Phân tích tính đa hình và mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;5 liên quan đến khả năng chịu mặn ở cây lúa (oryza sativa)

Để tạo ra các giống cây trồng chịu mặn thì việc nghiên cứu các gene quy định các tính trạng chống chịu mặn là hết sức quạn trọng, đặc biệt là các gene mã hóa cho các kênh vận chuyển ion

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

--

Trần Xuân An

PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN

OsHKT1;5 LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU MẶN Ở CÂY LÚA

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Đỗ Thị Phúc, người thầy, người hướng dẫn, đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy cô công tác tại Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

Trong quá trình học tập và nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, tôi cũng đã nhận được sự giúp đỡ và chia sẻ tận tình về chuyên môn của bạn, các anh chị trong phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Cuối cùng, tôi vô cùng cảm ơn gia đình, đồng nghiệp tại Trung tâm Chiếu xạ

Hà Nội và tất cả các bạn bè đã động viên và chia sẻ khó khăn cùng tôi trong suốt thời gian qua

Xin chân thành cảm ơn!

Trần Xuân An

BẢNG CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate Deoxyribonucleoside triphosphate dS/m deci Siemens per meter Deci Siemen trên mét EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit etilenediamin-tetra-axetic

HKT High-Affinity K + Transporter Kênh vận chuyển Klực cao + ái

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

QLT quantitative trait loci Locus tính trạng số lượng

TF Transcription factor Nhân tố phiên mã

1

MỤC LỤC

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đất nhiễm mặn và ảnh hưởng đến năng suất cây trồng 3

1.1.1 Giới thiệu về đất nhiễm mặn 3

1.1.2 Tình hình đất nhiễm mặn ở Việt Nam 3

1.1.3 Ảnh hưởng của mặn tới năng suất, chất lượng cây lúa 4

1.2 Cơ chế tác động của đất nhiễm mặn đến cây trồng 4

1.3 Các họ protein vận chuyển ion Na + ở cây trồng 8

1.3.1 Vai trò của protein NHX và SOS trong việc duy trì nồng độ Na + thấp trong tế bào chất 8

1.3.2 Protein HKT đóng vai trò chính trong khả năng chịu mặn của thực vật và ngăn chặn Na + vận chuyển từ rễ đến thân 10

1.4 Họ gen OsHKT ở cây lúa 12

1.5 Gen OsHKT1;5 14

1.6 Nghiên cứu đa hình sử dụng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự gen 16

1.6.1 Kĩ thuật PCR 16

1.6.2 Giải trình tự gen 17

1.6.3 Phân tích tin sinh học 19

1.7 Nghiên cứu biểu hiện của gen sử dụng phương pháp Realtime-PCR 21

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 24

2.2 Phương pháp phân tích đa hình gen 25

2.2.1 Trồng và thu mẫu 25

2.2.2 Tách chiết DNA tổng số 25

2

2.2.3 Khuếch đại gen bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu 26

2.2.4 Điện di trên gel Agarose 27

2.2.5 Tinh sạch và giải trình tự gen 28

2.2.6 Phân tích trình tự gen bằng các công cụ tin sinh 28

2.3 Phương pháp phân tích mức độ biểu hiện gen 28

2.3.1 Trồng lúa thủy cảnh và thu mẫu 29

2.3.2 Tách chiết ARN tổng số 29

2.3.3 Tổng hợp cDNA dùng mồi oligo T 30

2.3.4 Phản ứng Realtime-PCR 30

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Phân tích đa hình gen OsHKT1.5 ở các giống lúa 33

3.1.1 Tách chiết DNA tổng số 33

3.1.2 Phản ứng PCR nhân bản trình tự promoter và trình tự mã hóa của gen OsHKT1.5 33

3.1.2.1 Thiết kế mồi 33

3.1.2.2 Nhân vùng Promoter của gen OsHKT1.5 36

3.1.2.3 Nhân vùng CDS của gen OsHKT1;5 36

3.1.3 Phân tích đa hình vùng promoter của gen OsHKT1;5 37

3.2 Đánh giá mức độ biểu hiện gen OsHKT1;5 đáp ứng điều kiện mặn 43

3.2.1 Tách chiết RNA tổng số từ mô lá 43

3.2.2 Thiết kế và kiểm tra độ đặc hiệu của mồi 44

Realtime-Actin 45

3

3.2.3 Phân tích mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;5 bằng phương pháp

Real-time PCR 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

Kết luận 50

Kiến nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

Phụ lục 1 Kết quả phân tích các yếu tố cis trình tự promoter (-1500kb tính từ mã khởi đầu ATG) giống Nipponbare bằng công cụ PlantCARE 59

4

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các con đường điều hòa chống chịu stress mặn ở thực vật 7

Hình 1.2 Hai phân họ của họ gen HKT 10

Hình 1.3 Cấu trúc gen một số thành viên họ gen lúa 13

Hình 1.4 Mô hình gen AtHKT1;1 và OsHKT1;5 tách Na + khỏi lá cây bằng cách loại bỏ Na + khỏi xylem .14

Hình 1.5 Các giai đoạn trong phản ứng PCR 16

Hình 1.6 Sơ đồ giải trình tự gen theo phương pháp Sanger 18

Hình 1.7 Sơ đồ giải trình tự gen theo phương pháp giải trình tự tự động 19

Hình 1.8.Biểu đồ khuếch đại của Realtime-PCR 22

Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số tách từ các giống lúa nghiên cứu 33

Hình 3.2 Sơ đồ cấu trúc gen và các đoạn sản phẩm trong PCR 34

Hình 3.3 Kiểm tra độ đặc hiệu các các cặp mồi sử đụng để nhân bản Promoter và CDS gen OsHKT1;5 35

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng promoter của gen OsHKT1;5 36

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng CDS của gen OsHKT1;5 37

Hình 3.6 Kết quả so sánh trình tự axit amin của Protein OsHKT1;5 41

Hình 3.7 Kết quả mô phỏng cấu trúc protein OsHKT1;5 (A Mô hình cấu trúc protein TrkH; B và C Mô hình cấu trúc protein OsHKT1;5 và các vị trí đột biến làm thay đổi axit amin) .42

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm tách chiết RNA tổng số của giống lúa Pokkali .44

Hình 3.9 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu các các mồi sử dụng để xác định độ biểu hiện của gen OsHKT1;5 45

