Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật đất vùng rễ một số cây trồng ở việt nam cây thuốc có củ (cây nghệ), cây công nghiệp (cà phê) nhằm tăng năng suất và chất lượng cây trồng

Mycorrhiza là thể cộng sinh giữa hệ sợi nấmtrong đất với rễ của thực vật bậc cao, đây là mối quan hệ cộng sinh không thểtách rời, ảnh hưởng đến nhau: Nấm không có rễ thì không thể tồn tạ

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

***

BÙI ANH VĂN

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG KHU HỆ

NẤM VÙNG RỄ CÂY NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONGA L.)

VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

***

BÙI ANH VĂN

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG KHU HỆ

NẤM VÙNG RỄ CÂY NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONGA L.)

VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LÊ MAI HƯƠNG

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đãnhận được nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô, các anh chị và gia đình.

Với tất cả tấm lòng chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tớiPGS.TS Lê Mai Hương người đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, hướng dẫn tôi thựchiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa để tôi hoàn thiện luận văn này

Tôi xin đươc bày tỏ lòng biết ơn đến đề tài “Nghiên cứu metagenome của

vi sinh vật đất vùng rễ một số cây trồng ở Việt Nam: cây thuốc có củ (câynghệ), cây công nghiệp (cà phê) nhằm tăng năng suất và chất lượng cây trồng”MS: ĐTĐLCN.14/4 thuộc chương trình Hợp tác Nghiên cứu Việt Nam – HàLan, do PGS.TS Lê Mai Hương chủ nhiệm đã cho tôi cơ hội được thực hiệnnghiên cứu của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô giáo của Viện Sinh thái và Tàinguyên sinh vật, Trường Đại Học Thái Nguyên đã tận tình truyền đạt cho tôikiến thức trong suốt 2 năm học tập, là nền tảng cho tôi trong quá trình nghiêncứu luận văn, là hành trang quý báu theo tôi trong suốt cuộc đời

Tôi xin chân thành cảm ơn Ths Nguyễn Đình Luyện, Ths Hoàng Kim Chi

và tập thể cán bộ công tác tại phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hoá học cácHợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến gia đình thân yêu của tôi,những người đã luôn ở bên tôi, ủng hộ động viên và là chỗ dựa vững chắc để tôiyên tâm học tập hoàn thành khóa học này

Cuối cùng tôi xin kính chúc quý Thầy, Cô, Anh, Chị và gia đình dồi dào sức khỏe, thành công trong sự nghiệp!

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 18 tháng 10 năm 2018

Tác giả luận văn

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này làhoàn toàn trung thực, chưa hề sử dụng cho bảo vệ một học vị nào Mọi sự giúp

đỡ cho hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn Các thông tin, tài liệu trìnhbày trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc./

Tác giả luận văn

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Cây Nghệ vàng(Curcuma longa L.) 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật 3

1.1.2 Thành phần hóa học 4

1.2 Đại cương khu hệ nấm vùng rễ 5

1.2.1 Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhizae) 5

1.2.2 Nấm ngoại cộng sinh (Ectomycorrhizae) 6

1.2.3 Nấm rễ nội ngoại cộng sinh (Ectoendo mycorrhiza) 7

1.2.4 Một số loại nấm rễ khác. 8

1.2.5 Sự hình thành nấm cộng sinh vùng rễ 8

1.2.6 Tính chuyên hóa của khu hệ nấm cộng sinh vùng rễ 10

1.3 Vai trò khu hệ nấm vùng rễ 11

1.4 Nấm vùng rễ trên cây thuốc 15

1.5 Một số yếu tố tác động đến khu hệ nấm vùng rễ 15

1.5.1 Ảnh hưởng của các yếu tố lý học 15

1.5.2 Sự tương quan giữa các nhóm vi sinh vật với khu hệ nấm vùng rễ.17 1.6 Một số nghiên cứu về khu hệ nấm vùng rễ 17

1.6.1 Trên thế giới 17

1.6.2 Việt Nam 21

1.7 Công nghệ metagenomics trong nghiên cứu các khu hệ vi sinh vật 23

1.7.1 Giới thiệu về công nghệ metagenomics 23

1.7.2 Công nghệ metagenomics trong nghiên cứu khu hệ vi sinh vật đất .24 CHƯƠNG II : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26

2.1.1 Mẫu nghiên cứu 26

2.1.3 Hóa chất 26

2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 26

2.1.5 Môi trường 26

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu 27

2.2.2 Phân lập bào tử AM 28

2.2.3 Phân lập chủng nấm vùng rễ 28

2.2.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến khu hệ AM 29

2.2.5 Hoạt tính sinh enzyme ngoại bào 29

2.2.6 Tách chiết DNA tổng số 29

2.2.7 Kỹ thuật PCR 30

2.2.8 Phương pháp Tách dòng gen thông qua vector pBT 31

2.2.9 Đọc và phân tích trình tự 32

CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Phân lập bào tử nấm rễ nội cộng sinh 34

3.2 Ảnh hưởng của thời gian thu mẫu đến khu hệ nấm AM vùng rễ Curcuma longa L. 35

3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến khu hệ AM 38

3.4 Phân lập các chủng nấm vùng rễ khác 42

3.4.1 Phân lập mẫu rễ 42

3.4.2 Phân lập mẫu đất vùng rễ 43

3.5 Khả năng sinh enzyme ngoại bào 45

CHƯƠNG IV : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

4.1 Kết Luận 49

4.2 Kiến nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 56

STT Từ viết tắt Viết đầy đủ

3 AEM Nấm rễ nội cộng sinh không có màng ngăn

Hình 1 1: Cây nghệ vàng trông tại Hưng Yên [48] 3

Hình 1 2: Nấm rễ nội cộng sinh [47] 6

Hình 1 3: Nấm rễ ngoại cộng sinh [46] 7

Hình 3 1: Bào tử AM phân lập từ các mẫu đất N1t và N11t 35

Hình 3 2: Khả năng sinh enzyme ngoại bào 47

Bảng 2 1: Trình tự mồi sử dụng cho định danh các chủng nấm 30Bảng 2 2: Trình tự mồi cho định danh các chủng nấm AM 31Bảng 3 1: Số lượng bào tử AM tổng số trong 100g đất phân lập 34Bảng 3 2: Số lượng và thành phần nấm AM trong các mẫu đất vùng rễ ở

khoảng thời gian khác nhau. 35Bảng 3 3: Số lượng và thành phần nấm AM trong các mẫu đất vùng rễ ở điềukiện nitơ khác nhau. 40Bảng 3 4: Đặc điểm các chủng nấm phân lập từ rễ cây nghệ 44Bảng 3 5: Đặc điểm các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ cây nghệ 46Bảng 3 6: Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm phân lập 47

Biểu đồ 3 1: Tổng số loài và chi nấm AM có trong các mẫu đất 37Biểu đồ 3 2: Tổng số loài và chi nấm AM có trong các mẫu đất vùng rễ ở điềukiện bón nitơ khác nhau 41

Biểu đồ 3 3: Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm phân lập 47

MỞ ĐẦU

Khu hệ nấm vùng rễ là quần hợp nấm - thực vật đóng vai trò quan trọngtrong quá trình phát triển của thực vật cũng như nhiều hệ sinh thái Hơn 90%các loài thực vật có quan hệ với nấm theo hình thức nấm rễ và phụ thuộc vàomối quan hệ này để tồn tại Chúng phát triển bằng cách phát triển hệ sợi ra vùngđất bao quanh rễ và lan dần ra xung quanh, nhờ đó làm tăng khả năng hấp thudinh dưỡng, nước của hệ rễ và đồng thời làm thay đổi cấu trúc đất theo chiềuhướng có lợi Với tầm quan trọng và ý nghĩa thiết thực hình thức cộng sinh này

đã và đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng vào thựctiển sản xuất nông - lâm nghiệp ở nhiều nước trên toàn thế giới

