Đánh giá đa dạng di truyền và xác định marker phân tử đặc trưng nhận dạng một số mẫu sâm lai châu

Mục đích nghiên cứu Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ phân tử để xác định nguồn gốc, mốiquan hệ di truyền của các giống/loài Sâm Lai Châu, phân biệt Sâm Lai Châuvới với loài khác cùng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-*** -KHƯƠNG THỊ BÍCH

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER PHÂN TỬ ĐẶC TRƯNG NHẬN DẠNG

MỘT SỐ MẪU SÂM LAI CHÂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2018

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-*** -KHƯƠNG THỊ BÍCH

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER PHÂN TỬ ĐẶC TRƯNG NHẬN DẠNG

MỘT SỐ MẪU SÂM LAI CHÂU

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mãsố: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS KHUẤT HỮU TRUNG

HÀ NỘI - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân

tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS.Khuất Hữu Trung Các số liệu và tài liệu

được trích dẫn trong luận văn là trung thực.Kết quả nghiên cứu này không trùng với bất cứ công trình nào đã được công bố trước đó.

Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình.

Tác giả

Khương Thị Bích

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Viện Sinh thái và Tài nguyênSinh vật, Viện Di truyền Nông nghiêp, các thầy giáo, cô giáo đã tạo điều kiệnthuận lợi cho tôi được học tập và hoàn thành khóa học này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Phó giáo sư - Tiến sĩ Khuất Hữu Trung - Phó viện trưởng - Viện Di truyền Nông nghiệp, người đã tận

tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn: “Đánh giá đa dạng di

truyền và xác định marker phân tử đặc trưng nhận dạng một số mẫu Sâm Lai Châu.”

Tôi xin được cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn Kĩ thuật Di truyền - Viện

Di truyền Nông nghiệp luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về

cơ sở vật chất - trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sắc tới gia đình, đặcbiệt là bố mẹtôi, những người luôn bên cạnh và hỗ trợ tôi về mọi mặt để tôi cóthể hoàn thành tốt nhiệm vụ học tập của mình Nhân dịp này tôi cũng trântrọng cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp những người đã luôn bên cạnh, động viên,góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, tháng năm 2018

Tác giả

Khương Thị Bích

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1

PHẦN II: NỘI DUNG 4

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tình hình nghiên cứu cây Sâm Lai Châu trên Thế giới và ở Việt Nam 4

1.1.1 Tên gọi, phân loại và hình thái 4

1.1.2 Đặc điểm sinh thái và phân bố 11

1.1.3 Giá trị sử dụng và giá trị kinh tế 14

1.1.4 Các thành phần hoạt chất ở chi Panax 16

1.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền Sâm 19

1.3 Nghiên cứu bảo tồn và phát triển Sâm 21

1.4 Tổng quan phương pháp nghiên cứu về phân loại thực vật 22

1.4.1 Các phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái 22

1.4.2 Các phương pháp dựa trên chỉ thị phân tử 23

Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Vật liệu 30

2.2 Hóa chất 31

2.3 Phương pháp nghiên cứu 31

2.3.1 Tách chiết ADN tổng số 31

2.3.2 Chu trình PCR 32

2.3.3 Phương pháp điện di trên gel agarose 33

2.3.4 Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen 34

2.3.5 Giải trình tự 34

Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 35 3.2 Phân tích các sản phẩm khuếch đại của 25 mẫu nghiên cứu 36 3.3 Kết quả khảo sát trình tự vùng ITS1-5,8SrRNA-ITS2 ở các

mẫu nghiên cứu 36 3.4 Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS1-5,8SrRNA-ITS2

của các mẫu nghiên cứu 40

3.5 Kết quả xây dựng cây quan hệ phát sinh giữa 25 mẫu nghiên

cứu 45 3.6 Kết quả xác định Marker phân tử phân biệt 25 mẫu Sâm nghiên cứu 51 PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC: TRÌNH TỰ 25 MẪU SÂM LAI CHÂU NGHIÊN CỨU 70

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AFLP Amplified Fragments Length Polymorphism

cDNA Complementary deoxyribonucleic acid

CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide

DMSO Dimethyl sulfoxide(CH3)2SO

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTPs Deoxynucleoside triphosphates

EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid

EtBr Ethidium Bromide

ISSR Inter simple sequence repeat

ITS Internal Transcribed Spacer

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng nhân theo chuỗiRAPD Random Amplified Polymorphic DNA

rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA Ribonucleic acid

SCAR Sequence Characterised Amplification Regions

SSR Simple sequence repeats

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách 25 mẫu Sâm. 30Bảng 2.2 Danh sách các mồi ITS sử dụng trong nghiên cứu 31Bảng 3.1 Độ dài các trình tự thuộc 25 mẫu Sâm nghiên cứu và mẫu

tham chiếu KJ418192.1 38

Bảng 3.2 Thành phần bốn loại nucleotide của 25 mẫu nghiên cứu và

mẫu tham chiếu KJ418192.1 39Bảng 3.3 Hệ số tương đồng di truyền giữa 25 mẫu nghiên cứu và mẫu

tham chiếu KJ418192.1 vào trình tự vùng

ITS1-5,8SrRNA-ITS2 46

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Sơ đồ vùng ITS của các gen rDNA vùng nhân và vị trí của

các mồi ITS (Embong et al., 2008) 29Hình 3.1: Ảnh điện di ADN tổng số của 25 mẫu Sâm nghiên cứu 35Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS8 trên

25 mẫu Sâm với thang chuẩn Marker 100bp và mẫu đối

chứng trắng (H2O) 36Hình 3.3: Một đoạn giản đồ có các đỉnh với 4 màu sắc khác nhau tương

ứng với 4 loại nucleotide của mẫu Sâm PT7 37Hình 3.4: Kết quả gióng hàng, gióng cột 25 trình tự ITS1-5,8SrRNA-

ITS2 của 25 mẫu Sâm và mẫu tham chiếu KJ418192.1 44Hình 3.5 Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa 25 mẫu nghiên

cứu 47Hình 3.6 Cây quan hệ phát sinh giữa 25 mẫu nghiên cứu và mẫu tham

chiếu KJ418192.1 48

PHẦN I: MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Tại các nước châu Á, Nhân sâm được coi là vị thuốc quý đứng đầutrong các loại thuốc quý đông y (sâm, nhung, quế và phụ) Nhân sâm có tácdụng kích thích nhẹ ở liều thấp làm tăng vận động, tăng trí nhớ nhưng tácdụng ức chế ở liều cao đối với hệ thần kinh; làm tăng sinh lực chống lại sựmệt mỏi, giúp hồi phục sức lực làm tăng sự thích nghi của cơ thể trước nhữngbất lợi của điều kiện môi trường sống; tác dụng bảo vệ tế bào giúp hồi phục sốhồng cầu, bạch cầu bị giảm; tác dụng tăng nội tiết tố sinh dục; tác dụng khángviêm; tác dụng điều hoà hoạt động của tim; tác dụng hạ cholesterol máu,chống xơ vữa động mạch; tác dụng giải độc gan và tác dụng kháng khuẩn nhất

là đối với Streptococcus gây bệnh viêm họng

Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus) có tên gọi khác là

Tam thất hoang Mường Tè;Tam thất rừng; Tam thất đen Năm 2013, loài câynày đã được công bố phát hiện tại Lai Châu và đăng trên các tạp chí khoa họcquốc tế và đăng ký mẫu DNA vào ngân hàng Genbank Tính đến năm 2016 thìdiện tích phân bố tự nhiên của Sâm Lai Châu đã giảm đáng kể chỉ còn lại rất íttrong rừng rậm nguyên sinh mưa mùa nhiệt đới chưa bị tác động hoặc tácđộng nhẹ thuộc vùng núi cao xã Pa Vệ Sử, xã Ka Lăng, xã Thum Lũm, xã Tá

Bạ huyện Mường Tè, cây phân bố rải rác

Sâm Lai Châu có tác dụng tương tự như Nhân sâm: củ và thân rễ dùnglàm thuốc bổ; tăng lực, chống suy nhược, hồi phục sức lực bị suy giảm, kíchthích nội tiết sinh dục, tăng sức chịu đựng, giải độc và bảo vệ gan, điều hoàthần kinh trung ương, điều hoà tim mạch, chống xơ vữa động mạch, giảmđường huyết và có thể dùng làm thuốc trị viêm họng

Hiện nay, tại Việt Nam, Sâm Lai Châu còn lại rất ít trong tự nhiên.Chính vì vậy, việc bảo tồn và phát triển loại dược liệu quý báu này không chỉ

góp phần xoá đói giảm nghèo, tạo công ăn việc làm cho bà con vùng núi màcòn tạo nguồn dược liệu quý, sạch để cung cấp cho các công ty dược phẩm vàngười tiêu dùng Để góp phần nghiên cứu bảo tồn loài cây quý hiếm này, tôi

tiến hành thực hiện đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền và xác định marker

phân tử đặc trưng nhận dạng một số mẫu SâmLai Châu”.