5

Hình 3.10 Biểu hiện của gen OsHKT1;5 ở lá 2 giống lúa Nipponbare và Pokkali .46 Hình 3.11 Biểu hiện của gen OsHKT1;5 ở rễ 2 giống lúa Nipponbare và Pokkali .47

6

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Khả năng chịu mặn một số loại cây trồng 5

Bảng 1.2 Các thành viên họ gen HKT ở lúa [39] .13

Bảng 2.1 Một số giống lúa sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gene 26

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gene 27

Bảng 2.4 Thành phần và quy trình tổng hợp cDNA 30

Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng nhân bản vùng promoter và CDS của gene OsHKT1;5 34

Bảng 3.2 Sơ đồ kết quả so sánh trình tự nucleotide và thay đổi yếu tố cis trên promoter của gen OsHKT1;5 38

Bảng 3.3 Các yếu tố Cis thay đổi do đa hình promoter gen OsHKT1;5 39

Bảng 3.4 Sơ đồ kết quả so sánh trình tự nucleotide của CDS gen OsHKT1;5 40

Bảng 3.5 Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng Realtime-PCR 44

1

MỞ ĐẦU

Hiện nay, dưới tác động của biến đổi khí hậu, vấn đề đất nhiễm mặn ngày càng trầm trọng hơn, đặc biệt là các khu vực ven biển Đất nhiễm mặn gây ảnh hưởng xấu tới sự sinh trưởng và phát triển của nhiều loại cây trồng

Lúa là cây lương thực chủ yếu và quan trọng nhất đối với người dân Việt Nam Lúa là loài cây trồng mẫn cảm với các tác động đến từ bên ngoài (điều kiện ngoại cảnh) Hàng năm, thiệt hại về lương thực do thiên tai, ngoại cảnh bất lợi là không hề nhỏ Đây cũng được xem là những yếu tố chính làm giảm năng suất lúa

Do vậy, việc lựa chọn và chọn tạo giống cây lúa thích nghi với điều kiện mặn là cần thiết để đảm bảo an ninh lương thực quốc gia, cũng như sự tăng trưởng của kinh tế Việt Nam

Từ lâu, ngoài việc lựa chọn lúa có năng suất cao dựa vào đặc điểm hình thái của cây, việc lựa chọn lúa có kiểu gen chống chịu với ngoại cảnh bất lợi ngày càng được quan tâm nghiên cứu Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng được ứng dụng nhiều vào việc sàng lọc, lai tạo, nhân dòng gen có tính chống chịu cao

Để tạo ra các giống cây trồng chịu mặn thì việc nghiên cứu các gene quy định các tính trạng chống chịu mặn là hết sức quạn trọng, đặc biệt là các gene mã hóa cho các kênh vận chuyển ion Na+, K+ như họ gene HKT Trong đó, gene

OsHKT1;5 là một gene quan trọng tham gia vào quá trình cân bằng ion của tế bào

trong quá trình chống chịu mặn ở cây lúa

Hiện nay, chưa có nghiên cứu nào về gen OsHKT1;5 ở cây lúa được tiến

hành ở Việt Nam Vì những lý do trên chúng tôi lựa chọn đề tài: “Phân tích tính

đa hình v mức đ biểu hiện của gen OsHKT1;5 mã hóa cho protein vận chuyển ion ở cây lúa (Oryza sativa)” với mục đích:

3

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đất nhiễm mặn và ảnh hưởng đến năng suất cây trồng

1.1.1 Giới thiệu về đất nhiễm mặn

Đất mặn là đất có chứa nhiều muối hòa tan như là: NaCl, Na2SO4, CaCl2, CaSO4, MgCl2, NaHCO3… Nguồn gốc của những loại muối này rất khác nhau (nguồn gốc lục địa, biển hay nguồn gốc từ sinh vật,… ), nhưng nguồn gốc ban đầu của những loại muối này đều xuất phát từ các thành phần khoáng của đá núi lửa Những loại muối này có nguồn gốc từ muối hòa tan trong quá trình phong hóa đá, chúng di chuyển tập trung ở những dạng địa hình trũng không thoát nước, kết hợp với các yếu tố như đá mẹ, khí hậu khô hạn, mực nước mặn nông và sinh vật ưa muối,… hình thành lên đất mặn [2]

Ở Đồng bằng Sông Cửu Long, cũng như các vùng đất bằng phẳng ven biển khác ở nước ta, đất mặn là loại đất khá phổ biến Quá trình đất bị mặn hóa có liên quan chặt chẽ với vị trí địa lý, địa hình, tác động các của dòng chảy, sự hình thành

sự xâm lấn, mức độ mặn của nước biển và các hoạt động sản xuất của con người

Ở Việt Nam, đất mặn được hình thành do nước biển dâng lên bởi thủy triều hoặc

do nước mặn từ các dòng chảy ngầm di chuyển lên mặt đất, một nguyên nhân khác của sự mặn hóa là vấn đề sử dụng nước mặn từ các kênh tiêu dẫn vào đồng ruộng khi thiếu nước ngọt Ở một số vùng Việt Nam, có các dòng nước mặn ngầm rất gần với mặt đất, trong canh tác cây trồng cạn sự bốc hơi cũng là nguyên nhân kéo nước mặn lên làm nhiễm mặn đất tầng mặt [2]

1.1.2 Tình hình đất nhiễm mặn ở Việt Nam

Việt Nam là nước có bờ biển dài 3.260 km (không kể các đảo) Hiện nay, dưới tác động của biến đổi khí hậu, băng tan, mực nước biển dâng cao, làm vấn đề mặn hóa có nguy cơ trầm trọng hơn Theo công bố của Bộ Tài nguyên và Môi trường năm 2012 thì Việt Nam là 1 trong 5 nước trên thế giới chịu ảnh hưởng nặng

nề nhất của biến đổi khí hậu Chỉ tính riêng mực nước biển nếu dâng 75 cm đã làm cho 19% diện tích khu vực Đồng bằng sông Cửu Long bị ngập Nếu nước biển

4

dâng 1m vào năm 2100, sẽ làm ngập gần 38% diện tích khu vực Đồng bằng sông Cửu Long Theo Hồ Quang Đức (2010) cả nước có khoảng trên 1 triệu ha đất mặn, chủ yếu ở các tỉnh vùng đồng bằng sông Cửu Long, ngoài ra có một ít đất mặn nội địa phân bố ở Binh Thuận và Bình Thuận, gọi là đất mặn kiềm [2]

