Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính keo tụ sinh học từ các ao nuôi tôm tại tỉnh trà vinh

Để khắc phục hiện tượng trên nhiều nghiên cứu đã được thực hiện như xử lýnước thải nuôi trong thủy sản bằng cụm vi tảo, ứng dụng men vi sinh, loại bỏ chấthữu cơ khỏi các vùng nước ven bi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN

CÓ HOẠT TÍNH KEO TỤ SINH HỌC TỪ CÁC AO NUÔI

TÔM TẠI TỈNH TRÀ VINH

Ngành

Chuyên ngành

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫnSinh viên thực hiệnMSSV : 1411100330

: ThS PHẠM MINH NHỰT: VÕ LAN HƯƠNG

Lớp : 14DSH03

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sựhướng dẫn khoa học của ThS Phạm Minh Nhựt Các nội dung nghiên cứu, kết quảtrong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây.Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giáđược chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệutham khảo Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũngnhư số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thíchnguồn gốc Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu tráchnhiệm về nội dung luận văn của mình Trường đại học Công nghệ Thành phố HồChí Minh không liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ratrong quá trình thực hiện (nếu có)

Sinh viên

Võ Lan Hương

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành báo cáo này, trước tiên em xin gửi tới Ban Giám hiệu TrườngĐại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, lãnh đạo phòng Đào tạo Đại học vàBan Chủ nhiệm Viện Khoa học ứng dụng HUTECH lời cảm ơn sâu sắc, niềm tựhào vì đã được học tập tại Trường trong những năm qua

Bên cạnh đó, để hoàn thành được bài báo cáo này, em xin chân thành cảm ơnThS Phạm Minh Nhựt đã luôn bên cạnh em, cảm ơn thầy đã tận tình chỉ dạy em,cho em thêm động lực và niềm tin để phấn đấu hoàn thành tốt nhất đề tài của mình

Em xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn làm công tác nghiên cứu tạiPhòng thí nghiệm Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH đã giúp đỡ em nhiệt tìnhtrong suốt quá trình thực tập tại trung tâm

Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, người thân và các bạn

bè em, đã quan tâm sâu sắc, chia sẻ khó khăn trong quá trình thực tập và hoànthành báo cáo thật tốt

Trong quá trình hoàn thiện báo cáo không tránh khỏi những thiếu xót nhất định

mà em chưa thể khắc phục nên em rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô

để đề tài này được hoàn chỉnh hơn

Em xin chân thành cảm ơn

Sinh viên

Võ Lan Hương

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BÀNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về ngành nuôi trồng thủy sản 3

1.2 Khó khăn của ngành nuôi trồng thủy sản 4

1.2.1 Ảnh hưởng của dịch bệnh 4

1.2.1.1 Bệnh do virus 4

1.2.1.2 Bệnh do vi khuẩn 7

1.2.2 Ảnh hưởng của môi trường nước 8

1.2.2.1 Ô nhiễm từ nguồn nitơ 8

1.2.2.2 Ô nhiễm từ lớp bùn hình thành 9

1.2.2.3 Ô nhiễm từ môi trường tự nhiên 9

1.2.2.4 Một số nguyên nhân khác 9

1.3 Vai trò của chế phẩm vi sinh trong nuôi trồng thủy sản 9

1.3.1 Khái niệm 9

1.3.2 Thành phần 10

1.3.2.1 Vi khuẩn Gram dương 10

1.3.2.2 Vi khuẩn Gram âm 10

1.3.2.3 Nấm men 10

1.3.3 Vai trò 10

1.3.3.1 Cạnh tranh vị trí gắn kết 10

1.3.3.2 Sản xuất các chất ức chế 10

1.3.3.3 Cạnh tranh các nguồn năng lượng 11

1.3.3.4 Tăng cường sự hấp thu dinh dưỡng 11

1.3.3.5 Ảnh hưởng đến hệ thống nước xanh 11

1.3.3.6 Nâng cao đáp ứng miễn dịch 11

1.3.4 Ứng dụng chế phẩm vi sinh trong sử lý nước 12

1.4 Vi khuẩn keo tụ sinh hoạt và vai trò trong nuôi trồng thủy sản 12

1.4.1 Khái niệm keo tụ sinh hoạt 12

1.4.2 Giai đoạn hình thành 12

1.4.3 Vi khuẩn sản xuất keo tụ sinh học 12

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 14

2.1.1 Thời gian 14

2.1.2 Địa điểm thu mẫu 14

2.1.3 Địa điểm tiến hành nghiên cứu 14

2.2 Vật liệu 14

2.2.1 Mẫu 14

2.2.2 Hoá chất và môi trường 14

2.2.2.1 Hóa chất 14

2.2.2.2 Môi trường 15

2.3 Dụng cụ và thiết bị 15

2.3.1 Dụng cụ 15

2.3.2 Thiết bị 15

2.4 Phương pháp nghiên cứu 16

2.4.1 Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu 16

2.4.2 Phương pháp phân lập 16

2.4.3 Phương pháp nhuộm Gram 18

2.4.4 Phương pháp nhuộm bào tử 18

2.4.5 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 20

2.4.5.1 Phương pháp cấy chuyển vi sinh vật 20

2.4.5.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu 20

2.4.6 Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật 20

2.4.7 Phương pháp đánh giá hoạt tính keo tụ sinh học 21

2.4.8 Phương pháp định danh 21

2.4.8.1 Định danh bằng các phản ứng sinh hóa 21

2.4.8.2 Định danh bằng sinh học phân tử 31

2.4.9 Phương pháp xử lý số liệu 31

2.5 Bố trí thí nghiệm 31

2.5.1 Sơ đồ thí nghiệm 31

2.5.2 Quy trình phân lập 31

2.5.3 Sàn lọc hoạt tính keo tụ sinh học các chủng sau định danh sơ bộ 32

2.5.4 Định danh các chủng vi khuẩn sau sàng lọc 32

2.5.4.1 Định danh bằng các phản ứng sinh hóa 32

2.5.4.2 Định danh bằng sinh học phân tử 33

2.5.5 Bước đầu khảo sát quy trình thu hồi hợp chất keo tụ sinh học từ vi khuẩn 34 2.5.5.1 Sơ đồ quy trình thu hồi 34

2.5.5.2 Thuyết minh quy trình 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn từ các mẫu nước ao nuôi 36

3.2 Kết quả sàng lọc các chủng vi khuẩn phân lập có hoạt tính keo tụ sinh học 43 3.3 Kết quả định danh chủng 9.4 45

3.3.1 Định danh bằng các thử nghiệm sinh hóa 45

3.3.2 Kết quả định danh chủng 9.4 bằng phương pháp giải trình tự rDNA 16S 46 3.4 Kết quả bước đầu tách triết hoạt tính keo tụ sinh học từ chủng 9.4 48

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

4.1 Kết luận 50

4.2 Kiến nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 1: THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG 53

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ TỈ LỆ HOẠT TÍNH KEO TỤ XỬ LÝ BẰNG CHƯƠNG TRÌNH SAS 9.0 55

PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỪ GENE 61

BOD : Biochemical oxygen Demand

TSS : Turbidity & suspendid solids

DNA : Deoxyribonucleic acid

PCR : Polymerase Chain Reaction

NCBI : National Center for Biotechnology InformationSAS : Statistical Analysis Systems

RNA : Ribonucleic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Kết quả phân lập vi khuẩn từ các mẫu nước ao nuôi 46