2 Mục đích nghiên cứu

Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ phân tử để xác định nguồn gốc, mốiquan hệ di truyền của các giống/loài Sâm Lai Châu, phân biệt Sâm Lai Châuvới với loài khác cùng chi Panax; phục vụ cho công tác bảo tồn, chọn tạogiống và phát triển nguồn gốc dược liệu quý giá có giá trị kinh tế

Xác định được các chỉ thị/marker phân tử đặc trưng để nhận dạng một sốnguồn gen Sâm Lai Châutrong tập đoàn nghiên cứu

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: 25 mẫu Sâm thu thập tại 5 địa điểm ở Lai Châu(Ka Lăng - Mường Tè, Pa Vệ Sử - Mường Tè, Thu Lũm - Mường Tè; SìnHồ; Tam Đường và Phong Thổ)

- Thời gian thu mẫu: tháng 5 - 6/2017

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2017 đến tháng 8/2018

- Địa điểm nghiên cứu: thực hiện các thí nghiệm phân tử tại Bộ môn Kỹthuật di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học

Hiểu biết về đa dạng di truyền ở mức phân tử của các mẫu Sâm Lai Châuthu được, là cơ sở để phân loại, tuyển chọn những nguồn gen ưu tú phục vụcho công tác chọn và lai tạo giống mới Các marker phân tử nhận biết chínhxác một số nguồn gen Sâm bản địa quý được sử dụng để xác

định tính đúng giống phục vụ công tác nhân giống và kiểm soát cây con giống

ở giai đoạn sớm

Kết quả của đề tài rất có ý nghĩa trong việc xây dựng và tiêu chuẩn hoáphương pháp đánh giá nguồn gen làm cơ sở cho việc đăng kí bản quyền ởNgân hàng gen thế giới, khẳng định chủ quyền Quốc gia về nguồn tài nguyênthực vật bản địa

Ý nghĩa thực tiễn

Đề tài góp phần thu thập các nguồn gen Sâm thu thập tại Lai Châu

Kết quả đề tài góp phần bảo tồn và sử dụng hợp lí nguồn gen Sâm LaiChâu của Việt Nam, phục vụ cho công tác chọn tạo giống mới, chuẩn hóanguồn cây giống dược liệu góp phần nâng cao thương hiệu cho sản phẩm SâmLai Châu của Việt Nam ở khu vực và trên thế giới

PHẦN II: NỘI DUNG Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu cây Sâm Lai Châu trên Thế giới và ở Việt Nam

1.1.1 Tên gọi, phân loại và hình thái

v Tên gọi

Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus K.Komatsu,

S.Zhu & S.Q.Cai) là cây thân thảo, củ và rễ được sử dụng làm thuốc từ rất

lâu đời thuộc chi Nhân sâm (Panax L.), họ Ngũ gia bì (Araliaceae)

Các loài Nhân sâm được phân biệt dựa vào hình thái, màu sắc và đượcgọi theo tên địa phương; ví dụ một số loài Sâm chính như sau:

- Panax vietnamensis Ha et Grushv.: sâm Việt Nam, sâm Ngọc Linh, sâm Nga

Mi, mọc hoang dại, được trồng chủ yếu ở Kon Tum và Quảng Nam

- Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M Feng: mọc hoang dại ở miền Nam

Trung Quốc và Bắc Việt Nam

- Panax ginseng C.A Meyer: sâm Triều Tiên, sâm Cao ly, nhân sâm, hồng

sâm, là loài hoang dại, hiện nay rất hiếm, được trồng ở Đông Bắc, Châu Á

- Panax quinquefolius L.: sâm Mỹ, sâm Tây Dương, mọc hoang, được trồng ở

vùng Bắc Mỹ

- Panax notoginseng F.H Chen ex C.Y Wu et K.M Feng: sâm Trung Quốc,

tam thất, điền thất, phân bố loài hoang dại chưa rõ, được trồng ở Vân NamTrung Quốc

- Panax japonicus C.A Meyer: sâm Nhật Bản, sâm lá tô, sâm đốt tre, mọc

hoang dại ở Nhật Bản và Nam Trung Quốc

v Phân loại

Phân loại Sâm Lai Châu:

Giới : Plantae (Thực vật)Ngành : Magnoliophyta (Ngọc Lan)

Lớp : Magnoliopsida (Ngọc Lan)

Bộ : Araliales (Nhân sâm)

Họ : Araliaceae (Nhân sâm)

Chi : Panax (Sâm)Loài :Panax vietnamensis

Thứ loài: (Panax vietnamensis var fuscidiscus K.Komatsu,

S.Zhu & S.Q.Cai)

Theo Nguyễn Huy Sơn (2016) Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus) có tên gọi khác là Tam thất hoang Mường Tè;Tam thất rừng; Tam

thất đen[6] Loài cây này được Zhu và cộng sự đã mô tả là một thứ mới, bậc

phân loại dưới loài của Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis) Thứ này được

phát hiện đầu tiên tại vùng Jinping, phía nam của tỉnh Vân Nam - Trung Quốc

Đây là cây dược liệu đặc hữu có giá trị thuộc chi Sâm (Panax), họ Ngũ gia bì

(Araliaceae).Trong kết quả nghiên cứu của mình tác giả đã mô tả thu mẫuđược cả quả chín đốm đen

Chi Sâm Panax L gồm có 15 loài và dưới loài và hầu hết chúng là

nguồn dược liệu cho y học cổ truyền như các loại Nhân Sâm, Nhân Sâm Hoa

kỳ, Tam thất, Nhân Sâm Nhật bản và Sâm Ngọc Linh (Nguyễn Tập, 2005)[8].Mới gần đây nhóm nghiên cứu của Phan Kế Long et al., (2013) đã phát

hiện thứ Panax vietnamensis var fuscidiscus nói trên có phân bố ở tỉnh Lai

Châu và được gọi tên là Sâm Lai Châu Loài này có phân bố hẹp trên dãy núi

Pu Si Lung và lân cận (Mường Tè và Tây Sìn Hồ, giáp biên giới với TrungQuốc) và dãy núi Pu Sam Cáp nằm giữa các huyện Sìn Hồ và Tam Đường vớiThành phố Lai Châu, tỉnh Lai Châu Sâm Lai Châu bị người dân bản địa khaithác, sử dụng làm thuốc và bán sang Trung Quốc, đang bị đe doạ tuyệt chủng

ở mức độ trầm trọng (CR) (Phan Kế Long et al., 2013) [52]

v Đặc điểm hình thái

Chi Sâm Panax L thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae)được mô tả sớm

nhất và được ứng dụng phổ biến nhất.Chi Sâm được mô tả đầu tiên cho hai

loài là P quinquefolius L và P trifolius L với đặc điểm khác biệt so với các

chi khác trong họ là bầu 2 ô, hoa mẫu 5, xếp van hay xếp lợp (Linnaeus,

1754)[48].De Candolle (1830) đã sắp xếp một số loài thuộc chi Nothopanax vào chi Panax[23] Tuy nhiên, Decaisne và Planchon (1854) lại cho rằng đặc điểm chính của chi Panax là đài xếp van, nên chuyển 2 loài P quinquefolius

và P trifolius sang chi Aralia, đồng thời đồng nhất hoá các chi Polyscias Forest, Cheirodendron Nutt, Pseudopanax Koch và Maralia Pet vào chi Panax[22].Như vậy, với cách phân loại như trên, các tác giả đã cho rằng đặc điểm hình thái của chi Panax bên cạnh đài xếp van còn có đặc điểm thân gỗ

và thân thảo Đồng ý với quan điểm trên, các tác giả Bentham và Hooker

(1867), Clarke (1879) tiếp tục xác nhập chi Nothopanax vào chi Panax, đồng thời chuyển chi Panax vào tông (tribe) Panaceae[17], [19].

Seemann (1868) đã nghiên cứu sự khác biệt giữa chi Panax so với chi

khác trong họ Araliaceae là: thân dạng củ, đài 5, xếp lợp, bầu 2 ô Dựa vào kết

quả trên, tác giả đã chuyển 61 loài không có thân dạng củ ra khỏi chi Panax, đồng thời chuyển các loài có thân dạng củ trước đây ở các chi khác vào chi Panax, và chi này chỉ còn lại các loài: P trifolium L., P quinquefolius L., P ginseng Mey., P pseudoginseng Wall., P japonicus Mey và P bipinnatifidus Seem Với loài P fructicosus có đặc điểm là đài xếp van, tác giả xếp vào chi Nothopanax và đồng thời lấy loài này là danh pháp cho chi Nothopanax (Seemann, 1868) [57] Năm 1987, Harm cho rằng chi Panax có nguồn gốc từ chi Aralia dựa trên các đặc điểm của các loài Nhân sâm phân bố trên thế giới

như: cơ quan sinh sản, cơ quan sinh dưỡng[32].Britton và Brown (1913) cho

rằng loài P quinquefolius được mô tả lần đầu tiên và có đặc điểm

đại diện cho chi Panax như thân dạng củ, hoa mẫu 5 xếp van hay xếp lợp, bầu

2 ô, nên lấy loài này để phân loại danh pháp cho chi [18]