1.1.3 Ảnh hưởng của mặn tới năng suất, chất lượng cây lúa

Diện tích gieo trồng những năm gần đây có xu hướng giảm, do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu (hạn hán, nhiễm mặn), do chuyển đổi mục đích sử dụng đất, chuyển đổi cơ cấu cây trồng

Theo báo cáo số 152/BC-TCTK ngày 28/6/2017 của Tổng cục Thống kê,tính riêng vụ đông xuân 2017, hai vùng có diện tích đất lúa giảm nhiều nhất là vùng Đồng bằng sông Hồng và Đồng bằng sông Cửu Long vốn được coi là hai vựa lúa của cả nước Tại vùng Đồng bằng sông Hồng, diện tích gieo trồng lúa đông xuân 2017 đạt 536,2 nghìn ha, giảm 10,1 nghìn ha, bằng 98,2% so vùng kỳ năm trước Trong đó có đến 1,9 nghìn ha là diện tích bỏ hoang, ô nhiễm Tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long, diện tích xuống giống lúa đông xuân năm nay đạt 1.539,4 nghìn ha, giảm 16,3 nghìn ha, bằng 99,0% so cùng kỳ; diện tích không sản xuất (bỏ hoang, ô nhiễm, ) là 1,4 nghìn ha [1] Nguyên nhân chủ yếu của việc giảm diện tích trồng lúa là do biến đổi khí hậu, chuyển đổi mục đích sử dụng đất, trong

đó là nhiễm mặn được coi là một tác hại trực tiếp do biến đổi khí hậu gây ra

1.2 Cơ chế tác đ ng của đất nhiễm mặn đến cây trồng

Việc dư thừa muối trong đất đã làm tăng áp suất thẩm thấu của các dung dịch trong đất Ở điều kiện nồng độ muối tan trong đất nhỏ hơn nồng độ dịch tế bào trong rễ, cây có thể dễ dàng lấy được nước và chất khoáng từ đất do áp suất thẩm thấu và sức hút nước của rễ cây lớn hơn áp suất thẩm thấu và sức hút nước của đất Nếu nồng độ muối tan trong đất tăng cao dẫn đến mức sức hút nước của đất cao hơn sức hút nước của rễ thì chẳng những cây không lấy được nước trong đất mà còn mất nước vào đất Do đó, cây không hấp thu được lượng nước cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển, nhưng quá trình thoát hơi nước của lá vẫn diễn ra bình thường làm mất cân bằng nước gây nên hạn sinh lý Vì vậy, việc tăng

Bảng 1.1 Khả năng chịu mặn một số loại cây trồng [46]

EC (dS/m)

Nồng đ muối tan (‰)

2 Đậu phộng Arachis hypogaea L 3,2 2,048

4 Đậu nành Glycine max (L.) Merrrill 5,0 3,2

7 Cải bắp B oleracea L (Capitata Group) 1,8 1,152

9 Đậu đũa Vigna unguiculata (L.) Walp 4,9 3,136

melongena L varesculentum Nees 1,1 0,704

13 Bí xanh C pepo L var melopepo(L.) Alef 4,9 3,136

14 Khoai lang Ipomoea batatas (L.) Lam 1,5 0,96

15 Cà chua

Lycopersicum Lycopersicon(L.) Karst ex Farw [syn.Lycopersicon

esculentumMill.]

6

17 Bưởi Citrus x paradisi Macfady 1,2 0,768

19 Cam Citrus sinensis (L.) Osbeck 1,3 0,832

Chống chịu mặn ở thực vật là cơ chế được điều khiển bởi nhiều yếu tố Đối

với những loài nhạy cảm với độ mặn như Arabidopsis thaliana và Oryza sativa, ức chế sinh trưởng thường xảy ra ở nồng độ 100 mM NaCl, trong khi loài Atriplex amnicola có thể phát triển ở 600 mM NaCl [48] Thực vật có nhiều cách khác nhau

để thích ứng với stress mặn Khi tiếp xúc với điều kiện stress mặn, cây thường biểu hiện kiểu hình già yếu như cháy xém lá Một số phản ứng bên trong như giảm sự thoát hơi nước ở các lá bị cháy xém, chuyển hướng các nguồn năng lượng và dinh dưỡng đến cho lá non, đỉnh sinh trưởng và bảo vệ các cơ quan quan trọng bởi sự tích lũy các ion gây độc trong các lá già yếu [12]

Khả năng chịu mặn trong nhiều thực vật tỷ lệ nghịch với mức độ tích lũy

Na+ trong thân, đặc biệt là ở các cây lương thực như lúa mì và gạo, là những cây có khả năng chịu mặn kém [60] Có rất nhiều yếu tố dẫn đến khả năng chịu mặn khác nhau giữa các loài, trong đó các protein vận chuyển chất tan là một yếu tố đặc biệt quan trọng, điển hình như các protein vận chuyển Na+ [38; 44] Ion Na+ được phát hiện là có sự tích lũy khác nhau giữa các loại tế bào của lá Sự tích lũy Na+ ở các tế bào biểu bì lá do hoạt động của các kênh cation không chọn lọc, tránh gây độc cho các mô quang hợp [32]

Dựa vào cơ chế tác động của stress mặn do tích lũy/vận chuyển ion Na+

nên protein tham gia vận chuyển Na+ đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa cân bằng nội môi Na+ (homeostasis) Ở thực vật, có thể nhận thấy nhóm gen tham gia

mã hóa protein vận chuyển các ion Na+ bao gồm 3 họ gen chính là HKT, NHX và SOS [63]

7

Hình 1.1 Các con đường điều hòa chống chịu stress mặn ở thực vật [64]

Trong hình 1.1, Na+ đi vào tế bào thông qua các kênh không chọn lọc cation như NSCCs và hình thành con đường truyền tín hiệu làm biểu hiện vượt mức các gen như họ HKT và kích hoạt các cơ chế giải độc tế bào (như hoạt động của các kênh vận chuyển HKT1, NHX, SOS1) [22]

