Biểu hiện gen mã hóa nhân tố phiên mã dehydration responsive element binding của đậu tương (GmDREB) để tăng khả năng chịu hạn ở cây chuyển gen

TÀI TRỢĐề tài nghiên cứu trong luận văn thạc sĩ này được tài trợ bởi Quỹ Phát triểnkhoa học và công nghệ Quốc gia NAFOSTED trong đề tài mã số 106.01- 2018.27" với tên đề tài là: “Biểu hi

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐỖ THANH KIM HƯỜNG

TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN

GEN GmDREB7 PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐỖ THANH KIM HƯỜNG

TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN

GEN GmDREB7 PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG

Ngành: Di truyền học

Mã số: 8 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn là kết quả nghiên cứucủa tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của GS.TS Chu Hoàng Mậu Các số liệu,kết quả sử dụng trong luận văn là trung thực và được sự đồng ý của cán bộhướng dẫn và nhóm nghiên cứu

Tác giả luận văn

Đỗ Thanh Kim Hường

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đãtrực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiệnnghiên cứu và hoàn thành bản luận văn thạc sĩ này

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn - Viện Công nghệ Sinhhọc, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và TS Nguyễn Thị HảiYến - Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học TháiNguyên đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi tiến hành các thinghiệm trong đề tài luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của thầy cô và cán bộ Bộ mônSinh học hiện đại & Giáo dục Sinh học; cảm ơn các thầy cô Khoa Sinh học,Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo mọi điềukiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã độngviên, chia sẻ và giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành bài luận văn này

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2019

Tác giả luận văn

Đỗ Thanh Kim Hường

TÀI TRỢ

Đề tài nghiên cứu trong luận văn thạc sĩ này được tài trợ bởi Quỹ Phát triểnkhoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106.01-

2018.27" với tên đề tài là: “Biểu hiện gen mã hóa nhân tố phiên mã dehydration

responsive element binding của đậu tương (GmDREB) để tăng khả năng chịu hạn ở cây chuyển gen” do GS.TS Chu Hoàng Mậu làm chủ nhiệm.

Tác giả luận văn

Đỗ Thanh Kim Hường

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN……… i

LỜI CẢM ƠN……… ii

TÀI TRỢ……… iii

MỤC LỤC……… iv

DANH MỤC CÁC BẢNG……… v

DANH MỤC CÁC HÌNH……… vi

DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT……… vii

MỞ ĐẦU……… 1

1 Đặt vấn đề……… 1

2 Mục tiêu nghiên cứu……… 2

3 Nội dung nghiên cứu……… 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài……… 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 4

1.1 Đặc tinh chống chịu của thực vật……… 4

1.1.1 Tác động của các nhân tố phi sinh học đến thực vật………… 4

1.1.2 Cơ chế phân tử của đặc tinh chống chịu các yếu tố bất lợi của thực vật……… 5

1.2 Họ nhân tố phiên mã AP2……… 6

1.2.1 Cây đậu tương………

1.2.2 Nhân tố phiên mã DREB ở cây đậu tương………

1.3 Vector biểu hiện gen thực vật và đánh giá hoạt động của vector chuyển gen trên cây thuốc lá mô hình………

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…. 2.1 Vật liệu nghiên cứu………

2.1.1 Vật liệu thực vật………

2.1.2 Các loại vector và chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu………

2.2 Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu………

2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu………

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu………

2.3 Phương pháp nghiên cứu………

2.3.1 Nhóm phương pháp phân lập và xác định trình tự nucleotide của gen GmDREB7………

2.3.1.1 Tách chiết RNA tổng số và nhân bản gen GmDREB7 từ cDNA……… ………

2.3.1.2 Tách dòng gen GmDREB7………

2.3.1.3 Xác định trình tự nucleotide………

2.3.2 Nhóm phương pháp thiết kế gen GmDREB7, vector chuyển gen và tạo dòng vi khuẩn A tumefaciens CV58 mang vector chuyển gen chứa gen GmDREB7………