Nhiều nghiên cứu cho rằng chi Panax có mối quan hệ gần gũi với chi Aralia(Hara 1970; Wen, 1993; Wen và Zimmer, 1996; Plunkett et al., 1996;

Xiang và Lowry, 2007)[31], [65], [66], [54], [69] Theo các tác giả, cách phân

loại các loài thuộc chi Panax sẽ dựa vào hình thái của thân rễ (Rhizome type:

thân rễ có dạng thân củ (carot type); thân rễ có đốt kéo dài; và thân rễ có đốtngắn như đốt trúc); các đặc điểm cơ quan sinh dưỡng; đặc điểm hình thái,hình thái giải phẫu, hạt phấn và sinh học phân tử Bên cạnh cách phân loạidựa trên các hình thái còn có một số nghiên cứu phân loại khác dựa trên thànhphần hoạt chất và số lượng nhiễm sắc thể (Tsai và Feng, 1975; Yang, 1981)[63], [70]

Ví dụ, Tsai và Feng (1975) đã chỉ ra có 2 nhóm triterpenoid saponinchính tồn tại trong các loài Sâm khác nhau: Triterpenoid dammarane gồm có

các loài: P ginseng, P notogingseng và Triterpenoid oleanane gồm các loài:

P pseudoginseng, P zingiberensis, P japonicus, P japonicus var angustifolius, P japonicus var major, P japonicus var bipinatifidus, P stipuleanatus Ngoài ra, kết hợp với các đặc điểm hình thái của thân rễ, các

tác giả chia các loài Sâm ở Trung Quốc thành 2 nhóm chính: Nhóm 1 gồm cácloài có thân rễ ngắn, giống thân củ cà rốt, hạt lớn, đồng thời hoạt chất chính làtetracyclic triterpenoid có trong thân rễ; Nhóm 2 gồm các loài có thân rễ dàihay dạng đốt trúc, hạt nhỏ, đồng thời có hoạt chất pentacyclic triterpenoid.Yang (1981) đã chỉ ra số lượng nhiễm sắc thể của 7 loài Sâm Tác giả cũng

cho rằng hai loài P gingseng và P quinquefolius không là tổ tiên của chi Panax vì 2n = 48 (44), mà tổ tiên của chi Panax phải là P japonicus với bộ nhiễm sắc thể 2n = 24).

Tuy nhiên, số lượng các loàiSâm củachi Panax vẫn chưa rõ ràngvì một

số tác giả xác định cùng một loài nhưng lại cho các kết quả khác nhau Nhiềunghiên cứu xác định các loài Sâm đã sử dụngphương pháp hình thái học, tếbào học, giải phẫu học, sinh lý học và sinh thái học (Woo et al., 2004; Yu etal., 2009; Jee et al., 2014; Bai et al., 2015; Kim et al., 2015) [68], [73], [35],[13], [40] Sử dụng như đặc điểm hình thái để phân biệt giữa các loài có thểdẫn đến sự nhầm lẫn bởi vì các đặc điểm biểu hiện có thể là kết quả kết hợpcủa di truyền và môi trường (Jo et al., 2013) [37] Hơn nữa, kỹ thuật sinh họcphân tử đã được ứng dụng để bổ sung thêm một mức độ phân loại các loàithông qua các nghiên cứu về DNA (Lim và Choi 1990; Lim et al., 1993; Hon

et al., 2003) [46], [47], [33] Để phân loại các loài thực vật, các kỹ thuật nhưRFLP, RAPD, AFLP và SSR đã được sử dụng Trong đó các kỹ thuật markerSSR hoặc microsatellite có tiềm năng rất lớn do có khả năng phát hiện tính đahình rất cao, có thể phân biệt được sự sai khácmà không xác định được bằngcác marker khác như RAPD và RFLP(Powell et al., 1996; Kim et al., 2007;Silva et al., 2013)[55], [42], [58].Những nghiên cứu ứng dụng marker SSR đểđánh giá đa dạng di truyền, xây dựng bản đồ di truyền, so sánh gen, lựa chọntrợ giúp của marker đã mang lại nhiều kết quả khả quan, vì bộ gen của Nhânsâm là rất lớn (3.12 tỷ cặp base) và có rất nhiều giống phát triển gần đây

Bảng 1.1 cho thấy việc phân loại các taxon thuộc chi Panax dựa vào đặc điểm

hình thái với các kết quả rất khác nhau, đòi hỏi cần tiếp tục có những nghiêncứu về phân loại

Bảng 1.1: Phân loại các taxon Panax ở Châu Á theo quan điểm của các

nhà nghiên cứu hệ thống học thực vật giai đoạn 1996-2014

loại

Dựa trên hình thái Panax ginseng, P japonicas, Wen và Zimmer

và vùng P.bipinnatifidus (Sichuan, China), P. (1996)[66]

ITS1-5,8S-ITS2 omeiensis, P bipinnatifidus (Hubei,

China), P major ((Syn.: P japonicus var major; P pseudoginseng subsp.

himalaicus), P wangianus (Syn.: P.

japonicus var angustifolius), P.

sinensis, P zingiberensis, P.

pseudoginseng ,

P notoginseng, P.

stipuleanatus

Dựa trên hình P ginseng, P aponicus, P Zuo et al., (2011,

thái, các barcode bipinnatifidus, P elegantior, P 2014)[75], [76] ITS, barcode lục assamicus, P shangianus, P.

lạp và kỹ thuật variabilis, P omeiensis,P major, P.

zingiberensis, P vietnamensis, P.

pseudoginseng ,

P notoginseng,P.

stipuleanatus

Dựa trên hình Panax ginseng, P japonicus (Japan), Shu et al., (2003)

thái, trình tự gene P japonicus (China), P japonicus [61]

18S rDNA và var bipinnatifidus

gene matK/trnK P japonicus var major, P.

pseudoginseng subsp Himalaicus, P.

japonicus var angustifolius, P.

zingiberensis, P vietnamensis, P.

vietnamensis var fuscidiscus, P.

pseudoginseng ,

P notoginseng, P.

9

Ở Việt Nam, loài cây này đã được công bố phát hiện tại Lai Châu năm

2013 và đăng trên các tạp chí khoa học quốc tế và đăng ký mẫu DNA vào ngânhàng Genbank Tính đến năm 2016 thì diện tích phân bố tự nhiên của Sâm LaiChâu đã giảm đáng kể chỉ còn lại rất ít trong rừng rậm nguyên sinh mưa mùanhiệt đới chưa bị tác động hoặc tác động nhẹ thuộc vùng núi cao xã Pa Vệ Sử, xã

Ka Lăng, xã Thum Lũm, xã Tá Bạ huyện Mường Tè, cây phân bốrải rác

Sâm Lai Châu là cây thảo, sống nhiều năm, cao 40-80 cm Thân rễ hợptrục, nằm ngang hay hơi chếch, mập, nạc có nhiều chỗ lõm do vết thân để lại;

ít khi phân nhánh; đường kính củ 1,5-3 cm Mỗi cây thường có 1 thân mang

lá, ít khi 2 hoặc 3 trừ trường hợp đầu thân rễ bị tổn thương, sau phân nhánh vàmọc lên số chồi thân tương ứng Thân đơn độc, vỏ màu đen hoặc lục, mọcthẳng đứng, nhẵn, cao 0,3m (khi chưa có hoa); 0,7m (khi có hoa); khi tươiđường kính 0,3-0,6 cm, mặt cắt ngang hình tròn hay hơi có 3 cạnh, xốp ở giữakhi tươi, rỗng khi khô

Lá kép chân vịt, gồm 3-4 cái có khi lên đến 5-6 cái, mọc vòng ở ngọn;

có cuống dài 5-10 cm Lá chét 5; có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn,nhọn 2 đầu, 5-13 x 2-4 cm; mép có răng cưa, hoặc ở một số ít cây non có thểgặp dạng xẻ lông chim nông, mép của thuỳ nông cũng khía răng cưa; thường

có lông ở gân mặt trên lá

Mùa ra hoa tháng 4-5, quả tháng 7-9 (10) Tái sinh chủ yếu tự nhiênbằng hạt Thân mang lá lụi hàng năm vào mùa đông, chồi mới mọc lên từ đầuthân rễ vào đầu mùa xuân năm sau

Cây Sâm Lai Châu có phân bố tập trung chủ yếu ở tỉnh Lai Châu, cây

có cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn, hiếm khi có thêm 1 tán phụ, nhỏ Cuốngcụm hoa mọc đơn độc ở đỉnh thân, giữa vòng lá cao tán lá, dài đến 25 cm, gấp1,5-2 lần cuống lá Cụm hoa có dạng hình cầu Lá hoa tổng bao hình tam giáchẹp, dài khoảng 2mm, mép nguyên Cuống hoa dài 1-1,5cm, mang dày đặc

nhú mịn, mọng chất tiết giống như trên cuống cụm hoa Cụm hoa có đườngkính 2,5-4cm Số hoa trên 1 tán từ 70-100 hoa, có khi hơn tuỳ vào kích thước

và tuổi cây, nhưng tỷ lệ đậu quả thấp, chỉ đạt từ khoảng 40-50% Hoa màuvàng xanh nhạt, 5 lá đài nhỏ; 5 cánh hoa; 5 nhị; bầu 2 ô, có đầu nhuỵ thườngchẻ đôi Nhị đực màu trắng, chỉ nhị hình sợi, dài khoảng 2,5mm; bao phấnhình thuôn ngắn, dài khoảng 1mm Đĩa tuyến mật trên đỉnh bầu thoạt đầu hơihình nón, sau dẹt dần, toàn bộ màu mận chín