Các yếu tố phiên mã (transcription factor) cũng là một trong những yếu tố quan trọng, chúng có mối liên hệ chặt chẽ với các cơ chế cảm ứng mặn, đóng góp vào tính chống chịu của cây [22] Các yếu tố phiên mã chính liên quan trong các đáp ứng với stress mặn như bZIP [69], WRKY [30], AP2/ERF [33], MYB [11], bHLH [31], và NAC [62] Các yếu tố phiên mã này có vai trò trong điều hòa sự biểu hiện của các gen ảnh hưởng đến các mức độ chống chịu stress mặn ở thực vật (Hình 1.1) Khi có stress mặn, các gen liên quan đến các quá trình đáp ứng này được biểu hiện ở mức cao như các gen liên quan đến hấp thu các ion vô cơ, các gen

/K+ ở chồi, ethylene cũng đóng vai trò quan trọng quyết định sự chống

chịu mặn ở cây Arabidopsis Các thay đổi hàm lượng etilen được tạo ra khi bất

hoạt gen ETO1 và qua đó kích thích quá trình sản xuất ROS ở vùng trụ rễ bởi yếu

tố RBOHF Sự gia tăng ROS ở trụ giữa dẫn đến giảm dòng ion Na+

vào rễ, giảm thu nhận Na+

ở xylem và duy trì ion K+ ở rễ giúp tăng cường khả năng chống chịu mặn [28]

1.3 Các họ protein vận chuyển ion Na + ở cây trồng

tế bào chất

Hai yếu tố quan trọng duy trì nồng độ Na+

thấp trong tế bào chất là protein NHX1 ở không bào và protein SOS (còn được gọi là NHX7) trên màng tế bào Trong khi NHX rất cần thiết cho giải độc Na+

thông qua cô lập Na+ trong không bào, thì SOS có chức năng xuất Na+

ra khỏi tế bào Sự biểu hiện quá mức của gen

AtNHX1 và gen tương đồng (orthologs) của nó ở cây Arabidopsis thaliana và các loài thực vật khác, chẳng hạn như cà chua (Solanum lycopersicum) hoặc lúa, dẫn

đến tăng khả năng chịu mặn của cây trồng [4; 72] Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng họ protein NHX cũng rất quan trọng trong việc ngăn K+

trong không bào và

cân bằng pH nội môi [5] Sự biểu hiện quá mức của gen AtNHX1 trong cà chua làm

9

tăng K+

không bào cũng như vận chuyển K+ từ gốc sang chồi [5; 6], điều này có lợi

vì tăng tỷ lệ nội bào K+

/Na+, làm giảm sự stress Na+

Khả năng chịu mặn của thực vật có được là nhờ một loạt các đáp ứng nhằm hạn chế tích lũy ion Na+ ở thân và giảm sự vận chuyển Na+

lên thân, lá Sự tích lũy

Na+ và Cl- vào không bào là cơ chế thích nghi ở thực vật được bảo tồn ở cả thực vật nước ngọt và nước mặn [29] Ở mức độ tế bào, nhờ hoạt động của các protein NHX nên nồng độ Na+ tại không bào luôn được duy trì ở mức thấp hơn ngưỡng có khả năng gây độc cho tế bào [49] Kênh vận chuyển Na+/H+ và K+/H+ là hai kênh vận chuyển đóng vai trò quan trọng trong quá trình điều tiết duy trì cân bằng nồng

độ ion trong cơ chế chịu mặn của cây, trong đó vai trò vận chuyển Na+

/H+ trong tế bào do các protein được mã hóa bởi các gen thuộc họ gen NHX ở thực vật đảm

nhiệm Trong những nghiên cứu nhằm phân tích đáp ứng của cây Arabidopsis với

stress mặn cho thấy họ protein NHX tham gia vào sự vận chuyển ion Na+/H+ và

K+/H+, protein NHX giúp tích lũy ion K + vào nội mô tế bào, tăng cường hàm lượng ion Na+

vào bên trong không bào, giúp cây thực hiện chức năng điều tiết tốt hơn trong quá trình chịu mặn Nghiên cứu gần đây cho thấy rằng NHX có nhiều vai trò trong quá trình điều hòa áp suất thẩm thấu, tăng trưởng tế bào và phát triển thực vật [5;6]

Ở độ mặn vừa phải, cây mang đột biến gen SOS1 tích lũy Na+

trong thân ít hơn so với cây hoang dại, cũng chỉ ra rằng protein SOS1 tham gia vào việc nạp

Na+ vào xylem Một số nghiên cứu đã chỉ ra chức năng quan trọng này trong cà

chua [40] và ở Thellungiella salsuginea Ở điều kiện stress mặn, protein SOS1

cũng liên quan đến nồng độ K+

trong thực vật, điều quan trọng hơn đối với cây là giữ tỷ lệ K+/Na+ cao Đột biến gen SOS1 cho thấy sự hấp thu K+ có ái lực cao và giảm đáng kể hàm lượng K+ Qi và Spalding (2004) đã chứng minh rằng protein SOS1 có chức năng bảo vệ sự hấp thụ K+ thông qua AKT1 và nồng độ K+ bị mất đi trong stress mặn [45] Ngoài ra, protein ZxSOS1 kiểm soát vận chuyển đường dài

và duy trì cân bằng nội môi Na+, K+ đối với cây chịu hạn Zygophyllum xanthoxylum Protein SOS1 rất cần thiết cho cây trồng để đối phó với stress mặn

vận chuyển cation Na+

/K+ [49; 50]

đã dẫn đến việc xác định và mô tả đặc tính của nhiều gen HKT từ các loài thực vật khác nhau Protein HKT đã được chứng minh tham gia vận chuyển ion K+

và hoặc ion Na+qua màng Một số thành viên mã hóa cho việc vận chuyển có chọn lọc Na+

(như trong Arabidopsis thaliana gen AtHKT1;1) trong khi

một số thành viên khác mã hóa cho việc đồng vận chuyển ion Na+

11

Dựa trên các phân tích về trình tự thì họ gen HKT được chia thành 2 nhóm

là phân họ I và phân họ II [64] Phân họ I ứng với các gen tham gia quá trình vận chuyển Na+

có chọn lọc còn phân họ II tham gia quá trình đồng vận chuyển Na+/K+[50]