6 8

12 16 16 16

16 16 16 17 17

18

18 19 21

2.3.3 Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua A tumefaciens

2.3.4 Nhóm phương pháp phân tich, xử lý số liệu………

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN……

3.1 Đặc điểm của gen GmDREB7 phân lập từ giống đậu tương

DT2008…

3.1.1 Kết quả nhân bản, tách dòng và giải trình tự gen

GmDREB7

21222425

25

253.1.2 Mối quan hệ di truyền giữa giống đậu tương DT2008 và các

mẫu đậu tương mang mã số BT092314, BT089389,

NM001249580, NM001248527, AY244760 trên GenBank………

3.2 Thiết kế gen và vector chuyển gen thực vật mang gen

GmDREB7………

3.2.1 Thiết kế gen GmDREB7 nhân tạo………

3.2.2 Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen

GmDREB7

3.3 Chuyển gen và phân tich sự biểu hiện của gen GmDREB7 trên

cây thuốc lá………

3.3.1 Kết quả chuyển cấu trúc mang gen GmDREB7 vào cây thuốc

lá thông qua A tumefaciens………

3.3.2 Phân tich sự có mặt và sự biểu hiện ở mức phiên mã của gen

31

3333

34

36

36

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

1 Kết luận 41

2 Đề nghị 41

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Trình tự nucleotide của các cặp mồi PCR………

Bảng 2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn………

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng gắn gen GmDREB7 vào vector tách

dòng pBT………

Bảng 2.4 Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá………

Bảng 3.1 Các vị tri sai khác trong trình tự nucleotide của gen

GmDREB7 giữa giống đậu tương DT2008 và trình tự nucleotide

mang mã số BT092314 trên GenBank………

Bảng 3.2 Các vị tri sai khác trong trình tự amino acid suy diễn từ

gen GmDREB7 giữa giống đậu tương DT2008 và trình tự nucleotide

mang mã số BT092314 trên GenBank………

Bảng 3.3 Kết quả biến nạp cấu trúc pBI121_GmDREB7 vào cây

thuốc lá giống K326……… ……

1920

2024

28

30

38

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121………

Hình 2.1 Sơ đồ thi nghiệm tổng quát……….

Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pBI121_GmDREB7……

Hình 3.1 Sơ đồ thiết kế cặp mồi DREB7-F/DREB7-R

Hình 3.2 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại đoạn gen

GmDREB7 từ cDNA của giống đậu tương DT2008………

Hình 3.3 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR từ 4 dòng

khuẩn lạc………

Hình 3.4 Kết quả phân tich bằng BLAST trong NCBI………

Hình 3.5 Sự sai khác về trình tự nucleotide của đoạn mã hóa nhân tố

phiên mã GmDREB7 phân lập từ giống đậu tương DT2008 so với

trình tự mang mã số BT092314 trên GenBank………

26

2727

29

Hình 3.6 Trình tự amino acid suy diễn từ gen GmDREB7 của giống

đậu tương DT2008 so với trình tự amino acid suy diễn từ trình tự

nucleotide mang mã số BT092314 trên GenBank………

Hình 3.7 Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự nucleotide của

đoạn mã hóa DREB phân lập từ giống đậu tương DT2008 và các

trình tự mang mã số BT092314, BT089389, NM 001249580, NM

001248527, AY244760 trên GenBank………

Hình 3.8 Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự amino acid suy

diễn của protein DREB từ giống đậu tương DT2008 và từ các trình

tự mang mã số BT092314, BT089389, NM 001249580, NM

001248527, AY244760 trên GenBank………… …

Hình 3.9 Trình tự đoạn gen GmDREB7 nhân tạo……… ………

Hình 3.10 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt gen GmDREB7

trong vector pUC18 và sản phẩm cắt vector pBI121 bằng cặp

enzyme SacI và XbaI………

Hình 3.11 Sơ đồ cấu trúc vector pBI121_GmDREB7 sử dụng cho

chuyển gen vào thuốc lá nhờ A tumefaciens……….

Hình 3.12 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR từ

khuẩn lạc A tumefaciens chủng CV58………

31

32

3334

35

35

36

Hình 3.13 Hình mô tả quá trình biến nạp gen GmDREB7 và tái sinh

tạo cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật lây nhiễm A.

tumefaciens

Hình 3.14 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản gen

GmDREB7 trong các cây thuốc lá chuyển gen

Hình 3.15 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR trong các cây

thuốc lá chuyển gen

37

39

40

Polymerase Chain ReactionMôi trường ra rễ

Ribonucleic Acid

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là một trong những cây trồng

chiếm vị tri quan trọng trong các cây nông nghiệp và trong đời sống của conngười Đậu tương được xem là cây trồng khá nhạy cảm với các tác động củamôi trường Trong những năm gần đây, biến đổi khi hậu và sự nóng lên củatrái đất đã ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây đậutương Stress phi sinh học gây ảnh hưởng nghiêm trọng, đặc biệt là hạn và cóthể làm giảm năng suất đậu tương khoảng 40%