Nghệ vàng (Curcuma longa L.) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), thân rễ

nghệ vàng chứa tinh dầu, đặc biệt curcumin – hoạt chất quý trong y dược Nghệkhông chỉ làm gia vị để tạo màu cho món ăn mà đặc biệt nghệ còn dùng để làmthuốc, có nhiều loại nghệ nhưng nhưng nghệ vàng được sử dụng phổ biến trongcông nghiệp thực phẩm và dược phẩm Nghệ vàng có vị đắng cay, mùi thơmhắc, tính ấm, có tác dụng hành khí phá ứ, thông kinh chỉ thống Nghệ vàng dùng

để chữa các bệnh: viêm loét dạ dày, phong thấp, tay chân đau nhức, đặc biệtNghệ vàng còn dùng để điều trị ung thư, tiểu đường, viêm gan B, C, kháng nấm,chống oxy hóa, sử dụng trong Mỹ phẩm và Thực phẩm [9] Hoạt chất Curcumin

trong củ Nghệ (Curcuma longa L.): Curcumin là thành phần chính của

Curcuminoit – một chất trong củ Nghệ, có tên khoa học là hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5dione Curcumin có dạng bộtmàu vàng được mệnh danh như một loại thần dược có khả năng phòng chống vàchữa được rất nhiều loại bệnh: tác dụng chuyển hóa lipid, hoạt tính chống viêm,chống oxy hóa, chống ung thư - cảm ứng apoptosis, chống tăng sinh mạch máu

(1E,6E)-1,7-bis(4-ở khối u, giúp tăng cường miễn dịch, chống đông máu, hoạt tính kháng khuẩn,kháng nấm, kháng virus Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu về cây nghệ, nhưngkhu hệ nấm cộng sinh vùng rễ thì vẫn chưa được quan tâm nghiên cứu Vì vậy

đây là một hướng tiếp cận mới trong nghiên cứu toàn diện về cây nghệ tronglĩnh vực các hợp chất thiên nhiên Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề

tài “Bước đầu nghiên cứu đa dạng khu hệ nấm vùng rễ cây nghệ vàng (Curcuma longa L.) và khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng”, trong nghiên cứu này, chúng

tôi đã sử dụng kỹ thuật metagenomics để nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu

tố dinh dưỡng tới khu hệ nấm vùng rễ, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

Mục tiêu nghiên cứu: Xác định mức độ đa dạng khu hệ nấm rễ AM và đánh giá

một số chỉ tiêu sinh hóa

Nội dung nghiên cứu:

 Khảo sát khu hệ nấm vùng rễ cây nghệ vàng: Phân lập và phân loại một

số chủng nấm vùng rễ nội cộng sinh và ngoại cộng sinh

 Đánh giá ảnh hưởng hàm lượng nitơ, thời gian thu mẫu lên sự đa dạng khu hệ nấm vùng rễ dụng kỹ thuật phân tích dữ liệu metagenomics

CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Cây Nghệ vàng(Curcuma longa L.)

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Cây Nghệ vàng còn có tên “Uất kim”, Khương hoàng Tên khoa học là

Curcumin longa L, họ gừng (Zingiberaceae), thuộc loại cây cỏ dại cao 0,6 – 1m

thân rễ thành củ hình trụ hoặc hơi dẹt, khi cắt ngang có màu vàng sẫm [9] Câynghệ vàng được trồng phổ biến trong nước, tuy nhiên tập trung nhiều nhất ởvùng Hưng Yên, Thanh Hóa, Bình Dương Trên thế giới có nhiều ở Ấn Độ,Indonesia, Campuchia, Lào, Trung Quốc và một số nhiệt đới khác

Hình 1 1: Cây nghệ vàng trông tại Hưng Yên [48]

Nghệ vàng thuộc chi Curcuma, họ gừng Chi này có 15 loài, trong đó ở

Việt Nam tìm thấy 14 loài Theo các nghiên cứu gần đây, còn có nhiều loài khác

trong chi này có hoạt chất Curcumin như C.aromatica (nghệ trắng), C.zedoaria

( nghệ đen), lượng Curcumin cao nhất (cỡ 0,3%) phổ biến nhất ở Việt Nam chonên rất thuận lợi cho việc dùng làm nguyên liệu sản xuất Curcumin [9]

1.1.2 Thành phần hóa học

Bằng các nghiên cứu khoa học đã thực hiện từ năm 1988 đến nay thànhphần hóa học của củ nghệ vàng đã được xác định là gồm các thành phần chínhnhư curcumin, tinh dầu, tinh bột, v.v Sau đây là các thành phần cụ thể:

 Chất màu curcumin 0,3% - 1%, tinh thể nâu đỏ ánh tím, không tan trong nước, tan trong cồn, ete, clorofoc, dung dịch có huỳnh quang màu xanh lục

- Các chất màu vàng gọi chung là curcumin Vào đầu thế kỉ XIX người ta

đã chiết được curcumin tinh thể không tan trong nước, tan trong cồn, ete, dầubéo Nhưng năm 1953 Srinivasan đã chứng minh bằng sắc kí cột silic rằng đó làhỗn hợp:

- Curcumin chính thức (còn gọi là curcumin I) chiếm 60% đây là mộtdixeton đối xứng không no có thể coi như là diferuloyl-metan (axit ferulic làaxit hydroxy-4-metoxy-3-xinamic)

- Curcumin II hay demetoxy-curcumin chiếm 24% và curcumin III hay demetoxy-curcumin chiếm 14% trong đó 1 hay 2 hydroxyxinamic thay cho axitferulic Nếu dùng sắc kí trên giấy sẽ thấy các chất curcumin khác nữa nhưng vớilượng rất nhỏ

bis Năm 1977, Nguyễn Khang (Đại học Dược Hà Nội) đã chiết từ bột củnghệ sau khi đã cất lấy hết tinh dầu bằng benzen, sau đó thu hồi dung môi trong

áp lực giảm và kết tinh bằng cồn etylic cho tới khi có độ chảy không thay đổi vàmột vết trên sắc kí lớp mỏng đã thu được 0,76 – 1,1% curcumin I tinh khiết, độchảy 182 -183°C Nếu chọn củ nghệ thu vào tháng 1, tháng 2 có thể đạt tới 1,5%curcumin

 Tinh dầu 1 – 5% có màu vàng nhạt, thơm Trong tinh dầu gồm có 25%cacbua tecpenic, chủ yếu là zingiberen và 65% xeton sespuitecpenic, các chất tumeron, curcumen C15H24 một cacbon không no

 Ngoài ra còn tinh bột, canxi oxalat, chất béo Củ nghệ chứa 8 – 10% nước, 6 – 8% chất vô cơ, 40 – 50% tinh bột nhựa

1.2 Đại cương khu hệ nấm vùng rễ

Trong tự nhiên, giữa các sinh vật đều có mối quan hệ với nhau, ảnh hưởnglẫn nhau tạo thành quần xã sinh vật Trong đó, quan hệ cộng sinh là cả hai cùngsống chung và cùng tồn tại Khi mối quan hệ đó phát triển đến mức độ cao thìhình thành một loại cộng sinh Mycorrhiza là thể cộng sinh giữa hệ sợi nấmtrong đất với rễ của thực vật bậc cao, đây là mối quan hệ cộng sinh không thểtách rời, ảnh hưởng đến nhau: Nấm không có rễ thì không thể tồn tại, cây không

có nấm thì sinh trưởng phát triển kém và chết Sự cộng sinh giữa khu hệ nấm và

rễ cây mang lại lợi ích cho cả hai bên Thuật ngữ “Mycorrhiza” lần đầu tiênđược Frank – nhà bệnh cây lâm nghiệp người Đức – đưa ra vào năm 1885 để chỉmối quan hệ đặc biệt giữa rễ cây và nấm ngoại cộng sinh [35] Thuật ngữ nàybắt nguồn từ chữ Hy Lạp: Mykes (nấm) và Rhiza (rễ)