Bảng 3.4: Kết quả định danh sinh hóa của chủng vi khuẩn 9.4 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Mẫu lấy từ ao nuôi tôm ở tỉnh Trà Vinh 26

Hình 2.2: Mẫu để lắng trong bình chiết quả lê 27

Hình 2.3: Thử nghiệm Catalase 31

Hình 2.4: Thử nghiệm Voges Proskauer 32

Hình 2.5: Thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột 33

Hình 2.6: Thử nghiệm TSI 35

Hình 2.7: Thử nghiệm Citrate 36

Hình 2.8: Thử nghiệm thủy phân Casein 37

Hình 2.9: Thử nghiệm Nitrate 39

Hình 2.10: Môi trường TSB có bổ sung NaCl 40

Hình 2.11: Môi trường TSB ở 500C và 600C 40

Hình 2.12: Quy trình tinh sạch chất kết tụ sinh học 44

Hình 3.1: Hoạt tính keo tụ sinh học của 22 chủng vi khuẩn phân lập 28

Hình 3.2: Kết quả định danh chủng 9.4 bằng phương pháp giải trình tự rDNA 31

Hình 3.3: Kết quả tách chiết hoạt tính keo tụ sinh học từ chủng 9.4 32

MỞ ĐẦU

Qua nhiều năm, ngành nuôi tôm ở Việt Nam đã có những bước phát triển đáng

kể đóng góp một phần không nhỏ trong việc phát triển kinh tế của đất nước Tuy giátrị kinh tế của ngành nuôi trồng thủy sản mang lại khá lớn nhưng để phát triển lớnmạnh hơn nữa, ngành nuôi trồng thủy sản phải vượt qua không ít thách thức do thực

tế với quy mô nuôi nhỏ lẻ, ít được đầu tư đồng bộ về cơ sở hạ tầng, kỹ thuật dẫn đếnviệc kiểm soát môi trường và dịch bệnh trong toàn vùng nuôi gặp nhiều khó khăn.Hơn nữa, những hiện tượng thời tiết cực đoan như nắng nóng kéo dài, mưa lớn, hạnhán, thay đổi cường độ và tần suất của bão…do tác động của biến đổi khí hậu xuấthiện ngày càng nhiều ảnh hưởng không nhỏ đến môi trường nước nuôi tôm dẫn đếnsản lượng và chất lượng tôm nuôi giảm

Để khắc phục hiện tượng trên nhiều nghiên cứu đã được thực hiện như xử lýnước thải nuôi trong thủy sản bằng cụm vi tảo, ứng dụng men vi sinh, loại bỏ chấthữu cơ khỏi các vùng nước ven biển bị ô nhiễm bằng thực vật xử lý môi trường,…Trong đó công nghệ biofloc được ứng dụng rộng rãi hơn cả Công nghệ bioflocđược Giáo sư Yoram Avnimelech khởi xướng ở Israel và do Robins McIntosh thựchiện đầu tiên trong nuôi tôm thương phẩm ở Belize Công nghệ này thích hợp trongviệc sản xuất thủy hải sản do trong nước ao nuôi có chứa nhiều cacbon, nitơ,photpho và các chất dinh dưỡng khác, cũng như có các đặc điểm riêng như ít kimloại nặng, nồng độ nitơ, photpho, SS và nhu cầu oxy hóa học thấp hơn (COD) thíchhợp cho vi khuẩn keo tụ sinh học phát triển Vì vậy hướng sử dụng vi khuẩn keo tụ

để chúng có thể chuyển cơ chất (các chất thải hữu cơ) trực tiếp thành sinh khối vikhuẩn được xem là giải pháp hiệu quả, yêu cầu đầu tiên đặt ra khi ứng dụng các vikhuẩn có khả năng sản xuất keo tụ sinh học là phải có được nguồn chủng vi khuẩnthích hợp với điều kiện địa phương, và điều kiện môi trường thích hợp cho sự pháttriển cũng như hoạt tính của các chủng vi khuẩn này Tuy nhiên, hiện nay cácnghiên cứu trong nước về vấn đề này chưa được thực hiện nhiều

Chính vì vậy, đề tài “Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính keo

tụ sinh học từ các ao nuôi tôm tại tỉnh Trà Vinh” được thực hiện để giải quyết các

vấn đề trên, tìm kiếm, phân lập, sàng lọc các chủng vi khuẩn bản địa có hoạt tínhtạo keo tụ sinh học cao, có khả năng ứng dụng trong điều kiện Việt Nam

 Phân lập và tuyển chọn các chủng có hoạt tính tạo keo tụ sinh học cao

 Chủng vi khuẩn phải có tính an toàn và không gây bệnh Có khả năng tồn tạilâu dài trong môi trường và chịu được các điều kiện khắc nghiệt, thích hợp với điềukiện địa phương và điều kiện môi trường thích hợp cho sự phát triển cũng như hoạttính tạo keo tụ của các chủng vi khuẩn này

 Phân lập các chủng vi khuẩn có hoạt tính keo tụ sinh học từ các ao nuôi tôm tại tỉnh Trà Vinh

 Xác định hoạt tính keo tụ sinh học

 Sàng lọc hoạt tính keo tụ sinh học của các chủng

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về ngành nuôi trồng thủy sản

Trà Vinh là tỉnh ven biển thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) vớitổng diện tích tự nhiên là 2.288,09 km2, dân số (năm 2010) là 1.005.856 người, mật

độ dân số 440 người/km2 Ở vị trí nằm kẹp giữa 2 con sông lớn là sông Cổ Chiên vàsông Hậu, một mặt giáp biển Đông (dài 65 km), có 2 cửa sông quan trọng là CungHầu và Định An, hệ thống sông, kênh, rạch chằng chịt với tổng chiều dài 578 kmdiện tích lưu vực tự nhiên là 21.265 ha và khoảng 98.597 ha ngập nước (từ 3-5tháng/năm), có luồng cho tàu biển trọng tải lớn vào sông Hậu qua địa bàn huyệnDuyên Hải đã được Thủ tướng phê duyệt Vùng biển Trà Vinh rộng 45.536 hải lývuông, nguồn lợi thủy sản rất phong phú với nhiều loài có giá trị kinh tế cao; trữlượng (vùng cửa sông ven biển) trên 72.000 tấn, cho phép khai thác 50%, trữ lượngtrong nội đồng từ 3.000-4.000 tấn, cho phép khai thác từ 2.000-2.500 tấn,

Là tỉnh có vị trí quan trọng đối với nghề tôm cá đồng bằng sông Cửu Long,ngành nuôi trồng thủy sản ở Trà Vinh là một ngành kinh tế thủy sản tổng hợp cảtrong đất liền, ven biển và trên biển về các mặt khai thác, nuôi trồng, chế biến vàhậu cần dịch vụ Nghề cá Trong thời gian qua, thủy sản đạt được sự tăng trưởngđáng khích lệ và có đóng góp quan trọng vào sự phát triển kinh tế - xã hội chungcủa địa phương Tốc độ tăng trưởng bình quân giai đoạn 2006-2010 đạt 4,5%/năm

về sản lượng thủy sản (trong đó khai thác đạt 7,4%/năm); đạt 3,5%/năm về giá trịsản xuất; đạt 16,8%/năm về kim ngạch xuất khẩu Tính đến năm 2010, tổng sảnlượng thủy sản của tỉnh đạt 160.053 tấn (trong đó khai thác 77.276 tấn); tổng giá trịsản xuất đạt 2.931 tỷ đồng; kim ngạch xuất khẩu đạt 77,2 triệu USD Hơn nữa, pháttriển thủy sản còn tạo ra nhiều việc làm cho lao động địa phương, góp phần nângcao thu nhập, cải thiện mức sống và giải quyết nhiều vấn đề xã hội bức xúc kháccủa địa phương Tuy nhiên, sự phát triển ngành thủy sản của tỉnh trong thời gian quachủ yếu vẫn dựa trên những tiềm năng, thế mạnh sẵn có do còn gặp phải nhiều khókhăn như ô nhiễm môi trường, dịch bệnh, thời tiết là những yếu tố ngăn cản sựphát triển của ngành thủy sản trong thời kỳ tới