Tinh chống chịu các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh của thực vật nói chung

và của đậu tương nói riêng do nhiều gen quy định, sản phẩm của các gen nàyliên quan trực tiếp đến sự biểu hiện khả năng chống chịu hoặc có chức năng

điều hòa nhóm gen chống chịu Trình tự cis và nhân tố trans giữ vai trò quan

trọng trong sự biểu hiện gen đáp ứng với tác động của các stress phi sinh học

Nhân tố trans - protein DREB có thể liên kết với trình tự cis để kich hoạt biểu

hiện gen khi có tin hiệu stress ở thực vật

Protein DREB là một phân họ của họ nhân tố phiên mã AP2/ERF, có chứcnăng điều khiển sự biểu hiện của một số gen cảm ứng với hạn hán, nhiễm mặn

và nhiệt độ thấp, tạo ra tinh chống chịu các stress của ngoại cảnh ở nhiều loài

thực vật Thuộc tinh chủ yếu của gen DREB là vùng bảo thủ AP2 liên kết với các nhân tố phản ứng với các stress Nhiều gen DREB đã được phân lập từ các loài thực vật khác nhau, như cây Arabidopsis, lúa (Oryza sativa L.), ngô (Zea mays L.), lúa mì (Triticum aestivum) và nhiều cây trồng khác Ở cây đậu tương, hai gen GmDREB6, GmDREB7 đã được xác định tồn tại trong hệ gen cây đậu tương,

tuy nhiên đặc điểm về cấu trúc gen cũng như hoạt động của các gen này

như thế nào và sản phẩm protein của chúng có liên quan trực tiếp đến nhómchống chịu nào hay không đang là vấn đề cần tìm lời giải đáp.

Cách tiếp cận kỹ thuật chuyển gen trong nghiên cứu chức năng của genđang được ứng dụng ngày càng rộng rãi và nhiều gen mới trong hệ gen của câyđậu tương đã được giải mã chức năng Xuất phát từ những cơ sở trên chúng tôi

đã chọn và tiến hành đề tài: “Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen

GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương” để phục vụ chuyển gen với mục đich

đánh giá hoạt động và chức năng sinh học của gen GmDREB7 ở cây đậu tương.

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Phân tich được đặc điểm của gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương 2.2 Thiết kế được vector biểu hiện thực vật mang gen GmDREB7 của cây đậu

tương

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Nghiên cứu thông tin, thiết kế cặp mồi PCR, nhân gen, tách dòng và xác

định trình tự gen GmDREB7 từ cây đậu tương.

3.2 Nghiên cứu thiết kế gen và vector biểu hiện mang gen GmDREB7.

3.3 Chuyển cấu trúc mang gen GmDREB7 vào cây thuốc lá.

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1 Về mặt khoa học

Nghiên cứu góp phần làm rõ đặc điểm cấu trúc của gen GmDREB7 phân

lập từ cây đậu tương (giống DT2008) Những kết quả về tạo cây chuyển genthêm một lần nữa khẳng định cơ sở khoa học của việc ứng dụng kỹ thuậtchuyển gen trong cải thiện tinh chống chịu các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnhcủa cây trồng

4.2 Về mặt thực tiễn

Trình tự gen GmDREB7 phân lập được và các cây thuốc lá chuyển gen

được tạo ra có khả năng chống chịu tốt hơn so với cây đối chứng Qua đó, gópphần làm tiền đề cho việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khảnăng chống chịu của cây trồng nói chung cũng như trong thực tiễn chọn giốngcây trồng ở Việt Nam nói riêng

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc tính chống chịu của thực vật

1.1.1 Tác động của các nhân tố phi sinh học đến thực vật

Trong những thập kỷ gần đây, stress phi sinh học đã trở thành mối quan tâmchinh trong sản xuất nông nghiệp Sự tăng trưởng và phát triển của thực vật trongcác điều kiện stress có thể ảnh hưởng đến vụ mùa Thực vật có đặc điểm trạngthái sống đặc thù – bám trụ vào đất tại một chỗ, không di chuyển trong suốt quátrình phát triển cá thể Vì vậy, chúng thường xuyên đối mặt với điều kiện ngoạicảnh ngày càng nhiều tác động bất lợi lên quá trình sinh trưởng phát triển, gây ranhững biến đổi và đặc biệt ảnh hưởng đến năng suất cây trồng