Các thành viên của họ protein HKT được tìm thấy ở rất nhiều loài thực vật

như: Arabidopsis, lúa mạch, bạch đàn, nho, một số thực vật vùng băng giá, lúa gạo

và lúa mì Có nhiều bằng chứng cho thấy vai trò quan trọng của các thành viên họ protein HKT trong vận chuyển Na+ và Na+/K+, cụ thể là trong việc kiểm soát sự tích lũy Na+

và do đó xác định được khả năng chịu mặn [43]

Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bởi trình tự mã hóa của các gen và trình tự axit amin của protein HKT cho thấy họ gen được chia thành 2 phân họ chính (Hình 1.2) Sự phân chia của họ gen HKT thành hai phân họ chính được kết hợp với sự thay thế Glycine/Serine trong cấu trúc lỗ lọc của protein [34; 20].Tất cả các thành viên của phân họ 1 có một phân tử Serine ở vị trí này, trong khi các

thành viên của phân họ 2 (ngoại trừ khả năng phục hồi gen OsHKT2;1) có glycine Phân tích chức năng của gen TaHKT2;1, AtHKT1;1 và các gen lúa cho thấy cấu

trúc đặc biệt này có thể đóng vai trò trung tâm trong việc xác định khả năng chọn lọc Na+ của kênh vận chuyển [34; 20] Do đó, việc chia thành hai phân nhóm chính cũng có thể gọi là phân chia theo chức năng

Vai trò chính của gen AtHKT1;1 và gen tương đồng của nó trên lúa (OsHKT1;5) là mã hoá protein tham gia vào quá trình loại bỏ Na+ khỏi dòng mạch xylem từ rễ lên lá và chuyển các Na+

vào các tế bào nhu mô xung quanh, thông qua quá trình này sẽ bảo vệ mô lá khỏi độc tính của Na+

Sự biểu hiện vượt mức gen

AtHKT1;1 trong mô giúp tăng cường tính chống chịu mặn [7]

Các phân tích sinh lý học invivo trên các tế bào rễ đã cho thấy protein AtHKT1;1 hỗ trợ vận chuyển Na+ thông qua các kênh vận chuyển thụ động Sự loại bỏ Na+

khỏi mạch xylem được hỗ trợ bởi protein AtHKT1;1 cũng giúp kích thích quá trình vận chuyển ion K+ vào mạch xylem thông qua các kênh K+, làm gia

12

tăng tỉ lệ K+

/Na+ trên lá giúp cây chống lại stress do Na+ gây ra [47; 57] Gen

TaHKT1;4 được chứng minh là thuộc nhóm I trong họ gen HKT mã hóa cho

protein có chức năng loại bỏ Na+

ra khỏi mạch mô lá

Các phân tích so sánh giữa các giống lúa Indica chống chịu mặn và các

giống Japonica đã đưa ra giả thuyết rằng gen OsHKT1;4 giúp giảm sự vận chuyển

Na+ từ bẹ lá lên phiến lá lúa khi cây gặp stress mặn [10] Như vậy, các gen HKT nhóm I mã hóa sản phẩm có chức năng giúp thực vật tránh khỏi sự tích tụ quá nhiều Na+

trong suốt quá trình stress mặn

Sự duy trì K+

và loại bỏ Na+ ở mô lá cho thấy có mối tương quan rất mạnh đến sự chống chịu mặn ở thực vật Điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu về HKT nhóm I như là các yếu tố chính trong việc xác định tỉ lệ K+

/Na+ ở thực vật Tuy nhiên, nghiên cứu sâu trên các mô chồi và kỹ thuật “genome-wide association” đã chỉ ra ở những cây có khả năng phát triển trên các vùng đất nhiễm mặn như các vùng đất ven biển có sự tích tụ Na+

với nồng độ cao ở lá Nồng độ

Na+ cao ở lá có liên quan đến một alen của gen AtHKT1;1 Alen này làm giảm sự biểu hiện của gen AtHKT1;1 ở rễ [64]

1.4 Họ gen OsHKT ở cây lúa

Họ gen HKT ở lúa bao gồm 9 gen, được phân chia thành 2 phân họ dựa vào

sự lựa chọn vận chuyển các ion [43]:

- Phân họ 1 bao gồm: các gen OsHKT1;1 – OsHKT1;5 mã hóa cho sản phẩm

có chức năng vận chuyển Na+

- Phân họ 2 bao gồm: các gen OsHKT2;1 – OsHKT2;4, mã hóa cho sản phẩm

có chức năng vận chuyển theo 2 hướng, cả Na+ và K+, và chỉ vận chuyển

Na+ khi nồng độ Na+ cao

Cụ thể các thành viên họ gen HKT ở lúa được trình bày trong hình 1.3 và bảng 1.2

13

Hình 1.3 Cấu trúc gen m t số thành viên họ gen lúa [43]

màu trắng: Exon, màu xanh: Intron

Bảng 1.2 Các thành viên họ gen HKT ở lúa [43].

OsHKT8, SKC1 AK108663 Os01g20160 BAB93392 OsHKT1;5

14

Các gen này mã hóa cho các protein màng, tham gia vào việc vận chuyển các ion qua màng tế bào thực vật, có vai trò quan trọng đối với khả năng chống chịu mặn ở lúa

1.5 Gen OsHKT1;5

OsHKT1;5 là thành viên được

nghiên cứu nhiều trong phân họ 1 Biểu

hiện OsHKT1;5 được tìm thấy ở nhiều cơ

quan khác nhau nhưng chủ yếu là ở tế bào nhu mô của rễ và lá Ở lúa, hệ thống loại

Na+ phụ thuộc HKT1;5 tương tự với cơ chế trung gian của AtHKT1;1 trong Arabidopsis [24]

Hình 1.4 Mô hình gen AtHKT1;1 và

(a) gen AtHKT1;1 và OsHKT1;5 tách Na+ từ các mạch xylem tại màng tế bào nhu mô xylem Chức năng thu nhận Na+ của gen

AtHKT1;1 và OsHKT1;5 ngăn ngừa sự tích tụ

Na+ trong thân và lá, do đó bảo vệ quá trình quang hợp trong điều kiện mặn (b) Giả thuyết cho việc ghép nối Na +

từ xylem bằng các kênh vận chuyển HKT nhóm 1, đưa K+vào các ống xylem qua các kênh K+ kích hoạt khử cực Sự hấp thụ Na + do trung gian HKT

từ các mạch xylem sẽ làm cho sự khử cực màng tế bào màng xylem, do đó có thể kích hoạt các kênh K + dẫn ra ngoài Cơ chế này có thể dẫn đến việc tích lũy K +

tích tụ trong thân

và lá, góp phần bảo vệ lá khỏi mặn [24]