Người ta thường chia khu hệ nấm cộng sinh trong đất và rễ thành 3 loại:nẫm rễ ngoại cộng sinh, nấm rễ nội cộng sinh và nấm rễ nội ngoại cộng sinh.Ngoài ra, còn có một số loại khác

1.2.1 Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhizae)

Nấm rễ nội cộng sinh là nấm với thể sợi nấm xuyên qua các tế bào rễ,thường có một phần của sợi nấm còn nằm phía ngoài nhưng chúng không tạolớp vỏ bao ngoài rễ Đặc trưng là không có sự biến đổi màu sắc và hình thái của

rễ, có lông hút, không có thể sợi nấm và không có mạng lưới Hartig Dựa vàokết cấu sợi nấm có vách ngăn và vòi hút, người ta chia nấm nội cộng sinh thành

2 loại:

- Nấm rễ nội cộng sinh không có màng ngăn (AEM)

- Nấm rễ nội cộng sinh có màng ngăn (SEM) Với loại SEM, khi giảiphẫu sẽ thấy bên trong tế bào biểu bì rễ có các túi bọt (Vesicular) vàchùm (Arbuscular)

So với nấm ngoại cộng sinh, nấm nội cộng sinh rất ít loài Năm 1989, chỉmới phát hiện 133 loài nấm rễ nội cộng sinh [39] Con đường xâm nhập củanấm rễ nội cộng sinh:

Giai đoạn 1: Thiết lập điểm tiếp xúc và phát triển dọc theo bề mặt của rễ.Giai đoạn 2: Một hoặc nhiều sợi nấm hình thành chỗ phồng thâm nhập vào

tế bào biểu bì hoặc tế bào vỏ để vào rễ

Hình 1 2: Nấm rễ nội cộng sinh [47]

1.2.2 Nấm ngoại cộng sinh (Ectomycorrhizae)

Nấm rễ ngoại cộng sinh là nấm có sợi nấm bao quanh rễ dinh dưỡng chưahóa gỗ, không xuyên qua các tế bào mô rễ mà chỉ kéo dài giữa các tế bào Đây

là một loại nấm hình thành mạng lưới Hartig trong gian bào tầng vỏ rễ và môsợi nấm dày đặc trên bề mặt rễ của cây, không có mũ rễ, không có lông hút.Nấm rễ ngoại cộng sinh thường có màu sắc và hình dạng nhất định (có thể nhậnthấy bằng mắt thường) Đặc trưng cơ bản của chúng là:

 Trên bề mặt rễ dinh dưỡng hình thành một màng nấm (mantle) do các sợi nấm đan chéo nhau

 Giữa các tế bào tầng vỏ rễ hình thành một mạng lưới do thể sợi nấm sinhtrưởng mà thành

 Do tác dụng của nấm rễ, bộ rễ ngắn, to, giòn và có màu sắc khác nhau,tán rễ và biểu bì không có lông hút, bề mặt màng có nhiều sợi nấm kéodài ra.

Guo Xiuzhen và cộng sự đã phát hiện 140 loài, danh sách các loài, chi, họ,nấm ngoại cộng sinh thường hình thành thể quả trên mặt đất như nấm gan bò

(Boletus), nấm bao ngỗng (Amatina), nấm tán đỏ (Russula), nấm da (Thelephora), nấm cổ ngựa vỏ cứng (Scleroderma), nấm cổ ngựa đậu màu (Poisolithus)…[11] Con đường xâm nhập của nấm rễ ngoại cộng sinh:

Giai đoạn 1: Sợi nấm tiếp xúc, nhận biết và bám chặt các tế bào biểu bì rế

ở gần đỉnh rễ của rễ non tích cực phát triển

Giai đoạn 2: Ở giai đoạn này sự xâm nhập các sợi nấm hình thành lớpphủ dày đặc trên bề mặt rễ

Hình 1 3: Nấm rễ ngoại cộng sinh [46]

1.2.3 Nấm rễ nội ngoại cộng sinh (Ectoendo mycorrhiza)

Nấm rễ nội ngoại cộng sinh mang đặc trưng của 2 loại nội cộng sinh vàngoại cộng sinh về hình thái cũng như sinh lý Chúng thường có ở các rễ cây

thông (Pinaceae), cây Cáng lò (Betula alnoides), Đỗ quyên quả mọng (Arbutus)

và các cây thuộc họ Lan thủy tinh (Monotropaceae) [5].

1.2.4 Một số loại nấm rễ khác.

 Nấm rễ giả (Pseudo mycorrhiza): nấm rễ giả thường xuất hiện ở cây lá

kim, đặc biệt là các cây con vàng yếu, hoặc vườn ươm thiếu ánh sáng, có lúctrên cây có phân bón nhiều Loại này không có lưới Hartig và màng nấm nhưngtrong tế bào rễ vẫn có sợi nấm nội sinh Có tác giả cho rằng sự hình thành sợinấm giả là do rễ nấm ngoại cộng sinh thoái hóa dần rồi do nấm gây bệnh xâmnhiễm mà hình thành Những nấm gây bệnh này không ảnh hưởng lớn đến cây

 Nấm rễ ngoại vi (Peritrophic mycorrhiza): là nấm chỉ phủ một lớp lưới

sợi thưa ở bề mặt ngoài của rễ nhưng không xâm nhiễm vào rễ cây hoặc xâmnhiễm ở mức nhẹ Jan-Eriknylund cho rằng đó là giai đoạn đầu của lưới Hartig.Theo Piche (1982) từ khi có lưới thưa đến khi có lưới Hartig chỉ mất 5-14 ngày.Hiện tượng này không ảnh hưởng gì đến cây [16, 23]

về rễ cây, tiếp xúc nhanh với rễ cây Sau khi tiếp xúc chúng hình thành vòi bámtạo thành điểm xâm nhiễm và thành “dùi sợi nấm” chọc thủng vỏ rễ Điểm xâmnhập thường cách đuôi rễ 0,5 –1 cm, rồi liên tục hình thành nấm rễ nội cộngsinh mới Nói chung điểm xâm nhiễm nấm rễ nội cộng sinh là vỏ rễ cây hoặcqua lông hút mà nhiễm vào

Khả năng xâm nhập của nấm rễ nội cộng sinh phụ thuộc rất lớn vào mức

độ già, non của lông hút và loài cây chủ Rễ cỏ 3 lá (Trifolim repens) thường

phải sau 3 tuần, bạch đàn và cam quýt thường phải sau 1 tháng mới bắt đầu xâm

nhiễm Về tỷ lệ xâm nhiễm người ta thường lấy ngô làm đối chứng, sau 2 tuần

tỷ lệ xâm nhiễm là 23 – 27%

Cơ chế sợi nấm xuyên qua vách tế bào tầng bỏ rễ đến nay vẫn chưa rõ Cótác giả cho rằng sợi nấm hình thành dùi, có tác giả lại cho rằng sợi nấm sản sinhenzyme Nói chung, sợi nấm không xuyên qua tế bào phân sinh, cũng không qua

rễ cây có nốt sần cây họ Đậu [27]

Thể sợi nấm sau khi xâm nhập vào rễ có thể sinh trưởng nhanh len lỏi giữacác tế bào rồi mới vào trong tế bào, cũng có thể phát triển giữa các tế bào,nhưng không hình thành lưới Hartig như nấm ngoại sinh

Sợi nấm sau khi vào trong tế bào liền bao quanh lấy nguyên sinh chất, phânnhánh hình thành vòi hút, nhưng màng tế bào vẫn bao lấy nhánh sợi nấm vànguyên sinh chất Cuộc sống sợi nấm trong tế bào rất ngắn chỉ mấy ngày đếnmười mấy ngày là bị phân giải, nhưng tế bào nhiễm nấm vẫn sống và bị nhánhsợi nấm khác tạo ra sợi nhánh mới Cho nên, trong tế bào ta phát hiện cả sợinhánh, cả xác sợi nấm