[2] Ngày nay, do có sự biến đổi khi hậu toàn cầu nên môi trường ngày càng

bị tác động nặng nề hơn

Các tác nhân gây stress sẽ tạo nên những khả năng thich ứng đặc trưngcủa thực vật Do đó, việc tìm hiểu cơ chế tác động của các tác nhân gây stresscũng như những phản ứng thich nghi của cây trồng có vai trò quan trọng trongtrồng trọt Một số tác nhân gây stress có thể tác động riêng rẽ nhưng cũng cónhiều stress có thể phối hợp với nhau tác động lên cơ thể thực vật Vi dụstress thiếu nước thường liên kết với stress nhiễm mặn ở vùng rễ và stressnhiệt độ cao ở lá Một số yếu tố môi trường từ tác nhân bình thường chuyểnsang tác nhân stress chỉ trong vài phút (vi dụ nhiệt độ), có những yếu tố môitrường phải mất nhiều ngày hay nhiều tháng mới trở nên tác nhân stress (nướctrong đất, chất khoáng ) [2]

Đối với cây trồng, nhiệt độ tối ưu để phát triển bình thường là 23 - 28°C.Nếu nhiệt độ trên 30°C thậm chi đến 35°C sẽ ảnh hưởng lớn đến cây Trường

hợp tương tự xảy ra nếu nhiệt độ xuống dưới 15°C, năng suất cây trồng sẽgiảm đáng kể Một yếu tố khác đóng vai trò vô cùng quan trọng, đó là nước.Nước là nguyên liệu khởi đầu, sản phẩm trung gian và cũng là sản phẩm cuốicùng trong mọi quá trình trao đổi chất của tế bào Mọi quá trình phản ứngtrong cơ thể đều được thực hiện trong môi trường nước Do đó, thiếu hay thừanước đều ảnh hưởng xấu đến cây trồng Nhiều nghiên cứu trên thế giới đãthống kê được thiệt hại hàng năm do hạn hán gây ra là rất lớn, có thể làm mấtmùa, giảm đến trên 60% sản lượng [2].

1.1.2 Cơ chế phân tử của đặc tính chống chịu các yếu tố bất lợi của thực vật

Stress hạn, mặn và sốc nhiệt tác động xấu đến sự sinh trưởng, phát triển

và năng suất của nhóm cây trồng cạn Trong các điều kiện stress, thực vật vẫn

có những cơ chế để thich nghi đối với sự thay đổi cường độ khác nhau củastress, tuy nhiên những cơ chế này vẫn chưa đủ để giúp thực vật chống chịu.Thực vật có nhiều cơ chế phản ứng khác nhau với các stress thông quacác con đường truyền tin và phản ứng tế bào, từ việc thay đổi biểu hiện gen,trao đổi chất trong tế bào cho đến những thay đổi lớn liên quan đến mức độsinh trưởng và năng suất cây trồng Khi gặp các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh,những biến đổi trong quá trình phát triển và trao đổi chất sẽ làm thay đổi sựbiểu hiện của gen Điều này bắt đầu từ việc nhận biết tin hiệu ở mức độ tếbào, lan truyền tin hiệu trong tế bào, sau đó lan truyền khắp cơ thể

Để chống chịu với stress, các phản ứng sinh hóa được kich hoạt trongcây trồng để tich lũy nhiều các loại chất dễ hòa tan như: đường, amino acid,glycine betaine và polyamine để giúp các cây trồng đối phó với stress [15] vàgiúp cây phục hồi sau một thời gian nhất định chịu tác động từ điều kiện môitrường [14]

Sự biểu hiện của các gen cảm ứng với stress có liên quan chặt chẽ vớiquá trình phiên mã Vì vậy, sự biểu hiện của các gen này chịu ảnh hưởng của

cả môi trường trong và ngoài cơ thể, với nhiều mức độ điều hòa Các nhân tốphiên mã (Transcription factors - TFs) đóng vai trò điều khiển những thay đổitrong biểu hiện gen và phản ứng với các stress từ môi trường ngoại cảnh Hiệnnay, các protein DREB là nhóm TF được nghiên cứu thành công nhất, bởi nókich hoạt sự biểu hiện của nhiều gen mục tiêu chịu trách nhiệm kiểm soát cácyếu tố liên quan trong điều kiện phi sinh học [40]