OsHKT1;5 trong mô giúp tăng cường tính chống chịu mặn [8]

Ở lúa, gen OsHKT1;5 đã được chứng minh là một yếu tố quyết định khả

năng chịu mặn bằng các phân tích tính trạng số lượng (QTL) [47] Các locus từ một giống chống chịu ban đầu được nhắm mục tiêu như QTL dẫn đến tích lũy K+

cao hơn trong thân trong quá trình đáp ứng mặn được gọi là SKC1 (shoot K+

content 1- tên gọi khác của OsHKT1;5) Một trong những QTL chịu mặn chính của

cây lúa là vùng locus Saltol, liên quan đến cân bằng nội môi Na+/K+ trong quá trình stress mặn [61], trong vùng này người ta đã tìm thấy vị trí của SKC1 [26] Sản

phẩm gen OsHKT1;5, chọn lọc ưu tiên vận chuyển Na+

trong các tế bào biểu hiện

dị tật (heterologously), được chứng minh là có ảnh hưởng lớn đến việc giảm nồng

độ Na+

trong thân [47]

Những nghiên cứu trên phần nào dự đoán được chức năng của gen

OsHKT1;5 mã hóa cho sản phẩm protein OsHKT1;5 đối với việc loại bỏ Na+ trong

thân Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về gen OsHKT1;5, cũng như chưa có nghiên cứu nào về giải trình tự gen OsHKT1;5 trên các giống lúa địa

phương Trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện phân tích đa hình gen

OsHKT1;5 bằng phương pháp PCR- Giải trình tự, kết hợp với nghiên cứu biểu

hiện gen bằng phương pháp Realtime-PCR Nghiên cứu được thực hiện dựa trên kết quả của một số nghiên cứu trước đó của TS Đỗ Thị Phúc và cộng sự trên đối

tượng cây lúa như: trên gen OsHKT1;1 [42], gen OsHKT1;2 [15], gen OsHKT2;4

[39] Những kết quả này cho thấy phương pháp sử dụng để nghiên cứu là phương pháp phù hợp và có tính chính xác cao

ở điều kiện invitro

Kỹ thuật tổng hợp DNA invitro cũng phải tuân thủ đầy đủ những nguyên tắc

cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể, tuy nhiên có vài điểm khác biệt sau: Dùng

nhiệt độ cao biến tính tách mạch DNA thay cho enzym helicase; Sử dụng enzym DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp DNA mới trong môi trường nhiệt độ cao;

Sử dụng hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động để nhận lên một đoạn DNA đích xác định [37]

Hình 1.5 Các giai đoạn trong phản ứng PCR [37]

Từ việc khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của enzym DNA polymerase được tìm thấy trong vi khuẩn sống trong các suối nước nóng Phần lớn các DNA polymerase chỉ hoạt động ở nhiệt độ thấp Tuy nhiên, ở nhiệt độ này, DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerase không thể biến tính phần lớn các phần của

17

phân tử Nhưng các polymerase chịu nhiệt thì khác, các DNA polymerase này hoạt

động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến 100⁰C Ở nhiệt độ này DNA đã bị biến tính

(DNA dạng xoắn sẽ duỗi ra và ở dạng thẳng) Việc DNA polymerase gắn vào và

hoạt động là tương đối dễ dàng Phản ứng PCR là phản ứng chuỗi với nhiều chu kỳ nối tiếp nhau (khoảng 30-35 chu kỳ), mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: biến tính, gắn mồi và kéo dài (hình 1.5)

1.6.2 Giải trình tự gen

Có hai phương pháp giải trình gen đó là phương pháp hóa học của Gilbert và phương pháp enzym của Sanger và cộng sự Tuy nhiên, phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay là phương pháp enzym của Sanger [52]

Maxam- Phương pháp enzym

Phương pháp này được F Sanger và cộng sự phát minh vào năm 1977 Nguyên tắc của phương pháp enzym này là dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung nhờ

vào hoạt động của enzym DNA polymerase Với việc sử dụng thêm các

dideoxynucleotide (ddNTP) so với việc chỉ sử dụng các deoxynucleotide (dNTP) thông thường, kết quả quá trình tổng hợp là hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau

Một đoạn DNA mạch đơn (dài khoảng 20 nucleotide) được sử dụng làm mồi trong phản ứng Phản ứng sử dụng bốn loại dNTPs (trong đó có một loại đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ) và bổ xung thêm 1% ddATP (hoặc ddCTP, ddGTP, ddTTP) cho mỗi loại phản ứng Phản ứng được ngừng tổng hợp do có sự tham gia của các ddNTP mất hai nguyên tử oxy ở C3 và C2 Mỗi loại phản ứng được thực hiện riêng rẽ, đầy đủ các thành phần giống như một phản ứng PCR thông thường

(có DNA khuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTPs, enzym DNA polymerase, dung

dịch đệm) tuy nhiên có sự khác biệt là có thêm khoảng 1% một loại ddNTP Việc dừng phản ứng khi có mặt ddNTP tạo nên các đoạn oligonucleotide có kích thước dài ngắn khác nhau và được phân tích nhờ phương pháp điện di (Hình 1.6) Chúng

 Phương pháp xác định trình tự nucleotide bằng máy tự đ ng

Trong kĩ thuật này, người ta không đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ mà bằng hóa chất (các fluochrome) Mỗi loại ddNTP được đánh dấu bằng một hóa chất có màu khác nhau Vì vậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt bằng một loại ddNTP sẽ có cùng một màu Gel polyacriamid được sử dụng để điện di kết quả, sau đó kết quả sẽ được xử lí qua một hệ thống vi tính (hình 1.7) Hệ thông sẽ phân tích và đưa ra trình tự nucleotide cần xác định