Có trường hợp sợi nấm xâm nhập vào tầng vỏ ngoài không phân nhánh.Chúng chỉ phân nhánh ở tầng giữa và tầng trong của vỏ cây Nhánh sợi nấmtrong tế bào rất nhỏ chỉ 0,5 – 1,0µm Chỗ phân nhánh là nơi trao đổi chất dinhdưỡng giữa nấm và rễ Bởi vì ở gốc nhánh sợi nấm người ta phát hiện nhiều hạtđường và giọt dầu, và trong dịch bào phát hiện có muối photphorat và một sốhợp chất hòa tan Nhánh phân ra bị phân giải lại cung cấp cho rễ cây sử dụng[5]

 Nấm rễ ngoại cộng sinh:

Theo quan điểm bệnh lý học, quá trình hình thành nấm cộng sinh cũng nhưquá trình xâm nhiễm, chia ra các giai đoạn: tiếp xúc, xâm nhập, ủ bệnh hay pháttriển và xuất hiện Trong đất hình thành nhiều bào tử nấm, sợi nấm, xâm nhiễmvào bộ rễ, làm cho rễ cây ngừng sinh trưởng, phình lên và hình thành bao nấm,

sau đó sợi nấm phân nhánh thành bao Sợi nấm xâm nhiễm vào tầng vỏ của rễdinh dưỡng, giữa tế bào hình thành mạng lưới gọi là lưới Hartig [5].

Trong một số trường hợp chúng không theo trình tự như trên mà hìnhthành ngay lưới Hartig rồi hình thành bào sợi nấm, hoặc có lúc không hìnhthành cả 2 loại này Phần lớn nấm rễ chỉ cộng sinh với rễ dinh dưỡng Từ hạtnảy mầm ra lá thật, cây con sinh trưởng nhờ dinh dưỡng được cung cấp từ hạt,còn sau đó cây cần dinh dưỡng trong đất Giai đoạn này nếu bộ rễ tiếp xúc vớinấm rễ, thì sự hình thành rễ - nấm rất nhanh và rất có lợi Cho nên những nămgần đây, nhiều người dùng phương pháp cấy nấm vào cùng lúc cây con mới nảymầm ra lá thật và có thể đạt được mục đích rễ - nấm hóa cây mầm

1.2.6 Tính chuyên hóa của khu hệ nấm cộng sinh vùng rễ

Do sự chọn lọc và tính thích nghi khác nhau, phạm vi tồn tại cây chủ khácnhau Một số loài nấm hình thành trên nhiều loài cây Một số loài chỉ cộng sinhtrên một vài loài cây Chengming (1995) chia những loài sống trên 5 loại cây

gồm 10 loài thuộc Amanita, Cantharenlus; những loài sống trên 2 – 3 loại cây như Boletus, Ramaria; chỉ sống trên 1 loại cây có Suillus, Russula.

Có loài như Pisolithus tinctorius sống trên 72 loài cây, nấm mục rỗng mọc đất (Cenococcum geophyllum) mọc trên 75 loài cây hạt trần.

Cùng một loài nấm nhưng chủng khác nhau cũng có tính chuyên hóa khác

nhau Nấm Lactarius deliciosus có 3 kiểu chuyên hóa khác nhau (thông, vân

sam, lãnh sam) Có loài phạm vi cây chủ rất hẹp là nấm bụng màu trắng

(Hymenogaster albellus) chỉ có ở cây Bạch đàn.

Ngoài việc chọn loài cây thích hợp, các loài cây khác nhau có lúc cũngchọn nấm thích hợp Một số loài cây có thể dùng nhiều loài nấm khác nhau đểhình thành rễ nấm, thậm chí trên rễ của một loài cây có rất nhiều loài nấm cộngsinh Có nhiều loài cây như Thông 5 lá, Dương, Bạch đàn không có tính chuyên

hóa cao đối với nấm rễ Bạch đàn Úc tự nhiên đã thu thập được 400 loài

nấm cộng sinh trên 81 chi Bạch đàn [3, 32]

Ngược lại, có nhiều loài nấm rễ có tính chuyên hóa rất mạnh, như nấmngoại cộng sinh trên họ cây Long não Nếu như nấm cổ ngựa hạt đậu cấy lêncây con giâm hom sẽ không hình thành rễ - nấm [3]

Nhiều nước Đông Nam Á như Indonesia, Malaysia, Philippin, Thái Lan,Srilanca đều mở rộng nghiên cứu về nấm rễ cộng sinh với họ cây long não –

loài cây tượng trưng cho rừng mưa nhiệt đới Chủ yếu là nấm mỡ sáp (Laccaria laccuta) và nấm cổ ngựa vỏ cứng (Scleroderma), nấm cổ ngựa đậu màu Thái

Lan có 68 loài Calimantan có 60 loài, Philippin có 14 loài… [18]

Những loài cây khác nhau, các giai đoạn phát triển khác nhau, loài nấmcộng sinh cũng không hoàn toàn như nhau, nói chung những cây rừng nonlượng rễ - nấm rất ít, rừng già trưởng thành số loài chiếm nhiều nhất, nhưngrừng quá già lại rất ít Tổ thành quần thể nấm rễ thường thay đổi nấm Boletus vàAmanita thay thế dần nấm cổ ngựa vỏ cứng và chiếm dần ưu thế [18] Khôngnhững thế chúng biểu hiện sự giao thoa nhau Ví dụ trên cây Bạch đàn và câyDương, lúc cây còn non sự xuất hiện nấm rễ nội cộng sinh là chính, nhưng đếntuổi lớn nấm ngoại sinh lại chiếm ưu thế, cuối cùng là nấm ngoại cộng sinh thaythế Nguyên nhân của hiện tượng này có thể là do đặc tính sinh lý của cây ở cácgiai đoạn khác nhau [3,7]

1.3 Vai trò khu hệ nấm vùng rễ

Nấm vùng rễ (đặc biệt nhóm nấm AM – arbuscular) là thể sống cộng sinhbắt buộc, có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống của thực vật ở cạn, chúng cóvai trò thực tiễn trong nền kinh tế, khoa học và các chu trình vật chất, nănglượng trong tự nhiên Những hoạt động của nấm cũng như của thực vật có vaitrò hỗ trợ cho nhau Nấm sử dụng nguồn cacbon từ thực vật dưới dạng đườnghexoses và các vitamin Sự vận chuyển cacbon từ thực vật sang nấm được thực

hiện nhờ arbuscules hoặc các sợi nấm nội bào Tại các sợi nấm nội bào diễn raquá trình biến đổi dinh dưỡng thứ cấp để cung cấp glycogen, pentose, lipid…cho hoạt động của nấm Gần 20% cacbon do thực vật tổng hợp được chuyểnsang nấm và khoảng 25% cacbon nguồn gốc từ thực vật được nấm biến đổi và

dự trữ ở những sợi nấm ngoại bào, việc này góp phần làm tăng thêm nguồn hữu

cơ trong đất

 Tăng khả năng hấp thụ phốt pho và dinh dưỡng của cây chủ

Lợi ích của AM đối với thực vật chủ yếu là tăng cường cải thiện hấp thụcác chất dinh dưỡng và nước, trong đó quan trọng nhất là tăng cường hấp thụdinh dưỡng lân (P) (đến 80% nhu cầu về P và 25% nhu cầu về N của cây đượccung cấp nhờ nấm) [37] Sợi nấm có thể lan rộng đến 8 cm quanh rễ và hấp thụchất dinh dưỡng vận chuyển lại vào rễ, tăng khả năng hấp thụ các chất dinhdưỡng cao hơn so với lông rễ 10 lần Tốc độ thâm nhập của P qua sợi nấm caogấp 6 lần so với qua các lông rễ [8]

Trong đất luôn có lượng phốt pho nhất định, những gốc phốt phát khó hoạt động,

do kết hợp với Fe, Na, Al cố định trong đất mà thành các photpho không tan, cây không thể hấp thu chúng Số photpho đó có đến 1/2 - 1/3 thậm chí đến 95 – 99%, chỉ

có một lượng rất ít photpho hòa tan được cây sử dụng Lông hút của rễ chỉ hút một ít photpho hòa tan quanh rễ và xuất hiện hiện tượng thiếu photpho giả [8].