Thường có đến 80% số lượng hoa chỉ có một ô cùng một vòi nguyênphát triển, ô còn lại sớm bị tiêu giảm Quả mọng, gần hình cầu dẹt (thận) dẹttheo hướng lưng bụng, đường kính 0,6-1,2 cm, khi chín màu đỏ có chấm đen

Có 1 hạt, gần giống hạt đậu tròn, màu xám trắng, vỏ cứng, có rốn hạt

1.1.2 Đặc điểm sinh thái và phân bố

Trong vùng phân bố, Sâm mọc tự nhiên dưới tán rừng có độ cao từ 1500mtrở lên, phù hợp với điều kiện khí hậu ôn hòa, mát mẻ quanh năm Nhiệt độ trungbình từ 200C đến 250C, tổng tích ôn từ 7200-75000C/năm Nhiệt độ tối thấp trên

50C và nhiệt độ tối cao là 330C, nhiệt độ quá cao và thấp sẽ ảnh hưởng tới sinhtrưởng của cây Hạt Sâm có thể mọc mầm trong điều kiện nhiệt độ thấp, thời kỳhạt Sâm mọc yêu cầu nhiệt độ từ 100C trở nên Cây Sâm mọc tự nhiên dưới tánrừng nên yêu cầu về độ ẩm không khí và độ ẩm đất tương đối cao từ 80% đến90% so với độ ẩm tối đa Ở thời kỳ sinh trưởng, thân khí sinh yêu cầu độ ẩm cao,lượng mưa trung bình từ 200-250 mm/tháng Ngoài ra, trong quá trình sinhtrưởng của cây, các yếu tố như mưa dông, mưa đá, sương muối đều không thíchhợp, gây tổn hại đến cây Chế độ ánh sáng, đặc biệt là chất lượng ánh sáng vàthời gian chiếu sáng rất quan trọng đối với quá trình sinh trưởng và phát triển củacây Sâm Chế độ ánh sáng trực xạ chiếm 10% và tán xạ chiếm 90% là ánh sángđược xem là thích hợp nhất cho sinh trưởng của cây Cây Sâm phát triển tốt dướitán rừng, nơi đất đai tơi xốp,

có lớp mùn dày, đủ ẩm và có điều kiện thông thoáng tốt Cây cần một lượngđạm nhất định, pH trung tính, giàu lân và kali tạo điều kiện cho củ Sâm tíchlũy các hoạt chất có năng suất cao, chất lượng tốt Các loại đất trũng, nghèodinh dưỡng đều không thuận lợi cho sự sinh trưởng của cây.

Sự phân bố của chi Panax L chỉ xuất hiện ở Bắc bán cầu, kéo dài từ

vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đông của Bắc Mỹ bao gồm Bắc Hoa Kỳ và

Tây-Nam Canada (có 2 loài P quinquefolius và P trifoliatus Vùng Đông Bắc

Á (gồm Viễn Đông Nga, Đông Bắc Trung Quốc, bán đảo Triều Tiên và Nhật

Bản) có 2 loài là P ginseng và P japonica Trung tâm phân bố của chi Panax L.

có thể từ vùng Tây- Nam của Trung Quốc lan toả xuống phía Bắc của Việt Nam.Thực chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là Vân Nam (Trung Quốc)

và Lào Cai (Việt Nam), ở đây đang có tới 7 loài và dưới loài (thứ) mọc hoàn toàn

tự nhiên, 2 loài trồng là P notoginseng (nhập từ Bắc Mỹ) và P pseudoginseng (không tìm thấy trong tự nhiên, nhưng giả thiết có nguồn gốc từ vùng cận

Himalaya hoặc là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài gần gũi nào đó) Đây có thể

coi là trung tâm phân bố của chi Sâm (Panax L.) của thế giới Ở Bắc Mỹ hiện có

3 loài (P notoginseng; P quinquefolius và P trifoliatus) Giới hạn cuối cùng về phía Nam của chi Panax L là loài Sâm Việt Nam (Panax

vietnamensis) ở Miền Trung của Việt Nam, tại 14015’ vĩ độ Bắc.

Năm 2016, Phạm Quang Tuyến trong hội thảo “Bảo tồn và phát triển Sâm Lai Châu tại huyện Mường Tè” trong báo cáo về đặc điểm sinh thái cây

Sâm Lai Châu về cơ bản thống nhất với những mô tả về hình thái lá, hoa vàhạt của Phan Kế Long et al., (2013) [11] Nhưng tác giả có bổ sung đặc điểmquan trọng để nhận biết cây Sâm Lai Châu và phân biệt với các loài cùng chi

Panax đó là: quả khi chín có màu đỏ chấm đen ở đầu Đây là đặc điểm dễ nhận biết để phân biệt Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus) với Tam thất hoang (Panax stipuleanatus) và Sâm vũ diệp (Panax

bipinnatifidus) khi chín hạt chỉ có màu đỏ Như vậy, các kết quả nghiên cứu

phân loại, tên gọi và mô tả đặc điểm hình thái cây Sâm Lai Châu về cơ bản đãđầy đủ thông tin làm cơ sở nhận biết đặc trưng loài và dưới loài Tuy nhiên,một số mẫu cây mọc tự nhiên vẫn có đặc điểm hình thái thân và củ màu sắckhác nhau có thể do các yếu tố về vùng địa lý (xuất xứ) hoặc hoàn cảnh sống.Đây là yếu tố quan trọng để xác định mẫu giống trong quá trình chọn giống

Ở Việt Nam, Sâm Lai Châu có đặc điểm ưa ẩm và ưa bóng, mọc rải ráctrên đất có nhiều mùn, dưới tán rừng kín thường xanh ẩm, trên đất có nhiềumùn, hoặc rừng có xen lẫn với sặt gai, ở độ cao 1400-2300m Độ cao thườnggặp từ 1400-1900m Thực vật đi cùng thường là các loài cây thân gỗ, cây bụi,cây thảo thuộc các họ: Ngọc Lan (Magnoniaceae), Dẻ (Fagacea), Re(Lauraceae), Ngũ gia bì (Araliaceae), Đỗ quyên (Ericaceae), Hồi (Illiciaceae),

Gừng (Zingiberacaea), nhiều chỗ có Sặt gai (Sinarudinaria griffiana) chiếm

ưu thế và một số loài Dương xỉ khác

Đất đai, thổ nhưỡng: Sâm Lai Châu phát triển trên các nhóm: Đất mùntrên núi cao >1700m; đất mùn vàng đỏ trên núi cao 700-1700m Đất rừng cóSâm lai châu phân bố nhìn chung thuộc loại đất chua (pH 3,5-5,7); đất khámàu mỡ hàm lượng các bon hữu cơ 2,88-7,23%; hàm lượng nitơ tổng số 0,25-0,76%

Khí hậu: Số liệu khí hậu (bảng 1.2) được thu thập và kế thừa từ số liệu được tổng hợp ở bảng sau:

Bảng 1.2: Đặc điểm khí hậu các xã vùng cao huyện Mường Tè

Địa điểm nghiên cứu Lượngmưa Độ ẩm Nhiệt độ trungbình

Sâm Lai Châu là cây ưa ẩm, khí hậu mát quanh năm và lạnh về mùađông Kết quả điều tra đặc điểm khí hậu tại các xã vùng cao huyện Mường Tècho thấy tổng lượng mưa trong năm trung bình là 3.000mm/năm; Độ ẩmkhông khí 87,5%; Nhiệt độ trung bình năm là 150C Kết quả điều tra này mộtlần nữa khẳng định cây Sâm Lai Châu là cây ưa ẩm (87%), khí hậu mát quanhnăm (trung bình khoảng 150C).Kết quả nghiên cứu này là cơ sở cho việc lựachọn địa điểm trồng bảo tồn và phát triển cây Sâm tại Lai Châu.