19

Hình 1.7 Sơ đồ giải trình tự gen theo phương pháp giải trình tự tự động

1.6.3 Phân tích tin sinh học

Tin sinh học (bioinformatics) là một lĩnh vực khoa học sử dụng các công nghệ của các ngành toán học ứng dụng, tin học, thống kê, khoa học máy tính, trí tuệ nhân tạo, hóa học và hóa sinh để giải quyết các vấn đề sinh học Những lĩnh vực nghiên cứu chính của tin sinh học bao gồm so sánh trình tự (sequence alignment), so sánh cấu trúc protein (protein structural alignment), dự đoán cấu trúc protein (protein structure prediction), dự đoán biểu hiện gen (gene expression)

20

và tương tác protein - protein (protein-protein interactions), và mô hình hóa quá trình tiến hoá

Trình tự DNA của rất nhiều loài sinh vật được lưu trữ trong các ngân hàng

cơ sở dữ liệu gen Những dữ liệu này sẽ được phân tích để tìm ra những gen cấu trúc (gen mã hoá cho một protein nào đó), cũng như tìm ra các protein tương đồng

về chức năng) Việc so sánh trình tự nucleotide giữa các gen khác nhau có thể cho thấy sự tương đồng về chức năng của protein được các gen này mã hóa, hay mối quan hệ chủng loại phát sinh phân tử giữa những loài này Với sự tăng trưởng khổng lồ của dữ liệu loại này, việc phân tích trình tự DNA sử dụng chương trình máy tính để giúp tìm các trình tự tương đồng trong hệ gen của hàng loạt sinh vật, với số lượng nucleotide trong trình tự lên đến hàng tỉ Những chương trình như như CLASTAL, BLAST có thể tìm kiếm những trình tự DNA không giống nhau hoàn toàn do các đột biến nucleotide (thay thế, mất hay thêm các gốc base) [46, 36] Công cụ so sánh BLAST của ncbi.nlm.nih.gov là công cụ so sánh hữu ích khi

ta có thể so sánh trình tự DNA quan tâm với nguồn trình tự DNA khổng lồ ncbi.nlm.nih.gov cung cấp; công cụ so sánh MultAlin là một công cụ khác để so sánh, với ưu điểm của công cụ này là cho phép so sánh nhiều trình tự DNA hoặc Protein khác nhau với chú thích rõ ràng, dễ nhìn, sắp xếp theo mức độ tương đồng

Dự đoán cấu trúc là một ứng dụng quan trọng khác của tin sinh học Có thể

dễ dàng xác định trình tự axit amin hay còn gọi là cấu trúc bậc một của protein từ việc suy biến từ trình tự gen mã hóa cho nó Nhưng, protein chỉ có chức năng vốn

có khi nó cuộn gấp thành hình dạng chính xác (nếu điều này xảy ra ta có cấu trúc bậc hai, cấu trúc bậc ba và cấu trúc bậc bốn) Tuy nhiên, sẽ là vô cùng khó khăn nếu chỉ dự đoán các cấu trúc gấp nếp này từ trình tự axit amin Một số phương pháp dự đoán cấu trúc bằng máy tính hiện đang phát triển Một trong các ý tưởng quan trọng trong nghiên cứu tin sinh học là quan điểm tương đồng Trong một nhánh genomic của tin sinh học, tính tương đồng được sử dụng để dự đoán cấu trúc của gen: nếu biết trình tự và chức năng của gen A và trình tự này tương đồng với trình tự của gen B chưa biết chức năng thì có thể kết luận là A và B có cùng chức

1.7 Nghiên cứu biểu hiện của gen sử dụng phương pháp Realtime-PCR

Phản ứng tổng hợp chuỗi thời gian thực (Realtime-PCR) hay còn được gọi là phản ứng tổng hợp chuỗi định lượng là một kĩ thuật về sinh học phân tử được sử dụng trong phòng thí nghiệm dựa trên phản ứng tổng hợp chuỗi (Polymerase chain reaction-PCR), kĩ thuật này được sử dụng nhằm khuếch đại và cùng lúc xác định được số lượng của phân tử DNA đích Điểm khác biệt của Realtime-PCR với PRC thông thường là đoạn DNA được nhân lên sẽ được phát hiện trong thời gian thực (Realtime) Phương pháp PCR định lượng là phương pháp hiện đại để nghiên cứu biểu hiện gen [13], tuy nhiên nó yêu cầu một lượng cDNA đủ lớn để tiến hành phản ứng [35]

Hai phương pháp phổ biến để xác định được sản phẩm trong PCR định lượng đó là: (1) các dye phát huỳnh quang không đặc hiệu gắn vào bất kỳ đoạn DNA mạch đôi nào đó, và (2) các đầu dò DNA đặc hiệu có chứa các đoạn oligonucleotide đã được đánh dấu với chất báo cáo phát huỳnh quang, từ đó cho phép phát hiện chỉ khi có sự lai giữa đầu dò với một trình tự bổ sung với nó, nhằm định lượng được RNA thông tin (mRNA) và các RNA không mã hóa trong các tế bào cũng như các mô

22

 Biểu đồ khuếch đại của Realtime-PCR

Trong Realtime-PCR, ta có thể quan sát được trong quá trình nhân bản DNA trực tiếp của các ống phản ứng qua một biểu đồ khuếch đại (amplification graph) Biểu đồ này có trục tung là cường độ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích, còn trục hoành là các chu kỳ nhiệt

Trên biểu đồ khuếch đại này (Hình 1.8), ta sẽ quan sát được đối với từng ống phản ứng, cường độ huỳnh quang mà máy ghi nhận được trong những chu kỳ đầu rất thấp và hầu như không thay đổi, hiển thị bằng một đường thẳng nằm ngang, có thể gọi đây là “giai đoạn ủ”, vì trong giai đoạn này dù DNA đích vẫn được nhân bản thành các bản sao nhưng máy không ghi nhận được do số lượng chưa đủ để giúp cho chất phát huỳnh quang nhận được ánh sáng kích thích phát ra ánh sáng

23

huỳnh quang đủ cường độ Khi số lượng bản sao của DNA đích đạt đến một ngưỡng nhất định, ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ đủ cường độ để được máy ghi nhận, lúc này chúng ta sẽ thấy đường biểu diễn khuếch đại bắt đầu đi lên, ta sẽ quan sát thấy cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng từ lúc này trở đi sẽ tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lượng bản sao của DNA đích tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ Giai đoạn này được gọi là “giai đoạn lũy thừa” về cường độ huỳnh quang, không phải là giai đoạn lũy thừa về số lượng bản sao của DNA đích, do DNA đích đã được nhân lên từ trước đó rồi Độ tăng sẽ chậm dần khi cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng tăng trưởng đến một mức nào đó và đạt đến cân

bằng do phản ứng đã cạn dần dNTP và enzym Taq polymerase không hoạt động

hiệu quả nữa, nên cường độ huỳnh quang sẽ không còn gia tăng gấp đôi theo mỗi chu kỳ nữa Giai đoạn này được gọi là “giai đoạn bình nguyên” [3]

