác

Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ kháccho sự phát triển như các base nitơ hay các acid hữu cơ Một số acid hữu cơ có ảnhhưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic.Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrate, dẫn xuất của acid oleic làm thành phầnmôi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic

Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọngđến sự sinh trưởng của tế bào Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng cácmuối acetate để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic

3.4.5 Nhu cầu các muối vô cơ khác

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối

vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưuhuỳnh, magie, mangan Đặc biệt là magie và mangan, vì nó tham gia và đảm bảo chức

năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tếbào.

3.4.6 Nhu cầu dinh dưỡng oxy

Vi khuẩn lactic có khả năng sống được trong môi trường có oxy hay không có oxy.Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so vớitrong điều kiện kị khí

Trong điều kiện hiếu khí sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điềukiện kỵ khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành

CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATPTrong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đó lượng cơchất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn

3.5 Quá trình trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việclên men lactic

Một tính năng cần thiết của LAB trong quá trình trao đổi chất là khả năng lên mencarbohydrate, các ATP tạo ra được sử dụng cho các mục đích tổng hợp sinh học khác

và sản phẩm cuối cùng chủ yếu là acid lactic (từ 50% carbon của đường) LAB có khảnăng lên men các loại đường hexose (glucose, mannose, galactose, fructose…),disaccharide (lactose, saccharose…); pentose (arabinose, xylose, ribose…) và các hợpchất liên quan Chúng chỉ sử dụng được các loại đường ở dạng đồng phân D Tuynhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau làm thay đổi cách thức traođổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo ra cũng khác nhau

Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn lactic làm hai

nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình (hình 1.2).

- Lên men lactic đồng hình

Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic tạo rachiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol, di-acetiyl Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men:

C6H12O6→

2CH3CHOHCOOH + 21,8.104 JCon đường Glycolysis hay con đường EMB (Embden-Meyerhof-Parnas pathway)

được sử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ leuconostocs, nhóm III Lactobacilli, Oenococci và Weissellas) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và nhờ FDP aldolase

để tiếp tục chuyển thành dihydroxyacetonephosphate (DHAP) và phosphate (GAP) đối với những chất có mức phosphoryl hóa ở 2 vị trí, sau đó tạothành pyruvate Trong điều kiện có nhiều đường và hạn chế oxy, pyruvate bị khử thànhacid lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+, do đó NADH đã được oxyhóa trước đó, khi thế oxy hóa khử được cân bằng, sản phẩm cuối cùng được tạo ra chủyếu là acid lactic và quá trình này được gọi là lên men lactic đồng hình

glyceraldehyde-3 Lên men lactic dị hình

Một số con đường lên men khác như: con đường pentose phosphate, con đườngpentose phosphoketolase pathway, con đường hexose monophosphate, con đường 6-phosphogluconate Đặc điểm của con đường này là sự khử hidro ngay từ bước đầu tạo6-phosphogluconate Theo sau đó là sự tách carbon tạo pentose-5-phosphate và tiếp tụcchuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) và acetyl phosphate GAP đượctạo thành tương tự như trong con đường glycolysis và kết quả là tạo ra acid lactic.Trong điều kiện không có mặt của các chất nhận điện tử, acetyl phosphate sẽ bị khử tạothành ethanol thông qua CoA và acetaldehyde Khi quá trình này ngoài sản phẩm acidlactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như CO2, ethanol, acid acetic,acid succinic thì nó được gọi là lên men lactic dị hình

Phương trình chung biển diễn quá trình lên men:

CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH +

C2H5OH +CO2

Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic

và acid acetic 10% các loại khí 20% đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sựtích luỹ một lượng ít acid foocmic Như vậy, các sản phẩm phụ khác nhau đáng kể tạothành trong quá trình lên men lactic dị hình chứng tỏ rằng quá trình này phức tạp hơn

so với lên men lactic đồng hình Theo quan điểm tiến hoá sinh lý trong vi sinh vật họcngười ta cho rằng lên men lactic đồng hình là hướng tiến hoá độc lập của lên men dịhình

Thông thường, LAB lên men đồng hình chủ yếu lên men bằng con đường

glycolysis và ngược lại LAB lên men dị hình sử dụng con đường 6-PG/PK Tuy nhiên

nó không phải dúng cho tất cả các trường hợp (Owen R Fennema et al 2004)

Hình 1.2: Con đường lên men Glucose