1.1.3 Giá trị sử dụng và giá trị kinh tế

Tại các nước Châu Á, Nhân sâm được coi là vị thuốc quý đứng đầutrong các loại thuốc quý đông y (sâm, nhung, quế và phụ) Nhân sâm có tácdụng kích thích nhẹ ở liều thấp làm tăng vận động, tăng trí nhớ nhưng tácdụng ức chế ở liều cao đối với hệ thần kinh; làm tăng sinh lực chống lại sựmệt mỏi, giúp hồi phục sức lực; làm tăng sự thích nghi của cơ thể trước nhữngbất lợi của điều kiện môi trường sống; tác dụng bảo vệ tế bào giúp hồi phục sốhồng cầu, bạch cầu bị giảm; tác dụng tăng nội tiết tố sinh dục; tác dụng khángviêm; tác dụng điều hoà hoạt động của tim; tác dụng hạ cholesterol máu,chống xơ vữa động mạch; tác dụng giải độc gan và tác dụng kháng khuẩn nhất

là đối với Streptococcus gây bệnh viêm họng Thân rễ và rễ củ Sâm có thểdùng như Nhân sâm làm thuốc bổ; tăng lực, chống suy nhược, hồi phục sứclực bị suy giảm, kích thích nội tiết sinh dục, tăng sức chịu đựng, giải độc vàbảo vệ gan, điều hoà thần kinh trung ương, điều hoà tim mạch, chống xơ vữađộng mạch, giảm đường huyết, và có thể dùng làm thuốc trị viêm họng

Ginsenosides, cáchợp chất hóa học độc đáo của các loài Panax, đang được

nghiên cứu để sử dụng tiềm năng trong y học Tuy nhiên dược tính và tácdụng bổ dưỡng của Sâm còn gây tranh cãi trong giới học giả phương Tây

Nhân sâm thương mại được bán tại hơn 35 quốc gia với doanh số vượtquá tỷ $ 2.1 vào năm 2013, trong đó một nửa đến từ Hàn Quốc và Trung

Quốc là thị trường tiêu thụ lớn nhất (Bae và So, 2013) [12] Giá trị kinh tế củacác loại Nhân sâm rất khác nhau tùy vào thời điểm, xuất xứ, loài, độ tuổi, cónguồn gốc trồng hay từ tự nhiên Giá bán Sâm tự nhiên đắt gấp nhiều lần

Nhân sâm trồng, giá bán Nhân sâm đỏ (P ginseng) trồngtại Hàn Quốc là 250

USD/kg còn giá của Sâm tự nhiên cùng loại dao động từ 2000-20.000USD/kg

tùy vào tuổi Ở Việt Nam, giá bán của P vietnamensis khoảng1000-1500 USD/kg, giá bán của P vietnamensis var fuscidiscus khoảng 200-300 USD/kg; giá của P stipuleanatus khoảng 150-250 USD/kg và giá bản của P bipinnatifidus khoảng 100-200 USD/kg Chính vì có giá trị dược dụng và giá trị kinh tế lớn, mà các quốc gia trên thế giới có các loài thuộc chi Panax phân

bố tự nhiên như Hàn Quốc, Mỹ, Canada, Trung Quốc… đều đã đưa ra cácchương trình bảo tồn, phát triển và khai thác rất nghiêm ngặt để bảo vệ nguồntài nguyên quý hiếm này (Bai et al., 1997; Jennifer và Hamrick, 2004; Eidus

và Leopold, 2013) [14], [36], [24]

Theo Sách Đỏ Việt Nam (2007) Tam thất hoang là nguồn gen đặc biệtquý hiếm đối với Việt Nam và thế giới [1] Tất cả các bộ phận của cây đều cóthể dùng làm thuốc Thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăngcường sinh lực, chống stress Lá, nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kíchthích tiêu hoá, an thần

Tam thất có vị ngọt, hơi đắng, tính ôn; có tác dụng chỉ huyết, phá huyếttán ứ, tiêu thũng định thống và tư bổ cường tráng Ngoài ra, Tam thất có tácdụng tăng lực rất tốt, tác dụng này giống với tác dụng của Nhân sâm; rút ngắnthời gian đông máu; tiêu máu ứ và tăng lưu lượng máu ở động mạch vành củađộng vật thí nghiệm Làm tăng sức co bóp cơ tim ở liều thấp; tác dụng kíchdục, đối với chức năng nội tiết sinh dục nữ, thể hiện ở các hoạt tính oestrogen

và hướng sinh dục; giãn mạch ngoại vi và không ảnh hưởng đến huyết áp và

hệ thần kinh trung ương; điều hòa miễn dịch; kích thích tâm thần, chống trầm

uất Dựa trên những đặc điểm trên mà Tam thất đã được sử dụng trong đông y

từ khá lâu đời như một vị thuốc quý

Công trình nghiên cứu của tác giả Phạm Thanh Huyềncũng đã đạt một

số kết quả về nghiên cứu giá trị của các thành phần hóa học của loàiTam thấthoang tại Việt Nam.Tác giả cũng đã xác định được các thành phần hóa họccủa Tam thất hoang có Saponin, Phytosterol, tinh dầu, Axit hữu cơ, Acid béo,hợp chất uronic và đường khử tự do Ngoài ra, tác giả còn xác định sự khácnhau giữa thành phần hóa học tinh dầu lá và bước đầu xác định dấu vân tayhóa học của loài góp phần vào việc phân loại và kiểm định dược liệu(PhạmThanh Huyền, 2007)[2]

Trong Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vậtlần thứ 5, Lã Đình Mỡi và nhóm tác giả đã công bố kết quả nghiên cứu về cácloài cây thuốc quý thuộc họ Sâm Kết quả cho thấy trong rễ của hai loài Sâm

vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatusH.T Tsai et K.M Feng) phân bố tại vùng núi Hoàng Liên Sơn

(Lào Cai) chứa các hợp chất saponin triterpen thuộc nhóm olean (như cácchikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginseninosid Ro, Rb, Rd, Re, Rg1,Rg2, ), các phytosterol, đường khử tự do, tinh dầu, các acid hữu cơ, aciduronic và các acid béo Các thành phần hóa học chủ yếu của tinh dầu ở cả 2loài cũng tương tự nhau (như: β-farnesen, germacren D, spatulenol) Cả 2 loàihiện đã rất hiếm, đã và đang bị de dọa ở mức độ rất nguy cấp (CR A1a,c,d,B1+2b,c,e và CR A1c,d, B1+2b,ce) (Lã Đình Mỡi et al., 2013)[5] Nhìnchung, những nghiên cứu sâu về mặt hóa học mới chỉ được thực hiện ở một số

ít các loài thuộc học Sâm

1.1.4 Các thành phần hoạt chất ở chi Panax

Đến nay, các nhà khoa học đã xác định rất nhiều hoạt chất dược thuộccác nhóm ginsenoside, polysaccharide, polyacetylene, peptide và amino acid

ở các loài Nhân sâm thuộc chi Panax Tuy nhiên, thành phần dược dụng chủ

yếu được quan tâm là các triterpen saponin (ginsenoside), trong đó nhómsaponin dammarane và oleane là quan trọng nhất Chính thành phần và hàmlượng của nhóm hoạt chất này quyết định giá trị dược dụng của các taxoncũng như chất lượng dược liệu

Ginsenosides hoặc panaxosides là một lớp học của glycosides steroid , và

saponin triterpene, đặc biệt tìm thấy trong chi Panax nên còn gọi là saponin

Nhân sâm để phân biệt với các loại saponin trong nhiều loại thảo dược khác.Ginsenosides là chất quan trọng trong các mục tiêu nghiên cứu, khi chúng đượcxem như là các hợp chất chính đứng đằng sau những hiệu quả của Nhân sâm.Bởi vì ginsenosides xuất hiện trong Nhân sâm và mộtsố loại thực vật khác cùngvới nhiều hợp nhất như fenolic hay acid amin protein polyacetylene dẫn đếnnhiều khó khăn trong việc đánh giá về hiệu quả của Nhân sâm, tác động củachúng rất phức tạp và khó khăn để nghiên cứu Ginsenosides được phân táchbằng sắc ký cột Hàm lượng Ginsenoside có thể khác nhau tùy thuộc vào giống

cây Sâm (panax) và giai đoạn sinh trưởng, phát triển của Nhân sâm vào thời gian

khác nhau trước khi thu hoạch và cũng bị ảnh hưởng khá nhiều bởi quy trình vàphương pháp chế biến Gốc Sâm hay thân củ Sâm còn gọi là rễ chính là cơ quanđược sử dụng thường xuyên nhất, chứa nhiều phức hợp saponin Nhân sâm quantrọng nhất Chúng thường được phân chia thành hai nhóm: nhóm Rb1 (đặc trưngbởi protopanaxaDiol - PD gồm Rb1, Rb2, Rc và Rd) và nhóm Rg1(protopanaxaTriol PT : Rg1, Re, Rf, RG2)

Elyakov và cộng sự đã phân lập từ dịch chiết rễ Nhân sâm nhiều thànhphần có liên kết đường và đặt là “panaxoside”; panaxoside A và B được nhómtác giả báo cáo năm 1962 và các panaxoside C, D, E, F được công bố năm1964[27] Shibata và cộng sựcũng đã phân lập và mô tả các saponin từ Sâmtương tự và gọi là “ginsenoside” Năm 1962, Fujita và công sự đã nghiên cứu

dịch chiết cồn của rễ P ginseng, P japonicum và P quinquefolium, phân biệt

các saponin và thành phần aglycol và sapogenin của chúng bằng cách thủyphân với acid hydrochloric [28] Đến năm 1963, Shibata và cộng sự đã lậpcấu trúc sapogenin panaxadiol ở dạng dammarane-type tetracyclic triterpene[59]