1.2 Họ nhân tố phiên mã AP2

Họ AP2 là một nhóm lớn các nhân tố phiên mã ở thực vật, bao gồm bốnphân họ lớn: AP2, RAV, ERF và DREB [32] Phân họ protein DREB đặctrưng bởi miền bảo thủ AP2 chứa các vị tri liên kết với mạch DNA ở vùng

promoter Nhiều gen trong phân họ DREB đã được phân lập từ các loài thực vật, như cây Arabidopsis, lúa (Oryza sativa L.), ngô (Zea mays L.), lúa mì (Triticum aestivum) Tuy nhiên các công bố về chức năng của một số gen DREB chủ yếu ở cây Arabidopsis.

Gen mã hóa nhân tố phiên mã chứa miền AP2 liên quan đến nhiều quátrình sinh học của thực vật bao gồm sự tăng trưởng, truyền tin hiệu, phản ứngvới mầm bệnh và ứng phó với các stress phi sinh học như hạn hán, muối, Miền AP2 có khoảng 58 hoặc 59 amino acid, trong đó có một số amino acidliên kết với nhân tố đáp ứng sự mất nước (DRE) hoặc hộp GCC [25], [35]

1.2.1 Cây đậu tương

Đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill thuộc họ Đậu

(Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilinoideae), có bộ NST 2n = 40 Đậutương là một loại cây trồng cận nhiệt đới có nguồn gốc từ Đông Nam Á

Đậu tương là loại lương thực chinh ở các nước châu Á đã từ lâu và đã được

sử dụng làm loài thực vật mẫu cho các nghiên cứu về sinh lý thực vật, hóa sinh

và sinh học phân tử Các phân tich sinh hóa cho thấy hạt đậu tương chứa từ 38 40% protein, 12-25% lipid, các muối khoáng, các vitamin A, B1, B2,

-và nhiều axit amin thiết yếu (cystein, tryptophan, methionine, lysine, ) [39].Bên cạnh giá trị về kinh tế và dinh dưỡng cao, cây đậu tương còn giữ vai tròquan trọng trong việc cải thiện đồ phì và sử dụng bền vững tài nguyên đấtcanh tác [32]

Đậu tương thuộc loại cây Hai lá mầm, thân thảo, là cây trồng cạn thu hạt,bao gồm các bộ phận: Rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt Rễ đậu tương là rễ cọc,

gồm rễ cái và các rễ bên, trên rễ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm từ nito của không khi [1] Nhiều nghiên

cứu cho thấy, những giống đậu tương có khả năng cộng sinh và có đủ nốt sầnthường làm cho hàm lượng protein cao, cho nên trồng cây đậu tương có tácdụng cải tạo đất Trên thân có nhiều lông nhỏ, it phân cành, có từ 8 - 14 đốt,các cành và lá mọc ra từ các đốt trên thân Đậu tương có 3 loại lá chinh: Lámầm, cặp lá đơn, lá kép có 3 lá chét, đôi khi 4 - 5 lá chét Đậu tương thuộcloại cây tự thụ phấn, hoa lưỡng tinh, mọc thành chùm, mỗi chùm thường có 3

- 5 hoa có màu tim, tim nhạt hoặc trắng Quả đậu tương thuộc loại quả ráp, cónhiều lông bao phủ, khi chin vỏ quả có màu vàng hoặc xám đen Hạt có dạnghình tròn, bầu dục, tròn dài, tròn dẹt không có nội nhũ mà chỉ có một lớp vỏbao quanh một phôi lớn Vỏ hạt thường nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm,xanh, nâu, đen đa số là hạt màu vàng Đặc biệt, màu sắc rốn hạt ở các giống

là không giống nhau, đây là biểu hiện đặc trưng của giống

Trong các gian đoạn sinh trưởng, đặc biệt là thời kì ra hoa, tạo quả nếuthiếu nước thì hoa và quả non sẽ rụng nhiều Giai đoạn phát triển của quả và

thước hạt và năng suất giảm đi đáng kể Do vậy, thời kì này được chứng minh

là thời kì bị ảnh hưởng nghiêm trọng nhất nếu thiếu nước [36]

Đậu tương là cây nhạy cảm với điều kiện ngoại cảnh, đặc biệt là hạn Khinghiên cứu về đặc tinh chịu hạn của cây đậu tương về mặt sinh lý và di truyền