Nấm rễ nội sinh làm nhiệm vụ sản sinh enzyme Phosphatase chuyểnphotpho không tan thành photpho hòa tan, cung cấp cho cây trồng Hoạt tínhcủa enzyme tăng gấp mấy lần so với cây không có nấm rễ Ngoài ra, nấm rễ cóthể sản sinh muối oxalat kết hợp với Fe, Al, muối P không tan trong đất, từ đó

mà làm tăng khả năng hút P của rễ cây [8]

 Hình thành chất kích thích sinh trưởng

Trong quá trình cộng sinh với rễ cây, nấm có vai trò kích thích sinh trưởng thực vật bằng cách tiết ra rất nhiều các chất kích thích sinh trưởng như auxins,

cytokinins, axit gibberellic và một số chất kháng sinh để bảo vệ cây chủ chốnglại các mầm bệnh từ trong đất [33, 37].

 Nâng cao sức chống chịu và thích nghi với môi trường của cây trồngNấm rễ tham gia vào nhiều hoạt động có lợi cho cây trồng giúp cây sinhtrường và phát triển tốt Mạng lưới rộng lớn của rợi nấm rất quan trọng trongviệc hấp thụ và lưu giũ nước Trong điều kiện hạn hán, nấm rễ thực vật chịu hạnhán tốt hơn thực vật không có nấm rễ [45]

Sự cộng sinh của nấm rễ nội cộng sinh có thể làm tăng cường sinh trưởngcủa cây con lên đến 400%, giúp cây có khả năng chống chịu với điệu kiện khôhạn và nghèo dinh dưỡng [14] Ngoài ra, nấm rễ nội cộng sinh còn làm tăng khảnăng hấp thụ nước của rễ cây và bảo vệ rễ khỏi nguồn bệnh [14]

Thực tế ở những loài gỗ lớn có nấm rễ nội cộng sinh cho thấy cây vẫn tồntại và sinh trưởng trong điều kiện độ ẩm rất thấp trong khi những cây không cócộng sinh thì không sống được hoặc sinh trưởng yếu Kết quả nghiên cứu cũngcho thấy, sinh trưởng của cây con những loài gỗ lớn có sự cộng sinh đạt ngangvới cây không có sự cộng sinh nhưng chúng chỉ sử dụng lượng dinh dưỡng bằngmột nửa Những loài sống phụ thuộc vào nấm rễ nội cộng sinh chủ yếu là ởnhững nơi đất chặt, khô cằn, có hệ rễ ít phân nhánh vì lúc đó lượng chất dinhdưỡng tồn tại nhiều ở dạng khó tiêu, rễ cây không thể hấp thụ được mà phải nhờđến sự lan rộng của hệ sợi nấm [12]

 Cải thiện môi trường xung quanh

Nhiều nghiên cứu thăm dò điện tử chứng minh xung quanh rễ những câythông xuất hiện tầng kết dính rộng gấp nhiều lần so với cây thông không có nấm

rễ cộng sinh, tầng đó tạo ra khu trao đổi ion, bộ rễ tăng khả năng hấp thụ và vậnchuyển cây chủ, có lợi cho sinh trưởng phát triển của cây trồng

Nấm rễ nội cộng sinh tạo ra các hợp chất hữu cơ Humic và “keo”(polysaccharides ngoại bào) ràng buộc đất lại với nhau và cải thiện kết cấu đất Kết

cấu đất ảnh hưởng hưởng tích cực đến sự tăng trưởng bằng cách thúc đẩy thông khí, nước chuyển động vào đất, tăng trưởng gốc, phân phối dinh dưỡng [14].

Nấm rễ nội cộng sinh không chiếm tỷ lệ cao trong đất nhưng có vai tròquan trọng trong việc điều chỉnh đặc tính sinh học của đất nhờ sự phân bổ rộngkhắp của hệ sợ nấm trong lớp đất tầng mặt Nấm rễ nội cộng sinh có khả nănghấp thụ trực tiếp các chất carbon do cây cố định và cấu thành đầu vào chính củacarbon và năng lượng trong đất, chúng phân phối lượng carbon này khắp cả khuvực đất quanh rễ cây cho vi sinh vât sử dụng [43] Lượng cacbon đáng kể đượcvận chuyển bằng hệ sợi nấm từ cây này sang cây khác đã được xác định Điềunày giúp giảm sự cạnh tranh giữa các loài khác nhau và góp phần vào tính ổnđịnh và đa dạng của hệ sinh thái

Ngoài ra, trong đất có chứa ion Fe3+ ở dạng khó hòa tan Nấm rễ nội côngsinh đã tiết ra một hợp chất đặc biệt có khả năng hấp thụ mạnh ion Fe3+ và biếnđổi thành dạng dễ tan giúp cây dễ dàng sử dụng [35]

AM tham gia vào biến đổi mối quan hệ đất - cây - nước, tăng cường sựthích nghi của thực vật với các điều kiện bất lợi (khô hạn, nhiễm kim loại) Ởnhững nơi có hàm lượng kim loại nặng cao, AM có vai trò khử độc môi trườnggiúp cây sinh trưởng tốt Bắt đầu từ cải thiện hấp thụ nước và các chất dinhdưỡng quan trọng cho sự sinh trưởng của cây sẽ dẫn tới tăng hiệu suất quanghợp, sự vận chuyển chất dinh dưỡng và sự trao đổi chất của cây Cây sinhtrưởng nhanh, giảm bớt việc sử dụng phân bón hóa học (đôi khi lên tới một nửalượng dự kiến) dẫn tới tăng thu nhập cho nông dân Kết quả thử nghiệm phân

bón sinh học mycorrhiza trên cây Asparagus đã chứng minh được điều đó, khi

những nông dân sử dụng lượng phân bón hóa học cùng với phân bón sinh họcmycorrhiza thì năng suất cây trồng được cải thiện hơn 50% và thu nhập củanông dân tăng 61% so với khi sử dụng chỉ mỗi phân bón hóa [33, 37]

 Tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng

Năm 1942 Davis phát hiện nấm rễ ngoại cộng sinh có thể làm giảm bớtbệnh hại rễ Các năm 1968, 1982, 1994 nhiều tác giả đều đề cập đến nấm cộngsinh có thể giảm bệnh thối cổ rễ của thông xuống 25%, chúng không chỉ phòngtrừ bệnh mà còn xúc tiến sinh trưởng cây con, các bệnh tuyến trùng, bệnh mốcsương, bệnh bướu rễ đều giảm đi rõ rệt [33].