Có nhiều nghiên cứu cho thấy sự biến động thành phần ginsenodide

theo vào tuổi, điều kiện canh tác, vùng trồng ở nhiều taxon Panax khác nhau

trên thế giới (Kenneth et al., 2004[38]; Deborah et al., 2005[21]), biến động

ginsenodide và các hoạt chất khác theo điều kiện nuôi cấy in vitrocũng như sự

đa dạng và khác biệt hóa học của các loài (Kim, 2012[39]; Komatsu et al.,2005[43]; Quan et al., 2001 [56])

Quá trình nghiên cứu, sự đa dạng các hoạt chất có bản chất Saponin

được phát hiện ở chi Panax được hệ thống hóa trong một công trình nghiên

cứu mang tính khái quát hóa của các nhà khoa học Hàn Quốc Theo đó, đếncuối năm 2012, có tối thiểu 289 loại saponin khác nhau được ghi nhận, phânloại thành 6 nhóm là protopanaxadiol, protopanaxatriol, octillol, oleanolicacid, nhóm biến động vị trí chuỗi C17 và một nhóm đa thành phần có cấu trúcsapogenin khác nhau (Yang et al., 2014) [71]

Có một số nghiên cứu sử dụng thành phần hoạt chất, chủ yếu là các

saponin để phân biệt các taxon thuộc chi Panax: Tsai và Feng (1975) khảo sát

thành phần hoạt chất trong các loài Sâm ở Trung Quốc[63] Thông qua đó, cáctác giả đã chỉ ra có 2 nhóm triterpenoid saponin chính tồn tại trong các loàiSâm khác nhau: Triterpenoid dammarane và Triterpenoid oleanane Theo

Osamu Tanaka thì chi Panax có đến 8 loài và 11 taxon dưới loài được phân

thành các nhóm dựa vào thành phần hoạt chất

1.2.Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền Sâm

Tại nhiều nước trên thế giới, việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong phân

loại chi Panax đã được triển khai và đạt được nhiều kết quả mang tính ứng

dụng cao

Shim và cộng sự (2003) tiến hành phân biệt P.ginseng (Hàn Quốc) với các taxon Panax khác gồm Nhân sâm SheoAn (Trung Quốc), P notoginseng (Trung Quốc), P japonicus (Nhật Bản) và hai loại Nhân sâm thuộc loài P quinquefolius từ Mỹ và Canada được thu thập từ 6 vùng khác nhau bằng kỹ

thuật RAPD [60] Kết quả phân tích với mồi 80 mồi ngẫu nhiên cho thấy mồiOP-13B có thể xem là marker RAPD duy nhất để phân biệt các taxon Nhânsâm được khảo sát Những kết quả này cho phép phân biệt Nhân sâm Hàn

quốc (P ginseng) với các taxon khác ở mức độ phân tử.

Năm 2007, Kim và cộng sự đã phát triển các chỉ thị Microsatellite mới

để nhận dạng P Ginseng [41] Nhóm nghiên cứu đã xây dựng một thư viện được làm giàu microsatellite của P ginseng và 251 trình tự microsatellite mới

được xác định Thông qua việc xác định kiểu gene của 91 microsatellite bằngcách sử dụng tập hợp các mồi đặc hiệu cho chỉ thị, nhóm tác giả đã xác định

11 chỉ thị đa hình trong loài cũng như 14 chỉ thị đa hình phân biệt P ginseng

và P quinquefolius Kết quả nghiên cứu này cho thấy các chỉ thị microsatellite rất hữu ích cho phân tích di truyền và việc xác định các loài thuộc chi Panax.

Dan và cộng sự (2010) đã thử nghiệm với 35 cặp mồi được thiết kế cho

35 microsatellite được chọn ở các mẫu P ginseng cho thấy 12 trong số chúng

là đa hình, 19 là đơn hình và 3 không có sản phẩm khuếch đại [20] Phân tích

thêm các chủng thuộc P quinquefolius từ Mỹ và Canada cho thấy các mồi có khả năng khuếch đại ở P ginseng cũng thể hiện kết quả ở P quinquefolius Từ

đó, nhóm tác giả đề xuất và có thể sử dụng các chỉ thị ISSR có được trong

việc phân biệt các chủng P ginseng và P quinquefolius, cũng như trong việc

lập bản đồ gene và đánh giá mức độ bảo thủ

Thuan và cộng sự (2010) cũng đã sử dụng kỹ thuật RFLP với các mồikhuếch đại các vùng rDNA 18S và ITS cũng như kỹ thuật Random Amplified

Microsatellite (RAMS) để xác định 4 loài P ginseng, P quinquefolius, P notoginseng và P vietnamensis[62].Kết quả cho thấy, vùng ITS được khuếch đại với sản phẩm có kích thước như trông đợi ở tất cả các mẫu ngoại trừ P ginseng mua tại Việt Nam.Dựa trên trình tự vùng ITS, tất cả các mẫu được xác định là thuộc chi Panax Tuy nhiên, kết quả có được không thể sử dụng để

phân biệt các loài dựa trên trình tự gene 18S rRNA Phân tích RFLP trên vùng

ITS cho thấy hai mẫu thuộc P notoginseng không giống nhau, các tác giả giải

thích là do khác nhau về nguồn gốc, điều kiện trồng Ngoài ra, dựa trên phân

tích RFLP vùng ITS, các tác giả cho rằng 2 loài P ginseng và P quinquefolius

có quan hệ phát sinh gần Phân tích RFLP vùng 18S rRNA cũng cho thấy các mẫu thuộc P ginseng mua ở Hàn Quốc là giống nhau hơn những mẫu cùng

loài này mua ở Việt Nam Kết quả phân tích RFLP dựa trên vùng 18S rRNA

có mức độ tương đồng cao hơn dựa trên vùng ITS

Gần đây, Lee và cộng sự (2011) đã phát triển một chỉ thị SCAR dẫn xuất từ

ISSR để nhận dạng các chủng giống Sâm P ginseng để xác định sự phân biệt các

chủng nông nghiệp có đặc tính tốt phục vụ cho chọn giống [45] Các tác giả đã

khảo sát 80 mồi ISSR trên 6 mẫu thuộc P ginseng và 2 mẫu Nhân sâm nước ngoài thuộc hai loài P quinquefolius và P notoginseng 34 trong số 85 mồi SSR

hình thành các locus đa hình với tần suất trung bình 6,9 locus/mồi Các mẫukiểm tra được nhận thấy có khác biệt rõ ràng bằng cách sử dụng các mồi này.Các mồi UBC-821, UBC-868 và UBC-878 làm nảy sinh các band đa hình giữa

các chủng P ginseng và cho phép phân biệt chúng với các mẫu P quinquefolius

và P notoginseng Thêm vào đó, đa hình đặc hiệu cho chủng

Nhân sâm Sunwon được hình thành bằng cách xử lý sản phẩm PCR bằng mồi

PgI821C650 với enzyme giới hạn Taq I Kết quả này là công cụ chỉ thị DNA

hữu ích để xác định Nhân sâm Hàn Quốc, đặc biệt là chủng Sunwon, quản lýhạt giống và các chương trình chọn giống được hỗ trợ bằng chỉ thị phân tử

1.3 Nghiên cứu bảo tồn và phát triển Sâm

Năm 1988, hội thảo quốc tế về bảo tồn thực vật hoang dại hữu ích được

tố chức ở Chiang Mai, Thái Lan đã đánh giá cao tầm quan trọng của thực vậthoang dại hữu ích trong chăm sóc sức khỏe ban đầu, giá trị kinh tế và tiềmnăng của cây cỏ đối với việc tìm ra các loại thực phẩm và thuốc mới Đồngthời báo động về việc mất tính đa dạng sinh vật cây cỏ và có thể ảnh hưởngđến việc tìm kiếm loài hoang dại hữu ích mới mang lại lợi ích toàn cầu Nhằmbảo tồn các nguồn đa dạng sinh vật cũng như tạo ra và duy trì mối quan hệhợp tác, bảo vệ quyền lợi của các quốc gia trong việc bảo tồn và phát triển cácnguồn lợi đa dạng sinh vật, đã có 2 công ước toàn cầu được ký kết là Côngước đa dạng sinh học (CBD) và Công ước về chống buôn bán các loài độngthực vật có nguy cơ bị tiêu diệt (CITES) Với công ước CBD, lần đầu tiên thếgiới đã chuyển các nguồn tài nguyên sinh học từ một di sản chung của nhânloại thành tài sản quốc gia Mặc dù vậy, hoạt động bảo tồn đa dạng sinh học(trong đó có thực vật hoang dại hữu ích) đang gặp phải mối thách thức kép là:(i) mối thách thức của bản thân việc bảo tồn đa dạng sinh học, (ii) bảo vệ trithức truyền thống về sử dụng các nguồn tài nguyên khỏi sự khai thác mangtính chất thương mại trong phạm vi quốc gia cũng như quốc tế, (iii) phát triểncác sản phẩm từ đa dạng sinh học và bản quyền tri thức cộng đồng

Shi-Lia Zhou và cộng sự (2005) khi nghiên cứu về sự mất tính đa dạng

di truyền của loài P notoginsen, trong đó có sự so sánh với loài P stipuleanatus đã đề nghị cần phải bảo tồn tại chỗ các quần thể mọc hoang dại của loài P stipuleanatus, cũng như dựa vào bảo tồn tại vườn trồng các giống

khác nhau của loài P notogingseng (dẫn theo Phạm Thanh Huyền, 2007) Việc nghiên cứu trồng bảo tồn và phát triển loài P stipuleanatus ở Trung

Quốc cũng mới chỉ dừng lại ở mức đề xuất Mà chưa có các nghiên cứu gâytrồng và phát triển cụ thể Đây cũng chính là một trong những tồn tại trongnghiên cứu nhân giống, gây trồng trên thế giới nhằm bảo tồn cũng như phát

triển nguồn gen loài P stipuleanatus.