đã cho thấy rằng các đặc tinh này liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hóa keocủa chất nguyên sinh, quá trình trao đổi chất Tinh chịu hạn của cây đậu tương

là tinh trạng đa gen và chúng thể hiện ở nhiều mặt như: sự phát triển nhanhcủa bộ rễ, tinh chin sớm tương đối,

Các cây họ Đậu nói chung và cây đậu tương nói riêng là loài cây trồng

có nhu cầu về nước cao hơn các loài cây khác và không đồng đều qua các giaiđoạn, chúng thuộc nhóm cây chịu hạn kém Do hàm lượng protein và lipidtrong hạt cây đậu tương rất cao, để tổng hợp 1 kg chất khô cần 500 – 530 kgnước và trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nước của cây đậu tương cũngkhá cao 50%, trong khi ngô chỉ là 30% và lúa là 20% [3]

1.2.2 Nhân tố phiên mã DREB ở cây đậu tương

Từ những năm 80 của thế kỷ XX, các nghiên cứu về DREB đã được cácnhà khoa học trên thế giới quan tâm, tiến hành giải trình tự gen DREB và sosánh trình tự gen này ở các loài thực vật khác nhau như: họ Cúc (Asteraceae),

hướng dương (Helianthus annuus), lúa mì (Triticum aestivum L.)…

Nhiều thành viên trong phân họ DREB đã được phân lập, mô tả và cácnghiên cứu đã khẳng định chúng là những thành tố quan trọng, liên quan đến sựphản ứng với các nhân tố phi sinh học ở thực vật bằng cách quy định biểu hiệngen thông qua các trình tự DRE/CRT [38] Một số thành viên của phân họ gen

DREB được xác định có trong hệ gen của cây đậu tương như: GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc, GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3, GmDREB5, GmDREB6, GmDREB7 [28] Với trình tự và độ dài khác nhau nhưng mỗi gen

trong phân họ DREB đều có những biểu hiện mạnh khi đậu tương gặp các

điều kiện stress hạn, mặn, sốc nhiệt Trong khi nhóm DREB1 điều khiển tinhchịu hạn, mặn và lạnh thì nhóm DREB2 lại có vai trò chủ yếu trong điềukhiển tinh chịu hạn, chịu nóng,…

Đặc điểm của gen DREB ở cây đậu tương đã được tiếp cận nghiên cứu từ những năm đầu của thế kỉ XXI Chen và cs (2004) đã phân lập gen DREB1 từ mRNA của cây đậu tương có kich thước 705 bp [13] Gen DREB1 được phân

lập từ DNA của cây đậu tương bởi Charlson và cs (2009) cũng có kich thước

705 bp [8] Chen và cs (2007) đã phân lập gen GmDREB5 và gen GmDREB3

(2009) từ mRNA ở đậu tương với kich thước lần lượt là 927 bp [10] và 597 bp

[11] Liu và cs (2007) đã phân lập gen GmDREB6 từ mRNA ở cây đậu tương với kich thước là 693 bp [21] Tuy nhiên, việc nghiên cứu các gen DREB ở

cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng ở Việt Nam còn khá mới, chỉ

có một vài công bố về các gen DREB trong những năm gần đây, đó là các nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc và chức năng của gen DREB1 và DREB5 ở

cây đậu tương của nhóm tác giả Chu Hoàng Mậu và cs (2011) [4]

Đặc điểm của gen ứng cử viên GmDREB7

Trình tự gen mang mã số BT092314 trên GenBank phân lập từ mRNA

đậu tương là gen ứng cử viên được gán nhãn GmDREB7 Trình tự mang mã số

BT092314 do nhóm tác giả Cheung và cs (2009) nghiên cứu đã được đăng ki

mã số trên GenBank vào tháng 8/2009 Trình tự này có kich thước 793 bp,

được phân lập từ mRNA của cây đậu tương (Glycine max) và chưa rõ chức

năng sinh học Trình tự đoạn mã hóa của gen mang mã số BT092314 trênGenBank có kich thước 561 bp, từ vị tri nucleotide số 144 đến 704, với mã

mở đầu là ATG và mã kết thúc là TGA (Hình 1.1)

Hình 1.1 Thông tin về trình tự mang mã số BT092314 trên GenBank.