1.2 Khó khăn của ngành nuôi trồng thủy sản

Cũng như các ngành kinh tế khác ngành nuôi trồng thủy sản Trà Vinh đang gặpkhông ít những khó khăn như ảnh hưởng thời tiết và biến đổi khí hậu, mưa đến sớmnên độ mặn thấp, môi trường nuôi bị ô nhiễm nên dịch bệnh dễ xảy ra và khó khốngchế làm ảnh hưởng đến sản lượng và chất lượng tôm

1.2.1 Ảnh hưởng của dịch bệnh

Trong năm 2017, tình hình dịch bệnh trên thủy sản nuôi cũng khá phức tạp,khoảng 190 ha nuôi tôm bị bệnh Dịch bệnh trên tôm nuôi vẫn chưa được khống chếtriệt để, tình hình dịch bệnh xảy ra rải rác suốt vụ nuôi, ở hầu hết vùng nuôi, gâythiệt hại lớn cho người nuôi, chủ yếu các bệnh do virus gây ra như: WSSV, MBV,YHV, TSV hay bệnh do vi khuẩn: bệnh phát sáng, bệnh gan thận mủ …

1.2.1.1 Bệnh do virus

a Whiter Spot Syndrome Virus - WSSV

 Nguyên nhân: Do virus gây hội chứng đốm trắng (Whiter Spot Syndrome

Virus) gây ra

 Cách thức: Virus gây hội chứng đốm trắng khi xâm nhập vào tôm sẽ cư trú

ở nhiều bộ phận của tôm như mô nội bì, mô dạ dày, mang, buồng trứng, tinh hoàn,

hệ thống thần kinh, mắt, chân bơi và các bộ phận khác Sau khi xâm nhập vào tếbào chủ, virus này tiến hành tự nhân bản dựa trên cơ sở vật chất và năng lượng của

tế bào Thông qua quá trình này, số lượng virus tăng lên rất nhanh, đồng thời làmthay đổi hoạt động bình thường của tế bào Khi quan sát dưới kính hiển vi các tếbào bị nhiễm virus thường có nhân phình to Virus phát triển đến giai đoạn phá vỡnhân và giết chết tế bào, virus lan truyền ra môi trường nước, đi tìm ký chủ khác vàlại tiếp tục xâm nhập, tấn công (Trần Thị Việt Ngân, 2002 )

 Tác hại: Tôm bị bệnh đốm trắng dễ dàng phát hiện ở tôm nhỏ và sắp trườngthành, thường xuất hiện ở tầng mặt và dạt vào bờ, bỏ ăn, hoạt động kém, các phầnphụ bị tổn thương, nắp mang phồng lên và vỏ có nhiều sinh vật bám Khi tôm bịbệnh có dấu hiệu sức khỏe yếu đồng thời các đốm trắng xuất hiện, tỷ lệ tôm phátbệnh trong vòng 3 – 10 ngày lên đến 100% và tôm chết hầu hết ở ao nuôi

b Monodon Baculovirus MBV

 Nguyên nhân: Tác nhân gây bệnh là virus type A Monodon Baculovirus

 Cách thức: Vào giai đoạn đầu, sau khi tế bào vật chủ nhiễm MBV nhân tế

bào vẫn bình thường, chỉ có biến đổi nhỏ ở tế bào chất Sau đó nhân tế bào sưnglên, xuất hiện thể ẩn trong nhân Tế bào chất mất dần chức năng và hình thành giọt

mỡ Cuối cùng, nhân tế bệnh tăng gấp 2 lần đường kính bình thường và tăng 6 lần

về thể tích, bên trong có 1 đến nhiều thể ẩn Virus hủy hoại tế bào và bong tróc vàotrong ống gan tụy kèm theo hội nhiễm vi khuẩn Phá hủy mô gan tụy và màng ốngtiêu hóa

 Tác hại: Tôm chậm phát triển, ăn ít, có thể chuyển sang màu xanh xám, chết

lên đến 100% sau 2 tuần khi có biểu hiện lâm sàng Chủ yếu gây chết ở giai đoạn ấutrùng zoea, mysis và tôm giống nhỏ Nhiễm tỷ lệ cao ở tôm nuôi ấu niên và trưởngthành nhưng rất ít gây chết

c Yellow Head Virus - YHV

 Nguyên nhân: Tác nhân gây bệnh là Yellow Head Virus.

 Cách thức: YHV thường nhiễm bệnh ở các cơ quan bạch huyết, các mô liên

kết, tuyến sinh dục, buồng trứng, tế bào biểu bì ruột… Bệnh YHV lây lan cả theochiều ngang và chiều dọc Lây lan theo chiều ngang khi tôm khỏe ăn thịt tôm nhiễmYHV, tôm nhiễm bệnh bài tiết ra môi trường nước hoặc một số tôm tự nhiên cũng

sẽ nhiễm bệnh sẽ lây truyền cho các tôm trong ao nuôi Khả năng lây lan theo chiềudọc từ bố mẹ sang con thông qua trứng bị nhiễm bệnh

 Tác hại: Khi tôm bị nhiễm bệnh thì biểu hiện đầu tiên là tăng đột ngột lượng

thức ăn trong một vài ngày sau đó giảm ăn, và đa phần tôm dừng hẳn sau đó vàingày Giai đoạn đầu tiên thấy xuất hiện nhiều cá thể bơi lờ đờ trên mặt nước sát bờ

ao, những cá thể này thường xuất hiện màu vàng nhạt trên giáp đầu ngực, mang cómàu trắng nhợt hoặc có những sọc vàng đến nâu Sau đó vài ngày (2-3 ngày) sốlượng cá thể tăng nhanh chóng, cuối cùng tôm dừng ăn hẳn và có dấu hiệu chếttrong ao Đối với bệnh YHV tôm có thể chết tích luỹ đến 100% trong 7-10 ngày

d Taura Syndrome Virus TSV

 Nguyên nhân: Tác nhân gây bệnh là Taura Syndrome Virus

 Cách thức: Tôm bị hội chứng Taura thường diễn biến qua 3 thời kỳ của

bệnh

Thời kỳ cấp tính: Tôm postlarvae hay tôm lớn của loài P.vannamei khi bị

bệnhcho thấy sự chuyển màu đỏ nhợt, đặc biệt là đuôi và các chân bơi, nên ngườinông dân Ecuador đã đặt tên cho bệnh này, khi xảy ra lần đầu, là bệnh đỏ đuôi - TailRed Diseasse Sự thay đổi màu là do sự phình to của sắc tố đỏ trong biểu mô vỏ Sựdày mọng của các mép chân bơi, chân bò và đuôi tôm, là dấu hiệu đầu tiên của sựhoại tử cục bộ Tôm bệnh còn có một số dấu hiệu khác như: mềm vỏ, ruột rỗng vàthường chết khi lột xác Khi dịch bệnh xảy ra, một số loài chim biển sẽ tấn công ao

có tôm bệnh Ở tôm he chân trắng (P.vannamei), giai đoạn cấp tính có tỷ lệ chết cao (40 – 90%) Trong khi đó loài P stylirostris đã có sức đề kháng, chống lại sự cảm

nhiễm của loại virus này

Thời kỳ chuyển tiếp: Dù giai đoạn chuyển tiếp của Taura Syndrome chỉ diễn ratrong trong thời gian ngắn, nhưng cũng thể hiện một số dấu hiệu: Có nhiều điểm bịthương tổn mầu nâu, đen trên vỏ kitin, màu đen là của sắc tố melanin, là sản phẩmcuối cùng của cơ chế hoạt động miễn dịch tự nhiên ở tôm Ở thời kỳ này tôm bệnh

có thể có, hay không có hiện tượng mềm vỏ và đổi màu đỏ của các phần phụ Tômbệnh ở thời kỳ này vẫn có thể bắt mồi bình thường