Qua các nghiên cứu về phân loại, đặc điểm hình thái, phân bố, đặc điểmsinh thái, giá trị sử dụng cũng như khả năng nhân giống, gây trồng và bảo tồnloài Sâm trên thế giới còn rất nhiền vấn đề tồn tại cần giải quyết Đặc biệt,việc nghiên cứu kỹ thuật nhân giống, gây trồng để bảo tồn và phát triển cácloài Sâm vẫn còn là một khoảng trống Phần lớn các nghiên cứu mới chỉ dừnglại ở việc mô tả và phân loại, cũng như đánh giá đa dạng di truyền giữa các

loài trong chi Panax mà chưa có những nghiên cứu thực sự đi sâu vào vấn đề

kỹ thuật nhân giống, kỹ thuật lâm sinh trong việc gây trồng phát triển và bảotồn loài này

1.4 Tổng quan phương pháp nghiên cứu về phân loại thực vật

1.4.1 Các phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái

Các đặc điểm hình thái trong phân loại sinh vật được sử dụng từ rấtsớm Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là hai đơn vị phân loại (taxon)càng có nhiều đặc điểm chung, càng giống nhau thì quan hệ giữa hai taxoncàng gần gũi với nhau Bất cứ sự khác nhau nào giữa hai cá thể đều đượcnghiên cứu, nhưng không phải bất cứ đặc điểm nào cũng có thể dùng làm đặcđiểm phân loại Những đặc điểm phân loại ổn định, biến đổi chậm, liên quanđến những cấu trúc ít biến đổi của cơ thể sinh vật thường được sử dụng đểphân biệt và xác định các taxon bậc cao, những biến đổi nhanh hoặc liên quanđến cơ chế cách ly sinh sản có tác dụng xác định các taxon bậc thấp Người tathường kết hợp nhiều đặc điểm để làm tăng giá trị tin cậy của kết quả so sánh

Mặc dù phương pháp sử dụng các chỉ tiêu hình thái có ưu điểm là tiệnlợi, nhanh chóng, kinh tế, có thể so sánh các đặc điểm giữa các loài hoá thạchvới các loài đang sống để tìm kiếm mối quan hệ họ hàng giữa chúng Nhưngviệc lựa chọn và cân nhắc giá trị sử dụng của các đặc điểm phân loại là mộttrong những khâu khó nhất, không chỉ đòi hỏi kiến thức mà còn đòi hỏi kinhnghiệm và sự khéo léo của các nhà phân loại học Bên cạnh đó, phương phápnày nhiều khi không chính xác vì có hiện tượng đồng quy tính trạng và khôngphân biệt được các loài đồng hình.Mặt khác bởi hình thái chính là kết quả củabiểu hiện gene trong một điều kiện ngoại cảnh nhất định nên việc hoàn toàndựa vào hình thái đôi khi dẫn đến các kết quả không xác thực, nhất là đối vớicác taxon thực vật có mức độ thường biến cao Các marker hình thái có nhiềuđiểm hạn chế như: các biến đổi hình thái không phát hiện được ở một số loài;các nghiên cứu sử dụng đặc điểm hình thái nói chung thường giới hạn trongmột hay một vài locus; nhiều đặc điểm hình thái chỉ có thể quan sát được vàocuối chu kỳ sống; nhiều đặc tính hình thái không riêng biệt mà mang tính liêntục và chồng lấp giữa các loài gây trở ngại cho việc phân tích chính xác sự đadạng di truyền của quần thể.

1.4.2 Các phương pháp dựa trên chỉ thị phân tử

1.4.2.1 Các Marker phân tử dựa trên DNA

Các marker phân tử được sử dụng để đánh giá đa hình DNA được phânthành hai loại: marker dựa trên cơ sở lai phân tử và marker dựa trên cơ sở phảnứng chuỗi polymer hóa (PCR) Về mặt định dạng, đặc tính DNA có thể nhận rathông qua việc lai các đoạn DNA được cắt giới hạn bằng enzymes phân giải vớicác DNA thăm dò (probe) được đánh dấu vốn là các đoạn DNA có nguồn gốc

hoặc trình tự đã biết Marker trên cơ sở PCR bao gồm việc khuếch đại in vitro những trình tự DNA hay locus đặc trưng bằng cách sử dụng những trình

tự olygonucleotide trong vai trò là các mồi đặc hiệu hay ngẫu nhiên và mộtenzyme DNA polymerase bền nhiệt Các đoạn được khuếch đại được tách ratrên điện di và tạo các đặc trưng hình thành băng, các đặc trưng này vốn đượcphát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như nhuộm hay ghi phóng xạ tựđộng Những marker phân tử thường được sử dụng bao gồm:

Đa hình chiều dài các đoạn giới hạn [Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)]

RFLP là một kỹ thuật áp dụng để phân biệt các sinh vật với nhau bằngcách phân tích các kiểu dẫn xuất hình thành từ việc cắt nhỏ DNA củachúng.RFLP có thể ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng và phát sinh loài trêndải đối tượng từ các cá thể đến quần thể, từ trong loài đến các loài có quan hệ

họ hàng gần.RFLP được sử dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu lập bản đồgene bởi tính phong phú cao của chúng trên bộ gene, khả năng ứng dụng rộngcủa các enzymes cắt giới hạn khác nhau và sự phân bố ngẫu nhiên suốt bộgene của các RFLP (Neale & Williams 1991)[51].RFLP cũng được sử dụngtrong nghiên cứu khảo sát mối quan hệ giữa các bậc phân loại gần, hoặc sửdụng như một công cụ làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA (DNAfingerprinting), trong nghiên cứu về đa dạng di truyền lai, chuyển gene quantâm vào sinh vật và bao gồm cả những nghiên cứu về dòng gene hay phân bốgene giữa các cây trồng Các marker RFLP cũng được sử dụng lần đầu trongviệc xây dựng bản đồ di truyền bởi Botstein và cộng sự năm 1980, từ đó một

bộ các marker RFLP phát hiện được đã tạo nhiều cơ hội cho việc phát triểnmột bản đồ chi tiết ở rau diếp (Landry et al., 1987)[44]

DNA Đa hình khuếch đại ngẫu nhiên [Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)]

RAPD là một kỹ thuật dựa trên cơ sở PCR Phương pháp được dựa trên

cơ sở sự khuếch đại các đoạn DNA mục tiêu hay ngẫu nhiên dưới tác động

của enzyme với các mồi tùy chọn, kỹ thuật này được Welsh và McClellandphát triển năm 1991 Trong phản ứng RAPD, một chủng loại mồi đơn sẽ gắnvào DNA bộ gene ở hai vị trí khác nhau trên hai mạch bổ sung của DNAkhuôn mẫu Trung bình, mỗi mồi sẽ dẫn đến việc khuếch đại một vài locusriêng rẽ trên bộ gene, đó là cơ sở cho sự hữu dụng của RAPD cho việc sànglọc một cách hiệu quả các đa hình trình tự nucleotide giữa các cá thể Tuynhiên, vì tính ngẫu nhiên một cách tự nhiên trong việc khuếch đại DNA vớicác mồi có trình tự ngẫu nhiên, điều quan trọng là phải tối ưu hóa và duy trìđiều kiện phản ứng cho việc nhân mạch đôi DNA.

RAPD đã được sử dụng với nhiều mục đích, từ nghiên cứu ở mức độ cáthể (như xác định đa dạng di truyền) đến nghiên cứu liên quan đến những loài

họ hàng gần nhau.RAPD cũng đã và đang được ứng dụng vào việc nghiên cứulập bản đồ gene để lấp đầy những lỗ hổng mà các markers khác chưa thựchiện được (Hadrys et al., 1992)[30]

Vi vệ tinh hay Trình tự lặp đơn giản [Microsatellites or Simple sequence Repeat (SSR)]

Microsatellite đặc biệtthích hợp để phân biệt các kiểu gene có quan hệ

họ hàng gần; bởi mức độ biến động cao của chúng, vì thế chúng được ưa thíchkhi sử dụng trong các nghiên cứu về quần thể và cho việc nhận dạng cácchủng giống nông nghiệp có quan hệ gần Microsatellite thể hiện một tính đahình cao nên chúng là những marker có thể được sử dụng trong nhiều nghiêncứu về di truyền quần thể cũng như các nghiên cứu quan hệ phát sinh từ mức

độ cá thể (như nhân dòng vô tính và xác định các dòng) đến mức độ nhữngloài có quan hệ họ hàng gần Ngược lại, tỷ lệ đột biến cao của chúng làm chochúng không thích hợp trong nghiên cứu phân biệt các taxon có quan hệ phátsinh xa nhau.Microsatellite được xem là các marker lý tưởng trong nghiên cứulập bản đồ gene (Jarne & Lagoda 1996)[34].Marker SSR đã được chứng

minh tính hữu dụng cho việc đánh giá biến động di truyền trong chọn lọc cácsinh vật (Mohammadi & Prasanna 2003)[49].