Đặc điểm của trình tự amino acid suy diễn, vùng AP2 và các điểm DNA binding của trình tự mang mã số BT092314 trên GenBank

Trình tự gen mang mã số BT092314 trên GenBank là ứng cử viên gen

GmDREB7 mã hóa 186 amino acid Trình tự amino acid thuộc miền AP2 (Hình

1.2A) có 59 amino acid, từ vị tri amino acid số 64 đến 122, trong đó có 11

amino acid liên kết với promoter của nhóm gen chống chịu các stress phi sinhhọc, đó là các vị tri 66, 67, 69, 71, 73, 75, 79, 81, 88, 90, 93 (Hình 1.2B).

A

B

Hình 1.2 Đặc điểm trình tự amino acid suy diễn của trình tự mang mã số

BT092314 trên GenBank

Bằng công cụ Tin sinh học, dựa trên bản đồ gen đậu tương đã xác định

được gen ứng cử viên GmDREB7 có vị tri trên NST số 12 (LOC100527471)

(Hình 3.1)

Hình 1.3 Vị tri của gen GmDREB7 trên nhiễm sắc thể 12 của đậu tương

1.3 Vector biểu hiện gen thực vật và đánh giá hoạt động của vector

chuyển gen trên cây thuốc lá mô hình

Khả năng lây nhiễm một cách tự nhiên các trình tự DNA xác định của

Agrobacterium vào hệ gen thực vật đã được sử dụng vào việc phát triển các

vector biểu hiện để biến nạp vào thực vật Các vector này lợi dụng đặc tinh

bẩm sinh của Agrobacterium là quá trình biến nạp trung gian (mediated

transformation process)

Ðặc điểm của kỹ thuật chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium là

bất kỳ DNA nào đã tạo dòng đều có thể được chuyển vào hệ gen của tế bàothực vật Hai lá mầm Trước đây, loại vector thường được đề cập đến là vectorliên hợp (co-intergrative vector), tuy nhiên gần đây vector nhị thể (binaryvector) là phổ biến hơn

Hệ vector nhị thể đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phầnriêng biệt: Ti plasmid và vector T – DNA Hệ vector được thiết kế bao gồmhai plasmid tự tái bản Loại vector vận tải mang GOI giữa đoạn ngoại biên

của T – DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir đảm nhiệm chức năng vận

chuyển vào tế bào thực vật Plasmid hỗ trợ được cải biến từ các Ti plasmidbình thường bằng cách loại bỏ gen kich thich tế bào thực vật phát triển thànhkhối nhưng vẫn duy trì khả năng xâm nhập vào tế bào thực vật Để tái bản

trong A tumefaciens, vector nhị thể được thiết kế gồm các phần sau: (i) Vị tri ghép nối đa điểm; (ii) Đoạn khởi đầu tái bản ở cả E coli và A tumefaciens;

(iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực vật; (iv) Gen có khả

năng vận chuyển (oriV, oriT, trfA); (v) Đoạn T – DNA ngoại biên Ngoài ra,

còn một số thành phần phụ trợ khác như đoạn kich thich vận chuyển T – DNA[24], [5], [34]

Vector chuyển gen pBI121 có kich thước 14,75 kb, được cấu trúc bởi các

thành phần như 35S-promoter, chứa gen GUS với cặp enzyme giới hạn

XbaI/SacI, gen NPTII mã hóa protein kháng kháng sinh kanamycin (Hình 1.4).

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121

Cây thuốc lá là cây trồng vừa có giá trị kinh tế, vừa là cây mô hình quantrọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học và trong sự phát triển ban đầu củasinh học phân tử thực vật [43] Trong một nghiên cứu của nhóm tác giả tạiNhật Bản (2002) đã phát hiện ra rằng, nguồn gốc của cT-DNA trong bộ gen

của loài thuốc lá Nicotiana glauca hoang dã là T-DNA của Ri plasmid loại mikimopine (pRi) chứa trong Agrobacterium rhizogenes Đây là bằng chứng

rõ ràng đầu tiên về mối quan hệ ký sinh – vật chủ trong quá trình tiến hóa ban

đầu của cây thuốc lá Nicotiana [42].

Thuốc lá là loại cây được sử dụng phổ biến nhất để biểu hiện gen chuyển từnhiều loại sinh vật, bởi vì nó dễ trồng và dễ dàng biến đổi gen Nó cũng cung

cấp lượng mô sống đáng kể và có hệ thống nuôi cấy tế bào được thiết lập tốt.Nhiều protein vi khuẩn tham gia vào quá trình tổng hợp các sản phẩm thươngmại hiện đang được thiết kế để sản xuất trong thuốc lá Enzyme vi khuẩnđược tổng hợp trong thuốc lá có thể tăng cường bảo vệ, chống lại các stressphi sinh học và mầm bệnh [45] Thuốc lá cũng được sử dụng như một môhình cho tinh nhạy cảm với các bệnh thực vật, sinh tổng hợp pyridine alkaloid(như nicotine), stress oxy hóa… [44].