Thời kỳ mãn tính: Những con tôm bị bệnh do cảm nhiễm Taura Syndromenhưng sống sót qua thời kỳ cấp tính và thời kỳ chuyển tiếp, thì sẽ bước sang thời kỳmãn tính Thời kỳ này có thể kéo dài cho đến cuối đời của những con tôm bị bệnh.Tôm bị bệnh ở thời kỳ mãn tính, sau vài lần lột xác, cơ thể trở lại bình thường, cácdấu hiệu bệnh lý ở các thời kỳ trước biến mất, nhưng trong cơ thể tôm vẫn mangvirus gây bệnh cho đến hết cuộc đời Tuy nhiên, không có các dấu hiệu đặc thù để

có thể dùng làm cơ sở sàng lọc những cá thể mang virus Nếu các con tôm mangmầm bệnh thành thục, khi tham gia sinh sản có thể truyền virus gây bệnh Taura chođàn ấu trùng

 Tác hại: Bệnh TSV thường xảy ra ở giai đoạn ấu niên, từ 14-40 ngày tuổi.

Tôm lớn cũng có thể xuất hiện bệnh này nếu giai đoạn ấu niên chưa bị bệnh Bệnhnày có thể gây chết từ 40-90% tùy theo kích cỡ tôm bị bệnh

Bệnh TSV có thể lây nhiễm theo 2 trục ngang và dọc Đặc biệt sự lây nhiễmtheo trục dọc rất phổ biến, do những con tôm bị bệnh ở thời kỳ mãn tính, sau vài lầnlột xác, những dấu hiệu của bệnh TSV biến mất, nhưng trong cơ thể vẫn mang mầmbệnh Tôm he chân trắng lại có thể thành thục trong ao, nên rất khó tránh nguy cơđưa những con tôm mang mầm bệnh vào tham gia sinh sản, chúng sẽ sản sinh ra cácđàn tôm giống mang mầm bệnh Nguồn nước chứa các chất thải từ tôm bệnh vànhững con chim ăn tôm chết đã trở thành nguồn lây bệnh từ nơi này tới nơi khác

1.2.1.2 Bệnh do vi khuẩn

a Bệnh phát sáng

 Nguyên nhân: Nhiễm vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio sp chủ yếu và gây nguy

hiểm nhất là Vibrio harveyi Vibrio harveyi là vi khuẩn Gram âm, phát triển nhanh ở

độ mặn 10-40ppt (mạnh nhất ở độ mặn 20-30 ppt) Các vi khuẩn này có khả năngkháng lại nhiều loại kháng sinh Bệnh có thể nhiễm từ các trại giống, ao ương sang

ao thịt Trong sản xuất giống, mầm bệnh được lây lan chủ yếu bằng đường ruột từtôm mẹ sang ấu trùng trong giai đoạn sinh sản

 Triệu chứng: Tôm yếu, bơi không định hướng, tấp mé bờ, phản ứng chậm

chạp Mang và thân tôm có màu sẫm, bẩn, thịt đục màu Gan viêm và teo nhỏ, mấtchức năng tiêu hóa cho tôm Ăn giảm, không có thức ăn và phân trong ruột, phântôm trong nhá ít Đầu, thân tôm phát sáng màu trắng - xanh lục trong bóng tối.Quan sát bằng kính hiển vi thấy vi khuẩn phát sáng di chuyển trong cơ, máutôm Có đốm sáng rất nhỏ và nhiều trên phần cơ thịt của tôm Tôm chậm lớn, có thể

bị đóng rong ở mang và vỏ Tôm chết đáy rải rác tuỳ vào mức độ nặng nhẹ củabệnh Nếu nhiễm bệnh 100% đàn tôm trong giai đoạn 45 ngày nuôi đầu, có thể chếthàng loạt Tôm ấu trùng nhiễm bệnh có màu trắng đục, nhiễm bệnh nạng thì lắngdưới đáy bể ương và chết hàng loạt

b Hoại tử gan tụy

 Nguyên nhân:

Bệnh vi khuẩn hoại tử gan tụy Necrotizing Hepatopancreatitis Peru - NHP gây

ra bởi loài vi khuẩn gây bệnh, cơ thể loại Rickettsia, kích thước tương đối nhỏ, đahình thể, gam âm nội bào bắt buộc Phương thức lan truyền bệnh theo phương ngangqua nguồn nước ao bị ô nhiễm (trong phân) và hoặc cảm nhiễm qua đường miệng(ăn thịt đồng loại)

 Triệu chứng: Các dấu hiệu lâm sàng về tổng quan có thể cho biết tôm nuôi

nhiễm bệnh NHP: tuyến tiêu hóa (gan tụy) bị suy yếu từ nhợt nhạt đến trắng, quansát có các dấu hiệu: lờ đờ, giảm hấp thụ thức ăn, hệ số chuyển đổi thức ăn cao, bỏ

ăn, giảm tăng trưởng rõ, tỉ lệ trọng lượng chiều dài kém (“đuôi mỏng”), gầy mòn,

vỏ mềm, thân nhũn, mang sậm hoặc đen, teo gan tụy Kiểm tra ở mép ao, tôm bịnhiễm rỗng ruột và bề mặt nặng mùi do ngoại ký sinh gia tăng và các bệnh viêmnhiễm cơ hội khác (nghĩa là đốm đen) Bệnh do vi khuẩn liên quan đến vỏ bao gồmtổn thương loét biểu bì hoặc mòn phần phụ bị đen, và tế bào sắc tố phát triển dẫnđến xuất hiện rìa đen ở chân đuôi và chân bụng Gan tụy bị teo và có một số đặcđiểm sau: mềm và ướt, giữa đầy dịch, xanh xám và sọc đen (tế bào ống bị đen) Tỉ

lệ chết tăng dần hơn 90% có thể xảy ra trong vòng 30 ngày khi bắt đầu có dấu hiệulâm sàng nếu không được điều trị

c Bệnh vi khuẩn dạng sợi

 Nguyên nhân: Do vi khuẩn dạng sợi là Leucothrix mucor, Thiothrix sp.,

 Triệu trứng: Tôm bệnh thường ở các giai đoạn Mysis và post larva Bệnh

nặng tôm đổi màu sang màu vàng, nâu, xanh lá cây Tôm bơi lờ đờ, khó lột xác vàchết hàng loạt

1.2.2 Ảnh hưởng của môi trường nước

Những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường nước trong nuôi trồng tôm như:nguồn đạm từ thức ăn thừa, phân tôm, xác tảo chết tôm chết, các hóa chất tích tụ ởđáy ao nuôi tạo thành một lớp bùn hoặc do ô nhiễm nước mưa, lũ lụt… cuốn theocác chất thải hữu cơ từ chăn nuôi, sinh hoạt cùng một số nguyên nhân khác