1.4.2.2 Sử dụng các trình tự DNA bảo tồn cao trong phân tích quan hệ phát sinh ở thực vật

Hệ thống hóa là quá trình thăm dò, mô tả và giải thích tính đa dạng củathế giới sinh vật Vào năm 1758, Linnaeus đã xây dựng hệ thống phân loạimang tính thứ tự trước khi phát triển học thuyết tiến hóa Sự xuất hiện và pháttriển của các kỹ thuật phân tử mà đặc biệt là phản ứng chuỗi polymer hóa -PCR (Mullis và Faloona, 1987) đã hình thành nên một lượng lớn các dữ liệusẵn sàng cho việc giải trình tự DNA và các kỹ thuật làm nảy sinh đặc trưngnhận dạng DNA [50] Nhiều dạng đặc điểm mang tính thông tin, đặc biệt làcác trình tự DNA đã được ứng dụng trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh

và quá trình tiến hóa ở thực vật Các thực vật bậc cao mang trong nó ba bộgene: bộ gene trong nhân, bộ gene ty thể và bộ gene lạp thể

bộ gene lục lạp tiến hóa nhanh hơn những vùng mã hóa Các đột biến ở DNAlục lạp thường là các thay thế nucleotide hay sự sắp xếp lại Các đột biến tăngđoạn hay mất đoạn tích lũy trong vùng không mang mã xảy ra với tỷ lệ ngangvới sự thay thế nucleotide và chính kiểu đột biến này làm tăng cường tính đadạng của các vùng không mang mã Phần lớn các gene lục lạp là loại gene

đơn bản trong khi các gene trong nhân là thành viên của những họ đa gene.Tính bảo tồn cao của DNA lục lạp thực sự là ưu thế khi sử dụng nó để xâydựng lại mối quan hệ phát sinh và quá trình tiến hóa ở các mức độ từ loài đếnchi và đến họ thực vật.Có thể thấy những gene mã hóa và không mã hóa ở lụclạp thường được sử dụng trong nghiên cứu quan hệ phát sinh như sau:

Các trình tự bảo thủ ở bộ gene trong nhân

Bộ gene trong nhân có kích thước lớn nhất trong số ba bộ gene ở thựcvật (1.1 × 106 đến 110 × 106 kbp) và bao gồm rất nhiều gene Phần lớn các nỗlực nghiên cứu về quan hệ phát sinh bằng chỉ thị phân tử sử dụng các trình tựDNA ribosome trong nhân Cấu trúc căn bản của DNA ribosome là một đơn vịlặp đơn, mỗi đơn vị như thế có thể lặp lại đến hàng ngàn lần trong bộ gene

Bộ gene trong nhân chứa một vùng sao mã có cấu trúc bao gồm khoảng trốngbên ngoài vùng sao mã, tiếp theo là gene 18S mã hóa cho tiểu đơn vị nhỏ vàgene 26S mã hóa cho tiểu đơn vị lớn vốn phân cách nhau bởi một gene nhỏhơn là 5,8S Các khoảng trống trong vùng phiên mã (ITS1 và ITS2) tách rờinhững gene vừa đề cập Chiều dài của ba vùng mang mã là giống nhau ở cácthực vật: gene 18S là khoảng 1800bp, 26S là khoảng 3300bp và gene 5,8S làkhoảng 160bp Ngược lại, chiều dài của các khoảng trống giữa các gene biếnđộng từ 1 đến 8kb Họ gene rDNA chứa các vùng bảo tồn cao như 18S, 26S

có thể sử dụng để suy luận các quan hệ phát sinh ở các mức độ phân loạicao.Các đoạn tiến hóa nhanh như các vùng ITS có thể là thích hợp nhất trong

so sánh các loài và những chi gần nhau, thậm chí là so ở mức độ các quần thể

Các trình tự 18S rDNA thường được sử dụng rộng rãi hơn các trình tự26S.Cho dù cả hai vùng cùng được có dải ứng dụng rộng như nhau nhưngkích thước trên 3000bp của 26S rDNA đã cản trở các nhà nghiên cứu, đặc biệt

là trong việc giải trình tự toàn bộ gene.Trái lại, kích thước của 18S rDNAkhoảng 1800bp giúp cho nó được ưu tiên lựa chọn hơn để khuếch đại bằng

PCR và giải trình tự.Thực tế cho thấy hình thể cây quan hệ phát sinh sử dụngtrình tự 18S rDNA khá đồng dạng với cây quan hệ phát sinh sử dụng trình tự

rbcL ở nhiều mức độ phân loại ở thực vật hạt kín.Cho dù rất có tiềm năng

trong việc xây dựng cây quan hệ phát sinh ở thực vật, vùng 18S rDNA vẫnchưa được tận dụng trong hệ thống học thực vật hạt kín

Gene 26S rDNA thường được lưu ý là ứng viên cho việc thay thế gene18S rDNA Khi so sánh có thể nhận thấy toàn bộ gene 26S rDNA tiến hóanhanh gấp từ 1,6 đến 2,2 lần và cung cấp các đặc điểm mang tính thông tinnhiều hơn 3 lần so với 18S rDNA

Gene 5,8S rDNA dễ dàng được khuếch đại và giải trình tự khi sử dụngcác mồi định vị trên các gene 18S và 26S rDNA Gene 5,8S rDNA hiếm khiđược sử dụng để suy luận quan hệ phát sinh bởi tính bảo thủ cao và kíchthước bé (164-165bp) Tỷ lệ các vị trí mang thông tin tiềm năng cho phân tíchquan hệ phát sinh ở thực vật có hạt cũng tương đương với gene 18S rDNA

Vùng ITS: ITS1 phân cách gene 18S rDNA với gene 5,8S rDNA cònITS 2 phân cách gene 5,8S rDNA với gene 26S rDNA Vùng ITS hiện hữumột cách rộng rãi dưới 700bp ở các thực vật có hoa (Baldwin et al., 1995)[15].Vùng ITS chứa các trình tự bảo tồn cao nên rất nhiều mồi tổng thể đượcthiết kế cho việc khuếch đại và giải trình tự đã được mô tả.Các trình tự ITS1

và ITS2 vốn giàu GC làm cho việc giải trình tự trở nên khó khăn Khó khăntrong việc giải trình tự biến động theo các nhóm thực vật và việc cho thêmDMSO vào PCR hay phản ứng giải trình tự là việc bổ sung mang lại hiệu quảcao Việc căn trình tự ITS từ nhiều họ thực vật hạt kín chỉ ra rằng các trình tựITS1 và ITS2 đa dạng hơn trình tự của các gene rDNA Các trình tự ITS biếnđộng một cách hiệu quả cho phép giải quyết những câu hỏi về quan hệ phátsinh ở những taxon có quan hệ họ hàng gần Theo đó, rất nhiều các bài báothể hiện sự thành công trong việc xây dựng lại lịch sử tiến hóa sử

dụng các trình tự ITS(Bellarosa et al., 2005) [16] Hơn nữa, vùng ITS được ditruyền theo kiểu từ cả cha và mẹ khiến cho nó cũng có thể được sử dụng đểthăm dò sự lai chéo.

Hình 1.1: Sơ đồ vùng ITS của các gen rDNA vùng nhân và vị trí của các

mồi ITS(Embong et al., 2008) [25]

Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu là 25 mẫu Sâm được thu thậpở các

xã Pa Vệ Sử, Thu Lũm và Ka Lăng của huyện Mường Tè; Sìn Hồ; TamĐường và Phong Thổ tỉnh Lai Châu

Thời gian thu mẫu: từ tháng 5/2017 đến tháng 6/2017

Bảng 2.1 Danh sách 25 mẫuSâm.

1 AS02 Sâm Lai Châu Pa Vệ Sử - Mường Tè

7 PX13 Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè

8 PX14 Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè

9 PX15 Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè

10 MX5 Sâm Lai Châu Pa Vệ Sử - Mường Tè

11 MX4 Sâm Lai Châu Pa Vệ Sử - Mường Tè

12 MX1 Sâm lai châu Pa Vệ Sử - Mường Tè

13 PT3 Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè

14 PKL1 Sâm lai châu Ka Lăng - Mường Tè

15 PT10 Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè

16 PT19 Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè

17 PTPX3 Sâm Lai Châu tím Pa Vệ Sử - Mường Tè

18 PTPX2 Sâm Lai Châu tím Pa Vệ Sử - Mường Tè