Thuốc lá được sử dụng rộng rãi như một hệ thống cây mô hình trongnghiên cứu chuyển gen vì nhiều lý do: Di truyền phân tử của nó được hiểu rõ,lập bản đồ gen của nó gần như được hoàn tất,… Cây thuốc lá có thể sinhtrưởng, phát triển tốt trong ống nghiệm, trong điều kiện nhà kinh và tạo ra mộtlượng lớn sinh khối Thuốc lá cũng được coi là một trong những hệ thống tốtnhất để biến đổi lục lạp, giúp tăng cường hơn nữa hiệu quả đối với sự biểuhiện của protein tái tổ hợp Cây thuốc lá biến đổi gen cũng là mô hình lýtưởng cho nghiên cứu các chức năng sinh học cơ bản, chẳng hạn như tươngtác mầm bệnh, phản ứng môi trường, điều hòa sinh trưởng và lão hóa [45].Trong thực tế, nhiều nghiên cứu về biểu hiện mạnh của nhân tố phiên mãDREB cảm ứng với stress đã được nghiên cứu nhằm mục đich kich hoạt sựbiểu hiện của các gen mục tiêu có trình tự DRE trong các promoter của chúng

và kết quả cho thấy cây chuyển gen có khả năng chống chịu stress tốt hơn câykhông chuyển gen

Gen DREB1A có thể biểu hiện tốt ở nhiều cây trồng khác nhau Sự biểu hiện mạnh các AtDREB1A trong cây thuốc lá, cây lúa mì, cây lúa, cây lạc đã chứng minh khả năng chịu hạn tốt hơn và tăng cường sự biểu hiện của gen LEA

ở trong điều kiện nhà kinh [8], [19], [28]

Sự tác động đồng thời của hạn và nhiệt độ cao đến sinh trưởng của cáccây trồng mạnh mẽ hơn các stress đơn lẻ [25], [30], [31] Phân tich sự phiên

mã và trao đổi chất ở cây thuốc lá, về mặt sinh trưởng, đã chỉ ra rằng phảnứng của cây đối với sự kết hợp của nhân tố hạn và nhiệt độ cao một phần có

sự chồng chéo lên nhau, nhưng chinh điều này cũng nhằm chống lại các stress

đơn lẻ Gen DREB2A là một vi dụ cho vai trò điều hòa biểu hiện gen dưới sự

tác động đồng thời của hạn và nhiệt độ cao lên thực vật [31]

Trong một nghiên cứu khác, gen GmDREB2 được biểu hiện mạnh trong

môi trường có hạn, mặn, nhiệt độ thấp và ABA [13] Trong cây thuốc lá

chuyển gen, sự biểu hiện của gen GmDREB2 đã làm tăng sự tich lũy hàm

lượng prolin [20]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Giống đậu tương DT2008 được sử dụng làm vật liệu phân lập gen doViện Di truyền Nông nghiệp cung cấp DT2008 là giống lai giữa giốngDT2001 và giống HC100 (gốc Mexico) kết hợp với phương pháp đột biếnthực nghiệm và chọn lọc theo tiêu chuẩn thich ứng với chống chịu GiốngDT2008 có khả năng chống chịu tổng hợp với nhiều yếu tố bất lợi trong sảnxuất như hạn, úng, nhiệt độ, đất nghèo dinh dưỡng,

Cây thuốc lá Nicotinana tabacum K326 in vitro do Phòng thi nghiệm

Công nghệ tế bào thực vật thuộc Khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên cung cấp, sử dụng để nhận gen

-2.1.2 Các loại vector và chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu

Vector tách dòng pBT, vector chuyển gen pBI121 chứa promoter 35S doPhòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâmKhoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp

Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 do Phòng Công nghệ

Tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Côngnghệ Việt Nam cung cấp

2.2 Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu

Các loại kit thao tác phân tử: Kit GeneJET PCR Purification để tinh sạchsản phẩm PCR, kit để tách chiết plasmid từ vi khuẩn Các loại enzyme như