1.2.2.1 Ô nhiễm từ nguồn Nitơ

Khi nuôi trồng người ta thường sử dụng 2 dạng thức ăn chính sau: thức ănxanh và thức ăn tinh tuy nhiên kết quả quan sát đã cho thấy rằng trong hệ thốngthâm canh tôm thì chỉ có 15 – 20% thức ăn được dùng vào phát triển mô động vật,

có tới 15% tổng lượng thức ăn hao hụt do không ăn hết và thất thoát Dẫn đến phần

dư thừa bị lắng đọng và bị phân hủy bởi các vi sinh vật yếm khí tạo ra các chất độchại như CH4, NO2, NH3…, làm giảm lượng oxy hòa tan

Ô nhiễm nitơ chính là nguyên tố chủ yếu chiếm tỷ lệ lớn (30 – 40%) hìnhthành từ thức ăn thừa Nitơ dưới dạng protein được tôm hấp thu và bài tiết dướidạng NH3 NH3 sẽ được nhóm vi khuẩn Nitrosomonas sp và Nitrosococcus sp.

chuyển hóa thành NO2 - Trong quy trình nuôi tôm, hàm lượng NH3 và NO2 - luôn có

xu hướng tăng rất nhanh và gây độc làm tôm chậm lớn, dễ nhiễm bệnh, chết

Ngoài ra NH3 và NO2 - sẽ làm tảo trong ao nuôi phát triển đột biến, nhất là các loạitảo xấu, gây ra việc thiếu oxy trong nước ao nuôi trầm trọng vào ban đêm Đặc biệt

có thể làm sụp tảo nhanh chóng gây ra các ảnh hưởng nghiêm trọng cho tôm

1.2.2.2 Ô nhiễm từ lớp bùn hình thành

Hầu hết các chất trong nước nuôi tôm lắng đọng dưới đáy tạo thành một lớpbùn ô nhiễm Thành phần lớp bùn chủ yếu là các chất hữu cơ như protein, lipid, cácchất khoáng và vitamin, vỏ tôm lột xác,… Lớp bùn này luôn ở trong tình trạng ngậpnước yếm khí làm các vi sinh vật yếm khí phát triển mạnh, phân hủy các hợp chấttrên tạo thành các sản phẩm như H2S, NH3, CH4… ảnh hưởng đến độ pH của nước

và kìm hãm sự phát triển của tôm

Hơn nữa tôm luôn có xu hướng tránh khỏi vùng này và tập trung vào nhữngkhu vực sạch sẽ hơn Do việc tập trung vào một vùng sẽ làm giảm bớt diện tích cho

ăn, cũng như tăng tính cạnh tranh trong khi ăn Nếu như toàn bộ đáy ao bị dơ bẩnthì con tôm bị bắt buộc phải sống trong môi trường ô nhiễm Lớp bùn dơ bẩn còntác động lên nước trong ao nuôi làm giảm chất lượng nước

1.2.2.3 Ô nhiễm từ môi trường tự nhiên

Khi mưa xuống nước chảy qua mặt đất đồng thời với dòng chảy đã hòa tan

và cuốn theo nó các chất gây ô nhiễm nhu chất rắn, kim loại nặng, dầu mỡ, phânbón, thuốc trừ sâu, cùng với nước thải sinh hoạt từ các hộ dân cư, bệnh viện… hay

do các sản phẩm của hoạt động sống của sinh vật và kể cả xác chết của chúng đãgây ảnh hưởng xấu đến chất lượn nước nuôi thủy sản và sức khỏe của vật nuôi

1.2.2.4 Một số nguyên nhân khác

Dư lượng của các chất kháng sinh, dược phẩm, thuốc trị liệu và kích thích tốhay vật chất lơ lửng trong ao nuôi nhuyễn thể hay từ lồng bè, kim loại nặng, hóachất từ các vùng công nghiệp,… cũng là các nguyên nhân gây ô nhiễm nguồn nước.1.3 Vai trò của chế phẩm vi sinh trong nuôi trồng thủy sản

1.3.1 Khái niệm

Chế phẩm vi sinh hay probiotics là hỗn hợp vi sinh vật có lợi cho tôm bằngcách biến đổi hệ vi sinh vật xung quanh hoặc liên quan đến vật chủ, bằng cách nângcao khả năng sử dụng thức ăn hay nâng cao giá trị dinh dưỡng của thức ăn, nâng caođáp ứng của vật nuôi với mầm bệnh hay cải thiện chất lượng môi trường xungquanh thông qua quá trình phân hủy các chất hữu cơ trong nước nhan hơn (Moriaty,

1999; Tinh et al, 2007).

1.3.2 Thành phần

1.3.2.1 Vi khuẩn Gram dương

Các vi sinh vật Gram dương, hiếu khí và sinh bào tử được sử dụng nhằmmục đích nâng cao chất lượng nước ao nuôi do ức chế hệ vi sinh vật gây hại trongnước và làm giảm số mầm bệnh Một lợi ích trực tiếp trong việc sử dụng trực khuẩnnày là làm giảm việc sử dụng kháng sinh, hóa chất trong việc nuôi trồng thủy sản vànâng cao tỷ lệ sống của các loài nuôi trồng thủy sản ( Irianto và Austin, 2002 )

1.3.2.2 Vi khuẩn Gram âm

Có khả năng ức chế Saprolenia và A Salmocinida trên các loài cá có vây và

ngăn chặn các mầm bệnh trên tôm từ Vibrio spp, đồng thời có tác dụng làm giảm tỷ

lệ chết trên cá hồi ( Irianto và Austin, 2002 ), cải thiện chất lượng của ấu trùng cua,hàu và cá bơn, cải thiện quá trình tiêu hóa protein ở cá bơn khi được cung cấp qua

con đường cho ăn, làm tăng tỷ lệ sống của ấu trùng Pacific oyster ( Irianto và

Austin, 2002 )

1.3.2.3 Nấm men

Nấm men được ứng dụng phổ biến nhất với sự hiện diện của nấm men, nó sẽbám dính vào ruột, làm nâng cao sự tiết enzyme amylase và kích thích các enzymemàng ở ấu trùng sau 27 ngày tuổi ( Irianto và Austin, 2002 )

1.3.3 Vai trò

1.3.3.1 Cạnh tranh vị trí gắn kết

Một trong những cơ chế ngăn ngừa sự hình thành tập đoàn vi khuẩn gâybệnh là sự cạnh tranh vị trí gắn kết trên ruột hay trên bề mặt các mô khác

( Verschuere et al, 2000; Gullian et al, 2003; Tinh et al, 2007 ) Nên nhớ rằng khả

năng gắn kết trên ruột và bề mặt thành ruột là một quá trình rất cần thiết cho vikhuẩn cư trú trên ruột và chính là giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm của vi

khuẩn khác ( Verschuere et al, 2000 ) Do đó, việc cạnh tranh vị trí gắn kết có thể

được xem như là một hàng rào đầu tiên của hệ thống phòng chống lại sự xâm nhiễm

của vi khuẩn gây bệnh ( Tinh et al, 2007 ).

1.3.3.2 Sản xuất các chất ức chế

Một quần thể vi sinh vật đều có thể tạo ra cơ chế hóa học có khả năng tiêudiệt hoặc ức chế các quần thể vi sinh vật khác Chính sự hiện diện của các vi khuẩn

có khả năng sản xuất ra các chất ức chế trong ruột của vật chủ tạo nên một hàng rào

bảo vệ chống lại các bệnh cơ hội ( Verschuere et al, 2000; Tinh et al, 2007 ).