 Chất phát huỳnh quang là m t loại màu huỳnh quang gắn vào sợi đôi DNA

Màu huỳnh quang gắn vào sợi đôi DNA là một loại màu huỳnh quang có ái lực rất cao khi có sự có mặt của sợi đôi DNA và ái lực này là do khả năng chèn của màu vào giữa sợi đôi DNA và làm cho sợi đôi DNA phát được ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích

Ethidium bromide đã từng được sử dụng cho phương pháp Realtime-PCR này, nhưng do tính độc hại của nó và sau này các nhà khoa học sử dụng SYBR I vì một số ưu điểm vượt trội hơn như khả năng chèn vào sợi đôi cao nhưng không làm cho sợi đôi bị gắn chặt vào nhau khi bị biến tính, màu huỳnh quang nền rất thấp nhờ vậy mà ít ảnh hưởng lên hiệu quả PCR [17] Phổ quang của SYBR là λ= 488 cho nguồn sáng kích thích và λ= 522 cho ánh sáng huỳnh quang phát ra

24

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng v vật liệu nghiên cứu

 Đối tượng nghiên cứu

Các giống lúa nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1 và được cung cấp bởi Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Bảng 2.3 Một số giống lúa sử dụng trong nghiên cứu

 Vật liệu nghiên cứu

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

- Nhóm các hóa chất sử dụng tách chiết DNA, RNA tổng số: Tris HCl,

EDTA, CTAB, NaCl, Chloroform, Isoamyl alcohol, Isopropanol, Etanol,

TE, GeneJet Plant RNA Purification Mini Kit, DNase I

25

- Nhóm hóa chất dùng cho PCR, Realtime-PCR: Taq DNA polymerase, Taq

buffer, dNTP, mồi đặc hiệu, RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit , SYBR Green PCR Master Mix

- Nhóm hóa chất dùng cho điện di gel agarose: Agarose, đệm TAE, loading dye, ethydium bromide

- Kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR: GeneJET Gel Extraction

Các hóa chất và dụng cụ dùng trong thí nghiệm đều được cung cấp bởi các hãng có uy tín trên thế giới như Fermentas, Promega, Sigma, Invitrogen, Bioneer, Corning, Thermo

Máy móc, thiết bị tại phòng thí nghiệm B môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên:

- Máy nghiền Retsch mill – RETSCH – Đức

- Máy PCR 9700 Applied Biosystems - Mỹ

- Máy PCR Kyratec – Úc

- Máy ly tâm lạnh Hettich zentrifugen– Đức

- Máy soi gel Doc XR Biorad - Mỹ

- Một số thiết bị như bể điện di, máy vortex, bể ổn nhiệt, tủ nuôi thủy canh

2.2 Phương pháp phân tích đa hình gen

2.2.1 Trồng và thu mẫu

Mẫu được trồng trong các khay đất có chia ô và đánh số Mẫu lá lúa thu ở giai đoạn 3-4 lá được chia vào các ống eppendorf 2 ml Sau đó mẫu lá lúa được nghiền nhỏ bằng máy nghiền đồng thể Retsch – Đức Nitơ lỏng được sử dụng trong suốt quá trình thu mẫu và nghiền mẫu

26

Ủ ở 65°C trong vòng 15 phút Chờ nguội, bổ sung 500 ml CI (chloroform: isoamyl alcohol = 24:1) và vortex đều Ly tâm 10.000 vòng/ 10 phút ở 4°C Lúc này ống đã phân lớp, ta thu dịch pha trên và chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới Sau đó bổ sung thêm isopropanol lạnh với tỉ lệ 1:1 với mục đích là tủa DNA Trộn đều sau đó

để trong đá 10 phút Ly tâm 14.000 vòng/ 5 phút ở 4°C Rửa tủa bằng cách loại bỏ dịch pha trên và bổ sung 500 μl EtOH 70° Ly tâm 14.000 vòng/5 phút ở 4°C Thu tủa và để khô tủa ở nhiệt độ phòng Bổ sung 50 µl TE buffer

Sản phẩm DNA tách chiết được sau khi kiểm tra độ tinh sạch được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR

2.2.3 Khuếch đại gen bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu

Để thu thập thông tin về gen OsHKT1;5 chúng tôi sử dụng dữ liệu trên các

cơ sở dữ liệu online như ncbi.nlm.nih.gov, phytozome.jgi.doe.gov, rice.plantbiology.msu.edu

Mồi đặc hiệu được thiết kế và kiểm tra độ đặc hiệu bằng công cụ

Primer-BLAST trên ncbi.nlm.nih.gov dựa trên trình tự Promoter và CDS tìm kiếm được

(được trình bày ở phần kết quả) PCR được tối ưu chu trình nhiệt sao cho khi điện

di sản phẩm PCR tạo thành một băng duy nhất, đúng với tính toán lý thuyết

Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của phản ứng PCR được trình bày ở bảng 2.2 và bảng 2.3

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen

Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen

2.2.4 Điện di trên gel Agarose

Mục đích của phương pháp điện di agarose nhằm kiểm tra sơ bộ chất lượng mẫu DNA tổng số và kiểm tra kích thước sản phẩm PCR có đúng với tính toán lý thuyết khi so sánh với thang DNA chuẩn

Quy trình điện di: Pha gel agarose loại 1% bằng cách cho 1gram thạch agarose vào trong 100 ml đệm TAE, khuấy đều và cho vào lò vi sóng đun nóng sao cho gel tan đều và không tạo bọt Để gel nguội ở nhiệt độ phòng, khi gel nguội khoảng 50-55ºC, gel được đổ vào bể điện di có cài sẵn đá lạnh để làm đông gel, sau đó cắm lược điện di Sau khoảng 20 phút cho gel đông, rút lược ra và đổ đệm TAE 1X vào, đệm đổ ngập mặt gel, thường cao hơn bề mặt gel từ 2-3 mm Các