1.4 Nấm vùng rễ trên cây thuốc

Tất cả các cây thuốc ở nhiều nước trên thế giới đều chứa những khu hệnấm rễ Những khu hệ nấm rễ này có thể tổng hợp các chất giống như thuốc từcây chủ, hoặc tổng hợp nên một sản phẩm chứa một hay nhiều hợp chất có cấutrúc hóa học gần giống như thế, tức là tương tự như thuốc từ cây thuốc mà nó

nội sinh Ví dụ như trường hợp của các subglutinol do Fusarium subglutinans

tạo thành; nấm nội sinh vùng rễ này được phân lập từ một cây thuốc nổi tiếngcủa Trung Quốc có đặc tính ức chế miễn dịch và khá tương đồng về mặt cấutrúc với những hoạt chất đã biết của cây này [24]

thường gây chết một cách nhanh chóng Đa số vi sinh vật bị chết ở 60°C - 80°C.Một số khác chết ở nhiệt độ cao hơn Đặc biệt bào tử có khả năng tồn tại ở nhiệt

độ lớn 100°C Nhiệt độ cao thường gây biến tính protein, làm hệ enzym lập tứckhông hoạt động được, vi sinh vật trong khu hệ nấm dễ dàng bị tiêu diệt

- Độ ẩm:

Nước chiếm một tỷ lệ quan trọng trong hầu hết các thể sống Nước giúphòa tan các chất dinh dưỡng trong nước và được hấp thu vào tế bào, mọi phảnứng sinh hóa trong tế bào cần có nước mới xảy ra được Không những thế, độ

ẩm còn ảnh hưởng đến hầu hết các hoạt động sống của vi sinh vật Có nhữngloài thích nghi với môi trường ngập nước, có những loài có khả năng chịu khôhạn cao Nhưng phần lớn các vi sinh vật có khả năng phát triển mạnh ở độ ẩm60-70% Do ở độ ẩm này trong đất đã đạt được lượng nước và không khí cầnthiết Nếu độ ẩm cao hơn, thì lượng khí trong đất sẽ bị thải ra, dẫn đến thiếukhông khí sẽ ức chế sự phát triển của khu hệ nấm Tuy nhiên, trong điều kiệnkhô hạn thì hầu như mọi quá trình sinh hóa đều bị trì trệ

- Ánh sáng:

Hầu hết các thành phần trong khu hệ nấm vùng rễ phát triển tốt trong điềukiện thiếu ánh sáng (do không có sắc tố quang quang hợp nên hình thức dinhdưỡng của nấm là dị dưỡng hoại sinh) Ánh sáng trực tiếp của mặt trời và các tia

tử ngoại có thể gây ra những quá trình quang oxy hóa trong nguyên sinh chất tếbào, đặc biệt là các nucleic acid Dưới tác dụng của các bức xạ này các phảnứng hóa học trong tế bào bị phá vỡ, vi sinh vật có thể bị tiêu diệt

- Thành phần cơ học của đất:

Phần sinh khối chủ yếu của khu hệ nấm rễ có đến 90-99% được gắn vớipha rắn của đất, do các tiểu phần của đất ở pha rắn hấp thụ mạnh tế bào của visinh vật Tuy nhiên khả năng hấp thu này không cố định mà nó còn phụ thuộc

vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, pH, độ phân tán cũng như kích thước củatiểu phần đất, mùa trong năm… các tiểu phần tự nhiên trong đất thì luôn có kíchthước không đều nhau, các tiểu phần càng lớn tích lũy càng nhiều chất hữu cơ,nhiều chất dinh dưỡng sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của khu hệnấm vùng rễ Chính điều này đã góp phần quan trọng trong sự phân bố của cácthành phần khu hệ nấm rễ trong đất.

1.5.2 Sự tương quan giữa các nhóm vi sinh vật với khu hệ nấm vùng rễ

Ngoài những tác động của các điều kiện tự nhiên lên hoạt động sống củakhu hệ nấm vùng rễ, thì tác động của các yếu tố sinh học trong cùng hệ sinh tháicũng ảnh hưởng phần không nhỏ như: sự hiện diện của các loài vi sinh vật khác,các sản phẩm mà chúng tạo ra trong quá trình sống, tạo thành các chất ức chếcác hoạt động sống…của một loài vi sinh vật nào đó như:

+ Vi sinh vật nitrat hóa chỉ có thể tồn tại và phát triển trong đất, khi ở đó

có nhiều ammoniac, chất này là sản phẩm hoạt động sống của nhóm vi sinh vậthoại sinh, từ sự phân hủy protein

+ Actinomyces với một số loài vi nấm khác tạo thành kháng sinh dẫn đến

ức chế hoạt động sống, thậm chí tiêu diệt một số nhóm vi khuẩn, vì thế mà cácnhóm này không thể sống nơi có mặt của Actinomyces và các vi nấm khác.+ Sự hiện diện của loài Phytonematode (tuyến trùng gầy bệnh) dẫn theo sựhiện diện của nhiều loại vi nấm, các loài nấm này thường bắt tuyến trùng bằngcách: lưới, vòng thắt hay chất nhầy dính dẫn đến sợi nấm sẽ cắm vào thân tuyếntrùng, tiết ra enzyme phân hủy tuyến trùng biến thành chất dinh dưỡng chomình

1.6 Một số nghiên cứu về khu hệ nấm vùng rễ

1.6.1 Trên thế giới

Nấm rễ (mycorrhizae) được biết tới từ khoảng hơn 400 triệu năm trước kể

từ khi con người bắt đầu quan sát sự phát triển của cây trong quá trình trồng

trọt Sự hội tụ giữa nấm cộng sinh ở bộ rễ và cây trồng là sự liên quan hỗ

sinh phổ biến nhất trong tự nhiên và trong trồng trọt

Cho đến nay nấm rễ được biết đến khoảng trên 200 loài được mô tả trong

khuôn khổ ngành mới Glomeromycetes Tuy nhiên mới chỉ 4 bộ, 13 họ và 19

loài được nhận biết

Vì tính ưu việt của khu hệ nấm vùng rễ nên đã được các nhà khoa học ởkhắp nơi trên thế giới nghiên cứu từ hơn 20 năm nay trên nhiều loại thực vật vàcây trồng khác nhau như: Cỏ phấn hương (ragweed), Black truffle, cây thông,

cây ngô, cây dã yên thảo (Petunias), hoa lan, cỏ ba lá, các loại cây ăn quả như

cam, chanh, táo…

Các nghiên cứu về khu hệ nấm vùng rễ trên thế giới chủ yếu tập trung vềnghiên cứu khả năng tác dụng lên cây trồng, cách thức tác động lên cây trồng,tương tác giữa với các loại vi khuẩn khác trong đất, khả năng giúp cây hấp thucác chất dinh dưỡng, khả năng ứng dụng cũng như sản xuất nó

Vai trò quan trọng của nấm vùng rễ trong sản lượng cây trồng nông nghiệp đãđược nghiên cứu khá phổ biến Nấm vùng rễ là nhà điều phối chất dinh dưỡng chocây,thúc đẩy sự đồng hóa phốt pho cũng như các ion khác như kẽm, đồng, nitơ, bảo

vệ cây khỏi các nấm gây bệnh khác và tuyến trùng, làm tăng chất lượng đất và giúpcây chủ kháng chịu sự tác động của các kim loại nặng [17]

Ngoài ra, kết quả phân tích phân tử cho thấy khu hệ nấm có tính đa dạnggen không cao Tuy nhiên, nấm có tính độc lập sinh thái vùng, tính giàu vềchủng loại các loài NNSR bị giảm theo cường độ sử dụng đất Sự suy giảm vềquần thể này phụ thuộc vào các chế độ canh tác, sự lạm dung phân hóa học vàthuốc trừ sâu [15] Ngoài ra là tính chất đất, sự thay đổi về mùa vụ, loại câytrồng… cũng tác động đáng kể đến quần thể nấm rễ [41]

Vai trò của nấm rễ lên sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng đượcnghiên cứu bởi nhiều tác giả Nấm rễ được xem như yếu tố thúc đẩy làm tăng

trưởng cây (growth promoter) Chẳng hạn chủng nấm Piriformospora indica được phát hiện bởi Verma et al., 1998 là một yếu tố làm tăng trưởng thực vật mới là thành viên thuộc nấm đảm Basidiomycotina Chủng này đặc trưng bởi sự

hình thành các hậu bào tử có vách dày dạng quả lê Các tài liệu liên quan đều

cho thấy P indica có tiềm năng to lớn cho sự thúc đẩy tăng trưởng thực vật bởi khả năng tạo các khuẩn lạc trên rễ cây [30] P indica có nhiều đặc tính quí

giống với các nấm rễ khác nhưng lại có điểm khác với nấm rễ là có thể nuôi cấy

trên môi trường nhân tạo Khởi đầu là các nghiên cứu trên các đối tượng Zea may, Nicotina tabacum, glycine max, Pisum satium Về sau chủng nấm này

được nghiên cứu và đánh giá trên cây thuốc đã cho thấy sự tăng trưởng khi gây

nhiễm trên cây Withania somnifera và Spilanthes calva và sau đó là trên cây thuốc Adhatoda vasica Nees [30].