Các nhân tố ức chế được các vi khuẩn probiotic sản xuất ra bao gồm: khángsinh, bacteriocin, siderophone, lysozyme, protease, hydroperoxide, thay đổi giá trị

pH bằng cách tạo ra các acid hữu cơ ( Verschuere et al, 2000 ).

1.3.3.3 Cạnh tranh các nguồn năng lượng

Sự cạnh tranh diễn ra giữa vi sinh vật probiotic và các vi khuẫn gây bệnh chủyếu là sự cạnh tranh các ion sắt vì hầu như tất cả các vi sinh vật đều cần sắt để phát

triển ( Verschuere et al, 2000 ) Siderophore là một tác nhân giữ ion sắt chuyên biệt

có trọng lượng phân tử thấp có khả năng phân hủy sắt kết tủa và biến nó thành sắt

mà vi sinh vật có thể sử dụng được Do đó, các chũng vi khuẩn vô hại có thể sảnxuất siderophore được sử dụng như probiotic cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh

có thể sản xuất siderophore đồng thời cạnh tranh các ion sắt trong môi trường ion

sắt hiện diện hạn chế ( Verschuere et al, 2000; Tinh et al, 2007 ) Hiệu quả của các

vi sinh vật probiotic này làm tăng tính kháng Vibrio đã được kiểm chứng trên ấu trùng cá bơn ( Verschuere et al, 2000 )

1.3.3.4 Tăng cường sự hấp thu dinh dưỡng

Hệ vi sinh vật đường ruột đóng vai trò rất quan trọng đối với khả năng hấpthu chất dinh dưỡng của vật chủ Do đó, để tăng cường khả năng hấp thu chất dinhdưỡng ở vật chủ đòi hỏi hệ vi sinh vật đường ruột phải hoạt dộng tích cực Trongmột số nghiên cứu về tác dụng tăng cường hấp thu chất dinh dưỡng của vi sinh vậtprobiotic trong ruột của vật chủ, nấm men nâng cao sự ổn định của hệ vi sinh vật

đường ruột vì chúng hoạt động như một nhà sản xuất polyamine (Tinh et al, 2007 ).

1.3.3.5 Ảnh hưởng đến hệ thống nước xanh

Sự bổ sung chế phẩm probiotic trong đó có sự hiện diện của vi nấm, như bổ

sung vi nấm Isochrysis galbana vào môi trường nước trong quá trình nuôi cá chẽm

có thể làm giảm tỷ lệ chết của ấu trùng cá chẽm Ở ấu trùng của tôm, vi nấm có khả

năng kháng khuẩn nhất là hoạt tính chống lại các chủng Vibrio spp gây bệnh trên

tôm

1.3.3.6 Nâng cao đáp ứng miễn dịch

Các chất kích thích miễn dịch là các hợp chất hóa học hoạt hóa hệ thốngmiễn dịch của vật nuôi để chống lại sự xâm nhiễm của virus, vi khuẩn, nấm và canthiệp vào hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh và nâng cao chất lượngnước ao nuôi

1.3.4 Ứng dụng chế phẩm vi sinh trong ổn định xử lý nước

 Có khả năng tiêu diệt vi trùng gây bệnh làm cho vi trùng gây bệnh không tồntại lâu dài và phát triển trong môi trường nước

 Giúp giảm các chỉ tiêu như: COD, BOD, TSS, NH4, NH3, NO2…

 Làm tăng khả năng sự tạo bông và kết lắng của bùn hoạt tính, tăng mật độ visinh vật hữu ích trên các màng đệm sinh học giúp tăng cường hiệu quả trong các

hệ thống xử lý nước thải, giúp quá trình làm sạch được ổn định và đạt chỉ tiêu xảthải, phân hủy các mùn bã hữu cơ, xử lý khí độc trong ao nuôi tôm và làm sạchmôi trường, tăng hệ men vi sinh có lợi trong đường ruột của tôm, cá nuôi giúp tiêuhóa thức ăn tốt hơn Cuối cùng là tác dụng chữa trị và phòng một số bệnh phổ biếntrên thủy sản

1.4 Vi khuẩn keo tụ sinh học và vai trò trong nuôi trồng thủy sản

1.4.1 Khái niệm keo tụ sinh học

Keo tụ sinh học (Bioflocculant) là sản phẩm được hình thành trong quá trìnhphát triển của vi khuẩn, nấm, tảo (Desouky và cộng sự, 2008) Protein,polysaccharide, glycoprotein, nucleic acid và một vài đại phân tử khác là thành phầnchính của chất keo tụ sinh học (Lin J và Harichund C, 2012)

1.4.2 Giai đoạn hình thành

Sự keo tụ bao gồm 2 giai đoạn:

 Keo tụ ẩn: bằng mắt thường quan sát vẻ bên ngoài ta không thể nhận biết bất

cứ một biến đổi nào, mặc dù trong thực tế các hạt keo đã chập lại với nhautập hợp thành các hạt lớn hơn

 Keo tụ rõ: là giai đoạn thấy rõ sự biến đổi về màu sắc, ánh quang rồi chuyển đổi đến trạng thái đục mờ và cuối cùng tạo ra kết tủa

1.4.1 Vi khuẩn sản xuất keo tụ sinh học

Vi khuẩn sản xuất chất keo tụ sinh học là những loài vi khuẩn có thể sử dụngchất dinh dưỡng trong môi trường để tổng hợp các hợp chất đa phân tử trong tế bàodưới sự hoạt động của các enzyme đặc biệt, sau đó chúng có thể được bài tiết rangoài và tồn tại trong môi trường hoặc trên bề mặt vỏ tế bào vi khuẩn, các hợp chấtnày có khả năng tạo sự kết tụ với các chất khác nhau và tạo thành một khối nhầylắng xuống dưới đáy

Gần đây, chất keo tụ sinh học được ứng dụng nhiều trong việc loại bỏ chấtrắn lơ lửng ở các ngành công nghiệp, sinh hoạt, vật liệu xây dựng, xử lý nước thải

chăn nuôi vì hiệu quả cao, ít tốn kém, không độc hại với con người và môi trường.

Sự kết tụ các vật chất này giúp làm giảm các chỉ tiêu như COD và một phần độ đụccủa nước thải trước khi nước thải được xử lý bằng các phương pháp khác

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Thời gian

Từ ngày 1 tháng 4 năm 2018 đến ngày 29 tháng 7 năm 2018

2.1.2 Địa điểm thu mẫu

Mẫu được thu ở Hòa Minh, xã Long Hưng 1, huyện Châu Thành, thành phốTrà Vinh

2.1.3 Địa điểm tiến hành nghiên cứu

Phòng Thí nghiệm Viện Khoa học Ứng dụng Hutech, Trung tâm Đào tạonhân lực chất lượng cao Hutech, Khu Công Nghệ cao TP.HCM, Phường Hiệp Phú,Quận 9, TP.HCM

 NaCl (Trung Quốc)

 NaOH 2N (Trung Quốc)

 HCl 2N (Trung Quốc)

 Kaolin (Trung Quốc)

 CaCl2 (Trung Quốc)

 Glycerol (Trung Quốc)

 Peptone (Trung Quốc)

 Yeast extract (Himedia, Ấn Độ)

 Meat extract (Himedia, Ấn Độ)

 Urea (Trung Quốc)

 D-Glucose (Trung Quốc)