Vai trò của nấm rễ còn thể hiện như một yếu tố kích thích cây sản sinh racác chất có hoạt tính tự bảo vệ mình thường được gọi là các phytoalexin.Muraleedharan G.Nair et al., 1991 đã khảo sát vai trò của nấm rễ trên rễ cây

Trifolium repens trong việc kích thích cây chủ sinh ra các chất có hoạt tính kích thích sinh trưởng của nấm rễ, chủng Penicillium digitatum và ức chế chủng gây bệnh Rhizoctonia sp khi nuôi cấy in vitro.

Ngoài ra là các nghiên cứu về khả năng kháng chịu và giúp cây chủ kháng

chịu sự nhiễm kim loại nặng của chính tác giả Posta Katalin và CS, 2006 cũng

đã cho thấy rõ vai trò của nấm rễ trong bảo vệ cây chủ tránh các điều kiện bấtlợi của môi trường

Trong những năm 1980, sự phát triển công nghệ nuôi cấy mô rễ đã mở ramột hướng đi mới,cho phép nuôi cấy thành công một số chủng AM trong điềukiện invitro Sử dụng phương pháp này nấm AM và rễ cây được nhân lên đồngthời và nhanh chóng qua một số lần cấy chuyển, thời gian được rút ngắn rấtnhiều và đảm bảo được độ thuần khiết cao

Tháng 1 năm 2009, nhóm tác giả Venter,Marianne,Wilma đã báo kết quảnghiên cứu trình bày thông tin khá đầy đủ và toàn diện và nhân nhanh AM-invitro bao gồm:phương pháp tạo cộng sinh AM, nhân nhanh bào tử trong môitrường invitro,các bước phân lập bào tử từ môi trường nuôi cấy Nghiên cứucũng đã tạo được thể dạng hạt chứa các bào tử có nhiều đặc điểm như mật độbào tử cao,có tính ổn định và phân tán tốt trong môi trường đất Hạt chứa bào tử

có thể áp dụng trong sản xuất nông lâm ngư nghiệp như một loại chế phẩm cóthể dùng trực tiếp Nghiên cứu cũng đề cập đến một số thành phần có thể bổsung vào dạng hạt này làm tăng tác dụng ở hiện trường như chất kích thích sinhtrưởng, các chất trao đổi thứ cấp

Sanders là một chuyên gia về nấm mycorrhiza, khi cây được nấm đến sốngnhờ, ông nhận thấy cây lớn nhanh hơn vì nấm mang đến cho cây chất dinhdưỡng thiết yếu là photphat Photphat là nguồn lân đã góp phần làm nên cuộccách mạng xanh vào giữa thế kỷ 20 và đã thoả mãn được nhu cầu lương thựccho toàn thế giới hồi đó Sanders và các đồng nghiệm đang kiểm tra hiệu quảnhững sản phẩm của mình tại bang Colombia trên những cánh đồng trồng khoaitây và thấy chúng có thể cung cấp không dưới 50% lượng photphat mà cây cần.Ông khẳng định: “Nghiên cứu tại Colombia cho thấy loại nấm này sẽ đạt hiệuquả cao đối với những nước nhiệt đới”."(Loài nấm thay thế phân bón - Theo báoVietnamnet)

Đã có nhiều website công bố và quảng cáo về vai trò của nấm rễ với câytrồng và các sản phẩm dung trong nông nghiệp như Myco.com hay Agrobio củaHungary với các sản phẩm nổi tiếng được sản xuất từ các nấm rễ đã đượcthương mại hóa Hội nghị của ủy ban châu Âu về vấn đề này cũng được tổ chứcthường niên tại các nước châu Âu và chủ yếu là ở Hungary

Tuy nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhưng hiện nay các chế phẩm từnấm rễ mới được bán rộng rãi ở các nước có nền khoa học phát triển ở châu Mĩ,châu Âu và châu Đại Dương

1.6.2 Việt Nam

Việc phát triển nghiên cứu ứng dụng công nghệ nấm rễ trong nông, lâmnghiệp phục vụ cây trồng và phục hồi sinh thái là một hướng đi quan trọng, phùhợp với những nỗ lực phát triển trên thế giới Vì vậy ở Việt Nam đã có một sốkết quả nghiên cứu bước đầu về mycorrhiza

Tác giả Nguyễn Sĩ Giao đã nghiên cứu ứng dụng nấm rễ EctoMycorrhizacho sản xuất cây thông nhựa vườn ươm có chất lượng cao thông qua việc sửdụng chất nhiễm tự nhiên (đất rừng thông) và tuyển chọn cho sản xuất nhiễm(1981-1985) Do trình độ phát triển công nghệ nên kết quả còn hạn chế, chưađáp ứng được nhu cầu sử dụng chế phẩm một cách hiệu quả với số lượng lớncho sản xuất ươm và rừng trồng

Phạm Quang Thu (2001-2004) với đề tài nghiên cứu sản xuất chế phẩmnấm nội cộng sinh đa chủng cho cây lâm nghiệp Đề tài đã nghiên cứu sản xuấtchế phẩm nấm cộng sinh cho thông và bạch đàn dưới dạng bột chứa bào tử hữu

tính của nấm Pisolithus tinctorius và một số vi sinh vật chức năng Hiệu quả của

chế phẩm khi nhiễm cho Bạch đàn PN2 trồng trên các lập địa thoái hóa cho thấy

có sự khác biệt rõ rệt với đối chứng

Phạm Quang Thu & cs (2006-2007), đã nghiên cứu, phân lập một số chủng

nấm ngoại sinh rễ (NNSR- ectomycorhizal) trên cây lâm nghiệp Kết quả nghiêncứu là thu thập và giám định được 33 mẫu nấm ngoại cộng sinh, trong đó có 16loài cộng sinh với thông, 14 loài cộng sinh với bạch đàn và 3 loài cộng sinh với

cả thông và bạch đàn Trong số 33 loài có 15 loài có khả năng phân lập và nuôicấy thuần khiết trong môi trường nhân tạo (6 loài cộng sinh với thông, 6 loàicộng sinh với bạch đàn, 3 loài cộng sinh với cả thông và bạch đàn) Tỷ lệ thànhcông trong phân lập nấm ngoại cộng sinh với thông là 40%, với bạch đàn là42,9% Tốc độ sinh trưởng nấm của các loài tương đối khác nhau, có 4 loài nấmsinh trưởng nhanh, 8 loài trung bình và 3 loài sinh trưởng chậm Đây là nguồngen về các nấm ngoại cộng sinh cho những nghiên cứu về khả năng cộng sinh

và ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây trồng [4]

Phạm Quang Thu (2006-2010), Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm

vi sinh hỗn hợp dạng viên nén cho bạch đàn và thông trên các lập địa thoái hóa, nghèo chất dinh dưỡng [2,4]

Nguyễn Thị Dạ Thảo, Lê Đình Đôn, Bùi Cách Tuyến (Đại học Nông Lâm

TP Hồ Chí Minh) với đề tài nghiên cứu khoa học kĩ thuật về ảnh hưởng củaphân lân đến sinh trưởng, năng suất, tồn lưu dinh dưỡng và mật độ nấm cộngsinh trên vùng đất xám tỉnh Tây Ninh vụ Đông Xuân (2004-2006) đã cho thấyvai trò của cộng sinh nấm rễ cây không chỉ thúc đẩy sinh trưởng mà còn ảnhhưởng tốt đến năng suất cây trồng nông lâm nghiệp [6]

Các tác giả Nguyễn Minh Châu, Lê Quốc Huy (Trung tâm Công nghệ Sinhhọc Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp) đã tiến hành nghiên cứu sản xuấtthử nghiệm chế phẩm nấm rễ ECM dưới dạng viên nang; thử nghiệm một sốdung dịch để bảo quản chế phẩm và đánh giá hiệu quả cộng sinh của chế phẩndạng viên nang với cây sao đen trong vườn ươm và ngoài đồngruộng Kết quảnghiên cứu cho thấy, chế phẩm nấm rễ ECM dạng viên nang có nhiều ưu điểmhơn các dạng khác, sợi nấm được bọc trong thể keo alginate nên có khả năngtránh được sự tấn công của các vi sinh vật khác Chế phẩm ECM dạng nangđược bảo quản tốt nhất trong CaCl2 0,1M ở 40C, trong điều kiện này sợi nấmđược bọc alginate vẫn có thể tồn tại và phát triển tốt; nên sử dụng chế phẩmECM dạng nang tốt nhất trước 6 tháng để đảm bảo chất lượng và hiệu quả củachế phẩm Sử dụng chế phẩm cho cây sao đen giai đoạn vườn ươm đã cho hiệuquả cộng sinh rất tốt thể hiện ở mức độ sinh trưởng, khả năng tăng cường hấpthụ nước, dinh dưỡng và muối khoáng, khả năng lôi kéo các vi sinh vật có íchtrong đất tập trung gần vùng rễ, do đó nó không chỉ làm tăng chất lượng của câycon mà còn cải tạo đất Chế phẩm ECM áp dụng cho vườn ươm và trồng rừng,bước đầu cho thấy, có tác dụng làm tăng sinh trưởng của cây chủ trong vườnươm từ 250-280% so với đối chứng và 130-170% so với đối chứng ở rừngtrồng Cùng với đề tài nghiên cứu phương pháp nuôi cấy dung dịch lỏng in vitro

Keo lai và Keo tai tượng nhằm làm nảy mầm bào tử AM và xúc tiến quá trìnhhình thành cộng sinh AM trong rễ keo đã được tiến hành thành công Kết quảphương pháp là cơ sở quan trọng cho thử nghiệm phát triển phương pháp nuôicấy nhân nhanh sinh khối AM –invitro và Bioreactor cải tiến cho sản xuất chếphẩm AM [2].

Tăng Thị Chính, Bùi Văn Cường (2007), nghiên cứu sự đa dạng nấm cộngsinh Arbuscular Mycorrhiza ở cỏ Vetiver từ đất ô nhiễm chì [5]

Trần Thị Dạ Thảo đã nghiên cứu về sự cộng sinh của nấm Mycorrhiza trên cây

ngô (Zea mays L ssp mays) Qua nghiên cứu cho thấy rằng nấm rễ có khả năng

rất lớn trong việc tiết kiệm nước tưới, tăng hấp thu dinh dưỡng và tăng năngxuất cây trồng [6]

1.7 Công nghệ metagenomics trong nghiên cứu các khu hệ vi sinh vật

1.7.1 Giới thiệu về công nghệ metagenomics

Thuật ngữ "metagenomics" lần đầu tiên được đưa ra năm 1985 bởi nhómnghiên cứu của Handelsman [20] “Metagenomics” là phương pháp phân tích hệ

vi sinh vật các loài vi sinh vật trong các phức hệ vi sinh vật thu trực tiếp từ môitrường tự nhiên thông qua phương thức đọc trình tự mà không cần nuôi cấy[13,20,31] Là phương pháp phân tích hệ vi sinh vật trong tự nhiên không thôngqua quá trình nuôi cấy mà sử dụng các dữ liệu di truyền thông qua phân tích.Đây là một ngành khoa học mới nhằm cung cấp cho các nhà khoa học công cụtiếp cận với hầu hết các loài vi sinh vật khó nuôi cấy trên môi trường nhân tạo

Do đó, metagenomics cho phép nghiên cứu sự đa dạng của hệ vi sinh vật màchưa từng được nghiên cứu trước đây, và cung cấp một nhận thức hoàn toànmới về cấu trúc và chức năng của từng hệ sinh thái từ sự đa dạng của đại dươngcho đến hệ tiêu hóa của con người Như đã biết, chỉ có khoảng 0,1 đến 10%trong tổng số lượng các loài vi sinh vật đã được quan sát trong tự nhiên là có thểnuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm Những sinh vật không thể nuôi cấy

trên môi trường nhân tạo này đôi khi là độc nhất và có những tiềm năng độc đáonhư phân hủy rác thải hay tổng hợp các hợp chất có thể sử dụng như là thuốchay kháng sinh Metagenomics là một công cụ mạnh mẽ trong việc tiếp cận vớicác nguồn tài nguyên vi sinh vật mà chưa được khai thác về đa dạng sinh họctrong các mẫu thu từ môi trường Metagenomics được sử dụng như một công cụcủa hệ thống điều tra, phân loại và thao tác toàn bộ vật liệu gen phân lập từ môitrường Quá trình đa bước này dựa vào 4 bước chính:

(1) phân lập các vật liệu gen;

(2) thao tác trên các vật liệu gen này;

(3) xây dựng thư viện gen;

(4) phân tích các vật liệu gen trong các thư viện metagenome

Metagenomics là một ngành nghiên cứu mới và có thể áp dụng rộng rãitrong lĩnh vực Sinh học và Công nghệ sinh học

1.7.2 Công nghệ metagenomics trong nghiên cứu khu hệ vi sinh vật đất

Môi trường đất rất phức tạp khi nghiên cứu số lương và sự đa dạng các loàitrong hệ vi sinh vật Môi trường đất vùng rễ thích hợp cho các vi sinh vật vì nó

có chứa các khoáng chất với các kích cỡ, hình dạng và tính chất khác nhau kếthợp cùng với hệ vi sinh vật và các hợp chất hữu cơ trong các quá trình phânhủy Một ví dụ như: một gram của đất rừng có chứa khoảng 4x107 tế bào sinhvật nhân sơ, trong khi đó 1g của đất trồng trọt và đồng cỏ có chứa khoảng 2x109

tế bào sinh vật nhân sơ Dựa trên việc phân lập DNA từ một vài mẫu đất khácnhau, số lượng các sinh vật nhân sơ được xác định từ khoảng 2000 đến 18000

bộ gen trên một gram đất Số lượng này là rất thấp bởi vì các bộ gen của các loàihiếm và chưa được biết đến đã bị loại ra trong quá trình phân tích Do đó, sốlượng và sự đa dạng của các sinh vật nhân sơ trong 1g đất phải lớn hơn rất nhiều(16177 loài đã được xác định bởi NCBI (National Center for BiotechnologyInformation, 2005) Trong phân lập các vi sinh vật vùng rễ nói

chung và các vi nấm nói riêng kết hợp với metagenomics sẽ cho một kết quả cụthể và đầy đủ hơn về bức tranh đa dạng nấm vùng rễ (bao gồm nuôi cấy vàkhông nuôi cấy).

CHƯƠNG IIVẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Mẫu nghiên cứu

Các mẫu đất, rễ, củ cây Nghệ vàng được thu tại thôn Chi Lăng, xã Đại Tập,huyện Khoái Châu, Tỉnh Hưng Yên vào tháng 3 năm 2017 và được lưu giữ lạnh(-20oC) tại Phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các Hợp chất thiênnhiên

• Máy lắc thường Gerhardt (Đức)

• Kính hiển vi điện tử Olympus (Nhật Bản)

• Tủ lạnh Sanyo (Nhật Bản)

Rây ướt các kích thước khác nhau 120µm, 60µm, 45µm,32 µm

• Các dụng cụ cấy VSV (Việt Nam, Thụy Sỹ, Hàn Quốc, Trung Quốc, Mỹ…).

2.1.5 Môi trường

 Môi trường phân lập nấm vùng rễ