 Cồn 70o, cồn 96o

 (NH4)2SO4 (Trung Quốc)

 KH2PO4 (Trung Quốc)

 K2HPO4.3H2O (Trung Quốc)

 MgSO4.7H2O (Trung Quốc)

 Đũa thủy tinh

 Bao hấp, giấy gói, thun

 Cân phân tích A&D HR – 200 (Nhật)

 Nồi hấp khử trùng Autoclave ES – 315, Tomy (Nhật)

 Tủ ủ Sanyo MIR – 162, Sanyo (Nhật)

 Máy cô quay LABOROTA 4001– efficient, Heidolph (Đức)

 Que cấy vòng

 Bình chiết quả lê

 Máy lắc tròn SK-O330-Pro

 Cân phân tích A&D HR – 200 (Nhật)

 Máy quang phổ kế JASCO

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu

Các mẫu được thu ở vị trí gần đáy ao bằng cách sử dụng gàu, mẫu nước sẽbao gồm các phần nước và bùn Sau khi thu, mẫu sẽ được chuyển về phòng thínghiệm và bảo quản ở 40C Các mẫu nước được cho vào phễu chiết quả lê và phầnlắng sẽ được thu bằng erlen đã được hấp vô trùng

Hình 2.1: Mẫu lấy từ ao nuôi tôm ở

2.3.3 Phương pháp nhuộm Gram

Làm tiêu bản

 Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm vết bôi trên lame

 Dùng que cấy lấy một chút sinh khối

 Để khô vết bôi trong không khí hoặc cố định nhẹ trên đèn cồn

 Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh trong 1 phút

 Làm khô và soi tiêu bản với vật kính dầu

2.3.4 Phương pháp nhuộm bào tử

 Dùng dây cấy vòng vô trùng lấy sinh khối vi khuẩn cần xác định làm vết bôi trên lame

 Đặt một cốc nước trên bếp từ và đun sôi Sau đó đặt lên trên miệng cốc một miếng giấy lọc

 Cho dung dịch Malachite Green 5% vào vết bôi và đặt lame có sinh khối của

vi khuẩn lên miếng giấy lọc trên cốc và để trong thời gian 5 phút

 Sau đó rửa vết bôi bằng nước cất trong khoảng thời gian 30 giây

 Nhuộm bổ sung với thuốc nhuộm Fuchsin trong khoảng 60-90 giây

 Rửa lại bằng nước rồi thấm khô

 Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X

2.3.5 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật

2.3.5.1 Phương pháp cấy chuyển vi sinh vật

 Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, dễ thực hiện, các chủng

vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điểu kiện môi trườngthích hợp cho vi sinh vật phát triển Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát(từ 30C-50C) để bảo quản Quá rình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhấtđịnh, nhằm đảm bảo vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già

và chết Tùy từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyềnkhác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyền 1 lẩn

 Cách tiến hành: Giống vi sinh vật thuần khiết, được bảo quản trong ống

thạch nghiêng và giữ ở nhiệt độ 40C Sau 1 đến 3 tháng phải cấy truyền vi sinh vậtqua ống thạch nghiêng mới bằng cách dùng que cấy vòng lấy sinh khối vi sinh vậttrong ống thạch nghiêng cũ ria vào ống thạch nghiêng mới, sau đó đem ống thạchnghiêng mới đem đi ủ, thời gian ủ từ 48-72 giờ Ống thạch nghiêng chứa vi sinh vậtđược bảo quản trong tủ lạnh ở 40C (Nguyễn Văn Dũng và Dương Văn Hợp,

2007) 2.3.5.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu

 Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có thể giữgiống trong điều kiện lạnh sâu Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quátrình làm lạnh và tan mẫu Một nguyên nhân dẫn đến vỡ tế bào là việc tích lũy cácchất điện giải trong mãy bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào Đểkhác phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu

và tan nhanh như glycerol

 Cách tiến hành: Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích

hợp rồi hút 1 ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch vàthu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữgiống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Văn Dũng và Dương Văn Hợp, 2007)

2.3.6 Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật

 Mục đích: nhằm hoạt hóa các vi khuẩn được giữ giống phát triển lại bình

thường vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản

 Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh

dưỡng thích hợp Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinhdưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinhvật mà còn phải đảm bảo đầy đù các điều kiện hóa lý thích hợp đối với sự trao đổichất giữa sinh vật và môi trường

 Cách tiến hành: Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi

khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường TSA hay glycerol 40%, tiến hành tăng sinhbằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trường TSB trongđiều kiện vô trùng Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ởnhiệt độ phòng Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy ( Lê NgọcThùy Trang, 2013 ) Mật độ tế bào vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đomật độ ở bước sóng 600 nm

 Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (Công thức McFahrland)

Mật độ =OD600 nm x 1,02 x109 (cfu/ml)

2.3.7 Phương pháp đánh giá hoạt tính keo tụ sinh học

Kiểm tra khả năng kết tụ của các dòng vi khuẩn bằng hỗn hợp gồm 93 mldung dịch Kaolin (5 g/l); 5 ml dung dịch CaCl2 1%, pH =7; 2 ml dịch vi khuẩn Hỗnhợp được lắc trên máy lắc xoay vòng ở tốc độ 180 vòng/phút trong 1,5 phút rồi 80vòng/phút trong 3 phút , để lắng 10 phút, sau đó lấy phần trong ở trên đem đo OD ởbước sóng 550 nm Mẫu đối chứng thực hiện tương tự nhưng thay chủng vi khuẩnbằng nước cất vô trùng Tỷ lệ kết tụ được tính theo công thức:

Tỷ lệ keo tụ (%) = OD đối chứng−OD mẫu x 100%

 Cơ sở sinh hóa

Enzyme catalase hiện diện trong hầu hết các vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí có hệthống cytochrome và những vi sinh vật không có hệ thống cytochrome thì cũngkhông có catalase nên không có khả năng phân hủy hydroperoxide (H2O2)

Catalase là một homoprotein gồm 4 cấu tử protein và một nhân Fe2+ có khảnăng hân hủy hydroperoxide là một phân tử có độc tính cao trong tế bào, thành H2O

và để giải độc cho tế bào Trong phản ứng này, một phân tử hydroperoxide đóng vaitrò là một chất cho điện tử và một phân tử hydroperoxide khác đóng vai trò là mộtchất nhận điện tử Phân tử H+ từ chất cho điện tử sẽ khử cơ chất tạo nước và oxyphân tử

 Cách tiến hành

Hóa chất sử dụng là hydroperoxide 30% được giũ lạnh trong chai màu, tránh ánh sáng, dung dịch đệm phosphate pH 7,4

Có thể thực hiện phản ứng catalase theo các cách:

Thử trên lame: dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối đặt trên lame Nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật Ghi nhận lại sự sủi bọt nếu có

Thử trong ống nghiệm thạch nghiêng: nhỏ trực tiếp 1 ml H2O2 30% lên sinh khối của vi sinh vật Ghi nhận lại sự sủi bọt

 Đọc kết quả

Thử nghiệm (+): có hiện tượng sủi bọt khí

Thử nghiệm (-): không có hiện tượng sủi bọt khí

Hình 2.3: Thử nghiệm Catalase

b) Thử nghiệm Voges Proskauer (VP)

 Nguyên tắc: Phát hiện khả năng vi sinh vật tạo thành một số sản phẩm trung

tính acetylmethylcarbimol (acetoin) trong quá trình lên men glucose

 Cơ sở sinh hóa

Thử nghiệm VP nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản phẩm trung tínhtrong quá trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật Ở tế bào vi sinh vật, sựphân hủy glucose tạo ra sản phẩm trung gian là acid pyruvic, từ đó có thể chia visinh vật thành 2 nhóm theo 2 con đường chuyển hóa pyruvic khác nhau nhu sau:

nhóm trao đổi không tạo thành 2,3-butanediol như E.Coli là nhóm VP (-) và nhóm trao đổi tạo thành 2,3-butanediol, như Klebsiella là nhóm VP (+) Tuy nhiên, phản

ứng VP nhắm mục dích phát hiện acetoin là một tiền chất của 2,3-butanediol Vìacetoin là tiền chất của 2,3-butanediol nên trong quá trình nuôi cấy tích lũy rất ít Để

dễ dàng cho quá trình phát hiện, vi dinh vật phải được nuôi cấy trong điều kiện hiếukhí

Để phát hiện acetoin trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật, α-naphtol được sửdụng như một thuốc thử hát hiện môi trường kiềm mạnh được tạo ra KOH 40%được cho vào môi trường thử nghiệm

 Cách tiến hành

Cấy vi sinh vật vào môi trường glucose phosphate (MR-VP broth), ủ ở nhiệt độ

300C trong 2-5 ngày Thêm vào canh khuẩn dịch thuốc thử α-naphtol 5% trong cồn

và dung dịch KOH 40% với tỷ lệ 3:1 Quan sát phản ứng xảy ra trong 5 phút

 Đọc kết quả

Thử nghiệm (+): xuất hiện màu đỏ trên bề mặt môi trường

Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu

Hình 2.4: Thử nghiệm Voges Proskauer

c) Thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột

 Nguyên tắc: Nhằm xác định xem vi sinh vật có khả năng sản sinh hệ

enzyme amylase thủy phân tinh bột thành glucose hay không.

 Cơ sở sinh hóa

Tinh bột là một đại phân tử có cấu trúc từ các đơn phân là glucose gồm có haidạng amylose và amylopectin Amylose là phân tử tinh bột dạng thẳng không phânnhánh, cấu tạo từ 200-300 đơn vị, trong khi đó amylopectin là phân tử nhánh Tinhbột dễ dàng bị thủy phân bởi các vi sinh vật có khả năng sản sinh enzyme amylase

để tạo thành dextrin, maltose và glucose

Để phát hiện khả năng thủy phân tinh bột, sử dụng thuốc thử lugol là chất chỉthị Khi có sự hiện diện của tinh bột, iodine tạo phức màu nâu Khi tinh bột bị thủyphân, lugol không tạo phức nên màu nâu biến mất

 Cách tiến hành

Trong thử nghiệm này sử dụng môi trường Starch Agar với phương pháp cấyđiểm (agar spot) Sau đó tiến hành ủ ở 300C trong 24 giờ rồi đổ dung dịch lugolvào Nếu xung quanh cấy điểm không hình thành màu nâu thì kết quả đó dương tính

và ngược lại

 Đọc kết quả

Thử nghiệm (+): không xuất hiện màu nâu xung quanh điểm cấy

Thử nghiệm (-): toàn bộ đĩa xuất hiện màu nâu phức hợp của iodine và tinh bột

Hình 2.5: Thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột

d) Thử nghiệm trên môi trường TSI

 Nguyên tắc: Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng

các nguồn cacbonhydrate có mặt trong môi trường, khả năng sinh H2S, khả năngsinh gas trong môi trường

 Cơ sở sinh hóa

Môi trường TSI là môi trường rắn sử dụng trong thử nghiệm sinh hóa Môitrường TSI có các nguồn carbohydrate: lactose 1%, glucose 0,1% và sucrose 1%

Có 3 trường hợp xảy ra khi nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường TSI: chỉ lênmen glucose, lên men cả glucose lẫn lactose và không lên men được cả 2 nguồncacbonhydrate này

Nếu vi sinh vật lên men được glucose sau 18-24 giờ nuôi cấy: phần nghiêng củamôi trường pH có kiềm và phần sâu có pH acid Hiện tượng này được quan sát khi

có chất chỉ thị pH trong môi trường và chất chỉ thị pH thường được sử dụng làphenol red Điều này có nghĩa là trên phần nghiêng, một lượng nhỏ glucose được sửdụng hết hoàn toàn, sau đó chúng sử dụng đến pepton làm giải phóng NH3→pHkiềm→phần nghiêng có màu đỏ Trong khi đó, ở phần sâu có sự lên men kỵ khíglucose→các acid hữu cơ→pH acid→phần sâu có màu vàng

Nếu vi sinh vật có thể sử dụng cả hai nguồn carbohydrate: cà phần sâu lẫn phầnnghiêng đều có tính acid sau 18-24 giờ nuôi cấy→cả phần nghiêng lẫn phần sâu đề

có màu vàng vì lượng đường lactose đủ để vi sinh vật sử dụng trong thời gian này.Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả 2 nguồn cabonhydrate trên: khi đónguồn peptone trở thành nguồn cung cấp năng lượng cho quá trình sinh trưởng vàphát triển của vi sinh vật→làm môi trường có màu đỏ

Trong môi trường nếu có tạo thành H2S sẽ làm đen môi trường nuôi cấy Còntrường hợp có sinh gas thì sẽ tích tụ trong môi trường và có thể làm vỡ thạch haytạo thành các bọt khí bên trong

 Cách tiến hành

Môi trường TSI được chuẩn bị trong các ống nghiệm với phần nghiêng cáchnắp ống khoảng 2,5 cm, phần sâu có chiều cao khoảng 2,5 cm Dùng que cấy thẳngđưa vi sinh vật vào phần sâu của ống nhưng không đụng đáy ống, sau đó cấy ria lênphần nghiêng Ủ các ống nghiệm đã cấy ở 300C trong 18-24 giờ Ghi lại các biểuhiện ở phần sâu, phần nghiêng, sinh H2S và sinh gas

Hình 2.6: Thử nghiệm TSI

e) Thử nghiệm Citrate

 Nguyên tắc: Nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng citrate như là

nguồn carbon duy nhất hay không

 Cơ sở sinh hóa

Sự biến dưỡng citrate thường thông qua sự kết hợp với acetylCoA thànhoxaloacetate để vào chu trình Krebs Sản phẩm biến dưỡng citrate thay đổi tùy pHcủa môi trường Khi pH tăng môi trường chuyển sang kiềm, lượng formate vàacetate tăng trong khi lactate và CO2 giảm Ở pH trung tính, sản phẩm chủ yếu là

CO2 và acetate, còn ở pH acid, sản phẩm tạo ra chủ yếu là acetoin và lactate Nhưvậy, sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường

Mặt khác, các vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate như là carbon duy nhất cókhả năng sử dụng muối ammonium như làm nguồn nitơ duy nhất→sinh ra NH3 làmkiềm hóa môi trường.

Như vậy, trong môi trường thử nghiệm khả năng sử dụng citrate như là nguồncarbon duy nhất có chứa đạm ở dạng muối ammonium sẽ làm tăng pH của môitrường thể hiện qua sự đổi màu chỉ thị pH trong môi trường

Thử nghiệm (+): môi trường chuyển sang màu xanh dương

Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu

Hình 2.7: Thử nghiệm Citrate

f) Thử nghiệm thủy phân casein

 Nguyên tắc: Thử nghiệm này nhằm xác định xem vi sinh vật có khả năng

thấm qua màng nguyên sinh chất của vi khuẩn Do đó, trước khi casein vi khuẩn sử